JP2015223124A - イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、ゴム組成物、並びに空気入りタイヤ - Google Patents
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Abstract
【課題】実質的に分子の末端部分のみに変性が加えられたイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンの提供。また、該イソプレンオリゴマー及び／又は該ポリイソプレンを配合したゴム組成物、並びに該ゴム組成物をタイヤの各部材（トレッド、サイドウォール等）に用いた空気入りタイヤの提供。【解決手段】下記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているイソプレンオリゴマー。前記イソプレンオリゴマーをポリマー鎖の端部に有するポリイソプレン。（ｎは１〜１０の整数，ｍは１〜３０の整数、Ｙは水酸基、ホルミル基、カルボキシル基、エステル基カルボニル基または二リン酸基）【選択図】なし
Description
本発明は、イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、イソプレンオリゴマー及び／又はポリイソプレンを含むゴム組成物、並びに該ゴム組成物を用いた空気入りタイヤに関する。
従来より、ゴム製品においては、本来的にゴムが有する特性に対して新たな特性を付与することを目的として、その用途に応じて様々な材質や形状の充填剤等をゴム組成物中に導入することで、所望の特性を発現させることが行われている。例えば、自動車用のタイヤにおいては、有機物であるゴム相の中にシリカ、カーボンブラック等の充填剤を導入し、耐摩耗性、低発熱性、ウェットグリップ性能などの特性の向上が図られている。
このようなゴム組成物においてゴム相に対して充填剤等を混合する際には、両者の親和性を高め、低発熱性やウェットグリップ性能等をより向上させる目的で、ゴム相に含まれるゴム分子に対して、例えば、チッ素原子含有基を有し、かつクロロスルフェニル基を有する化合物を反応させる処理等を行い、充填剤に対して親和性を示す官能基をゴム分子内に導入した変性ゴム（変性ジエン系重合体）を使用することが行われていた（例えば、特許文献１、２）。
しかしながら、ゴム分子に所定の官能基を導入する方法によっては、ゴム分子内の所定の位置に当該官能基を導入することが困難である結果、特にゴム分子を成す主鎖のランダムな位置に官能基が導入されることが知られている。このように主鎖に所定の官能基が導入されたゴム分子を用いた場合、ゴム分子と充填剤の結合状態がランダムとなって所望の効果が得られ難くなるばかりでなく、当該官能基が導入された箇所においてはゴムとしての特性が低下する結果、ゴム全体としての特性が損なわれるという問題があった。
本発明は、前記課題を解決し、実質的に分子の末端部分のみに変性が加えられたイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンを提供することを目的とする。また、該イソプレンオリゴマー及び／又は該ポリイソプレンを配合したゴム組成物、並びに該ゴム組成物をタイヤの各部材（例えば、トレッド、サイドウォール）に用いた空気入りタイヤを提供することを目的とする。
本発明は、下記式（１）で表されるイソプレンオリゴマーであって、下記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているイソプレンオリゴマーに関する。
（式（１）中、ｎは１〜１０の整数を表す。ｍは１〜３０の整数を表す。Ｙは、水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は下記式（２）で表される基を表す。）
下記式（１−１）中のＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（１−１）中のＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていないことが好ましい。
上記式（１）中のＩ−Ｉ部分が下記式（ａ）〜（ｊ）のいずれかであることが好ましい。
上記イソプレンオリゴマーは、下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸から生合成されて得られることが好ましい。
（式（３）中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
上記生合成をプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて行うことが好ましい。
上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質であることが好ましい。
［１］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
［３］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
（式（３）中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
［１］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
［３］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
本発明はまた、下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸から生合成する上記イソプレンオリゴマーの製造方法に関する。
（式（３）中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
上記生合成をプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて行うことが好ましい。
本発明はまた、下記式（４）で表されるポリイソプレンであって、下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているポリイソプレンに関する。
（式（４）中、ｎは１〜１０の整数を表す。ｍは１〜３０の整数を表す。ｑは３０〜４００００の整数を表す。Ｙは、水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は下記式（２）で表される基を表す。）
下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていないことが好ましい。
上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分が下記式（ａ）〜（ｊ）のいずれかであることが好ましい。
上記ポリイソプレンは、上記イソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成されて得られることが好ましい。
本発明はまた、上記イソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成する上記ポリイソプレンの製造方法に関する。
本発明はまた、上記イソプレンオリゴマー及び／又は上記ポリイソプレンを含むゴム組成物に関する。
本発明はまた、上記ゴム組成物を用いて作製した空気入りタイヤに関する。
本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）で表されるイソプレンオリゴマーであって、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているイソプレンオリゴマーである。また、本発明のポリイソプレンは、上記式（４）で表されるポリイソプレンであって、上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているポリイソプレンである。従って、本発明のイソプレンオリゴマー、及び本発明のポリイソプレンは、実質的に分子（ゴム分子）の末端部分のみに硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団による変性が加えられており、分子（ゴム分子）が本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤との親和性に優れる。よって、本発明のイソプレンオリゴマー及び／又は本発明のポリイソプレンをゴム組成物に配合することにより、従来よりも高い次元でゴム分子と充填剤が複合したゴム組成物が得られ、例えば、低発熱性、ウェットグリップ性能（特に、耐摩耗性）に優れたゴム組成物を提供できる。また、該ゴム組成物をタイヤの各部材（例えば、トレッド、サイドウォール）に使用することにより、例えば、低発熱性、ウェットグリップ性能（特に、耐摩耗性）に優れた空気入りタイヤを提供することができる。
人工的にゴム分子（ポリイソプレン）を生合成する工程においては、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）等の開始基質とイソペンテニル二リン酸等のモノマーの混合物にプレニルトランスフェラーゼ等の酵素を作用させることで、開始基質に対して１〜８個程度のイソプレン単位が付加重合したイソプレンオリゴマーが生成する。その後、当該イソプレンオリゴマーに対して更にイソペンテニル二リン酸を付加重合する酵素を含有するラテックス成分を混合することで、オリゴマーに対して多数のイソペンテニル二リン酸が連なったポリイソプレンが生成することが知られている。
このように、開始基質に対してモノマーを順次結合させてゴム分子とする各過程においては、天然の酵素による付加重合が不可欠である。
このため、ゴム分子（ポリイソプレン）を生合成する際の開始基質やモノマーとしては、当該使用する酵素が反応を触媒するものを使用する必要がある結果、ゴム分子（ポリイソプレン）の原料として使用される開始基質やモノマーの構造が限定されていた。特に開始基質に関しては、オリゴマーを生成させるための酵素に起因する制限により、天然に存在するジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸等に限定されていた。
この結果、人工的に生合成されるゴム分子（ポリイソプレン）においても、その構造の自由度が限定され、天然ゴムにない機能性を付加するための自由な分子設計が困難であった。
このため、例えば、官能基等が導入されたゴム分子（ポリイソプレン）を得たい場合には、原料として合成ゴムを用いる場合と同様に、一旦生合成されたゴム分子（ポリイソプレン）に対して、例えば、チッ素原子含有基を有し、かつクロロスルフェニル基を有する化合物を反応させる処理等を行い、充填剤に対して親和性を示す官能基をゴム分子内に導入されていた。
これに対し、本発明はイソプレンオリゴマーやポリイソプレンを製造する際の開始基質として構造の一部が変性されたファルネシル二リン酸等を使用することで、末端部に機能性を付加したイソプレンオリゴマーやポリイソプレンの製造が可能であることを見出したことに基づくものである。
特に、本発明は天然に存在する開始基質であるファルネシル二リン酸等に対して下記式（Ｉ）のＩ部分の構造を維持することで、その他の部分に所望の構造を導入した場合であっても、天然に存在するオリゴマー生成酵素であるプレニルトランスフェラーゼや、その一部を変異した酵素を用いることで、イソプレンオリゴマーが生成可能であることを見出したことに基づくものである。この理由は必ずしも明らかではないが、プレニルトランスフェラーゼが開始基質の下記式（Ｉ）のＩ部分の構造に吸着を生じ、他の部分の構造には比較的鈍感であるためと考えられる。
当該知見に基づけば、所望の特性を有する末端部を有するイソプレンオリゴマーやポリイソプレンを提供することが可能となり、イソプレンオリゴマーやポリイソプレン自体の特性を損なうことなく、様々な機能を付加したイソプレンオリゴマーやポリイソプレンを提供することが可能となる。
更に、本発明者らは、上記知見に加えて、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団による変性を末端部に加えたイソプレンオリゴマーやポリイソプレンをゴム組成物に配合することにより、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団による変性以外の変性を末端部に加えたイソプレンオリゴマーやポリイソプレンをゴム組成物に配合した場合に比べて、より高い次元でゴム分子と充填剤が複合したゴム組成物が得られ、例えば、低発熱性、耐摩耗性、破断時伸び、破断強度、ウェットグリップ性能（特に、耐摩耗性）により優れたゴム組成物を提供できることを見出した。
（イソプレンオリゴマー）
本発明のイソプレンオリゴマーは、下記式（１）で表されるイソプレンオリゴマーであって、下記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されている。また、本明細書において、下記式（２）で表される基は、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、下記式（５）で表される基となる）。本明細書において、下記式（２）で表される基とは、このような水酸基の一部又は全部が解離している基も含む概念である。
（式（１）中、ｎは１〜１０の整数を表す。ｍは１〜３０の整数を表す。Ｙは、水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は下記式（２）で表される基を表す。）
本発明のイソプレンオリゴマーは、下記式（１）で表されるイソプレンオリゴマーであって、下記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されている。また、本明細書において、下記式（２）で表される基は、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、下記式（５）で表される基となる）。本明細書において、下記式（２）で表される基とは、このような水酸基の一部又は全部が解離している基も含む概念である。
本発明のイソプレンオリゴマーは、天然ゴムに近い構造を有しており、ゴム分子との相溶性が高い。また、本発明のイソプレンオリゴマーは、実質的に分子の末端部分のみに硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団による変性が加えられている。すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーは、一方の末端（重合停止末端）に位置する水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は上記式（２）で表される基を有し、さらに、もう一方の末端（重合開始末端）に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているため、イソプレンオリゴマーが本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤との相互作用が強い。このように、本発明のイソプレンオリゴマーは、ゴムとの相溶性が高く、さらに、シリカ等の充填剤との相互作用が強いため、ゴム組成物に配合することにより、従来よりも高い次元でゴム分子と充填剤が複合したゴム組成物が得られ、例えば、ゴム組成物の低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）を向上できる。
本発明のイソプレンオリゴマーは、重合開始末端や重合停止末端に近い部分にのみ極性基等が存在する。そのため、主鎖部分に極性基等を有する場合や重合停止末端部分のみに極性基等を有する場合に比べて、イソプレンオリゴマーが本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤の分散性が高く、例えば、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）の向上効果が高い。
また、本発明のイソプレンオリゴマーは、優れた抗菌活性を示す。これは、イソプレンオリゴマーを構成する上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているため、自然界に存在する通常のイソプレンオリゴマーと構造が異なり、菌が有する酵素もしくは補酵素の阻害、核酸合成の阻害、細胞膜合成の阻害、細胞質膜の合成の阻害、細胞膜の破壊、細胞質膜の破壊等の作用を有するためであると推測される。
式（１）のｎは１〜１０（好ましくは１〜４、より好ましくは２〜３）の整数を表す。
式（１）のｍは１〜３０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８、更に好ましくは１〜５）の整数を表す。
式（１）のＹは、水酸基（−ＯＨ）、ホルミル基（−ＣＨＯ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（−ＣＯＯＲ）、カルボニル基（―ＣＯＲ）又は上記式（２）で表される基を表す。
エステル基（−ＣＯＯＲ）、カルボニル基（―ＣＯＲ）のＲは、炭素数１〜３０（好ましくは炭素数１〜１７）のアルキル基を表す。炭素数１〜３０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。
式（１）のＹとしては、優れた抗菌性を示すこと、及びシリカ等の充填剤との相互作用が強いことから、水酸基、カルボキシ基が好ましい。
式（１）のｍは１〜３０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８、更に好ましくは１〜５）の整数を表す。
式（１）のＹは、水酸基（−ＯＨ）、ホルミル基（−ＣＨＯ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（−ＣＯＯＲ）、カルボニル基（―ＣＯＲ）又は上記式（２）で表される基を表す。
エステル基（−ＣＯＯＲ）、カルボニル基（―ＣＯＲ）のＲは、炭素数１〜３０（好ましくは炭素数１〜１７）のアルキル基を表す。炭素数１〜３０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。
式（１）のＹとしては、優れた抗菌性を示すこと、及びシリカ等の充填剤との相互作用が強いことから、水酸基、カルボキシ基が好ましい。
本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されている。なお、本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されていればよく、上記置換に加えて、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団が、更に硫黄原子以外の原子や他の原子団により置換されていてもよい。
上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）としては、例えば、水素原子、メチル基、メチレン基、炭素原子、メチン基等が挙げられる。
上記硫黄原子を含む原子団としては、例えば、メルカプト基、硫黄原子を含む環状構造を有する基（例えば、下記式（ｓ−１）〜（ｓ−５）で表される基）等が挙げられる。なかでも、硫黄原子を含む環状構造を有する基が好ましく、硫黄原子を含む飽和の環状構造を有する基がより好ましく、下記式（ｓ−１）〜（ｓ−５）で表される基が更に好ましく、下記式（ｓ−１）で表される基が特に好ましい。なお、硫黄原子を含む環状構造とは、硫黄原子が環の一部を形成している環状構造を意味する。環状構造中、硫黄原子の数は、好ましくは１〜３、炭素原子の数は、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５である。
上記硫黄原子以外の原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、炭素原子等が挙げられる。なかでも、酸素原子が好ましい。すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団が、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されていると共に、更に酸素原子により置換されていることが好ましい。
上記他の原子団としては、例えば、エーテル基、アセトキシ基、アルコキシ基（好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基、より好ましくはメトキシ基）、水酸基、アリール基（好ましくはフェニル基）、アルキル基（好ましくは炭素数１〜５のアルキル基、より好ましくはエチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基）、アセチル基、Ｎ−アルキルーアセトアミノ基（アルキルの炭素数は好ましくは１〜５）、アジド基等が挙げられる。なかでも、アルコキシ基、エーテル基、アルキル基が好ましい。すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団が、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されていると共に、更にアルコキシ基、エーテル基、及びアルキル基からなる群より選択される少なくとも１種の基（特に、エーテル基）により置換されていることが好ましい。
本発明のイソプレンオリゴマーは、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているが、当該置換は、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分のイソプレン単位の繰り返し部のうち、下記式（１−１）中のＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（１−１）中のＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていないことが好ましい。これは、本発明者らが天然に存在する開始基質であるファルネシル二リン酸等に対して上記式（Ｉ）のＩ部分の構造を維持することで、その他の部分に所望の構造を導入した場合であっても、天然に存在するオリゴマー生成酵素であるプレニルトランスフェラーゼや、その一部を変異した酵素を用いることで、イソプレンオリゴマーが生成可能であることを見出したことに基づくものである。
（式（１−１）中のｎ、ｍ、Ｙは式（１）中のｎ、ｍ、Ｙと同一である。）
上記式（１）中のＩ−Ｉ部分の具体例としては、例えば、下記式（ａ）〜（ｊ）で表される構造が挙げられる。なかでも、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）の向上効果が高いという理由から、下記式（ｅ）、（ｊ）で表される構造が好ましい。
（イソプレンオリゴマーの製造方法）
本発明のイソプレンオリゴマーの製造方法としては、例えば、下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸（以下では、アリル性二リン酸誘導体ともいう）と、イソペンテニル二リン酸から生合成する方法が挙げられる。また、本明細書において、アリル性二リン酸誘導体は、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、上記式（５）で表される基のようになる）。本明細書において、アリル性二リン酸誘導体とは、このような水酸基の一部又は全部が解離している化合物も含む概念である。
（式（３）中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
本発明のイソプレンオリゴマーの製造方法としては、例えば、下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸（以下では、アリル性二リン酸誘導体ともいう）と、イソペンテニル二リン酸から生合成する方法が挙げられる。また、本明細書において、アリル性二リン酸誘導体は、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、上記式（５）で表される基のようになる）。本明細書において、アリル性二リン酸誘導体とは、このような水酸基の一部又は全部が解離している化合物も含む概念である。
式（３）のｐは１〜１０（好ましくは１〜４、より好ましくは２〜３）の整数を表す。
本明細書において、式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）としては、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）と同様のものが挙げられる。
本明細書において、式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の置換は、上記式（１）について説明した置換と同様である。
なお、置換は、上述の通り、上記式（Ｉ）のＩ部分の構造を維持するように置換されていることが好ましい。すなわち、下記式（３−１）中のＩＶ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが置換され、下記式（３−１）中のＶ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていないことが好ましい。これにより、天然に存在するオリゴマー生成酵素であるプレニルトランスフェラーゼや、その一部を変異した酵素を用いることで、イソプレンオリゴマーが好適に製造可能である。
（式（３−１）中のｐは式（３）中のｐと同一である。）
アリル性二リン酸誘導体の具体例としては、例えば、下記式（Ａ）〜（Ｊ）で表される化合物が挙げられる。
なお、本明細書において、ＯＰＰは、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、上記式（５）で表される基となる）。本明細書において、ＯＰＰとは、このような水酸基の一部又は全部が解離している基も含む概念である。
上記式（Ａ）〜（Ｊ）などで表されるアリル性二リン酸誘導体は、例えば、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール等から、実施例に記載の方法を参考に当業者であれば製造できる。
アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸とから本発明のイソプレンオリゴマーを生合成する方法としては、例えば、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて行う方法が挙げられる。具体的には、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸とをプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の存在下に反応させればよい。
なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素とは、アリル性基質（アリル性二リン酸）とイソペンテニル二リン酸との間の縮合反応を触媒し、イソプレン単位が１単位増えた新たなアリル性二リン酸を合成することにより、アリル性基質（アリル性二リン酸）に順次イソペンテニル二リン酸を連結していく反応を触媒する活性を有する酵素を意味する。例えば、以下の反応を触媒する酵素が挙げられる。
上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、既に多くの存在が確認されている。プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素としては、例えば、ゲラニル二リン酸合成酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、Ｚ−ノナプレニル二リン酸合成酵素（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，２３３，７７３．）、ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）合成酵素（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．ａｎｄ Ｏｇｕｒａ，Ｋ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２，１５２７．；Ｋｅｅｎｍａｎ，Ｍ．Ｖ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｃ．Ｍ．（１９７４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６１，３７５．）等が挙げられる。各々の酵素により生成できる最大のイソプレン単位の数（上記式（１）のｍ）が決まっているため、目的のイソプレン単位数（上記式（１）のｍ）に応じて使用する酵素を変更すればよい。
上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は全ての生物種が有するが、例えば、ミクロコッカス・ルテウスＢ−Ｐ２６（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ Ｂ−Ｐ２６）、エシェヒリア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サッカロマイセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アラビドプシス・サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペリプロカ・セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｈｉｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、ＡＴＣＣ４９４２６）等が挙げられる。
アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸とをプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の存在下に反応させることにより、本発明のイソプレンオリゴマーが得られる。プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の存在下とは、上記生物の培養物、該培養物より分離した生物体、該生物体の処理物、該培養物若しくは該生物体から精製した酵素、遺伝子工学的手法によりプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（この酵素には後述の変異型酵素も含まれる）を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）の培養物、該培養物より分離した生物体、該生物体の処理物、該培養物若しくは該生物体から精製した酵素等が存在する状況を意味する。
なお、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を発現するように形質転換された生物体とは、従来公知の遺伝子工学的手法により作製された形質転換体であって、作製方法は、後述する。
なお、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を発現するように形質転換された生物体とは、従来公知の遺伝子工学的手法により作製された形質転換体であって、作製方法は、後述する。
上記生物の生物体を得るには、当該生物を適当な培地で培養すればよい。このための培地はその生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類、ホルモン等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度２０〜６０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８０時間程度培養を行えばよい。
上記生物の培養物とは、例えば、上述の培養条件にて上記生物を培養した培養液や、該培養液から生物（生物体）をろ過等により分離した培養ろ液（培養上澄液）等が挙げられる。また、上記培養物より分離した生物体とは、例えば、培養液からろ過や遠心分離等により分離された生物体（生物）等が挙げられる。
上記生物体の処理物とは、例えば、上記培養物より分離した生物体をホモジナイズした生物体破砕物、超音波処理した生物体破砕物等が挙げられる。
上記培養物又は上記生物体から精製した酵素とは、例えば、上記培養物又は上記生物体に存在する酵素を塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の精製操作を行うことにより得られる酵素である。なお、精製酵素の純度は、特に限定されない。
アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸とをプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の存在下に反応させることにより、本発明のイソプレンオリゴマーが得られるが、具体的には、例えば、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸とを含む溶液中に上記生物体の培養物や精製酵素等を添加することにより反応を行えばよい。また、反応温度は、例えば、２０〜６０℃、反応時間は、例えば、１〜１６時間、ｐＨは、例えば５〜８とすればよい。また、必要に応じて、塩化マグネシウム、界面活性剤、２−メルカプトエタノール等を添加してもよい。
上記反応により得られる本発明のイソプレンオリゴマーは、通常、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基又は水酸基である。この水酸基は上記式（２）で表される基が加水分解されることにより生じる。
また、上記式（１）のＹがホルミル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがカルボキシ基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがエステル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがカルボニル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがホルミル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがカルボキシ基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがエステル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（１）のＹがカルボニル基であるイソプレンオリゴマーは、例えば、上記式（１）のＹが上記式（２）で表される基であるイソプレンオリゴマーを酸化、エステル化することにより得られる。
本発明のイソプレンオリゴマーは、開始基質であるアリル性二リン酸誘導体を有機合成する以外は、生合成により得られるため、石油資源の枯渇や環境問題に配慮できる。
上記式（１）、上記式（１−１）において、Ｉ−Ｉ部分が開始基質であるアリル性二リン酸誘導体に由来する構造に対応し、（）ｍ部分が酵素反応により伸長した部分の構造に対応する。
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素）
次に、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素について説明する。
上記生物が有するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の一例として、Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す。
次に、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素について説明する。
上記生物が有するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の一例として、Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す。
上記生物が有する酵素（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素）の本来の基質（開始基質）は、アリル性二リン酸である。そして、本発明において開始基質として使用する上記アリル性二リン酸誘導体は、本来、上記生物が生産する酵素の阻害剤として機能するものである。従って、上記生物が生産する酵素では、上記アリル性二リン酸誘導体に対する酵素活性が低い場合が多い。そのため、本発明では、上記アリル性二リン酸誘導体に対する酵素活性を向上させた変異型酵素を使用することが好ましい。
変異型酵素を使用する場合には、遺伝子工学的手法により、変異型酵素を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）を作製すればよい。
本発明者らは、上記Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の変異型酵素を作製し、上記アリル性二リン酸誘導体に対する酵素活性を向上させることに成功した。
本発明者らは、上記Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の変異型酵素を作製し、上記アリル性二リン酸誘導体に対する酵素活性を向上させることに成功した。
本発明者らは、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（特に、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素）において、１番目のアスパラギン酸リッチドメインの５残基上流に位置するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基、特に、親水性のアミノ酸残基（好ましくは、グリシン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸）に置換することにより、上記アリル性二リン酸誘導体に対する酵素活性を増大できることを見出した。上記アリル性二リン酸誘導体は、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団が導入されているため、アリル性二リン酸よりも極性が高い。そのため、上記アリル性二リン酸誘導体に含まれる硫黄原子等の極性の高い部分の近傍に位置するアミノ酸の疎水度を低減することにより、活性が向上するものと推測される。なお、本明細書において、アスパラギン酸リッチドメイン（Ｆｉｒｓｔ Ａｓｐａｒｔａｔｅ−Ｒｉｃｈ Ｍｏｔｉｆ：ＦＡＲＭともいう）とは、ファルネシル二リン酸合成酵素やゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素等のトランス型プレニルニリン酸合成酵素に共通して存在するアスパラギン酸に富んだ２つの領域のうち、上流部位を意味する。
ＦＡＲＭ配列の具体例としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列）の８６位から９２位までのアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列）の８２位から８６位までのアミノ酸配列に見られるＤＤＬＰＳＤ、ＤＤＩＭＤからなるアミノ酸配列が挙げられる。
ＦＡＲＭ配列の具体例としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列）の８６位から９２位までのアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列）の８２位から８６位までのアミノ酸配列に見られるＤＤＬＰＳＤ、ＤＤＩＭＤからなるアミノ酸配列が挙げられる。
具体的には、以下の（１）、（２）のいずれかの変異を行うことが好ましい。
（１）Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアルギニン、セリン、又はアスパラギン酸に置換
（２）Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをグリシン、又はセリンに置換
（１）Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアルギニン、セリン、又はアスパラギン酸に置換
（２）Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをグリシン、又はセリンに置換
具体的には、以下の変異型酵素を作製した。
変異型酵素Ｙ８１Ｒ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアルギニンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号５，６に示す）
変異型酵素Ｙ８１Ｓ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをセリンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号７，８に示す）
変異型酵素Ｙ８１Ｄ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアスパラギン酸に置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号９，１０に示す）
変異型酵素Ｆ７７Ｇ：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをグリシンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１１，１２に示す）
変異型酵素Ｆ７７Ｓ：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをセリンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１３，１４に示す）
変異型酵素のなかでも、Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素のＹ８１Ｄ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のＦ７７Ｇが好ましい。
ここでは、野生型の酵素としてＢａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を用いる場合について説明したが、他のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を野生型の酵素として用いた場合であっても、同様の手法により変異型酵素を作製できる。
変異型酵素Ｙ８１Ｒ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアルギニンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号５，６に示す）
変異型酵素Ｙ８１Ｓ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをセリンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号７，８に示す）
変異型酵素Ｙ８１Ｄ：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の８１位のチロシンをアスパラギン酸に置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号９，１０に示す）
変異型酵素Ｆ７７Ｇ：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをグリシンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１１，１２に示す）
変異型酵素Ｆ７７Ｓ：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の７７位のフェニルアラニンをセリンに置換（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１３，１４に示す）
変異型酵素のなかでも、Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素のＹ８１Ｄ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のＦ７７Ｇが好ましい。
ここでは、野生型の酵素としてＢａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を用いる場合について説明したが、他のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を野生型の酵素として用いた場合であっても、同様の手法により変異型酵素を作製できる。
プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、酵素は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても酵素活性を有する場合があることが知られている。従って、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸（アリル性二リン酸誘導体）と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
（式（３）中、ｐは１〜１０の整数を表す。）
［２］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸（アリル性二リン酸誘導体）と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
なお、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を維持するためには、１〜２５個のアミノ酸、好ましくは１〜１２個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
また、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の活性を有する場合があることが知られている。従って、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
［３］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
なお、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を維持するためには、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法により、当該蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて当該蛋白質を製造する。そして、当該蛋白質を使用して、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒できるか否かをＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等により基質又は生成物の定量、定性を行うことにより確認する方法が挙げられる。
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ）
また、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡとしては、下記［１］〜［３］が挙げられる。
［１］上記［１］〜［３］の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１，３，５，７，９，１１，１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３］配列番号１，３，５，７，９，１１，１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
また、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡとしては、下記［１］〜［３］が挙げられる。
［１］上記［１］〜［３］の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１，３，５，７，９，１１，１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３］配列番号１，３，５，７，９，１１，１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、従来公知の方法により、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる生物体を培養し、得られる培養物から該蛋白質を精製する。そして、当該蛋白質を使用して、アリル性二リン酸誘導体と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒できるか否かをＨＰＬＣ、ＴＬＣ等により基質又は生成物の定量、定性を行うことにより確認する方法が挙げられる。
なお、変異型酵素及び該変異型酵素をコードするＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １０， ６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９， ６４０９（１９８２） 、Ｇｅｎｅ， ３４， ３１５ （１９８５） 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １３， ４４３１ （１９８５） 、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ４８８ （１９８５） 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表される塩基配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列）や配列番号３で表される塩基配列（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の塩基配列）に部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
（形質転換体）
次に、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）の作製方法について簡単に説明する。ここでは、主として上記変異型酵素を発現するように形質転換された形質転換体の作製方法について簡単に説明する。このような形質転換体は、上記設計思想が決定すれば、従来公知の方法により作製することができる。
次に、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）の作製方法について簡単に説明する。ここでは、主として上記変異型酵素を発現するように形質転換された形質転換体の作製方法について簡単に説明する。このような形質転換体は、上記設計思想が決定すれば、従来公知の方法により作製することができる。
変異を導入する場合には、まず、目的の部位に変異を導入できるように、プライマーを設計する。プライマーの塩基配列は、例えば、実施例に記載の塩基配列等が挙げられる。次に、例えば配列番号１で表される塩基配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列）を含むＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、上記プライマーを用いてＰＣＲ法等により変異が導入された直鎖状のＤＮＡを増幅する。そして、得られた直鎖状のＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
また、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、配列番号１で表される塩基配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列）を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入し、該発現ベクターを鋳型ＤＮＡとして、上記プライマーを用いてＰＣＲ法等により変異が導入されたＤＮＡをポリメラーゼにより環状にし、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
なお、変異を導入しない場合には、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、配列番号１で表される塩基配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列）を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入し、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
また、上記説明では、既知の配列番号１で表される塩基配列（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素の塩基配列）を含むＤＮＡを用いる場合について説明したが、上記生物由来の他のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、若しくは上記生物以外の生物由来のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡを用いてもよい。この場合には、公知の手法により、例えば、配列番号１で表される塩基配列の一部をプローブとして用いて、スクリーニングすることにより、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡを特定し、単離すればよい。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
また、上記生物由来のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を上述のような精製操作により、精製し、該精製酵素のアミノ酸配列を決定することにより、該酵素をコードするＤＮＡを特定し、単離してもよい。
また、上記生物由来のプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を上述のような精製操作により、精製し、該精製酵素のアミノ酸配列を決定することにより、該酵素をコードするＤＮＡを特定し、単離してもよい。
宿主細胞としては、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、上記組換え体ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを使用できる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、上記組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３〜ｐＥＴ−５２（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７ （１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８２， ４３０６ （１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０ ［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２ ［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１ （ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９ ［Ｇｅｎｅ， ３３， １０３ （１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３５， ５９４−５９９ （１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５３， ６７４−６７９ （２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ ＭＰ３４７ 、エシェリヒア・コリ ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ） ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ） ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．） ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）］ 、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法 ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ６１２７ （１９８８）］、ヒートショック法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４， １８２ （１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８１， ４８８９ （１９８４）］ 、酢酸リチウム法 ［Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５３， １６３ （１９８３）］ 等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ， ３２９， ８４０ （１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １０１， １３０７ （１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３ （１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）］ 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２， ４５６ （１９７３） に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２） 、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６， ４７ （１９８８） 等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ） 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ） Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）］ 等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）］ 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
宿主としては、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは微生物、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を生成、蓄積させることにより、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を製造することができる。また、必要に応じて、上記精製操作により酵素を精製してもよい。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、上述の培地組成及び培養条件により培養を行えばよい。
（ポリイソプレン）
次に、本発明のポリイソプレンについて説明する。本発明のポリイソプレンは、下記式（４）で表されるポリイソプレンであって、下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されている。本発明のポリイソプレンは、下記式（４）で表されるようにトランス構造部、シス構造部からなる。なお、トランス構造部は、トランス構造のイソプレン単位の繰り返し部（ＩＩ−Ｉ部分と（）ｍ部分を合わせた部分）を意味する。また、シス構造部は、シス構造のイソプレン単位の繰り返し部（下記式（４）中の（）ｑ部分）を意味する。
なお、本明細書において、分子（ゴム分子）の末端部分を変性とは、分子（ゴム分子）の末端に存在する上記式（１）中のＩ−Ｉ部分や下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分の所定の部分に所望の官能基が導入されていること、又は、分子（ゴム分子）の末端に存在する上記式（１）中のＩ−Ｉ部分や下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分の所定の部分に異なる構造が導入されていることをいう。
（式（４）中、ｎは１〜１０の整数を表す。ｍは１〜３０の整数を表す。ｑは３０〜４００００の整数を表す。Ｙは、水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は下記式（２）で表される基を表す。）
次に、本発明のポリイソプレンについて説明する。本発明のポリイソプレンは、下記式（４）で表されるポリイソプレンであって、下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されている。本発明のポリイソプレンは、下記式（４）で表されるようにトランス構造部、シス構造部からなる。なお、トランス構造部は、トランス構造のイソプレン単位の繰り返し部（ＩＩ−Ｉ部分と（）ｍ部分を合わせた部分）を意味する。また、シス構造部は、シス構造のイソプレン単位の繰り返し部（下記式（４）中の（）ｑ部分）を意味する。
なお、本明細書において、分子（ゴム分子）の末端部分を変性とは、分子（ゴム分子）の末端に存在する上記式（１）中のＩ−Ｉ部分や下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分の所定の部分に所望の官能基が導入されていること、又は、分子（ゴム分子）の末端に存在する上記式（１）中のＩ−Ｉ部分や下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分の所定の部分に異なる構造が導入されていることをいう。
本発明のポリイソプレンは、天然ゴムに近い構造を有しており、ゴム分子との相溶性が高い。また、本発明のポリイソプレンは、実質的に分子の末端部分のみに硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団による変性が加えられている。すなわち、本発明のポリイソプレンは、シス構造部の末端に位置する水酸基、ホルミル基、カルボキシ基、エステル基、カルボニル基又は上記式（２）で表される基を有し、さらに、上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているため、ポリイソプレンが本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤との相互作用が強い。このように、本発明のポリイソプレンは、ゴムとの相溶性が高く、さらに、シリカ等の充填剤との相互作用が強いため、ゴム組成物に配合することにより、従来よりも高い次元でゴム分子と充填剤が複合したゴム組成物が得られ、例えば、ゴム組成物の低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）を向上できる。
本発明のポリイソプレンは、シス構造部の末端部分やトランス構造部の末端に近い部分にのみ極性基等が存在する。そのため、主鎖部分に極性基等を有する場合やシス構造部の末端部分のみに極性基等を有する場合に比べて、ポリイソプレンが本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤の分散性が高く、例えば、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）の向上効果が高い。
上記式（４）のｎ、ｍは、上記式（１）のｎ、ｍと同様である。
上記式（４）のｑは、３０〜４００００（好ましくは８００〜３００００、より好ましくは１０００〜２００００）の整数を表す。
上記式（４）のＹは、上記式（１）のＹと同様である。なお、Ｙとしては、シリカ等の充填剤との相互作用が強いことから、水酸基、カルボキシ基が好ましい。
上記式（４）のｑは、３０〜４００００（好ましくは８００〜３００００、より好ましくは１０００〜２００００）の整数を表す。
上記式（４）のＹは、上記式（１）のＹと同様である。なお、Ｙとしては、シリカ等の充填剤との相互作用が強いことから、水酸基、カルボキシ基が好ましい。
上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）としては、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）と同様のものが挙げられる。
また、上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の置換は、上記式（１）について説明した置換と同様である。
上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているが、当該置換は、イソプレンオリゴマーについて説明したのと同様に、下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていないことが好ましい。
（式（４−１）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙは式（４）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙと同一である）
上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分の具体例としては、例えば、上記式（ａ）〜（ｊ）で表される構造が挙げられる。なかでも、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）の向上効果が高いという理由から、上記式（ｅ）、（ｊ）で表される構造が好ましい。
（ポリイソプレンの製造方法）
本発明のポリイソプレンの製造方法としては、例えば、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成する方法が挙げられる。
本発明のポリイソプレンの製造方法としては、例えば、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成する方法が挙げられる。
本発明のポリイソプレンは、開始基質であるアリル性二リン酸誘導体を有機合成する以外は、生合成により得られるため、石油資源の枯渇や環境問題に配慮できる。
従来から、天然ゴムラテックスには、イソプレンオリゴマーとイソペンテニル二リン酸との間の縮合反応を触媒し、イソプレンオリゴマーに順次イソペンテニル二リン酸をＺ型（新たに増えたイソプレン単位がシス構造）に連結していき、ポリイソプレンを生成する以下のような反応を触媒する活性を有する酵素やゴム延長因子等が含まれていることが知られている。
本発明では、この酵素やゴム延長因子等を使用して、ポリイソプレンを製造できる。
すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から本発明のポリイソプレンを生合成する方法としては、例えば、天然ゴムラテックス中に含まれる酵素やゴム延長因子等を用いて行う方法が挙げられる。また、天然ゴムラテックスからクローニングされた酵素やゴム延長因子等を用いて行ってもよい。
すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から本発明のポリイソプレンを生合成する方法としては、例えば、天然ゴムラテックス中に含まれる酵素やゴム延長因子等を用いて行う方法が挙げられる。また、天然ゴムラテックスからクローニングされた酵素やゴム延長因子等を用いて行ってもよい。
すなわち、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸とを上記酵素及び／又は上記ゴム延長因子の存在下で反応させればよい。具体的には、例えば、本発明のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸とを含む溶液中に、天然ゴムラテックスや天然ゴムラテックスから分離した酵素、ゴム延長因子等を添加することにより反応を行えばよい。また、反応温度は、例えば、２０〜４０℃、反応時間は、例えば、１〜７２時間、ｐＨは、例えば、６〜８とすればよい。また、必要に応じて、塩化マグネシウム、界面活性剤、２−メルカプトエタノール等を添加してもよい。
上記反応により得られる本発明のポリイソプレンは、通常、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基又は水酸基である。この水酸基は上記式（２）で表される基が加水分解されることにより生じる。
また、上記式（４）のＹがホルミル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがカルボキシ基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがエステル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがカルボニル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがホルミル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがカルボキシ基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがエステル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化、エステル化することにより得られる。
また、上記式（４）のＹがカルボニル基であるポリイソプレンは、例えば、上記式（４）のＹが上記式（２）で表される基であるポリイソプレンを酸化、エステル化することにより得られる。
上記天然ゴムラテックスの由来は、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、カシワバゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｙｒａｔａ）、ベンジャミンゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｊａｍｉｎａ）、インドボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）、キチチタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｅｕｓ）等が挙げられる。なかでも、生産されているゴムの分子量が大きい、ラテックス中に含まれるゴム分量が多いという理由から、パラゴムノキが好ましい。
天然ゴムラテックスは、例えば、パラゴムノキの幹にナイフ等を用いて溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出する天然ゴムラテックスを回収することにより得られる。
天然ゴムラテックスから分離した酵素、ゴム延長因子とは、例えば、天然ゴムラテックスを遠心分離することにより分離されたしょう液（Ｓｅｒｕｍ）や液低相（ｂｏｔｔｏｍ ｆｒａｃｔｉｏｎ）やゴム相（ｒｕｂｂｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）等が挙げられる。しょう液や液低相やゴム相には、上記酵素や上記ゴム延長因子等が含まれている。
上記式（４）、上記式（４−１）において、ＩＩ−Ｉ部分が開始基質であるアリル性二リン酸誘導体に由来する構造、（）ｍ部分、（）ｑ部分が酵素反応により伸長した部分の構造に対応する。また、ＩＩ−Ｉ部分と（）ｍ部分を合わせた構造は、ポリイソプレンを製造する際に用いたイソプレンオリゴマーに由来する構造に対応する。
（ゴム組成物）
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンオリゴマー及び／又は本発明のポリイソプレンを含む。よって、本発明のゴム組成物は、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）に優れている。なお、本発明のポリイソプレンは、ゴム成分として使用できる。
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンオリゴマー及び／又は本発明のポリイソプレンを含む。よって、本発明のゴム組成物は、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性（特に、耐摩耗性）に優れている。なお、本発明のポリイソプレンは、ゴム成分として使用できる。
本発明のポリイソプレンの含有量は、ゴム成分１００質量％中、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは６０質量％以上であり、１００質量％であってもよい。
本発明のポリイソプレン以外に使用できるゴム成分としては、例えば、イソプレンゴム（ＩＲ）、天然ゴム（ＮＲ）、ブタジエンゴム（ＢＲ）、スチレンブタジエンゴム（ＳＢＲ）、スチレンイソプレンブタジエンゴム（ＳＩＢＲ）、クロロプレンゴム（ＣＲ）、アクリロニトリルブタジエンゴム（ＮＢＲ）等のジエン系ゴムが挙げられる。ゴム成分は、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、ＮＲ、ＢＲが好ましい。
本発明のイソプレンオリゴマーをゴム組成物に配合する場合は、イソプレンオリゴマーとの相溶性が高いという理由から、ゴム成分として、ＮＲを使用することが好ましい。本発明のイソプレンオリゴマーとＮＲを併用することにより、本発明のイソプレンオリゴマーを配合した効果がより好適に得られる。
本発明のイソプレンオリゴマーをゴム組成物に配合する場合、ゴム成分１００質量％中のＮＲの含有量は、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは６０質量％以上であり、１００質量％であってもよい。
本発明のイソプレンオリゴマーの含有量は、ゴム成分１００質量部に対して、好ましくは１質量部以上、より好ましくは２質量部以上である。１質量部未満であると、イソプレンオリゴマーを配合したことにより得られる効果が充分に得られないおそれがある。また、上記イソプレンオリゴマーの含有量は、好ましくは２０質量部以下、より好ましくは１５質量部以下である。２０質量部を超えると、強度が低下し、また耐摩耗性も低下するおそれがある。
本発明で使用できる充填剤としては、例えば、シリカ、カーボンブラック、クレー、炭酸カルシウム等が挙げられる。
本発明では、充填剤としてシリカを使用することが好ましい。シリカを配合することにより、本発明のイソプレンオリゴマー及び／又は本発明のポリイソプレンを配合することにより得られる効果が充分に得られる。シリカとしては特に限定されず、例えば、乾式法シリカ（無水ケイ酸）、湿式法シリカ（含水ケイ酸）等が挙げられるが、シラノール基が多いという理由から、湿式法シリカが好ましい。
また、本発明では、充填剤としてカーボンブラックを使用することも好ましい。この場合にも、本発明のイソプレンオリゴマー及び／又は本発明のポリイソプレンを配合することにより得られる効果が充分に得られる。
本発明のゴム組成物には、前記成分以外にも、ゴム組成物の製造に一般に使用される配合剤、例えば、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、各種老化防止剤、オイル等の軟化剤、ワックス、硫黄等の加硫剤、加硫促進剤などを適宜配合することができる。
本発明のゴム組成物の製造方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、前記各成分をオープンロール、バンバリーミキサーなどのゴム混練装置を用いて混練し、その後加硫する方法等により製造できる。
本発明のゴム組成物は、タイヤの各部材（例えば、トレッド、サイドウォール、アンダートレッド、プライ、ブレーカー、カーカス）等に好適に使用できる。
（空気入りタイヤ）
本発明の空気入りタイヤは、上記ゴム組成物を用いて通常の方法によって製造できる。すなわち、ゴム組成物を未加硫の段階でタイヤの各部材（例えば、トレッド、サイドウォール）の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成形機上にて通常の方法にて成形し、他のタイヤ部材とともに貼り合わせ、未加硫タイヤを形成する。この未加硫タイヤを加硫機中で加熱加圧してタイヤを製造できる。
本発明の空気入りタイヤは、上記ゴム組成物を用いて通常の方法によって製造できる。すなわち、ゴム組成物を未加硫の段階でタイヤの各部材（例えば、トレッド、サイドウォール）の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成形機上にて通常の方法にて成形し、他のタイヤ部材とともに貼り合わせ、未加硫タイヤを形成する。この未加硫タイヤを加硫機中で加熱加圧してタイヤを製造できる。
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
（開始基質の調製）
（製造例１）
（上記式（Ａ）で表される化合物の合成）
上記式（Ａ）で表される化合物（２９）の合成は、下記スキームに示したとおりである。クロロアセトン（３５）に塩基触媒下でエチルメルカプタンを反応させ、ケトン（３６）を得た。このケトン（３６）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、フラッシュカラムを用いて分離精製した。Ｅ体、Ｚ体の構造確認には、１Ｈ−ＮＭＲを用いた。即ち、３位のメチル基のケミカルシフトにおいて、一般に、エステルカルボニル基に対しシス位のメチル基は、トランス位より低磁場に出る。Ｅ体（３７）をＬｉＡｌＨ４で還元し、アルコール（３８）が得られる。また、このアルコールにおいて、３位のメチル基のケミカルシフトは、エステルのときとは逆に、シス位のメチル基がトランス位より高磁場にでる。この事でさらに、Ｅ体、Ｚ体を確認できた。このアルコール（３８）を、Ｐｏｕｌｔｅｒ等の手法により、Ｐｈ３Ｐ存在下ＣＣｌ４にて塩素化し、ＴＨＰ（トリス（テトラ−ｎ−ブチル）アンモニウムハイドロジェン２リン酸）を用いてピロリン酸化し、上記式（Ａ）で表される化合物（２９）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例１）
（上記式（Ａ）で表される化合物の合成）
上記式（Ａ）で表される化合物（２９）の合成は、下記スキームに示したとおりである。クロロアセトン（３５）に塩基触媒下でエチルメルカプタンを反応させ、ケトン（３６）を得た。このケトン（３６）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、フラッシュカラムを用いて分離精製した。Ｅ体、Ｚ体の構造確認には、１Ｈ−ＮＭＲを用いた。即ち、３位のメチル基のケミカルシフトにおいて、一般に、エステルカルボニル基に対しシス位のメチル基は、トランス位より低磁場に出る。Ｅ体（３７）をＬｉＡｌＨ４で還元し、アルコール（３８）が得られる。また、このアルコールにおいて、３位のメチル基のケミカルシフトは、エステルのときとは逆に、シス位のメチル基がトランス位より高磁場にでる。この事でさらに、Ｅ体、Ｚ体を確認できた。このアルコール（３８）を、Ｐｏｕｌｔｅｒ等の手法により、Ｐｈ３Ｐ存在下ＣＣｌ４にて塩素化し、ＴＨＰ（トリス（テトラ−ｎ−ブチル）アンモニウムハイドロジェン２リン酸）を用いてピロリン酸化し、上記式（Ａ）で表される化合物（２９）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例２）
（上記式（Ｂ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｂ）で表される化合物（３０）の合成は、下記スキームに示したとおりである。クロロアセトン（３５）にプロピルメルカプタンを塩基触媒下で反応させ、ケトン（４０）を得た。得られたケトン（４０）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、Ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムで分離精製した。Ｅ体（４１）をＬｉＡｌＨ４で還元しアルコール（４２）を得た。このアルコール（４２）は、常法どおり塩素化し、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｂ）で表される化合物（３０）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｂ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｂ）で表される化合物（３０）の合成は、下記スキームに示したとおりである。クロロアセトン（３５）にプロピルメルカプタンを塩基触媒下で反応させ、ケトン（４０）を得た。得られたケトン（４０）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、Ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムで分離精製した。Ｅ体（４１）をＬｉＡｌＨ４で還元しアルコール（４２）を得た。このアルコール（４２）は、常法どおり塩素化し、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｂ）で表される化合物（３０）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例３）
（上記式（Ｃ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｃ）で表される化合物（３１）の合成法は、下記スキームに示したとおりである。メチルビニルケトン（４４）に塩基触媒下でエチルメルカプタンをＭｉｃｈａｅｌ付加し、ケトン（４５）を得た。このケトン（４５）を、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、Ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムで分離精製した。Ｅ体（４６）をＬｉＡｌＨ４で還元しアルコール（４７）を得た。このアルコール（４７）は、常法どおり塩素化し、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｃ）で表される化合物（３１）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｃ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｃ）で表される化合物（３１）の合成法は、下記スキームに示したとおりである。メチルビニルケトン（４４）に塩基触媒下でエチルメルカプタンをＭｉｃｈａｅｌ付加し、ケトン（４５）を得た。このケトン（４５）を、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともに、Ｗｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムで分離精製した。Ｅ体（４６）をＬｉＡｌＨ４で還元しアルコール（４７）を得た。このアルコール（４７）は、常法どおり塩素化し、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｃ）で表される化合物（３１）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例４）
（上記式（Ｄ）で表される化合物の合成）
他の化合物と同様に上記式（Ｄ）で表される化合物を調製した。
各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｄ）で表される化合物の合成）
他の化合物と同様に上記式（Ｄ）で表される化合物を調製した。
各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例５）
（上記式（Ｅ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｅ）で表される化合物（３４）の合成法を下記スキームに示した。１，１−ジメトキシ−３−ブタノン（５７）を酸触媒下で１，２−エチレンジチオールと反応させ、ケトン（５８）を得た。このケトン（５８）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともにＷｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムにより分離精製された。Ｅ体（５９）をＬｉＡｌＨ４で還元し、アルコール（６０）を得た。このアルコール（６０）は、常法とおりクロロ化され、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｅ）で表される化合物（３４）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｅ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｅ）で表される化合物（３４）の合成法を下記スキームに示した。１，１−ジメトキシ−３−ブタノン（５７）を酸触媒下で１，２−エチレンジチオールと反応させ、ケトン（５８）を得た。このケトン（５８）は、ジエトキシカルボエトキシメチルホスフィンオキシドとともにＷｉｔｔｉｇ反応を行い、Ｅ体、Ｚ体不飽和カルボン酸エステルを得た。Ｅ体、Ｚ体は、カラムにより分離精製された。Ｅ体（５９）をＬｉＡｌＨ４で還元し、アルコール（６０）を得た。このアルコール（６０）は、常法とおりクロロ化され、ＴＨＰを用いてピロリン酸化し、上記式（Ｅ）で表される化合物（３４）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例６）
（上記式（Ｆ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｆ）で表される化合物（１４）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとエタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（６９）を合成した。次いで（６９）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７０）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（７１）を得た。この後は塩化物（７１）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｆ）で表される化合物（１４）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｆ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｆ）で表される化合物（１４）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとエタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（６９）を合成した。次いで（６９）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７０）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（７１）を得た。この後は塩化物（７１）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｆ）で表される化合物（１４）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例７）
（上記式（Ｇ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｇ）で表される化合物（１６）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとブタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（７５）を合成した。次いで（７５）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７６）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（７７）を得た。この後は塩化物（７７）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｇ）で表される化合物（１６）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｇ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｇ）で表される化合物（１６）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとブタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（７５）を合成した。次いで（７５）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７６）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（７７）を得た。この後は塩化物（７７）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｇ）で表される化合物（１６）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例８）
（上記式（Ｈ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｈ）で表される化合物（１７）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとペンタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（７８）を合成した。次いで（７８）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７９）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（８０）を得た。この後は塩化物（８０）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｈ）で表される化合物（１７）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｈ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｈ）で表される化合物（１７）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとペンタンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（７８）を合成した。次いで（７８）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（７９）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（８０）を得た。この後は塩化物（８０）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｈ）で表される化合物（１７）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例９）
（上記式（Ｉ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｉ）で表される化合物（１８）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとヘキサンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（８１）を合成した。次いで（８１）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（８２）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（８３）を得た。この後は塩化物（８３）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｉ）で表される化合物（１８）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｉ）で表される化合物の合成）
上記式（Ｉ）で表される化合物（１８）の合成法を下記スキームに示した。ゲラニオール（２１）とジヒドロピランをピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸（ＰＰＴＳ）触媒下で縮合して、ゲラニオールの水酸基をテトラヒドロピラン環で保護したエーテル（２２）を得た。（２２）に二酸化セレンの触媒として用い、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による酸化反応を行い、選択的に８位の炭素に水酸基を導入しトランス体のアルコール（２３）を得た。（２３）の水酸基を、ジクロロメタン中でＮ−クロロこはく酸イミド（ＮＣＳ）を用いてクロロ化することにより塩化物（２４）を得た。（２４）を金属ナトリウムとヘキサンチオールを用いてスルフィド合成を行いスルフィド（８１）を合成した。次いで（８１）をＰＴＳ触媒下でテトラヒドロピラン環を外し、アルコール（８２）とした。これより先は前述と同じ合成法を用いクロロ化することにより、水酸基を塩素で置換し塩化物（８３）を得た。この後は塩化物（８３）をＴＨＰを用いて二リン酸化して上記式（Ｉ）で表される化合物（１８）を得た。各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（製造例１０）
（上記式（Ｊ）で表される化合物の合成）
他の化合物と同様に上記式（Ｊ）で表される化合物を調製した。
各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
（上記式（Ｊ）で表される化合物の合成）
他の化合物と同様に上記式（Ｊ）で表される化合物を調製した。
各合成段階における中間体および最終生成物の確認は、ＴＬＣおよび機器による分析（ＩＲ、ＮＭＲ）を用いて行った。
＜Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素を使用した実験例＞
（製造例１１）
（変異導入酵素の作製）
Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に示す）に変異を導入し、変異導入酵素の作製を行なった。
試薬はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。目的の部位に変異を導入できるようにプライマーを設計した。なお、変異導入用プライマーは株式会社医学生物学研究所（製造元：ＸＸ ＩＤＴ）より購入した。設計したプライマーは、以下に示すとおりである。
変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ｃａａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｃｇｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃｇ−３’（配列番号１５）
アンチセンスプライマー ５’−ｃｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇｃｇｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔｔｇ−３’（配列番号１６）
変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ｃａａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｃｔｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃｇ−３’（配列番号１７）
アンチセンスプライマー ５’−ｃｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇａｇｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔｔｇ−３’（配列番号１８）
変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｔｃｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃ−３’（配列番号１９）
アンチセンスプライマー ５’−ｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇｇａｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔ−３’（配列番号２０）
（製造例１１）
（変異導入酵素の作製）
Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に示す）に変異を導入し、変異導入酵素の作製を行なった。
試薬はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。目的の部位に変異を導入できるようにプライマーを設計した。なお、変異導入用プライマーは株式会社医学生物学研究所（製造元：ＸＸ ＩＤＴ）より購入した。設計したプライマーは、以下に示すとおりである。
変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ｃａａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｃｇｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃｇ−３’（配列番号１５）
アンチセンスプライマー ５’−ｃｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇｃｇｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔｔｇ−３’（配列番号１６）
変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ｃａａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｃｔｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃｇ−３’（配列番号１７）
アンチセンスプライマー ５’−ｃｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇａｇｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔｔｇ−３’（配列番号１８）
変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａａｔｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａｇａｇｔｃｃｇｔａｔｇｇａｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇｃ−３’（配列番号１９）
アンチセンスプライマー ５’−ｇｃｇａｔｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｔａｃｇｇａｃｔｃｔｔｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔｔ−３’（配列番号２０）
ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅはＢａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（以下、野生型酵素ともいう）が組み込まれたｐＥＸ（ｐＥＸ／ＢＳ−ＦＰＳ）を用いた。
なお、ｐＥＸ／ＢＳ−ＦＰＳは、東北大学多元物質科学研究所の古山種俊教授より譲渡して頂いた。１０ｘ Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを ２μｌ、ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ２−２０ｎｇ、ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ ０．４μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ２０μｌ、Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （２．５Ｕ／μｌ） ０．４ｍｌを混合し、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、９５℃ ３０ ｓｅｃを１サイクル、９５℃ ３０ ｓｅｃ−５５℃ １ ｍｉｎ−６８℃ ８ ｍｉｎを１５サイクル行った。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液にＤｐｎ Ｉを０．４μｌ入れ、３７℃１時間、Ｄｐｎ Ｉ処理を行なった。Ｄｐｎ Ｉ処理液１−１０μｌ を用いヒートショック法によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩培養し、形質転換株を選択した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。該プラスミドは、シークエンサーを用いて変異導入を確認した。
なお、ｐＥＸ／ＢＳ−ＦＰＳは、東北大学多元物質科学研究所の古山種俊教授より譲渡して頂いた。１０ｘ Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを ２μｌ、ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ２−２０ｎｇ、ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ ０．４μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ２０μｌ、Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （２．５Ｕ／μｌ） ０．４ｍｌを混合し、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、９５℃ ３０ ｓｅｃを１サイクル、９５℃ ３０ ｓｅｃ−５５℃ １ ｍｉｎ−６８℃ ８ ｍｉｎを１５サイクル行った。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液にＤｐｎ Ｉを０．４μｌ入れ、３７℃１時間、Ｄｐｎ Ｉ処理を行なった。Ｄｐｎ Ｉ処理液１−１０μｌ を用いヒートショック法によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩培養し、形質転換株を選択した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。該プラスミドは、シークエンサーを用いて変異導入を確認した。
（製造例１２）
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の生産）
得られたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）／ｐＥＸ／ＢＳ−ＦＰＳ（野生型および変異型）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、３７℃で３時間振盪培養後、０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧ を添加し、３０℃で１８時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、およびＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムを用いてプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を精製した。精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を確認した。
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の生産）
得られたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）／ｐＥＸ／ＢＳ−ＦＰＳ（野生型および変異型）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、３７℃で３時間振盪培養後、０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧ を添加し、３０℃で１８時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、およびＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムを用いてプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を精製した。精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を確認した。
（実施例及び比較例）
（イソプレンオリゴマーの調製）
精製した各蛋白質を１０ｍｇ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ ８．５）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、５ ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、製造例１〜１０で調製した各開始基質）、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調整し、５５℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈで３０分反応させた。
反応終了後、塩酸、ヘキサンを加え、攪拌後、静置した。その後、上清（ヘキサン層）をエバポレーションにより濃縮乾固した。その一部をＮＭＲにより構造を確認し、イソプレンオリゴマーを得た。
得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、表１，２に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
なお、式（１）中のｎ、ｍは、使用した開始基質の情報と、ＴＬＣによるイソプレン鎖長を基に算出した。また、Ｙは、ＮＭＲまたＩＲにより構造を同定した。
（イソプレンオリゴマーの調製）
精製した各蛋白質を１０ｍｇ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ ８．５）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、５ ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、製造例１〜１０で調製した各開始基質）、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調整し、５５℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈで３０分反応させた。
反応終了後、塩酸、ヘキサンを加え、攪拌後、静置した。その後、上清（ヘキサン層）をエバポレーションにより濃縮乾固した。その一部をＮＭＲにより構造を確認し、イソプレンオリゴマーを得た。
得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、表１，２に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
なお、式（１）中のｎ、ｍは、使用した開始基質の情報と、ＴＬＣによるイソプレン鎖長を基に算出した。また、Ｙは、ＮＭＲまたＩＲにより構造を同定した。
（実施例及び比較例）
（野生型酵素と変異型酵素の活性の比較（基質別の相対活性））
製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、以下の条件で反応を行い、各開始基質に対する各変異型酵素の活性を野生型酵素（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素）ゲラニル二リン酸に対する活性を１００として指数表示した（表３）。
精製した蛋白質を５００ｎｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（製造例１〜１０で調製した各開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ））、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、５５℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで１５分反応させた。反応後、液体シンチレーションの値とＴＬＣを定量することにより、各酵素の活性を測定した。
（野生型酵素と変異型酵素の活性の比較（基質別の相対活性））
製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、以下の条件で反応を行い、各開始基質に対する各変異型酵素の活性を野生型酵素（Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素）ゲラニル二リン酸に対する活性を１００として指数表示した（表３）。
精製した蛋白質を５００ｎｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（製造例１〜１０で調製した各開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ））、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、５５℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで１５分反応させた。反応後、液体シンチレーションの値とＴＬＣを定量することにより、各酵素の活性を測定した。
（実施例及び比較例）
（ポリイソプレンの調製）
ラテックス成分を１０μｌ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ ｍＭフッ化カリウム、５０ μＭ イソプレンオリゴマー、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸、を含む反応液を調整し、３０℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３日間反応させた。反応後、ＧＰＣにより分子量を測定した。そして、測定した分子量と、使用した開始基質の情報を基に、式（４）中のｎ、ｑを算出した。得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｑ）は、表４，５に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。また、Ｙの同定は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様に行った。
（ポリイソプレンの調製）
ラテックス成分を１０μｌ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ ｍＭフッ化カリウム、５０ μＭ イソプレンオリゴマー、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸、を含む反応液を調整し、３０℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３日間反応させた。反応後、ＧＰＣにより分子量を測定した。そして、測定した分子量と、使用した開始基質の情報を基に、式（４）中のｎ、ｑを算出した。得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｑ）は、表４，５に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。また、Ｙの同定は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様に行った。
なお、ラテックス成分としては、パラゴムノキから得られたラテックスを超遠心分離することにより調製したしょう液を使用した。
なお、使用したイソプレンオリゴマーは、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で、変異型酵素Ｙ８１Ｒ等を用いて、各開始基質（ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、製造例１〜１０で調製した各開始基質）を用いて得られたイソプレンオリゴマーを使用した。
なお、以下の表４、５において、開始基質として、ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物、上記式（Ｃ）で表される化合物、上記式（Ｄ）で表される化合物、上記式（Ｅ）で表される化合物、上記式（Ｆ）で表される化合物、上記式（Ｇ）で表される化合物、上記式（Ｈ）で表される化合物、上記式（Ｉ）で表される化合物、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で変異型酵素Ｙ８１Ｒ等を使用して得られたイソプレンオリゴマーをそれぞれ、イソプレンオリゴマー（ＧＰＰ）、イソプレンオリゴマー（ＤＭＡＰＰ）、イソプレンオリゴマー（Ａ）、イソプレンオリゴマー（Ｂ）、イソプレンオリゴマー（Ｃ）、イソプレンオリゴマー（Ｄ）、イソプレンオリゴマー（Ｅ）、イソプレンオリゴマー（Ｆ）、イソプレンオリゴマー（Ｇ）、イソプレンオリゴマー（Ｈ）、イソプレンオリゴマー（Ｉ）、イソプレンオリゴマー（Ｊ）とする。
なお、以下の表４、５において、開始基質として、ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物、上記式（Ｃ）で表される化合物、上記式（Ｄ）で表される化合物、上記式（Ｅ）で表される化合物、上記式（Ｆ）で表される化合物、上記式（Ｇ）で表される化合物、上記式（Ｈ）で表される化合物、上記式（Ｉ）で表される化合物、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で変異型酵素Ｙ８１Ｒ等を使用して得られたイソプレンオリゴマーをそれぞれ、イソプレンオリゴマー（ＧＰＰ）、イソプレンオリゴマー（ＤＭＡＰＰ）、イソプレンオリゴマー（Ａ）、イソプレンオリゴマー（Ｂ）、イソプレンオリゴマー（Ｃ）、イソプレンオリゴマー（Ｄ）、イソプレンオリゴマー（Ｅ）、イソプレンオリゴマー（Ｆ）、イソプレンオリゴマー（Ｇ）、イソプレンオリゴマー（Ｈ）、イソプレンオリゴマー（Ｉ）、イソプレンオリゴマー（Ｊ）とする。
次に、本発明のイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンをゴム組成物に配合し、性能評価を行うために、まず、当該評価に供するイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンを調製した。基本的には、上述の実施例（イソプレンオリゴマーの調製）、実施例（ポリイソプレンの調製）に従って調製したが、得られるイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンの分子量を調整するために、上述の（イソプレンオリゴマーの調整）、（ポリイソプレンの調製）に記載の条件を調整して反応を行った。
（製造例１３）
（ゴム組成物評価用のイソプレンオリゴマーの調製）
まず、製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、イソプレンオリゴマーの調製を行なった。なお、得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ、Ｙ）は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の方法により決定した。
（ゴム組成物評価用のイソプレンオリゴマーの調製）
まず、製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、イソプレンオリゴマーの調製を行なった。なお、得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ、Ｙ）は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の方法により決定した。
（イソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）の調製）
開始基質として、ゲラニル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、ゲラニル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）の調製）
開始基質として、ジメチルアリル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、ジメチルアリル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ａ）の調製）
開始基質として、上記式（Ａ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ａ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ａ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ａ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ａ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ａ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｂ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｂ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｂ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｂ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｂ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｂ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｂ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｃ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｃ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｃ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｃ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｃ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｃ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｃ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｄ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｄ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｄ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｄ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｄ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｄ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｄ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｅ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｅ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｅ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｅ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｅ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｅ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｅ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｆ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｆ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｆ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｆ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｆ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｆ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｆ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｇ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｇ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｇ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｇ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｇ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｇ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｇ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｈ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｈ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｈ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｈ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｈ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｈ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｈ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｉ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｉ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｉ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｉ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｉ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（１−Ｊ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｊ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｊ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（１−Ｊ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（１−Ｊ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（製造例１４）
（ゴム組成物評価用のポリイソプレンの調製）
次に、製造例１３で得られたイソプレンオリゴマーを用いて、ポリイソプレンを調製した。なお、得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙ）は、実施例（ポリイソプレンの調製）と同様の方法により決定した。
（ゴム組成物評価用のポリイソプレンの調製）
次に、製造例１３で得られたイソプレンオリゴマーを用いて、ポリイソプレンを調製した。なお、得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙ）は、実施例（ポリイソプレンの調製）と同様の方法により決定した。
（ポリイソプレン（１−ＧＰＰ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（１−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−ＧＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−ＧＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（１−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−ＧＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−ＤＭＡＰＰ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（１−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−ＤＭＡＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（１−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ａ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ａ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ａ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ａ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ａ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ａ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ａ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｂ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｂ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｂ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｂ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｂ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｂ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｂ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｃ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｃ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｃ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｃ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｃ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｃ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｃ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｄ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｄ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｄ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｄ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｄ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｄ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｄ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｅ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｅ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｅ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｅ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｅ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｅ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｅ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｆ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｆ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｆ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｆ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝４０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｆ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｆ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｆ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝４０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｇ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｇ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｇ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｇ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝２、ｑ＝１５００〜７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｇ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｇ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｇ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝２、ｑ＝１５００〜７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｈ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｈ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｈ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｈ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝２０００〜７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｈ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｈ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｈ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝２０００〜７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｉ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｉ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｉ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｉ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｉ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｉ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｉ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（１−Ｊ）の調製）
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｊ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｊ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｊ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１３で調製したイソプレンオリゴマー（１−Ｊ）を用いて、ポリイソプレン（１−Ｊ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（１−Ｊ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
＜Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を使用した実験例＞
（製造例１５）
（変異導入酵素の作製）
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す）に変異を導入し、変異導入酵素の作製を行なった。
試薬はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。目的の部位に変異を導入できるようにプライマーを設計した。なお、変異導入用プライマーは株式会社医学生物学研究所（製造元：ＸＸ ＩＤＴ）より購入した。設計したプライマーは、以下に示すとおりである。
変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａｔａａｔａｔｃａｔｃａｔｇｃａｃａａｇｃｇｔａｃｃａｇｔａｔｇａａｇａａｃｔｔｃａａｔａｇｃｔｇｃａ−３’（配列番号２１）
アンチセンスプライマー ５’−ｔｇｃａｇｃｔａｔｔｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｔａｃｔｇｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｔｇａｔａｔｔａｔ−３’（配列番号２２）
変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａｔａａｔａｔｃａｔｃａｔｇｃａｃａａｇｃｇｔａｃｔａｇｔａｔｇａａｇａａｃｔｔｃａａｔａｇｃｔｇｃａ−３’（配列番号２３）
アンチセンスプライマー ５’−ｔｇｃａｇｃｔａｔｔｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｔａｃｔａｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｔｇａｔａｔｔａｔ−３’（配列番号２４）
（製造例１５）
（変異導入酵素の作製）
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す）に変異を導入し、変異導入酵素の作製を行なった。
試薬はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。目的の部位に変異を導入できるようにプライマーを設計した。なお、変異導入用プライマーは株式会社医学生物学研究所（製造元：ＸＸ ＩＤＴ）より購入した。設計したプライマーは、以下に示すとおりである。
変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａｔａａｔａｔｃａｔｃａｔｇｃａｃａａｇｃｇｔａｃｃａｇｔａｔｇａａｇａａｃｔｔｃａａｔａｇｃｔｇｃａ−３’（配列番号２１）
アンチセンスプライマー ５’−ｔｇｃａｇｃｔａｔｔｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｔａｃｔｇｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｔｇａｔａｔｔａｔ−３’（配列番号２２）
変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用プライマー
センスプライマー ５’−ａｔａａｔａｔｃａｔｃａｔｇｃａｃａａｇｃｇｔａｃｔａｇｔａｔｇａａｇａａｃｔｔｃａａｔａｇｃｔｇｃａ−３’（配列番号２３）
アンチセンスプライマー ５’−ｔｇｃａｇｃｔａｔｔｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｔａｃｔａｇｔａｃｇｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｔｇａｔａｔｔａｔ−３’（配列番号２４）
ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（以下、野生型酵素ともいう）が組み込まれたｐＵＣ１１９（ｐＵＣ１１９／ＳＡ−ＧＧＰＳ）を用いた。
なお、ｐＵＣ１１９／ＳＡ−ＧＧＰＳは、東北大学工学部の西野徳三教授より譲渡して頂いた。１０ｘ Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを ２μｌ、ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ２−２０ｎｇ、ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ ０．４μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ２０μｌ、Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （２．５Ｕ／μｌ） ０．４ｍｌを混合し、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、９５℃ ３０ ｓｅｃを１サイクル、９５℃ ３０ ｓｅｃ−５５℃ １ ｍｉｎ−６８℃ ８ ｍｉｎを１５サイクル行った。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液にＤｐｎ Ｉを０．４μｌ入れ、３７℃１時間、Ｄｐｎ Ｉ処理を行なった。Ｄｐｎ Ｉ処理液１−１０μｌ を用いヒートショック法によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩培養し、形質転換株を選択した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。該プラスミドは、シークエンサーを用いて変異導入を確認した。
なお、ｐＵＣ１１９／ＳＡ−ＧＧＰＳは、東北大学工学部の西野徳三教授より譲渡して頂いた。１０ｘ Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを ２μｌ、ｄｓＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ２−２０ｎｇ、ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５０ｎｇ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ ０．４μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ２０μｌ、Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （２．５Ｕ／μｌ） ０．４ｍｌを混合し、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、９５℃ ３０ ｓｅｃを１サイクル、９５℃ ３０ ｓｅｃ−５５℃ １ ｍｉｎ−６８℃ ８ ｍｉｎを１５サイクル行った。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液にＤｐｎ Ｉを０．４μｌ入れ、３７℃１時間、Ｄｐｎ Ｉ処理を行なった。Ｄｐｎ Ｉ処理液１−１０μｌ を用いヒートショック法によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩培養し、形質転換株を選択した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。該プラスミドは、シークエンサーを用いて変異導入を確認した。
（製造例１６）
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の生産）
得られたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）／ｐＵＣ１１９／ＳＡ−ＧＧＰＳ（野生型および変異型）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、３７℃で３時間振盪培養後、０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧ を添加し、３０℃で１８時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、およびＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムを用いてプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を精製した。精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を確認した。
（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の生産）
得られたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）／ｐＵＣ１１９／ＳＡ−ＧＧＰＳ（野生型および変異型）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、３７℃で３時間振盪培養後、０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧ を添加し、３０℃で１８時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、およびＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムを用いてプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を精製した。精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を確認した。
（実施例及び比較例）
（イソプレンオリゴマーの調製）
精製した各蛋白質を１０ｍｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５ ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、製造例１〜１０で調製した各開始基質）、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調整し、５５℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈで３０分反応させた。
反応終了後、塩酸、ヘキサンを加え、攪拌後、静置した。その後、上清（ヘキサン層）をエバポレーションにより濃縮乾固した。その一部をＮＭＲにより構造を確認し、イソプレンオリゴマーを得た。
得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、表６，７に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
なお、式（１）中のｎ、ｍは、使用した開始基質の情報と、ＴＬＣによるイソプレン鎖長を基に算出した。また、Ｙは、ＮＭＲまたＩＲにより構造を同定した。
（イソプレンオリゴマーの調製）
精製した各蛋白質を１０ｍｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５ ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、製造例１〜１０で調製した各開始基質）、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調整し、５５℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈで３０分反応させた。
反応終了後、塩酸、ヘキサンを加え、攪拌後、静置した。その後、上清（ヘキサン層）をエバポレーションにより濃縮乾固した。その一部をＮＭＲにより構造を確認し、イソプレンオリゴマーを得た。
得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、表６，７に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
なお、式（１）中のｎ、ｍは、使用した開始基質の情報と、ＴＬＣによるイソプレン鎖長を基に算出した。また、Ｙは、ＮＭＲまたＩＲにより構造を同定した。
（実施例及び比較例）
（野生型酵素と変異型酵素の活性の比較（基質別の相対活性））
製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、以下の条件で反応を行い、各開始基質に対する各変異型酵素の活性を野生型酵素（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素）の活性を１００として指数表示した（表８）。
精製した蛋白質を５００ｎｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（製造例１〜１０で調製した各開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ））、１ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、５５℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３０分反応させた。反応後、液体シンチレーションの値とＴＬＣを定量することにより、各酵素の活性を測定した。
（野生型酵素と変異型酵素の活性の比較（基質別の相対活性））
製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、以下の条件で反応を行い、各開始基質に対する各変異型酵素の活性を野生型酵素（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素）の活性を１００として指数表示した（表８）。
精製した蛋白質を５００ｎｇ、５０ ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ５．８）、５０ ｍＭ 塩化アンモニウム、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２５ ｍＭ 開始基質（製造例１〜１０で調製した各開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ））、１ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、５５℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３０分反応させた。反応後、液体シンチレーションの値とＴＬＣを定量することにより、各酵素の活性を測定した。
（実施例及び比較例）
（ポリイソプレンの調製）
ラテックス成分を１０μｌ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ ｍＭフッ化カリウム、５０ μＭ イソプレンオリゴマー、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸、を含む反応液を調整し、３０℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３日間反応させた。反応後、ＧＰＣにより分子量を測定した。そして、測定した分子量と、使用した開始基質の情報を基に、式（４）中のｎ、ｑを算出した。得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｑ）は、表９，１０に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。また、Ｙの同定は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様に行った。
（ポリイソプレンの調製）
ラテックス成分を１０μｌ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．５）、２．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ ｍＭフッ化カリウム、５０ μＭ イソプレンオリゴマー、２５ ｍＭ ［１−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸、を含む反応液を調整し、３０℃のｗａｔｅｒｂａｔｈで３日間反応させた。反応後、ＧＰＣにより分子量を測定した。そして、測定した分子量と、使用した開始基質の情報を基に、式（４）中のｎ、ｑを算出した。得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｑ）は、表９，１０に示す通りであった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。また、Ｙの同定は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様に行った。
なお、ラテックス成分としては、パラゴムノキから得られたラテックスを超遠心分離することにより調製したしょう液を使用した。
なお、使用したイソプレンオリゴマーは、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で、変異型酵素Ｆ７７Ｇ等を用いて、各開始基質（ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、製造例１〜１０で調製した各開始基質）を用いて得られたイソプレンオリゴマーを使用した。
なお、以下の表９、１０において、開始基質として、ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物、上記式（Ｃ）で表される化合物、上記式（Ｄ）で表される化合物、上記式（Ｅ）で表される化合物、上記式（Ｆ）で表される化合物、上記式（Ｇ）で表される化合物、上記式（Ｈ）で表される化合物、上記式（Ｉ）で表される化合物、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で変異型酵素Ｆ７７Ｇ等を使用して得られたイソプレンオリゴマーをそれぞれ、イソプレンオリゴマー（ＧＰＰ）、イソプレンオリゴマー（ＤＭＡＰＰ）、イソプレンオリゴマー（Ａ）、イソプレンオリゴマー（Ｂ）、イソプレンオリゴマー（Ｃ）、イソプレンオリゴマー（Ｄ）、イソプレンオリゴマー（Ｅ）、イソプレンオリゴマー（Ｆ）、イソプレンオリゴマー（Ｇ）、イソプレンオリゴマー（Ｈ）、イソプレンオリゴマー（Ｉ）、イソプレンオリゴマー（Ｊ）とする。
なお、以下の表９、１０において、開始基質として、ゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物、上記式（Ｃ）で表される化合物、上記式（Ｄ）で表される化合物、上記式（Ｅ）で表される化合物、上記式（Ｆ）で表される化合物、上記式（Ｇ）で表される化合物、上記式（Ｈ）で表される化合物、上記式（Ｉ）で表される化合物、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の条件で変異型酵素Ｆ７７Ｇ等を使用して得られたイソプレンオリゴマーをそれぞれ、イソプレンオリゴマー（ＧＰＰ）、イソプレンオリゴマー（ＤＭＡＰＰ）、イソプレンオリゴマー（Ａ）、イソプレンオリゴマー（Ｂ）、イソプレンオリゴマー（Ｃ）、イソプレンオリゴマー（Ｄ）、イソプレンオリゴマー（Ｅ）、イソプレンオリゴマー（Ｆ）、イソプレンオリゴマー（Ｇ）、イソプレンオリゴマー（Ｈ）、イソプレンオリゴマー（Ｉ）、イソプレンオリゴマー（Ｊ）とする。
次に、本発明のイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンをゴム組成物に配合し、性能評価を行うために、まず、当該評価に供するイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンを調製した。基本的には、上述の実施例（イソプレンオリゴマーの調製）、実施例（ポリイソプレンの調製）に従って調製したが、得られるイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンの分子量を調整するために、上述の（イソプレンオリゴマーの調整）、（ポリイソプレンの調製）に記載の条件を調整して反応を行った。
（製造例１７）
（ゴム組成物評価用のイソプレンオリゴマーの調製）
まず、製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、イソプレンオリゴマーの調製を行なった。なお、得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ、Ｙ）は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の方法により決定した。
（ゴム組成物評価用のイソプレンオリゴマーの調製）
まず、製造例１〜１０で調製した開始基質、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いて、イソプレンオリゴマーの調製を行なった。なお、得られたイソプレンオリゴマーの詳細（式（１）中のｎ、ｍ、Ｙ）は、実施例（イソプレンオリゴマーの調製）と同様の方法により決定した。
（イソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）の調製）
開始基質として、ゲラニル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、ゲラニル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）の調製）
開始基質として、ジメチルアリル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、ジメチルアリル二リン酸を用いて、イソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝２であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ａ）の調製）
開始基質として、上記式（Ａ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ａ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ａ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ａ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ａ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ａ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｂ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｂ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｂ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｂ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｂ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｂ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｂ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｃ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｃ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｃ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｃ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｃ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｃ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｃ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｄ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｄ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｄ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｄ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｄ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｄ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｄ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｅ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｅ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｅ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｅ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｅ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｅ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｅ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝２、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｆ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｆ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｆ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｆ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｆ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｆ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｆ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｇ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｇ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｇ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｇ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｇ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｇ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｇ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｈ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｈ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｈ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｈ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｈ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｈ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｈ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｉ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｉ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｉ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｉ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｉ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（イソプレンオリゴマー（２−Ｊ）の調製）
開始基質として、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｊ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｊ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
開始基質として、上記式（Ｊ）で表される化合物を用いて、イソプレンオリゴマー（２−Ｊ）の調製を行った。得られたイソプレンオリゴマー（２−Ｊ）の詳細（式（１）中のｎ、ｍ）は、ｎ＝３、ｍ＝１であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（製造例１８）
（ゴム組成物評価用のポリイソプレンの調製）
次に、製造例１７で得られたイソプレンオリゴマーを用いて、ポリイソプレンを調製した。なお、得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙ）は、実施例（ポリイソプレンの調製）と同様の方法により決定した。
（ゴム組成物評価用のポリイソプレンの調製）
次に、製造例１７で得られたイソプレンオリゴマーを用いて、ポリイソプレンを調製した。なお、得られたポリイソプレンの詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ、Ｙ）は、実施例（ポリイソプレンの調製）と同様の方法により決定した。
（ポリイソプレン（２−ＧＰＰ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（２−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−ＧＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−ＧＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（２−ＧＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−ＧＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−ＤＭＡＰＰ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（２−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−ＤＭＡＰＰ）を用いて、ポリイソプレン（２−ＤＭＡＰＰ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−ＤＭＡＰＰ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝２、ｑ＝３０００〜１５０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ａ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ａ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ａ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ａ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜１８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ａ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ａ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ａ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜１８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｂ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｂ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｂ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｂ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｂ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｂ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｂ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｃ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｃ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｃ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｃ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｃ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｃ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｃ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｄ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｄ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｄ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｄ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｄ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｄ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｄ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｅ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｅ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｅ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｅ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｅ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｅ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｅ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝２、ｍ＝１、ｑ＝１０００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｆ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｆ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｆ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｆ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝８００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｆ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｆ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｆ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝８００〜８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｇ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｇ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｇ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｇ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｇ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｇ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｇ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１２０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｈ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｈ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｈ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｈ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｈ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｈ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｈ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝３０００〜１７０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｉ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｉ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｉ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｉ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｉ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｉ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｉ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝１５００〜１００００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
（ポリイソプレン（２−Ｊ）の調製）
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｊ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｊ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｊ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝４５００〜１８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
製造例１７で調製したイソプレンオリゴマー（２−Ｊ）を用いて、ポリイソプレン（２−Ｊ）の調製を行った。得られたポリイソプレン（２−Ｊ）の詳細（式（４）中のｎ、ｍ、ｑ）は、ｎ＝３、ｍ＝１、ｑ＝４５００〜１８０００であった。なお、Ｙは、水酸基、又は上記式（２）で表される基であった。
<ゴム組成物の評価>
次に、本発明のイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンをゴム組成物に配合し、性能評価を行った。
次に、本発明のイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンをゴム組成物に配合し、性能評価を行った。
以下、実施例１〜４０及び比較例１〜４で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＲ：ＴＳＲ２０
ＢＲ：ＪＳＲ（株）製のＢＲ０１
カーボンブラック：三菱化学（株）製のダイヤブラック（Ｎ２２０）
イソプレンオリゴマー：製造例１３、１７で得られたイソプレンオリゴマー
ポリイソプレン：製造例１４、１８で得られたポリイソプレン
酸化亜鉛：三井金属鉱業（株）製の酸化亜鉛１号
ステアリン酸：日油（株）製のステアリン酸
老化防止剤：大内新興化学工業（株）製のノクラック６Ｃ（Ｎ−（１，３−ジメチルブチル）−Ｎ’−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン）
ワックス：大内新興化学工業（株）製のサンノックワックス
硫黄：鶴見化学（株）製の粉末硫黄
加硫促進剤ＮＳ：大内新興化学工業（株）製のノクセラ−ＮＳ（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ベンゾチアジルスルフェンアミド）
シリカ：日本シリカ（株）製のニップシールＡＱ（湿式シリカ）
シランカップリング剤：デグッサ社製のＳｉ２６６（ビス（３−トリエトキシシリルプロピル）ジスルフィド）
加硫促進剤ＤＰＧ：大内新興化学工業（株）製のノクセラーＤ（Ｎ，Ｎ−ジフェニルグアニジン）
ＮＲ：ＴＳＲ２０
ＢＲ：ＪＳＲ（株）製のＢＲ０１
カーボンブラック：三菱化学（株）製のダイヤブラック（Ｎ２２０）
イソプレンオリゴマー：製造例１３、１７で得られたイソプレンオリゴマー
ポリイソプレン：製造例１４、１８で得られたポリイソプレン
酸化亜鉛：三井金属鉱業（株）製の酸化亜鉛１号
ステアリン酸：日油（株）製のステアリン酸
老化防止剤：大内新興化学工業（株）製のノクラック６Ｃ（Ｎ−（１，３−ジメチルブチル）−Ｎ’−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン）
ワックス：大内新興化学工業（株）製のサンノックワックス
硫黄：鶴見化学（株）製の粉末硫黄
加硫促進剤ＮＳ：大内新興化学工業（株）製のノクセラ−ＮＳ（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ベンゾチアジルスルフェンアミド）
シリカ：日本シリカ（株）製のニップシールＡＱ（湿式シリカ）
シランカップリング剤：デグッサ社製のＳｉ２６６（ビス（３−トリエトキシシリルプロピル）ジスルフィド）
加硫促進剤ＤＰＧ：大内新興化学工業（株）製のノクセラーＤ（Ｎ，Ｎ−ジフェニルグアニジン）
実施例１〜４０及び比較例１〜４
表１１〜１４に示す配合処方にしたがい、１．７Ｌバンバリーミキサーを用いて、硫黄及び加硫促進剤以外の材料を混練りし、混練り物を得た。次に、得られた混練り物に硫黄及び加硫促進剤を添加し、オープンロールを用いて練り込み、未加硫ゴム組成物を得た。得られた未加硫ゴム組成物をスチーム加硫プレスを用いて圧力８０ｋｇｆ／ｃｍ２にて１５０℃で３０分間加硫し、加硫ゴム組成物を得た。
表１１〜１４に示す配合処方にしたがい、１．７Ｌバンバリーミキサーを用いて、硫黄及び加硫促進剤以外の材料を混練りし、混練り物を得た。次に、得られた混練り物に硫黄及び加硫促進剤を添加し、オープンロールを用いて練り込み、未加硫ゴム組成物を得た。得られた未加硫ゴム組成物をスチーム加硫プレスを用いて圧力８０ｋｇｆ／ｃｍ２にて１５０℃で３０分間加硫し、加硫ゴム組成物を得た。
得られた加硫ゴム組成物について下記の評価を行った。結果を表１１〜１４に示す。なお、表１１、１２の基準配合は比較例２、表１３、１４の基準配合は比較例４とした。
（粘弾性試験）
（株）岩本製作所製の粘弾性スペクトロメーターを用いて、７０℃、歪み２％時（初期伸度）の条件でｔａｎδの測定を行ない、基準配合のｔａｎδを１００として指数表示した。指数が大きいほど発熱が大きいことを表す。指数が１００以下のとき、耐発熱性（低発熱性）は向上したものとみなした。すなわち、指数が小さいほど低発熱性に優れることを示す。
（株）岩本製作所製の粘弾性スペクトロメーターを用いて、７０℃、歪み２％時（初期伸度）の条件でｔａｎδの測定を行ない、基準配合のｔａｎδを１００として指数表示した。指数が大きいほど発熱が大きいことを表す。指数が１００以下のとき、耐発熱性（低発熱性）は向上したものとみなした。すなわち、指数が小さいほど低発熱性に優れることを示す。
（ランボーン摩耗試験）
（株）岩本製作所製のランボーン摩耗試験機を用いて、荷重３ｋｇ、スリップ率４０％および砂量１５ｇ／分の条件で５分間摩耗試験を実施した。サンプルの形状は厚さ５ｍｍ、直径５０ｍｍとし、砥石は、粒度＃８０のＧＣタイプ砥粒を使用した。試験結果を、基準配合を１００（基準）として指数化した。指数が大きいほど耐摩耗性に優れ、指数が１００を超えるとき耐摩耗性は向上したものとみなした。
（株）岩本製作所製のランボーン摩耗試験機を用いて、荷重３ｋｇ、スリップ率４０％および砂量１５ｇ／分の条件で５分間摩耗試験を実施した。サンプルの形状は厚さ５ｍｍ、直径５０ｍｍとし、砥石は、粒度＃８０のＧＣタイプ砥粒を使用した。試験結果を、基準配合を１００（基準）として指数化した。指数が大きいほど耐摩耗性に優れ、指数が１００を超えるとき耐摩耗性は向上したものとみなした。
（引張試験）
ＪＩＳ Ｋ６２５１「加硫ゴムおよび熱可塑性ゴム−引張特性の求め方」に準じて、上記加硫ゴムシートからなる３号ダンベル型試験片を用いて引張試験を実施し、破断強度（ＴＢ）（ＭＰａ）、破断時伸び（ＥＢ）（％）を測定した。試験結果を、基準配合を１００（基準）として指数化した。破断強度、破断時伸び共に指数が大きいほど、破断強度、破断時伸びに優れることを示す。
ＪＩＳ Ｋ６２５１「加硫ゴムおよび熱可塑性ゴム−引張特性の求め方」に準じて、上記加硫ゴムシートからなる３号ダンベル型試験片を用いて引張試験を実施し、破断強度（ＴＢ）（ＭＰａ）、破断時伸び（ＥＢ）（％）を測定した。試験結果を、基準配合を１００（基準）として指数化した。破断強度、破断時伸び共に指数が大きいほど、破断強度、破断時伸びに優れることを示す。
表１１、１２より、上記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているイソプレンオリゴマーを使用した実施例では、低発熱性、耐摩耗性、破断時伸び（特に、耐摩耗性）に優れていた。
表１３、１４より、上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているポリイソプレンを使用した実施例では、低発熱性、耐摩耗性、破断強度（特に、耐摩耗性）に優れていた。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（野生型酵素）の塩基配列
配列番号２：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（野生型酵素）のアミノ酸配列
配列番号３：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（野生型酵素）の塩基配列
配列番号４：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（野生型酵素）のアミノ酸配列
配列番号５：変異型酵素Ｙ８１Ｒの塩基配列
配列番号６：変異型酵素Ｙ８１Ｒのアミノ酸配列
配列番号７：変異型酵素Ｙ８１Ｓの塩基配列
配列番号８：変異型酵素Ｙ８１Ｓのアミノ酸配列
配列番号９：変異型酵素Ｙ８１Ｄの塩基配列
配列番号１０：変異型酵素Ｙ８１Ｄのアミノ酸配列
配列番号１１：変異型酵素Ｆ７７Ｇの塩基配列
配列番号１２：変異型酵素Ｆ７７Ｇのアミノ酸配列
配列番号１３：変異型酵素Ｆ７７Ｓの塩基配列
配列番号１４：変異型酵素Ｆ７７Ｓのアミノ酸配列
配列番号１５：変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用センスプライマー
配列番号１６：変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用アンチセンスプライマー
配列番号１７：変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用センスプライマー
配列番号１８：変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用アンチセンスプライマー
配列番号１９：変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用センスプライマー
配列番号２０：変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用アンチセンスプライマー
配列番号２１：変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用センスプライマー
配列番号２２：変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用アンチセンスプライマー
配列番号２３：変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用センスプライマー
配列番号２４：変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用アンチセンスプライマー
配列番号１：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（野生型酵素）の塩基配列
配列番号２：Ｂａｃｈｉｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ファルネシル二リン酸合成酵素（野生型酵素）のアミノ酸配列
配列番号３：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（野生型酵素）の塩基配列
配列番号４：Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（野生型酵素）のアミノ酸配列
配列番号５：変異型酵素Ｙ８１Ｒの塩基配列
配列番号６：変異型酵素Ｙ８１Ｒのアミノ酸配列
配列番号７：変異型酵素Ｙ８１Ｓの塩基配列
配列番号８：変異型酵素Ｙ８１Ｓのアミノ酸配列
配列番号９：変異型酵素Ｙ８１Ｄの塩基配列
配列番号１０：変異型酵素Ｙ８１Ｄのアミノ酸配列
配列番号１１：変異型酵素Ｆ７７Ｇの塩基配列
配列番号１２：変異型酵素Ｆ７７Ｇのアミノ酸配列
配列番号１３：変異型酵素Ｆ７７Ｓの塩基配列
配列番号１４：変異型酵素Ｆ７７Ｓのアミノ酸配列
配列番号１５：変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用センスプライマー
配列番号１６：変異型酵素Ｙ８１Ｒ作製用アンチセンスプライマー
配列番号１７：変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用センスプライマー
配列番号１８：変異型酵素Ｙ８１Ｓ作製用アンチセンスプライマー
配列番号１９：変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用センスプライマー
配列番号２０：変異型酵素Ｙ８１Ｄ作製用アンチセンスプライマー
配列番号２１：変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用センスプライマー
配列番号２２：変異型酵素Ｆ７７Ｇ作製用アンチセンスプライマー
配列番号２３：変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用センスプライマー
配列番号２４：変異型酵素Ｆ７７Ｓ作製用アンチセンスプライマー
Claims (15)
- 下記式（１）で表されるイソプレンオリゴマーであって、下記式（１）中のＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているイソプレンオリゴマー。
- 下記式（１−１）中のＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（１−１）中のＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていない請求項１記載のイソプレンオリゴマー。
- 上記式（１）中のＩ−Ｉ部分が下記式（ａ）〜（ｊ）のいずれかである請求項１記載のイソプレンオリゴマー。
- 下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸から生合成されて得られる請求項１〜３のいずれかに記載のイソプレンオリゴマー。
- 前記生合成をプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて行う請求項４記載のイソプレンオリゴマー。
- 前記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質である請求項５記載のイソプレンオリゴマー。
［１］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
［３］配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸との反応を触媒する活性を有する蛋白質
- 下記式（３）で表され、下記式（３）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているアリル性二リン酸と、イソペンテニル二リン酸から生合成する請求項１〜３のいずれかに記載のイソプレンオリゴマーの製造方法。
- 前記生合成をプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて行う請求項７記載のイソプレンオリゴマーの製造方法。
- 下記式（４）で表されるポリイソプレンであって、下記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが、硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団により置換されているポリイソプレン。
- 下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが硫黄原子又は硫黄原子を含む原子団に置換され、下記式（４−１）中のＩＩ−ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は置換されていない請求項９記載のポリイソプレン。
- 上記式（４）中のＩＩ−Ｉ部分が下記式（ａ）〜（ｊ）のいずれかである請求項９記載のポリイソプレン。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成されて得られる請求項９〜１１のいずれかに記載のポリイソプレン。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のイソプレンオリゴマーと、イソペンテニル二リン酸から生合成する請求項９〜１１のいずれかに記載のポリイソプレンの製造方法。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のイソプレンオリゴマー及び／又は請求項９〜１１のいずれかに記載のポリイソプレンを含むゴム組成物。
- 請求項１４記載のゴム組成物を用いて作製した空気入りタイヤ。
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