CN105378073A - 用于改善的病毒生产的禽类细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供禽类细胞,其中一种或多种以下基因或其同系物的表达或活性被降低:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。本发明还提供用于在具有降低的一种或多种IFITM基因表达的禽类细胞,胚胎和/或禽类细胞系中传代病毒的方法以及涉及调查以下一种或多种基因,或其同系物的序列的方法:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
Description
发明领域
本发明涉及一种禽类细胞,其中至少一种干扰素诱导型跨膜蛋白(IFITM)的表达和/或活性减少。
发明背景
对病毒性感染和疾病的预防和控制代表了对于医学和兽医学的一项持续挑战。因此,减少病毒性疾病的发病率和严重性的方法保持在医学和生物学技术研究的前沿。
目前用于控制病毒性感染和疾病的最常见的策略是疫苗接种的方法。疫苗可以包含灭活的病毒或其纯化的产物,其已经使用化学物例如氮杂环丙烷(aziridine)处理,例如二乙烯亚胺(binaryethyleneimine,BEI)。或者,疫苗可以包含活的、减毒的病毒,其已经在导致毒力丧失而保持免疫原性的条件下培养。例如,致病性病毒可以通过一系列细胞培养物或动物胚胎传代,直到它在其靶细胞中在复制方面足够差,使得其可以用作疫苗的点。在这点时,病毒已经丧失了毒力但仍然具有免疫原性并能够刺激免疫反应。
胚胎鸡蛋和原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)通常用于制造人用和兽用病毒疫苗,包括传统的大体积疫苗例如流感或新城疫(NewcastleDisease)疫苗以及更现代的用于疫苗的重组病毒载体(例如痘病毒)。为了生成无毒力的减毒病毒,胚胎鸡蛋和CEF用于传代病毒。利用减毒病毒的疫苗的例子包括麻疹疫苗,腮腺炎疫苗,风疹疫苗,口服脊髓灰质炎疫苗(Sabin)和黄热病疫苗。
病毒性疾病对动物和人类健康两者的全球负担导致要求大规模生产疫苗中使用的灭活的和减毒的病毒。另外,季节性流行病的爆发,例如流感的爆发,要求在短时期内生产大量的病毒。实际上,流行病期间治疗有效的流感病毒疫苗的全球可用性仍然是对于生物医药工业的重大挑战。
影响胚胎鸡蛋和CEF在生产用于疫苗的病毒中的使用的一个当前问题是生成所需的大量病毒所花费的时间。另外,在疫苗中使用活的,减毒的病毒的一个缺点是为了生成减毒的病毒,在宿主细胞中达到足够数量的传代所花费的时间长度。例如,高度减毒的修饰疫苗病毒Ankara(MVA),其充当候选疫苗以针对感染性疾病和癌症免疫,要求在CEF中多于500次传代以生成减毒的MVA,其丧失了编码基因组序列的重要部分,并对哺乳动物细胞表现出对复制的严重限制。另外,对宿主细胞中病毒传代速率的限制可能作为限制步骤,从而影响病毒生产和产出(yield)。
因此,需要在用于生产疫苗的系统(例如胚胎鸡蛋和CEF中)中增加灭活的和减毒的病毒两者的产出和生产效率的方法。
附图简述
图1:chIFITM基因座结构和多序列比对
Gga5上的IFITM基因簇侧翼有ATHL1和BAGALNT4。这一区域与Hs11上的IFITM基因簇同线(syntenic)(A)。使用ClustalW和手动比对细化(manualalignmentrefinement)进行了人,黑猩猩和鸡直系同系物(ortholgoue)比对,并使用BioEdit注释。彩色柱示出了所有的9种IFITM序列之间共享的残基。使用序列下方的符号突出显示了重要的残基:Δ-酪氨酸;O-双半胱氨酸;*-对于多聚化重要的苯丙氨酸;↑-保守的泛素化赖氨酸。IM1(膜内1),CIL(保守的胞内环),IM2(膜内2)。
图2:使用一系列假型化(pseudotyped)病毒感染A549细胞,所述假型病毒具有狂犬病病毒糖蛋白包膜(CVS;攻击病毒标准品(狂犬病病毒),MHK;莫科拉(Mokola)病毒和RV1,拉哥斯蝙蝠(Lagosbat)病毒)或流感血凝素包膜(H1(人),H4(禽)和H5(人),H7(禽),H10(禽))。
图3:过表达的IFITM蛋白在A549细胞中的细胞定位。
图4:(A)IFN-γ刺激后,DF-1鸡细胞中chIFITM3表达的对数倍数变化(logfoldchange),(B)使用chIFITM3特异性siRNA(CH)或杂乱(scrambled)siRNA(NS)的chIFITM3敲低百分比,(C)使用甲型流感病毒(A/WSN/1933(WSN/33))对DF-1细胞的感染,使用针对核蛋白(NP)的抗体通过流式细胞术测量。在所有情况下,使用与chIFITM特异性siRNA(CH)或杂乱siRNA(NS)的预孵育。误差棒表示以一式三份进行的每种条件间的标准偏差。
图5:鸡IFITM转录物在一组组织中的差异表达。
图6:根据表达的蛋白水平(A),根据HA标签的蛋白印迹(B)表达不同水平chIFTIM3蛋白的A549细胞限制用拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)糖蛋白包膜假型化的慢病毒的复制。
图7:鸡IFITM3在DF-1鸡细胞中具有抗病毒活性。使用TNF-α和TNF-γ刺激后,或与非靶向siRNA或一种chIFITM3特异性siRNA预孵育后,使用定量RT-PCR测量chIFITM3的表达水平或对数倍数变化(A)。通过流式细胞术使用针对核蛋白(NP)的抗体测量了使用甲型流感病毒(A/WSN/1993[WSN/33])感染的DF01细胞中敲低内源性chIFITM3表达的影响(B)。P=0.01,学生t检验。通过WSN感染使用chIFITM3转染的DF-1细胞。通过流式细胞术检测了HA和NP的表达(C和D),并通过PFU测量了病毒滴度(E)。误差棒表示以一式三份进行的每种条件间的标准偏差。
发明概述
干扰素诱导型跨膜(IFITM)蛋白家族是干扰素刺激的基因家族,其限制几种高度病原性人类病毒的复制,包括SARS冠状病毒,丝状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒),甲型流感病毒和黄病毒(登革病毒)。虽然IFITM基因座(其包括IFITM1,2,3和5)存在于哺乳动物物种中,但是该基因座在禽类物种中尚未得到鉴定和表征。本发明者证明了IFITM基因座存在于鸡中并鉴定了新的禽类IFITM序列,其在细胞中表达时与抑制细胞的病毒性感染的能力相关。
这些鉴定的IFITM序列可以促进在禽类宿主细胞中传代和繁殖病毒的改进的方法。它们也可以用于对禽类动物筛选对病毒性感染的抗性以及在群体中选择具有增加的对病毒性感染的抗性的动物的方法。
因此,在第一个方面,本发明提供禽类细胞,其具有一种或多种以下多肽或其同系物的降低的表达和/或活性:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
所述细胞可以具有降低的鸡IFITM3(SEQIDNo.3)或其同系物表达。
所述禽类细胞可以在禽类胚胎中。所述禽类细胞可以来源于禽类胚胎。例如,所述禽类细胞可以是鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。
所述细胞可以是器官,卵/蛋,禽或任意其它动物的一部分。
所述禽类细胞可以包含一种或多种以下多肽,或其同系物的突变形式:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3),其中所述突变形式与对病毒感染的减少的抗性相关。
所述禽类细胞的基因组可以缺少一种或多种编码以下多肽或其同系物之一的核苷酸序列:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
或者,在所述禽类细胞中通过RNA干扰(RNAi)可以降低以下一种或多种多肽,或其同系物的表达:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
在第二个方面,本发明涉及用于繁殖(propagate)病毒的方法,其包括以下步骤:
(i)使用病毒转导根据本发明的第一个方面的禽类细胞;和
(ii)传代所述细胞以繁殖所述病毒。
在第三个方面,本发明提供用于生产疫苗的方法,其包括以下步骤:
(i)根据本发明的第二个方面的方法繁殖病毒;和,
(ii)将所述繁殖的病毒掺入疫苗中。
在第四个方面,本发明提供用于生成减毒的病毒的方法,其包括以下步骤:
(i)使用病毒转导根据本发明的第一个方面的禽类细胞;和,
(ii)传代所述禽类细胞,使得所述病毒完成多轮感染并变得减毒。
在第五个方面,本发明提供用于生产疫苗的方法,其包括以下步骤:
(i)根据本发明的第四个方面使病毒减毒;
(ii)繁殖所述减毒的病毒;和
(iii)将(ii)中生成的病毒掺入疫苗中。
在本发明的第五个方面的方法中,可以根据本发明的第二个方面的方法进行步骤(ii)。
根据第二至第五方面任一项的方法,所述病毒可以经由酸性内体进入。
在第六个方面,本发明提供转基因禽类动物,其中一种或多种以下多肽,或其同系物的表达或活性被降低,敲低或敲除:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
在第七个方面,本发明提供转基因禽类动物,其生殖细胞和体细胞包括编码以下一种或多种多肽或其同系物的一种或多种核苷酸序列的异质形式(heterogenicversion):鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3),该基因在胚胎阶段时引入到所述动物中,或所述动物的祖先中。
在第八个方面,本发明提供转基因禽类动物,其中编码以下多肽或其同系物的一种或多种基因的拷贝数增加:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
根据本发明的第六,第七或第八个方面的转基因动物可以是家养家禽动物。例如,所述转基因动物可以是鸡。
在第九个方面,本发明提供根据本发明的第一个方面的禽类细胞,其来源于根据本发明的第六,第七或第八个方面的转基因禽类动物。
在第十个方面,本发明涉及用于调查禽类动物对病毒性感染的先天性抗性的方法,其包括下述步骤:调查编码一种或多种以下多肽或其同系物的核苷酸序列:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)和/或调查所述核苷酸序列在基因组上的拷贝数。
在第十一个方面,本发明提供用于从同一物种的多个禽类动物中选择对病毒性感染具有抗性的禽类动物的方法,其包括以下步骤:
(i)在所述多个禽类动物中调查编码以下一种或多种多肽,或其同系物的核苷酸序列:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)和/或所述核苷酸序列在基因组上的拷贝数。
(ii)选择具有与对病毒性感染的抗性相关的IFITM1,IFITM2和/或IFITM3核苷酸序列和/或拷贝数的禽类动物。
多个禽类动物在IFITM基因座处可能表现出遗传变异和/或拷贝数变异。
病毒感染可以由经由酸性内体进入的病毒介导。例如,病毒感染可以由禽流感病毒(AIV),感染性支气管炎病毒(IBV),感染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)或新城疫病毒(NDV)介导。
在第十二个方面,本发明提供用于在禽类动物中预防或治疗病毒性感染的方法,其包括在所述动物中增加以下一种或多种多肽或其同系物的表达的步骤:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
在第十三个方面,本发明提供禽类IFITM多肽,其包括SEQIDNo.2(鸡IFITM2)或其变体或同系物的氨基酸序列。
所述禽类IFITM多肽可以包括一个或多个,或所有的以下氨基酸残基:Trp35,Ser36,Leu37,Arg64,Asp65,Asp71,Gly74,Ala75,Tyr78,Ala82,Lys83,Asn86和Ile87,遵循SEQIDNo.2中所给的氨基酸位置编号。
变体或同源禽类IFITM多肽可以包含与SEQIDNo.2具有至少80%同源性的氨基酸序列。
当在细胞中表达时,所述禽类IFITM多肽可以抑制对所述细胞的病毒感染。
在第十四个方面,本发明提供编码根据本发明的第十二个方面的多肽的核酸序列。
对禽类IFITM基因座的鉴定促进降低用于传代病毒的禽类细胞对病毒性感染的抗性的能力。禽类宿主细胞对病毒性感染的此种降低的抗性增加所述病毒的感染率,从而改进病毒在禽类宿主细胞中传代的效率。因此本发明提供用于在禽类细胞中传代病毒的方法,例如,为了生产用于疫苗中的病毒和为了生成减毒的病毒。
另外,对病原体的控制是保证食物安全中的关键组成部分,其中地方性和外来病毒两者都造成重大的威胁,特别是对于家禽业和小规模家禽养殖户。本发明人对禽类IFITM基因座进行的鉴定和表征将提供改进的方法来抗击重要的家禽病毒性疾病,从而改进食物安全。
对禽类IFITM基因座的鉴定将促进对病毒性感染具有增加的抗性的禽类的选择和繁殖,并使得能够生成表达与对病毒性感染的增加的抗性相关的外源性IFITM序列的转基因动物。因此,本发明提供策略和方法以增加家禽群的先天性病毒抗性,并因此控制病毒在家禽群体中的传入和扩散并降低目前对疫苗接种计划的依赖。
详细说明
IFITM
本发明涉及禽类IFITM多肽。
干扰素诱导型跨膜(IFITM)蛋白限制几种高病原性人类病毒的进入过程和复制,包括SARS冠状病毒,丝状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒),甲型流感病毒,黄病毒(登革病毒)和HIV-1。它们的表达由I和II型干扰素诱导,因此它们落入干扰素刺激的基因(ISG)的范畴内。
IFITM蛋白较小(约130aa)并共享由保守的CD225域所确定的共同的拓扑学。CD225域包含两个膜内(IM)区(IM1和IM2)和保守的胞内环(CIL),并且侧翼有N端和C端域。
在人类中,IFITM1,2和3表达于范围广泛的组织中,而IFITM5的表达被限制在成骨细胞中。小鼠具有IFITM1,2,3和5的直系同系物以及另外的基因Ifitm6和Ifitm7。
IFITM蛋白通过阻断多样的包膜病毒的细胞质进入和复制来抑制病毒性感染。IFITM蛋白介导的限制发生在IFITM限制性病毒的进入位点处在晚期内体和溶酶体组分中,在那里所述蛋白被预测为采取膜内结构。因此IFITM介导的限制在病毒复制之前,病毒编码的对抗措施显然没有合成的机会。
IFITM蛋白阻止病毒包膜融合蛋白的酸性活化后,病毒和内体膜之间融合孔的形成。已经证明了IFITM蛋白改变细胞膜特性的能力,导致融合孔的形成被阻滞在半膜融合(hemi-membranefusion)的阶段。在小鼠细胞中Ifitm3的耗尽导致IFN介导的针对内体进入病毒的保护效果的40%-70%丧失,并在缺少Ifitm1,2,3,5和6的IfitmDel小鼠中也检测到了相似的弱化。最近,通过IFITM3变体和一些具有季节性或流行性流感H1N1/09病毒的住院个体数目之间的相关性,证明了IFITM3参与病毒限制的直接临床证据。
鸡基因组在染色体5上含有两个推定的IFITM基因,即所谓的IFITM5(ENSGALG00000004239;染色体5:1620304-1621805:1)和IFITM10(ENSGALG00000020497;染色体5:15244061-15249351:1)。先前基于核苷酸序列同源性的鸡基因组分析已经预测了与人IFITM1(变体1:XM_001233949.2;变体2:XM_003641281.1)和IFITM3(XM_420925.3)直向同源的另外两种IFITM的存在。此类基因组分析常常由于对假基因的不恰当鉴定和直向同系物的错误分配(misassignment)而被混淆,这是由于对物种形成期间基因复制和进化分歧事件的知识不完全所致。对于预测的禽类IFITM序列这是特别相关的,因为它们的核苷酸序列与人和黑猩猩直向同系物显著不同。没有对提供IFITM样功能的禽类多肽的先前的报道。
为了限定功能性禽类IFITM核苷酸和多肽序列,本发明人已经进行了对同线区域的仔细基因组分析和基因产物的功能表征。
本发明涉及禽类IFITM多肽,其包括选择下组的氨基酸序列:SEQIDNo1(鸡IFITM1),SEQIDNo2(鸡IFITM2),SEQIDNo3(鸡IFITM3),以及其同系物和变体。
SEQIDNo1:
MQSYPQHTSINMPSYGQDVTTTIPISPQPPPKDFVLWSLFNFVLCNAFCLGLCALSYSIKSRDRIIAKDFVGASSYGRTAKIFNIFAFCVGLLVTILSIVLVFLYLPLYTVRP
SEQIDNo2:
MKPQQAEVSIPLHPPGRGPPLASLPDEQPRDFILWSLFNVLAGFALAYLGCFCFPSLIFSIKARDCKVLGDLEGARRYGSRAKVLNIIFSVLIAVGVLSTITIAIMFITAISR
SEQIDNo3:
MERVRASGPGVPPYEPLMDGMDMEGKTRSTVVTVETPLVPPPRDHLAWSLCTTLYANVCCLGFLALVFSVKSRDRKVLGDYSGALSYGSTAKYLNITAHLINVFLIILIIALVASGTIMVANIFNHQQQHPEFIGPT
术语“多肽”以常规意义使用,意指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基,通常是L-氨基酸。
这些chIFITM多肽可以由根据以下序列的cDNA序列编码:chIFITM1(SEQIDNo4),chIFITM2(SEQIDNo5),chIFITM3(SEQIDNo6和SEQIDNo7)。
SEQIDNo4:
acagctgccctccagcaccatgcagagctaccctcagcacaccagcatcaacatgccttcctacgggcaggatgtgaccaccactattcccatctctccgcagccgccccccaaggattttgtactctggtccctcttcaactttgtgctgtgcaacgccttctgcctgggcttatgtgctctctcatactccatcaagtccagggataggatcatcgccaaggacttcgtaggcgccagcagctatgggaggacagcgaagatctttaacatctttgcattctgtgtgggacttcttgtgaccatcctctccatcgtcctggtgtttctctacctcccgttgtacactgtgcggccctgatctggcctgatcaagaggagcagcactgcggtcccactcctccttccctctacctctggtatcacccccaccgaggtgactcagttcgggatgagcccttggggtgagctgaaggcaaataaagcttcttccccattcta
SEQIDNo5:
ATGAAGCCGCAACAGGCGGAGGTGAGCATCCCGCTGCACCCACCCGGGCGGGGGCCGCCCCTCGCCAGCCTCCCCGACGAGCAGCCCCGCGACTTCATCCTCTGGTCCCTCTTCAACGTCCTGGCGGGCTTCGCTCTCGCCTACCTCGGCTGCTTCTGCTTCCCCTCGCTCATCTTCTCC
ATCAAGGCCCGCGACTGCAAAGTGCTGGGCGACCTGGAAGGTGCTCGGCGGTATGGAAGCCGGGCCAAGGTGCTGAACATCATCTTCTCTGTGCTGATAGCCGTCGGTGTGTTGTCCACCATCACCATTGCCATCATGTTCATCACCGCGATCAGCAGATAG
SEQIDNo6:
caccgggctgcggggaaacgaaaccagttccctccgtcctcccgtcccggcgccgcccccaagcctcatagcccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcccaccgtatgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtggtgacggtggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgcaccacgctgtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagtccagggatcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcgaagtacctgaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccctggttgccagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccgaattcattggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgctttccttgcttcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacaccccttgctctggcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcactctgcctttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacacaataaaggtatctttcacttttgtcccac
SEQIDNo7:
ggaccccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcccaccgtatgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtggtgacggtggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgcaccacgctgtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagtccagggatcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcgaagtacctgaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccctggttgccagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccgaattcattggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgctttccttgcttcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacaccccttgctctggcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcactctgcctttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacacaataaaggtatctttcacttttgtcccac
本发明人已经确定了禽类IFITM多肽能够限制由各种各样的病毒引起的感染。
chIFITM多肽能够限制通常不靶向禽类细胞的人类病毒对宿主细胞的感染。因此,chIFITM序列在操作宿主细胞对各种各样的病毒的易感性中可能是有用的,所述病毒包括通常不靶向该物种的细胞类型的病毒。
术语“禽类”以常规意义使用,指代在鸟纲(Aves)的系统发生类别内的动物。
特别地,术语禽类可以指鸡形目家族(Galliformesfamily)内的动物,其包括,但不限于,鸡,火鸡,松鸡,鹌鹑,鹧鸪和雉(pheasant)。
禽类动物可以是家养家禽动物,例如鸡或火鸡。
同系物和变体
术语“同系物”指代与选自下组的氨基酸序列具有等同功能的来自另一种禽类动物的多肽:SEQIDNo1,SEQIDNo2和SEQIDNo3。禽类IFITM同系物可以来自于相关物种(例如,来自鸡形目家族的另一种禽类动物)或来自于相同物种的不同品种(例如,鸡的另一品种)。
术语“变体”指代与选自下组的氨基酸序列具有等同功能,但包括一个或多个氨基酸取代,插入或删除的多肽:SEQIDNo1,SEQIDNo2和SEQIDNo3。可以通过本领域已知的方法,如定点诱变或易错PCR生成变体IFITM多肽。
功能性等同指IFITM多肽在细胞中表达时抑制该细胞的病毒性感染的能力。
禽类IFITM同系物可以独立地折叠以形成包括CD225域的结构。
禽类IFITM多肽可以包括一个或多个,或所有的以下氨基酸残基:Trp35,Ser36,Leu37,Arg64,Asp65,Asp71,Gly74,Ala75,Tyr78,Ala82,Lys83,Asn86和Ile87,其参照SEQIDNo.2中所给的氨基酸位置编号。
变体或同源禽类IFITM多肽可以包括与SEQIDNo.1,2或3具有至少70,80,90,95或98%同源性的氨基酸序列。
可以通过肉眼,或更通常在容易得到的序列比较程序的帮助下进行同一性比较。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多序列之间的%同一性。用于进行这样的比对的一个适合的计算机程序是GCGWisconsinBestfit包(UniversityofWisconsin,U.S.A.;Devereux等,1984,NucleotidesequencesResearch12:387)。可以进行序列比较的其它软件的例子包括但不限于,BLAST包(见Ausubelet等,1999ibid–Chapter18),FASTA(Atschulet等,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者都可用于离线和在线搜索。
一旦软件已经产生了最优比对,可能计算%同一性。软件通常完成这点作为序列比较的一部分并生成数字结果。
由于遗传密码的冗余性,编码相同多肽的SEQIDNo4-7的序列中的变异是可能的。这些序列包含在本发明中。
编码核苷酸序列中的单核苷酸多态性(SNPs),插入和删除,以及禽类IFITM多肽中的其它变异可能影响多肽的抗病毒功能。因此,IFITM变体可以是活性或无活性变体,其中活性变体是具有等于或大于野生型序列的抗病毒活性的IFITM多肽,而无活性变体是具有比野生型序列少的抗病毒活性的IFITM多肽。变体IFITM序列可以称作突变体序列。
野生型蛋白指代包含作为在一般群体中常见的氨基酸序列的非突变形式的氨基酸序列的蛋白。
IFITM序列变体可以存在于禽类动物的群,品种(breed),和/或物种中。这些IFITM序列变体可以是与不同水平的对病毒性感染的抗性相关的活性或无活性变体,因此群,品种和/或物种中的个体动物可以与不同水平的对病毒性感染的抗性相关。
使病毒繁殖和减毒
本发明提供用于繁殖病毒的方法,其通过使用病毒转导禽类细胞以及传代细胞以繁殖病毒。
禽类细胞可以形成禽类胚胎的一部分,其可以来源于禽类胚胎或其可以是禽类细胞系。
细胞可以是任意禽类细胞或禽类细胞系。
用于疫苗中的病毒通常通过在胚胎鸡蛋和/或来源于胚胎鸡蛋的细胞,例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中繁殖产生。
用于在禽类细胞中繁殖病毒的一般技术是本领域公知的。
术语“转导”以常规意义使用,表示通过病毒载体将遗传材料转导到宿主细胞中。在发明中,这指代将病毒遗传材料转导到宿主细胞中,使得病毒能够复制,从而生成的病毒后代从宿主细胞释放来感染其它细胞。
术语“繁殖”指代增加病毒颗粒的数量或量。
短语“将细胞传代”指代促进或实现禽类宿主细胞的分裂和/或维持,使得病毒感染群体中的多个细胞,使得病毒复制和繁殖能够发生。
如果禽类细胞形成禽类胚胎的一部分,例如,如果其为胚胎鸡蛋,那么将细胞传代可以指代提供适合的环境,使得病毒在初始的转导事件后能够感染胚胎中的多个细胞。如果禽类细胞来源于胚胎鸡蛋,例如,如果细胞是CEF,那么将细胞传代可以涉及使用标准的细胞培养技术维持细胞并促进细胞的分裂,如定期将细胞分到新的组织培养容器中以维持所需的培养密度。
疫苗可以包含死的/灭活的病毒或其纯化的产物。或者,疫苗可以包括活的、减毒的病毒,其已经在导致毒力丧失同时保持免疫原性的条件下培养。例如,致病性病毒可以通过一系列细胞培养物或动物胚胎传代,直到它在其靶细胞中在复制方面足够差,使得其可以用作疫苗的点。在这一点时所述病毒已经丧失了毒力但仍然具有免疫原性并能够刺激免疫反应。用于疫苗中的减毒的病毒通常如下产生:将病毒在胚胎鸡蛋和/或来源于胚胎鸡蛋的细胞,如CEF中传代,直到此类点,在那里病毒对于其原始的宿主细胞不再具有毒性并因此对于其原始的宿主物种不再具有毒性。
IFITM多肽限制通常不靶向它们正在被表达的宿主细胞的病毒感染的能力在生成用于疫苗的减毒病毒的背景中是重要的。禽类宿主细胞中IFITM表达和/或活性的降低可以增加宿主细胞对非禽类病毒(例如哺乳动物病毒,如人类病毒)感染的易感性。
因此,本发明提供用于生成减毒的病毒的方法,其包括以下步骤:
(i)使用病毒转导根据第一个方面的禽类细胞;和,
(ii)传代禽类细胞,使得病毒完成多轮感染并变得减毒。
本发明提供的繁殖和/或减毒病毒的方法涉及降低用于传代病毒的禽类胚胎或禽类细胞中的IFITM1,IFITM2和/或IFITM3或其同系物的蛋白水平。IFITM蛋白发挥功能以抑制病毒感染,因此其中IFITM表达或活性减少的细胞对于病毒传染更易感。细胞对病毒性感染的增加的易感性导致较高的病毒感染效率,其中与没有操作IFITM表达的细胞比较,更多的细胞被感染并产生更多的病毒。这些特性对于涉及在宿主细胞中传代病毒的应用中改进病毒生产的产出是有益的。
本发明的第一个方面涉及一种禽类细胞,其具有鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和/或鸡IFITM3(SEQIDNo.3)或其同系物的降低的表达和/或活性。
术语“降低”表明IFITM的表达或活性小于同等的未修饰或未处理的野生型细胞中的IFITM的表达或活性。
IFITM的表达或活性可以降低例如多达25,50或75%。
可以通过本领域的技术人员已知的一些方法生成具有降低的IFITM表达或活性的禽类胚胎或禽类细胞系。
可以通过RNA干扰(RNAi)途径使用RNAi介质(mediator)例如反义RNA,短干扰RNA(siRNA),mircoRNA或短发夹RNA(shRNA)降低IFITM基因的表达。RNAi介质分子可以作为裸露的RNA,在质粒载体中,或在脂质体中和/或蛋白囊泡中通过如电穿孔,脂转染或纳米颗粒递送技术等的技术瞬时递送。或者,可以通过使用逆转录病毒,例如慢病毒将RNAi介质分子稳定地引入靶细胞的基因组中,其中使用慢病毒转导靶细胞,使得慢病毒基因组整合到靶细胞的基因组中。如果使用包括可追踪标志物,如GFP的慢病毒载体,那么可以选择其中表达RNAi介质的细胞。因为慢病毒基因组稳定地整合到宿主细胞基因组中,所以允许RNAi介质分子的遗传性表达,并产生了IFITM的降低的稳定后代表达水平。
可以使用本领域中一些公知的技术评估降低的IFITM表达的确认。例如,可以使用常规或实时PCR技术评估IFITMmRNA的水平和通过蛋白印迹(Westernblotting)技术评估IFITM蛋白水平。
一种或多种以下多肽或其同系物的表达在动物的生殖细胞和体细胞中被降低或敲低:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)的转基因动物可以如下生成:在适当的发育阶段,通过慢病毒递送靶向编码所述多肽的一种或多种核苷酸序列的RNAi介质分子到所述动物的成熟卵母细胞,精子,新受精的合子,早期胚胎或原生殖细胞(PCG)。这将导致RNAi介质分子在细胞后代中的表达并减少由靶定基因编码的多肽的表达。
可以通过在适合的发育阶段将编码多肽的显性负性突变形式的转基因序列递送到所述动物的成熟卵母细胞,精子,新受精的合子,早期胚胎或原生殖细胞(PCG)来降低上述多肽之一的活性。
或者,可以通过同源或靶向重组事件产生靶标基因的敲除。
还可以使用上文所述的技术使用不编码功能性IFITM蛋白的核苷酸序列代替编码IFITM的基因。在本发明的语境中,术语“功能性”指代IFITM多肽当在宿主细胞中表达时,抑制该细胞的病毒性感染的能力。
疫苗
通过本发明的方法繁殖和/或减毒的病毒可以掺入疫苗中。
如本文所使用的术语“疫苗”指代当施用到受试者时,诱导或刺激保护性免疫反应的制剂。疫苗可以使生物体对特定疾病免疫。
疫苗可以治疗性使用,以治疗存在的感染;或预防性使用,以阻断或降低感染的可能性和/或预防或降低感染疾病的可能性。
疫苗包括一种或多种疫苗接种实体(vaccinatingentity)和任选地一种或多种佐剂,赋形剂,载体和稀释剂。
疫苗接种实体可以是通过本发明的方法繁殖和/或减毒的病毒。
疫苗接种实体也可以是通过本发明的方法繁殖和/或减毒的病毒的纯化产物。
疫苗可以包括,或能够表达另一种活性剂,例如,可以在疫苗接种实体诱导的适应性免疫反应之前刺激早期保护的活性剂。所述试剂可以是抗病毒剂,例如I型干扰素。或者/另外,所述试剂可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
调查禽类动物对病毒性感染的先天性抗性
本发明提供用于调查禽类动物对病毒性感染的先天性抗性的方法,其包括调查编码一种或多种以下多肽或其同系物的核苷酸序列和/或其拷贝数的步骤:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
例如,可以通过筛选IFITM基因的序列变异调查编码IFITM多肽的核苷酸序列的序列。可以使用一些常规技术进行IFITM变体的筛选,所述常规技术是本领域公知的,并且包括但不限于,PCR,常规DNA测序和第二代DNA测序。
基因的拷贝数是存在于基因组中的基因的拷贝的数量。拷贝数变异(CNV)是基因组中导致具有一种或多种基因的异常拷贝数的细胞的DNA变化。当基因组的相对较大区域已经被删除(给出少于基因的正常拷贝数)或复制(给出超过基因的正常拷贝数)时通常出现CNV。
可以通过细胞遗传学技术调查拷贝数变异,如荧光原位杂交,比较基因组杂交,阵列比较基因组杂交,使用SNP阵列的虚拟核型分析(virtualkaryotyping)和下一代测序。
除了上文所述的用于筛选IFITM基因的方法外,本发明还提供用于从相同物种的多个禽类动物选择对病毒性感染具有抗性的禽类动物的方法。这种方法包括下述步骤:调查如上文所述的一种或多种禽类IFITM基因的序列和/或拷贝数,以及选择具有与对病毒性感染的抗性相关的IFITM1,IFITM2和/或IFITM3序列或拷贝数的禽类动物。
根据上文的方法筛选和潜在地选择的多个动物可以构成群,品种或物种。由于IFITM基因的遗传序列的可能变异,群体中的不同动物可能与不同的IFITM序列相关。群体的个体成员之间的IFITM基因的遗传序列中的这些差异可以称为多个中的遗传变异。
抑制病毒感染
术语“为了抑制病毒性感染”指代多肽减少,抑制或降低病毒进入细胞,在细胞内复制或从细胞释放的能力。因此,表达能够抑制病毒性感染的多肽的禽类动物与对病毒性感染的抗性相关。
一些用于评估病毒性感染性的技术是本领域中已知的。这些技术通常涉及在已经被病毒感染的群体中确定病毒复制标志物的存在,例如测定病毒RNA,病毒肽和/或病毒颗粒的水平,或测定死亡率水平。这些技术通常用于确定实体,如多肽,或核苷酸序列的潜在抗病毒功能,其通过增加或减少样品中候选抗病毒实体的水平,并与尚未调节抗病毒实体水平的等同样品比较病毒性感染性的水平。用于评估病毒性感染性水平的技术包括但不限于,空斑测定,流式细胞术,qPCR,ELISA和死亡率。
病毒感染
本发明的多肽能够抑制病毒性感染。
病毒性感染可以由经由内体进入细胞的任意病毒引起。这种进入涉及经由胞吞将病毒摄入靶细胞中,之后经由内体途径加工。因为内体在细胞中得到加工和成熟,所以其pH变得更为酸性且增加的酸性导致内体构造的变化,这允许病毒被释放到细胞中。
病毒性感染可以由禽类和/或哺乳动物病毒引起。病毒可以是包膜病毒。IFITM通过阻断病毒包膜与细胞内体膜融合来阻断包膜病毒的胞质溶胶进入。
禽类病毒性感染可以是禽流感,禽类感染性支气管炎,感染性法氏囊病,马立克病(Marek’sdisease)或新城疫。
禽流感由禽流感病毒(AIV)(其为正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的甲型流感病毒)引起。甲型流感病毒的所有亚型(但不是所有亚型的所有毒株)适于禽类,并且甲型流感病毒的所有亚型的毒株已经从野生禽类分离,其中它们通常在没有疾病症状表现的情况下被携带。然而,甲型流感病毒的一些隔离群可以同时在家养家禽和偶尔在人类中引起严重的疾病。甲型流感病毒为负义的,单链的,分段的RNA病毒。它们根据存在于病毒壳体上的H数字(代表血凝素的类型)和N数字(代表神经苷酸氨酶的类型)限定。存在17种不同的H抗原(H1至H17)和9种不同的N抗原(N1至N9)。AIV的亚型包括但不限于,H1N1,H5N1,H5N2,H5N8,H7N1,H7N3和H7N7。
AIV的细胞进入和复制是一个多步骤过程,其涉及病毒通过病毒血凝素和宿主唾液酸之间的相互作用进入宿主细胞中,病毒RNA基因组(vRNA)以及病毒核心蛋白在酸性内体区室环境中的释放,vRNA向mRNA转化以促进病毒蛋白的表达,vRNA的复制以及病毒颗粒通过起泡从被感染的细胞释放。
禽类中的症状是可变的且可以是非特定的,但可以包括竖起的羽毛,蛋产量减少和与呼吸疾病组合的重量减轻。在其最高病原性的形式中,在鸡和火鸡中的AIV在2天内产生严重病症的突然出现以及几乎100%的死亡率。这些爆发可能对家禽养殖人员引起巨大的经济损失。
禽类感染性支气管炎由禽类感染性支气管炎病毒(IBV)引起。IBV是一种高感染性的冠状病毒,其感染禽类物种,包括鸡,并影响呼吸道,肠,肾和生殖系统。
IBV具有非分段的,正义单链RNA基因组,并通过在酸性内体中进入宿主细胞中,接着将病毒基因组RNA释放到细胞质中来复制。该冠状病毒基因组具有5’甲基化的帽和3’多聚腺苷酸化尾,其允许RNA附接到核糖体用于直接翻译。冠状病毒还编码复制酶,其允许RNA病毒基因组使用宿主细胞机器转录为新的RNA拷贝。
感染性法氏囊病(也称为IBD,冈博罗(Gumboro)病,感染性滑囊炎或感染性禽类肾病)是一种由感染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的幼鸡的高度传染性疾病。IBDV是一种双链RNA病毒,其具有双分段基因组,并属于双RNA病毒科(Birnaviridae)的禽双片段RNA病毒属(Avibirnavirus)。IBDV通过酸性内体进入宿主靶细胞。存在病毒的两种不同血清型,但仅血清型1病毒在家禽中导致疾病。已经鉴定了IBDV血清型1的至少六种抗原性亚型,且这一亚型中的变体能够突破商业鸡群中高水平的母源抗体,导致鸡中高达60至100%死亡率。
IBD以免疫抑制和死亡率(通常在3至6周龄时)表征。疾病症状可能突然出现,而发病率通常达到100%。感染的禽类可能产生水样腹泻,并可能具有肿胀的沾染粪便的肛门。大多数被感染的群可能是斜躺着的并具有竖起的羽毛。感染主要影响法氏囊,并且产生免疫受损的被感染的禽类。
马立克病是一种鸡的高度传染性病毒性新生物疾病,其由一种称为马立克病病毒血清型1(MDV-1)或原鸡(Gallid)疱疹病毒2(GaHV-2)的alpha疱疹病毒(alphaherpesvirus)引起。疾病的特征在于T细胞淋巴瘤的存在和淋巴细胞浸润神经和器官。已知发生于MDV-1感染后的六种症状为:神经淋巴瘤病,急性马立克氏病,眼淋巴瘤病,皮肤马立克氏病,动脉粥样硬化和免疫抑制。
MDV-1包括DNA基因组并为核复制型的,其中病毒DNA在感染细胞的核内转录为mRNA。感染起始于当病毒包膜糖蛋白与靶细胞膜受体相互作用,导致病毒粒子被内化到酸性内体中并脱壳(dismantle),允许病毒DNA迁移到细胞核。一旦在细胞核内,发生病毒DNA的复制和病毒基因的转录。
在有症状的感染期间,被感染的细胞转录裂解性病毒基因,其导致被感染的宿主细胞死亡。除了裂解性病毒基因外,宿主细胞还可以表达潜伏相关的转录物(LAT)作为代替。以这种方式病毒可以在细胞(和因此宿主细胞)中无限期持续下去。
新城疫由禽类副粘病毒(paramyxovirus),新城疫病毒(NDV)引起。副粘病毒的基因组为非分段的负义RNA,长度为15-19千碱基。感染NDV的体征随诸如病毒株,以及宿主的健康,年龄以及物种等因素而变化很大,但包括:呼吸系统体征(喘气,咳嗽),神经体征(抑郁,食欲不振,肌肉震颤,翅膀下垂,头颈部扭曲,盘旋,完全瘫痪),眼睛和颈周围的组织肿胀,呈绿色,水样腹泻,畸形,粗糙或薄壳蛋和减少的蛋产量。在急性病例中,死亡可能是突然的,而且,在爆发开始时,剩下的禽类可能没有症状。然而,在具有良好免疫力的禽群中,体征(呼吸系统和消化道)是轻度且行进性的,并在7天后紧接着是神经症状,特别是头部扭曲。NDV毒株可以归类为强毒(velogenic)(高毒力),中毒(mesogenic)(中间毒力)或低毒(lentogenic)(无毒力)。高毒性毒株产生严重的神经和呼吸系统体征,快速传播并导致高达90%的死亡率。中毒性毒株导致咳嗽,影响蛋质量和产量,并导致高达10%的死亡率。低毒性毒株产生轻度体征,伴有可忽略不计的死亡率。
本发明的多肽可以用于预防或治疗病毒性疾病。
多肽用于预防病毒性疾病的用途涉及其作为预防性实体的用途。在本文中,多肽或编码所述多肽的核酸可以施用到还没有感染疾病和/或其没有表现出疾病的任何症状的禽类动物以预防或削弱疾病的起因,或降低或预防至少一种与疾病相关的症状的形成。
多肽用于治疗病毒性疾病的用途涉及其作为治疗性实体的用途。在本文中,多肽或编码所述多肽的核酸可以施用到患有存在的疾病或病症的禽类动物以减轻,降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减慢,降低或阻断疾病的进程。
增加表达
本发明提供用于在禽类动物中预防或治疗病毒性感染的方法,其包括在动物中增加一种或多种以下多肽或其同系物的表达的步骤:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
可以通过例如使用相关的基因转染或转导禽类动物增加表达。可以通过基于载体的方法引入基因。载体可以是病毒载体或非病毒载体。
载体可以用于“基因治疗”类型方法中来引起禽类动物的基因组上基因的拷贝数的永久增加。
也可以通过调整控制基因表达的启动子和/或增强子增加表达。
转基因禽类动物
如上文所述,IFITM多肽的序列变体可能在它们抑制病毒性感染的能力方面不同。另外,增加的IFITM表达水平可能与针对病毒性感染的增加的保护作用相关。因此,本发明还涉及用于产生对病毒性感染具有增加的抗性的禽类动物的方法,所述方法包括在所述禽类动物中增加IFITM1,2和3中的一种,两种,或三种的表达,或诱导其活性变体的表达或过表达或增加其在基因组上的拷贝数。
转基因禽类动物可以是转基因鸡。
如本文使用的,对于有意通过人工干预而不是自发突变引入受试者的基因组中的核酸序列,术语外源的(exogenic),转基因的和异质的都是同义的。所有产生转基因动物(包括转基因鸡)的方法依赖于设计为将新的遗传材料插入将产生生殖细胞的细胞中的技术。因此,成熟的卵母细胞,精子,新受精的合子,早期胚胎或原始生殖细胞(PGC)可以作为靶标用于引入转基因。
可以用于生成转基因动物的方法是本领域公知的,并包括但不限于,病毒介导的基因转移,DNA显微注射,胚胎干细胞/原细胞介导的基因转移,核转移,人工染色体转移,睾丸介导的基因转移和精子介导的基因转移。
本发明还提供转基因禽类动物,其生殖细胞和体细胞包含编码本发明的多肽的异质核苷酸序列,其在胚胎阶段被引入所述动物或所述动物的祖先中。
本发明现在将通过实施例进一步描述,其意图用来帮助本领域的普通技术人员实施本发明,而并不意图以任意方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:挖掘(mining)鸡IFITM序列
对最新版本的鸡基因组(v4.0,NCBI浏览器)的TBLASTN分析揭示了三种鸡IFITM。这些中的两个先前已经被鉴定并命名为IFITM3-样(NCBII.D.XM_420925.3)和IFITM1-样(变体1:XM_001233949.2;变体2:XM_003641281.1)。与哺乳动物的IFITM一样,所有chIFITM旁系同系物(paralogues)由两个外显子组成,且内含子-外显子边界的位置在所有这些物种中保守。
实施例2:注解所述鸡IFITM基因
3种chIFITM基因和灵长类物种中直接直向同系物之间的氨基酸比对表明一些保守的IFITM家族基序存在于一些鸡的序列中(图1B)。鸡的序列与人和黑猩猩的直向同系物显著不同;然而一些残基(其大多数位于保守胞内环(CIL)域中)是保守的。多序列比对也揭示了鸡IFITM基因中帮助将每个序列归类于IFITM1或IFITM2/3的一些重要残基。在所有的灵长类IFITM2或3序列中,Tyr20是保守的,并也存在于鸡IFITM3中而不存在于任意的其它IFITM1直向同系物中。比对还揭示了其它功能上重要的残基也在一些鸡IFITM序列中保守,包括膜内1(IM1)中的两个半胱氨酸(Cys75-76),其已经证明在其它物种中被棕榈酰化(palmityolate)并对于膜定位重要。Phe79(也位于IM1中)在鸡IFITM3中保守。对人类IFITM基因座和鸡基因组(v4.0,NCBI)的这一区域之间的保守同线性(synteny)分析以及对关键残基的详尽分析已经得出了将chIFITM基因定义为鸡IFITM3(chIFITM3)(先前为“NCBI鸡IFITM1-样”)和鸡IFITM1(chIFITM1)(先前为“NCBI鸡IFITM3-样”)。还鉴定了一种新的chIFITM,chIFITM2(图1)。
实施例3:使用假型化病毒感染表达IFITM的细胞系
在过表达的chIFITM3水平和被用狂犬病病毒(lyssavirus)包膜LBV假型化的慢病毒载体感染的细胞的百分比之间存在负相关(图6)。
在A549细胞中,鸡IFITM的抗病毒限制的水平与它们的直向同系物人类蛋白比较。chIFITM3的过表达导致A549细胞对一系列用狂犬病病毒包膜假型化的慢病毒载体的感染降低94%-98.5%;RABV,LBV和MOKV。这与huIFITM3对相同病毒的限制水平非常相似(图2),尽管鸡很少感染狂犬病病毒。ChIFITM2也限制了狂犬病病毒LBV和RABV感染达70%,然而它仅最低程度上限制了MOKV狂犬病病毒(20%)。对于用IAVH1,H4,H5,H7和H10假型化的慢病毒看到了相似的限制模式。HuIFITM3和chIFITM3非常有效地限制了所有流感血凝素的病毒感染,从而将感染降低了大于90%。ChIFITM2和huIFITM2较为中等地限制,尽管chIFITM2(其具有针对MOKV狂犬病病毒的有限活性)将流感H4限制到与chIFITM3相似的水平。相似地,huIFITM2对流感病毒H1和H4比对H5显示更大的限制。总体来说,虽然chIFITM3和huIFITM3仅共有42%的氨基酸同一性,但是与huIFITM3和IFITM2(它们共有90%的序列同一性但显示不同的病毒限制模式)形成对比,chIFITM3的病毒限制水平与huIFITM3相等。
实施例4:IFITM蛋白的细胞定位
通过荧光显微法使用直接缀合FITC的抗HA抗体,建立了IFITM蛋白在经转导的A549细胞中的细胞定位。鸡IFITM3和huIFITM3定位在核周围而chIFITM1和huIFITM1定位在整个细胞质中(图3)。
实施例5:在DF-1鸡细胞中组成性IFITM表达敲低
DF-1细胞中的chIFITM3的基本水平(通过定量RT-PCR测量)是相对高的,但IFN-γ的添加导致中度的诱导(图4A)。在IFN-γ处理的细胞中使用靶向chIFITM3的siRNA的在前处理导致表达下降1.47个对数倍数。这一对数倍数下降等于相对表达的敲低62.9%。
为了进一步调查chIFITM3在天然鸡细胞中的功能,调查了它在流感感染期间的表达。被流感(A/WSN/1993)感染的DF-1细胞的百分比从无siRNA处理后的14%,增加到当使用靶向chIFITM3的siRNA预处理时的31.5%感染(图4C)。
通过定量RT-PCR使用chIFITM3的引物,本发明人评估了DF-1细胞中chIFITM3的组成性表达水平。DF-1细胞大量表达chIFITM3(对于IFITM3,阈值循环[CT]为20而对于GAPDH为22)。尽管为IFN可诱导的,IFN-γ的添加仅导致中度诱导,而IFN-α的添加导致chIFITM3表达的2.67-log2(6.4倍)增加。
使用设计针对chIFITM3转录物的siRNA,敲低了DF-1细胞中的chIFITM3表达。对未刺激的DF-1细胞使用这一siRNA处理导致转录水平降低1.23-log2(2.4倍),而使用非特异性siRNA,chIFITM转录物的丰度没有变化。对内源性chIFITM3的敲低导致DF-1细胞被有复制能力的甲型流感病毒(A/WSN/1993)的感染的大于2倍增加(图5B),其通过对NP表达的流式细胞分析测定。此外,在DF-1细胞中过表达chIFITM3降低病毒复制达平均55%(图7D),而空斑试验表明在chIFITM3过表达后,病毒载量从1.3x106PFUml-1降低到3.1x105PFUml-1(图7E)。总的来说,这些结果表明chIFITM3能够限制IAV进入DF-1细胞。
实施例6:RNA组织组中的chIFITM表达
chIFITM1,2或3特异性的引物用于使用RT-PCR在一系列组织类型中扩增mRNA转录物。IFITM2和3的表达在所有测试的细胞系中组成性表达(图5),但IFITM1的表达仅限于粘液囊(bursa)(一种B细胞发育需要的器官),胃肠道,盲肠扁桃体和气管。
材料和方法
质粒。所有的IFITM基因克隆到pSIN-BNHA的BamHI和NotI位点中,且通过毛细管测序(GATCbiotech)确定序列。
细胞培养条件。A549细胞培养于F-12(Invitrogen)而HEK293和DF-1细胞培养于DMEM(Invitrogen),所有的培养基补充有10%v/vFBS(Biosera)。
生成表达IFITM的细胞系。从GeneArt(LifeTechnology)订购了鸡和人IFITM基因序列并经密码子优化用于在人类细胞中表达。基因盒插入慢病毒质粒,pSIN-BNHA中,其会保证C-末端HA标签紧接着IFITM蛋白。通过3质粒转染HEK293-T细胞(其在10cm皿中生长到汇合)制备慢病毒。将OptiMEM(200μl,Gibco)与10μl的Fugene-6(Roche)混合。用于转染的DNA在终体积为15μl的Tris-EDTA(TE)中制成,其含有1μggag-pol表达载体(p8.91),1μgVSV-G表达载体(pMDG)和1.5μg表达转基因的载体(pSIN-BNHA)。将该DNA添加到OptiMEM溶液并孵育15分钟(分)。一旦从细胞去除培养基并使用8mlDMEM,10%FBS替换,将DNA混合物逐滴添加到细胞。在37℃和5%CO2持续24小时(h)后,去除所述培养基并使用8mlDMEM,10%FBS替换,再孵育24h。在转染后48和72h通过收集上清液并使用0.45μM滤器(Millex)过滤收获组装的病毒。将等分试样(1ml)在-80℃冷冻。该慢病毒用于转导人A549肺上皮细胞并产生混合的群体。
共聚焦显微法。在使用编码IFITM的质粒(1μgDNA和3μlFugene[Promega])转染1天前,将细胞以1x105/孔接种于12孔板中的盖玻片上。细胞使用100%甲醇固定10分钟,接着在1%牛血清白蛋白(BSA)中封闭30分钟。使用缀合AlexaFluor550缀合的抗HA抗体(ab117513)靶向HA表位,并通过具有人(ab25630;abcam)或鸡(LEP100IgG;DevelopmentalStudiesHybridomaBank)特异性的Lamp1抗体,接着使用缀合AlexaFluor488的二抗(ab96871;Abcam)孵育使内体可视化。
单细胞克隆。在透明的,平底96孔板(Corning)的所有孔装入100μl培养基,除了孔A1外。将200μl细胞悬液(2x104细胞/ml)添加到孔A1,接着以1:2系列稀释到孔H1。将另外100μl培养基添加到第1列的所有孔,并沿着板的每一行对第12列进行另一系列稀释。向96孔板的所有孔再添加100μl培养基使得每个孔的终体积为200μl,之后将板在37℃孵育4-5天。标记在它们中仅具有1个克隆的孔并使其扩增,接着收集到24孔板并容许达到汇合。制备细胞用于流式细胞分析,并将具有高水平HA表达的集落转移到T25烧瓶中。
流式细胞分析。将每个孔的培养基收集到2mlEppendorf管中。使用300μl0.25%的胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将细胞从塑料上分离,使用300μl细胞培养基,10%FBS中和,并与上清液合并。细胞在2000g离心5分钟,将沉淀物重悬于100μlPBS并转移到96孔v-底板(Nunc)。将板再次离心并根据制造商的指导在100μlCytofix/CytopermTM缓冲液(BectonDickinson)中固定和透化细胞并洗涤。将细胞重悬于一抗中(表S4)并在4℃孵育1小时,接着是两轮洗涤。接着,将细胞重悬于缀合荧光蛋白的二抗中,并在暗处孵育1小时,除非一抗具有缀合的荧光标志物。再次洗涤细胞,重悬于300μlPBS中,之后通过流式细胞术(FACSCaliburII,BectonDickinson)分析。表达GFP的细胞使用4%v/v多聚甲醛(paraformaldehyde)(USB)固定20分钟,使用PBS洗涤两次并重悬于300μlPBS中,之后通过流式细胞术分析。
使用假型化病毒感染表达IFITM的细胞系。将表达鸡或人IFITM的A549细胞系以3x103细胞/孔接种于96孔板中,一天后使用表达GFP的假型化狂犬病病毒(RABV攻击病毒标准株11(CVS-11;EU352767),拉哥斯蝙蝠病毒LBV.NIG56-RV1;HM623779)和莫科拉病毒(MOKV.98/071RA361;GQ500108))或表达萤光素酶的假型化流感病毒(HA1(AF117241),HA4(D90302),HA5(EF541394),H7(AJ491720),和H10(CY014671))感染。GFP表达(作为慢病毒感染的测量)在感染后48小时使用4%v/v多聚甲醛(USB)固定20分钟后通过荧光显微法测量。使用100μlPBS/Hoechst溶液(LifeTechnologies,200ng/μl)洗涤细胞并粘上板密封。根据制造商的说明分析细胞来确定表达GFP的细胞的比例(CellomicsArrayScanVTI,Thermofisher)。萤光素酶活性(作为慢病毒感染的测量)在暴露后48小时使用50μlBright-GloTM试剂(Promega)测定。使细胞裂解2分钟,之后使用FLUOstaromega(BMGLabtech)测量萤光素酶活性水平。相对于不存在IFITM蛋白过表达时A549的感染,报告GFP和萤光素酶水平。表达IFITM蛋白的被感染的细胞的百分比记录为未转导的A549细胞中的感染比例(标准化到100%)。
Cellomics荧光细胞分析。将细胞稀疏地接种(3x103/孔,透明,平底96孔板,Corning)并使用表达GFP的病毒感染。48小时后,在100μlPBS中洗涤细胞并使用4%v/v多聚甲醛(USB)固定20分钟。使用100μlPBS/Hoechst溶液(LifeTechnologies,200ng/μl)洗涤细胞并粘上板密封。根据制造商的说明分析细胞来确定表达GFP的细胞比例(CellomicsArrayScanVTI,Thermofisher)。
萤光素酶报告物试验。将细胞以3x103/孔接种到白色平底96孔板(NUNC)并在37℃放置24小时。将适合体积的表达流感病毒蛋白壳体和萤光素酶报告基因的假型化病毒添加到细胞并在37℃孵育48小时。从培养箱中移出细胞以达到室温,之后向每个孔添加50μlBright-GloTM试剂(Promega)。使细胞裂解2分钟,之后使用FLUOstaromega(BMGLabtech)测量萤光素酶活性水平。
siRNA敲低研究。将DF-1细胞以5x104/孔接种到24孔板中。将细胞暴露于稀释在LipofectamineRNAiMax(Invitrogen)中的针对chIFITM3的siRNA(gcgaagtacctgaacatcacg)或非特异性siRNA(uucuccgaacgugucacgugu)达48小时。通过添加200ng/ml的鸡IFN-γ(Kingfisherbiotech#RP0115c)再持续24小时或以MOI为0.1添加甲型流感病毒(A/WSN/1933(WSN/33))1小时来刺激细胞。根据制造商的说明提取RNA(RNAeasyminikit,Qiagen)。使用来自ABI的探针和引物(鸡GAPDH;4448489和鸡IFITM3;定制试验)进行RT-PCR(QuantiTectMultiplexRT-PCRkit,Qiagen),见表S1。通过流式细胞测定分析(见上文)使用抗NP抗体(ab20921,AbCam)测量流感病毒。
空斑试验。将待试验的材料系列稀释于无血清DMEM中并用于感染12孔板中的MDCK细胞。孵育1小时后,除去接种物,并使用含有0.2%BSA(Sigma-Aldrich),1.25%Avicel(FMCBiopolymer),和1μg胰蛋白酶ml-1的DMEM覆盖细胞。两天后,去除覆盖物,并使用4%甲醛盐水(formalsaline)-PBS溶液固定细胞20分钟,接着使用0.1%甲苯胺蓝溶液(Sigma-Aldrich)染色,使得可以计算PFU的数量。
IFITM蛋白在不同的鸡组织中的表达。从6周至9周龄的无特定病原体(SPF)罗德岛红(RhodeIslandred,RIR)鸡取出组织,特别是胸腺,脾脏,法氏囊,哈氏腺(Harderiangland),盲肠扁桃体,美克尔憩室(Meckel’sdiverticulum),骨髓,脑,肌肉,心脏,肝脏,肾脏,肺和皮肤。用DNA酶处理RNA并进行逆转录(SuperScriptIII逆转录酶,Invitrogen)。使用以下引物组通过PCR扩增来自每个组织的cDNA:chIFITM1(F’-AGCACACCAGCATCAACATGC,R’-CTACGAAGTCCTTGGCGATGA),chIFITM2(F’-AGGTGAGCATCCCGCTGCAC,R’-ACCGCCGAGCACCTTCCAGG)和chIFITM3(F’-GGAGTCCCACCGTATGAAC,R’-GGCGTCTCCACCGTCACCA)。扩增GAPDH的引物(F’-ACTGTCAAGGCTGAGAACGG,R’-GCTGAGGGAGCTGAGATGA)设计为跨越内含子-外显子边界,其允许检测并区分cDBA和gDNA扩增,并用作上样对照。
以上说明书中提及的所有出版物通过提述并入本文。不脱离本发明的范围和精神,本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是明显的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述,但是应当理解所要求保护的本发明不应过度限于这些具体的实施方案。事实上,对于病毒学,分子生物学或相关领域的技术人员明显的对所描述的用于实施本发明的方式的各种修改意图在所附权利要求的范围内。
Claims (28)
1.一种禽类细胞,其具有降低的以下一种或多种多肽或其同系物的表达和/或活性:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
2.根据权利要求1的禽类细胞,其中所述禽类细胞在禽类胚胎内,源自于禽类胚胎或者是禽类细胞系。
3.根据权利要求2的禽类细胞,其为鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。
4.根据权利要求1至3中任一项的禽类细胞,其中所述禽类细胞包含一种或多种以下多肽或其同系物的突变体形式:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3),其中所述突变体形式与降低的对病毒性感染的抗性相关。
5.根据权利要求1至3中任一项的禽类细胞,在所述禽类细胞中一种或多种编码以下多肽或其同系物之一的核苷酸序列不存在于其基因组中:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
6.根据权利要求1至3中任一项的禽类细胞,其中一种或多种以下多肽或其同系物的表达通过RNA干扰(RNAi)降低:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
7.一种用于繁殖病毒的方法,其包括以下步骤:
(i)使用病毒转导根据权利要求1至6中任一项的禽类细胞;和
(ii)传代所述细胞以繁殖所述病毒。
8.一种用于生产疫苗的方法,其包括以下步骤:
(i)根据权利要求7繁殖病毒;和
(ii)将繁殖的病毒掺入疫苗中。
9.一种用于生成减毒病毒的方法,其包括以下步骤:
(i)使用病毒转导根据权利要求1至6中任一项的禽类细胞;和
(ii)传代所述禽类细胞,使得所述病毒完成多轮感染并变得减毒。
10.一种用于生产疫苗的方法,其包括以下步骤:
(i)根据权利要求9使病毒减毒;
(ii)繁殖减毒的病毒;和,
(iii)将(ii)中生成的病毒掺入疫苗中。
11.根据权利要求7至10中任一项的方法,其中所述病毒经由酸性内体进入。
12.一种转基因禽类动物,其中一种或多种以下多肽或其同系物的表达和/或活性被降低,敲低,或敲除:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
13.一种转基因禽类动物,其生殖细胞和体细胞包括一种或多种编码以下多肽或其同系物之一的核苷酸序列的异质形式:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3),所述核苷酸序列在胚胎阶段时导入所述动物、或所述动物的祖先。
14.一种转基因禽类动物,其中一种或多种编码以下多肽或其同系物的基因的拷贝数增加:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
15.根据权利要求12至14中任一项的转基因动物,其中所述禽类动物是家养家禽动物。
16.根据权利要求15的转基因动物,其中所述禽类动物是鸡。
17.根据权利要求1的禽类细胞,其来源于根据权利要求12至16中任一项的转基因禽类动物。
18.一种用于调查禽类动物对病毒性感染的先天性抗性的方法,其包括下述步骤:调查编码一种或多种以下多肽或其同系物的核苷酸序列:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)和/或调查所述核苷酸序列在基因组上的拷贝数。
19.一种用于从同一物种的多个禽类动物选择对病毒性感染具有抗性的禽类动物的方法,其包括以下步骤:
(i)在所述多个禽类动物中调查编码一种或多种以下多肽或其同系物的核苷酸序列:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)和/或所述核苷酸序列在基因组上的拷贝数;
(ii)选择具有与对病毒性感染的抗性相关的IFITM1,IFITM2和/或IFITM3核苷酸序列和/或拷贝数的禽类动物。
20.根据权利要求19的方法,其中所述多个禽类动物在IFITM基因座处表现出遗传变异和/或拷贝数变异。
21.根据权利要求19或20的方法,其中所述病毒性感染由经由酸性内体进入的病毒介导。
22.根据权利要求21的方法,其中所述病毒性感染由禽流感病毒(avianinfluenzavirus,AIV),感染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV),感染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)或新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)介导。
23.一种用于在禽类动物中预防或治疗病毒性感染的方法,其包括在所述动物中增加一种或多种以下多肽或其同系物的表达的步骤:鸡IFITM1(SEQIDNo.1);鸡IFITM2(SEQIDNo.2)和鸡IFITM3(SEQIDNo.3)。
24.一种禽类IFITM多肽,其包含SEQIDNo.2(鸡IFITM2)的氨基酸序列或其变体或同系物。
25.根据权利要求24的禽类IFITM多肽,其包括遵循SEQIDNo.2中所给的氨基酸位置编号的以下氨基酸残基:Trp35,Ser36,Leu37,Arg64,Asp65,Asp71,Gly74,Ala75,Tyr78,Ala82,Lys83,Asn86和Ile87。
26.根据权利要求24的禽类IFITM多肽,其中所述氨基酸序列与SEQIDNo.2具有至少80%的同源性。
27.根据权利要求24或25的禽类IFITM多肽,其当在细胞中表达时抑制所述细胞的病毒性感染。
28.一种核酸序列,其编码根据权利要求24至27中任一项的多肽。
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