CZ2019392A3 - Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J - Google Patents

Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J Download PDF

Info

Publication number
CZ2019392A3
CZ2019392A3 CZ2019-392A CZ2019392A CZ2019392A3 CZ 2019392 A3 CZ2019392 A3 CZ 2019392A3 CZ 2019392 A CZ2019392 A CZ 2019392A CZ 2019392 A3 CZ2019392 A3 CZ 2019392A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
poultry
alv
avian leukosis
resistant
virus
Prior art date
Application number
CZ2019-392A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308509B6 (cs
Inventor
Jiří Hejnar
Pavel Trefil
Anna Koslová
Jitka Mucksová
Jiří Plachý
Jiří Kalina
Markéta Reinišová
Dana Kučerová
Original Assignee
Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i.
BIOPHARM, Výzkumný ústav biofarmacie a veterinárních léčiv a.s.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., BIOPHARM, Výzkumný ústav biofarmacie a veterinárních léčiv a.s. filed Critical Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i.
Priority to CZ2019-392A priority Critical patent/CZ308509B6/cs
Priority to EP20743052.1A priority patent/EP4075964A1/en
Priority to CN202080044789.4A priority patent/CN115003155A/zh
Priority to PCT/CZ2020/000030 priority patent/WO2020253894A1/en
Priority to KR1020227000427A priority patent/KR20220018016A/ko
Priority to AU2020297483A priority patent/AU2020297483A1/en
Publication of CZ2019392A3 publication Critical patent/CZ2019392A3/cs
Publication of CZ308509B6 publication Critical patent/CZ308509B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/30—Bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsob produkce geneticky upravené drůbeže, které je charakterizováno tím, že tato drůbež nese deleci W38 zavedenou do genu chNHE1 pomocí homologní rekombinace mediované CRISPR/Cas9, případně že nese deleci W38 zavedenou pomocí CRISPR/Cas9 a specifickou sgRNA, za vzniku kura domácího nebo krocana domácího rezistentního vůči ptačímu leukózovému viru ALV typu J.

Description

Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J
Oblast techniky
Řešení se týká uměle vytvořené, trvalé a geneticky podmíněné rezistence vůči závažnému drůbežímu onemocnění - ptačí leukóze, vyvolané virem ALV podskupiny J.
Dosavadní stav techniky
Aviámí leukóza je neoplastické onemocnění hematopoetického systému drůbeže vyvolávané ptačími leukózovými viry.
Původcem aviámí leukózy jsou ptačí leukózové viry (ALV) z čeledi Retroviridae, nej častěji z podskupin A a B, nověji J a zcela recentně K. Infekce exogenními ALV se v populaci drůbeže zjišťují velmi často (Jurajda,V., 2002), ale incidence klinického onemocnění je obecně mnohem nižší (1 až 5 % z infikovaných), než např. u Markovy nemoci. Z leukózových forem se relativně nejčastěji vyskytuje lymfoidní leukóza (LL); ostatní patologické projevy ALV včetně osteopetrózy, sarkomů a jim příbuzných nádorů, se vyskytují v terénu sporadicky až vzácně. Výjimku tvoří myelocytomatóza, vyvolávaná ALV z podskupiny J, která se v 90. letech začala vyskytovat v rozmnožovacích chovech masného typu (RCHM) a u výkrmových kuřat v mnoha zemích světa, včetně České republiky. Ekonomická závažnost ALV typu J spočívá nej en v přímých ztrátách úhynem, ale zejména v negativním vlivu na užitkovost chovů (nižší hmotnostní přírůstky a snáška). Navíc imunosupresivní účinek latentních infekcí virem lymfoidní leukózy zhoršuje průběh jiných infekcí.
V případě infekce drůbeže ALV-J virus vstupuje do buněk přes receptor chNHEl. Tento retrovirus se pomocí reverzní transkripce přepisuje a integruje se jako proviníš do jaderné DNA hostitelské buňky. Z provirové DNA se přepisuje virová RNA, která se v cytoplasmě translatuje a balí do nově vznikajících částic. Uvolňováním částic z infikované buňky dochází k šíření infekce do permisívních buněk v těle jedince, pokud drůbež není nějakým způsobem rezistentní nebo chráněna restrikčními faktory.
V životním cyklu retrovirů rozhoduje o citlivosti nebo rezistenci k viru přítomnost vhodné receptorové molekuly na povrchu cílové buňky. Receptor chNHEl je buněčný glykoprotein s iontově výměníkovou funkcí, který se vyskytuje jako homotrimer. Jeho prominentní první extracelulámí smyčka obsahuje aminokyselinové zbytky kritické pro interakci s ALV-J. Kuřecí buňky zbavené tohoto glykoproteinu nejsou permisívní pro infekci ALV-J. Stejně tak delece jediné aminokyseliny, W38, má za následek rezistenci k ALV-J, nikoli ovšem ostatních podskupin ALV. Delece nebo substituce W38 byly nalezeny v NHE1 bažantů a většiny hrabavých ptáků, citlivými druhy jsou tak jen kur domácí, čtyři druhy divokých kurů, krocan a několik druhů amerických křepelů z rodů Calipepla, Colinus a Oreortyx (Plachý J, Reinišová M, Kučerová D, Senigl F, Stepanets V, Hron T, Trejbalová K, Elleder D, Hejnar J.: Identification of New World quails susceptible to infection with avian leukosis virus subgroup J. Journal of Virology 91(3): e0200216,2017). Podle našeho výzkumu se v chovech domácích slepic ani v primitivních plemenech kúra domácího nevyskytují alely s deleci W38. Proto nelze využít přirozených zdrojů variability pro plemenitbu směrem k rezistenci (Reinišová M, Plachý J, Kučerová D, Senigl F, Vinkler M, Hejnar J.: Genetic Diversity of NHE1, Receptor for Subgroup J Avian Leukosis Virus, in Domestic Chicken and Wild Anseriform Species. PloS One 1 l(3):e0150589).
V drůbežářsky vyspělých státech je systematickou a dlouhodobou selekcí zvířat s tímto onemocněním dosahováno eradikace (např. poslední ohnisko infekce ALV-J ve Spojených státech
-1 CZ 2019 - 392 A3 bylo likvidováno v r. 2007 (Malhotra S, Justice J 4th, Lee N, Li Y, Zavala G, Ruano M, Morgan R, Beemon K: Complete genome sequence of an american avian leukosis virus subgroup j isolate that causes hemangiomas and myeloid leukosis. Genome Announcements 3(2): pii: e01586-14, 2015). Jedná se ale o poměrně náročný a nákladný screening zvířat ve šlechtitelské procesu, který je možný jen ve velkochovech pod plnou kontrolou proti infekčním onemocněním. V Číně a v podstatě celé Asii a Africe, kde je naprosto normální trhový prodej drůbeže jakéhokoliv stáří a kde probíhá výkrm i v malých rodinných farmách bez jakékoliv kontroly, je zatím nereálné se této virové choroby drůbeže zbavit i přes eradikační programy v posledních letech.
Podstata vynálezu
Výše uvedené problémy odstraňuje způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že tato drůbež nese deleci W38 zavedenou do genu chNHEl pomocí homologní rekombinace mediované CRISPR/Cas9, případně že nese deleci W38 zavedenou pomocí CRISPR/Cas9 a specifickou sgRNA, za vzniku rezistentního kúra domácího nebo krocana domácího vůči ptačímu leukózovému viru ALV typu J.
Původci vynálezu byli vytvořeni geneticky upravení drůbeží jedinci, u kterých byl pomocí genomové editace primordiálních gonocytů (PGC) deletován kodon pro tryptofan v poloze 38 (W38) v genu pro iontový výměník chNHEl. Protože chNHEl slouží jako receptor pro ALV-J a W38, je aminokyselina kritická pro jeho receptorovou, ale nikoli výměníkovou funkci, výsledkem navození plné rezistence vůči ALV-J. Řešení vychází ze dvou již udělených českých patentů č. 307102 ač. 307285.
Podle českého patentu č. 307102 je nám známo, že ke konstrukci transgenních jedinců je možné použít drůbeží embryonální buňky, tzv. primordiální gonocyty (PGC), které mohou být in vitro kultivovány, geneticky upraveny a posléze transplantovány do varlat kohoutů sterilizovaných ozářením. Z vnesených buněk dojde k obnově spermiogeneze a lze tak dospět k potomkům, kteří ponesou genetickou modifikaci identickou s transplantovanými PGC. Podle českého patentu č. 307285 je nám známo, že delece aminokyseliny W38 v receptoru chHNEl způsobí plnou rezistenci proti ptačí leukóze, a to v in vitro modelu na kuřecích fibroblastech.
Způsob podle vynálezu je ve své podstatě sloučením výsledků těchto dvou již uvedených českých patentů, kdy vznikne geneticky upravená linie kúra domácího s deleci W38. Díky znemožnění vstupu leukózovým virům do buňky takových jedinců se navodí trvalá rezistence. Tato ochrana je u těchto kuřat geneticky podmíněná, a tudíž přenosná do dalších generací. Zahrnutím takto rezistentních modifikovaných jedinců do šlechtitelského programu mohou danou vlastnost získat všichni jedinci, čímž se výrazně zvýší kvalita chovného hejna a ve svém důsledku dojde k výrazné ekonomické úspoře v produkci vajec, popř. drůbežího masa. Tento nový způsob může mít celosvětový dopad na zdraví drůbeže a je platný zejména pro kúra domácího a krocana domácího (souhrnně uváděno jako drůbež).
Způsob podle vynálezu týkající se aviámí leukózy typu J řeší původci vytvořený model geneticky upravených jedinců s trvalou rezistencí vůči infekci ALV-J. Představuje tak cestu k eradikaci této choroby nejen v Číně a jihovýchodní Asii, ale i v dalších částech světa, protože existuje riziko znovu zavlečení nových a hůře eradikovatelných čínských kmenů ALV-J do oblastí, kde se toto onemocnění v současnosti nevyskytuje, včetně Evropy a Spojených států.
Jak už bylo uvedeno, český patent č. 307285 se zejména týká senzitivity a rezistence k infekci ALV-J u kúra domácího. Zakládá nárok na izolovanou molekulu DNA kódující mutovaný protein chNHEl, nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 byl/je deletován a dále izolované molekuly DNA kódující mutovaný protein chNHEl, nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je
- 2 CZ 2019 - 392 A3 nahrazen glycinem, popř. glutamátem. V tomto patentu bylo experimentálně na buňkách ověřeno, že sekvence NHE1 kúra domácího obsahující W 38 mutantu poskytuje úplnou rezistenci k infekci ALV-J! V tomto patentu se přišlo na skutečnost, že je-li v receptoru chHNEl nahrazen tryptofan za glycin, tato substituce způsobí plnou rezistenci proti ptačí leukóze a to v in vitro modelu na kuřecích fibroblastech. Tato skutečnost se pak mohla potvrdit/vyvrátit pouze vytvořením transgenní drůbeže, kde je tato delece nebo substituce zavedena do genomu editací pomocí CRISPR/Cas9. K tomuto účelu slouží nově vytvořený model tvorby transgenních zvířat podle českého patentu č. 307102, který se přímo týká způsobu produkce ptačích oplození schopných spermií vyvinutých ve varleti sterilizovaného kohouta příjemce, po transplantaci donorových primordiálních zárodečných buněk drůbeže, umožňující naprosto reálnou a praktickou tvorbu transgenních jedinců s cca 50% vysokou účinností.
Objasnění výkresů
Na přiložených výkresech je na obr. 1 znázorněno schéma homologní rekombinace vedoucí k deleci W38 v kuřecím genu pro NHE1. Zcela nahoře intron-exonová struktura genu chNHEl. V 1. exonu je cílová oblast pro gRNA (uprostřed) s vyznačením kodonu TGG pro W38 (žlutě) jako štěpným místem pro nukleázu Cas9 (nůžky). Červeně jsou vyznačeny nukleotidy, jejichž synonymní mutací se vytváří rozpoznávací místo pro endonukleázu Bsal, která poté slouží pro detekci upravené alely. Dole jsou sekvence jednořetězcových oligonukleotidů (ssODN) použitých jako templát pro homologní rekombinaci u kuřete a krocana.
Na obr. 2 je srovnání sekvence alely chNHEl divokého typu (A) a po deleci kodónu pro W38 (B). Ukázáno jen bezprostřední okolí W38, které je vyznačeno šipkou. Sekvence znázorněna jako chromatogram s přepisem nukleotidové i aminokyselinové sekvence.
Na obr. 3 je znázorněna GFP pozitivita po infekci fibroblastů z embryí o genotypu W38 -/- (vlevo nahoře), W38 +/- (vpravo nahoře) a W38 +/+ (vlevo dole) měřená pomocí průtokové cytometric. Na ose x intenzita GFP fluorescence, na ose y počty buněk. Procenta GFP pozitivních buněk v pravém dolním rohu histogramu. Vpravo dole souhrnný graf s procenty GFP pozitivních buněk u všech vyšetřovaných embryí (po čtyřech od každého genotypu).
Na obr. 4 je znázorněna kvantifikace virémie u kuřat genotypů W38 -/-, +/- a +/+ (vyznačeno na ose x) po infekci reportérovým vektorem RCASBP(J)GFP. Virémie stanovena (na ose y) jako relativní jednotky (násobky) negativní kontroly (infekce nespecifickým virem RCAS-A) po kvantitativní RT PCR.
Způsob podle vynálezu byl původci dobře ověřen v laboratořích Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., Praha, CZ, a v BIOPHARMu a.s., Pohoří-Chotouň, CZ.
Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nijak neomezují.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava linie kúra domácího s modifikací receptorového genu chNHEl
Základem přípravy geneticky modifikovaných linií drůbeže je derivace primordiálních germinálních buněk z kuřecích embryí ve stáří 24 až 96 hodin. Tyto buňky byly kultivovány z odebraných vzorků embryonální krve, nebo z hlavové čisti embrya a expandovány in vitro. Delece W38 byla do genomu PGC zavedena pomocí CRISPR/Cas9 s gRNA specifickou pro oblast W38 v genu pro chNHEl atemplátu pro homologní rekombinaci s oblastí W38 (obr. 1). Konstrukt
-3CZ 2019 - 392 A3 kódující CRISPR/Cas9 s příslušnou gRNA a templář pro homologní rekombinaci byly do PGC vpraveny elektroporací v systému Amaxa. Po elektroporaci byly selektovány buňky pozitivní na fluorescenci GFP sdruženou s CRISPR/Cas9 s využitím třídění jednotlivých buněk na průtokovém cytometru. Dobře rostoucí expandovaný klon molekulárně ověřený na deleci W38 byl poté ortotopicky transplantován do sterilizovaných kohoutů-recipientů podle CZ patentu č. 307102. Po pěti měsících byla pozorována obnovená spermiogeneze a ejakuláty kohoutů-recipientů byly použity k umělé inseminaci slepic, nejdříve intramagnální a poté intravaginální. V potomstvu se vyskytovali výhradně jedinci heterozygotní pro deleci W38. Po dosažení pohlavní zralosti byli heterozygoti kříženi a v potomstvu G2 segregovaly v očekávaném poměru všechny genotypy, tj. W38 +/+, W38 +/- a W38 -/-. Shoda s očekávaným poměrem naznačuje, že delece W38 nepředstavuje pro nositele významnou zátěž, která by snižovala užitkovost v chovu. Delece W38 byla ověřována na všech úrovních (klony PGC, ejakulát kohoutů-recipientů, krev nebo péřová pulpa jedinců G1 a G2) molekulárně genetickými metodami, tj. izolací DNA, amplifikaci specifického úseku chNHEl polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a sekvenováním PCR produktu. Ukázky sekvencí DNA jsou na obr. 2.
Příklad 2
Průkaz rezistence nositelů delece W38 vůči AUV-J
Rezistence jedinců W38 byla prokazována třemi nezávislými způsoby, které jsou obvyklé ve virologickém výzkumu a které jsou specificky etablovány pro AUV-J.
A. In vitro infekce embryonálních fibroblastů
Embrya jedinců G2 byla inkubována do 10. dne vývoje a poté byly připraveny kultury embryonálních fibroblastů. Genotyp W38 byl ověřen izolací DNA, PCR a sekvenováním. Kultury embryonálních fibroblastů byly infikovány virem s receptorovou specificitou ALV-J, konkrétně reportérovým vektorem RCASBP(J)GFP, který pro jednoduchou detekci viru transdukuje reportérový gen pro zelený fluorescenční protein (GFP). Kvantitativní stanovení GFP bylo provedeno pomocí průtokové cytometrie. Embryonální fíbroblasty s genotypy W38+/+ a W38+/byly shodně GFP pozitivní v cca 90 % buněk, což indikuje téměř dokonalé promoření virem. Naopak, embryonální fíbroblasty s genotypem W38-/- vykazovaly GFP pozitivitu v méně než 0,05 % buněk, což představuje přirozené pozadí dané autofluorescencí (obr. 3). Lze uzavřít, že genotyp W38-/-je dokonale rezistentní k infekci ALV-J na úrovni embryonálních fibroblastů.
B. In vivo infekce kuřat
Kuřata genotypů W38 +/+, W38 +/- a W38 byla ve stáří od několika dní do 2 měsíců infikována reportérovým vektorem RCASBP(J)GFP, který zachovává receptorovou specifícitu ALV-J a je přitom agresivnější než prototypové kmeny ALV-J, např. HPRS103. Normální průběh infekce ALV-J se projevuje transientní virémií, která podle stáří infikovaného jedince nastupuje po několika dnech, vrcholí zpravidla do 10 dnů a přetrvává jeden až dva týdny po vrcholu. Přítomnost viru in vivo byla tentokrát ověřována molekulárně, kvantitativní detekcí virové genomové RNA technikou reverzně transkriptázové kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR) i biologicky, komplementačním testem, při kterém replikačně kompetentní vnesený virus komplementuje defektivní virus, který je sekundárně kvantitativně stanoven na základě tvorby fokusů transformovaných buněk. Druhý způsob detekce ověřuje přítomnost biologicky aktivního viru, nikoli jen pouhé RNA. Vyšetřovaným materiálem bylo v obou případech sérum infikovaných zvířat odebrané ve dvou časových bodech, jeden a dva týdny po infekci. Pomocí RT-qPCR byla všechna kuřata genotypu W38-/- (celkem 5 kuřat) vyšetřena jako negativní v obou odběrech. Genotypy W38 +/+ a W38 +/- (celkem 10 kuřat) byly s jedinou výjimkou pozitivní v pozdějším odběru, v prvním odběru byla tři kuřata negativní, což znamená pomalý nástup virémie během prvního týdne a nárůst virémie během druhého týdne. Jediná negativita zde může znamenat neúspěšnou infekci, např. kvůli špatné inokulaci. Tyto výsledky jsou v souhrnu uvedeny v obr. 4.
-4CZ 2019 - 392 A3
V komplementačním testu byly v prvním odběru zaznamenány jen ojedinělé pozitivity u genotypů W38 +/+ a W38 +/-. Ve druhém odběru byly odběry zvířat těchto genotypů s jedinou výjimkou (jedinec shodný s předchozím experimentem) pozitivní, zatímco všechny genotypy W3 8 -/-zůstaly negativní (tab. 1). V souhrnu lze uzavřít, že delece W38 navozuje dokonalou rezistenci vůči ALVJ při inokulaci viru do krevního oběhu juvenilních jedinců. Tento typ infekce nejlépe simuluje přirozenou infekci v podmínkách domácího chovu.
Tabulka 1
Genotyp kuřat Číslo kuřete Stáří kuřat v době _ infekce (dny) Titr viru (lU/ml)
6 dnů p.i. 13 dnů p.i.
W38 -/- 604 28 0 0
W38 -/- 606 28 0 0
W38 -/- 611 20 0 0
W38 -/- 612 20 0 0
W38 -/- 615 14 0 0
W38 +/- 601 28 0 101
W38 +/- 603 28 0 102
W38 +/- 605 28 0 101
W38 +/- 610 20 102 103
W38 +/- 616 20 0 103
W38 +/- 618 14 0 102
W38 +/- 619 14 101 103
W38 +/+ 617 14 102 103
V tabulce 1 je ověření virémie u kuřat genotypů W38 -/-, +/- a +/+ (kontrolní genotyp divokého typu) po infekci reportérovým vektorem RCASBP(J)GFP. Virémie stanovena jako titr komplementovaného defektivního viru 16Q aterminálním ředěním ve dvou odběrech séra, a to po 6 a 13 dnech po infekci.
C. Indukce nádorů virem pseudotypovaným ALV-J
Abychom simulovali tvorbu solidních tumorů po infekci ALV-J, pseudotypovali jsme transformující virus přítomný v křepelčí buněčné linii 16Q a obsahující onkogen \-src virem s receptorovou specificitou ALV-J, konkrétně vektorem RCASBP(J)GFP. Vzniká tak akutně transformující virus s onkogenem \-src obalený glykoproteinem viru ALV-J, který je schopen indukovat rychle rostoucí sarkomy v místě inokulace, v našem případě v křídě lni řase. Byla inokulována kuřata ve stáří 10 dnů až dvou měsíců, incidence a růst sarkomů byly sledovány po dobujednoho měsíce. Všechna kuřata genotypů W38 +/+aW38 +/-vyvinula progresivně rostoucí sarkomy, zatímco kuřata genotypu W38 nevyvinula nádor ani vjediném případě. Nádory u zvířat genotypu W38 +/+ rostly rychleji než nádory u kuřat genotypu W38 +/-, což indikuje mírný negativně dominantní efekt alely s deleci W38. To patrně souvisí s trimerizací chNHEl. Závěrem lze říci, že i v tomto experimentu se prokazuje (dokonalá) úplná rezistence vůči ALV-J v případě homozygotní delece W38.
Výše uvedené příklady přesvědčivě dokumentují, že nově vytvořená linie kúra domácího způsobem podle vynálezu, která nese homozygotní deleci W38 v genu chNHEl, je dokonale rezistentní vůči patogennímu viru ALV-J při zachování jeho normálních růstových, reprodukčních a užitkových vlastností a bez j akýchkoli zj evných vedlej ších efektů, což přináší veliký ekonomický efekt.
-5CZ 2019 - 392 A3
Průmyslová využitelnost
Nový způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J, přináší naprosto originální řešení eradikace aviámí leukózy ALV typu J a nabízí nový vytvořený model geneticky upravených jedinců s trvalou rezistencí vůči infekci ALV-J. Představuje tak naprosto revoluční způsob eradikace této choroby nejen v silných drůbežářských státech, např. v Číně a jihovýchodní Asii, ale i v dalších částech světa, protože toto onemocnění má potenciál k znovu zavlečení do oblastí, kde byl jeho původce již eradikován.
Seznam literatury:
JURAJDA, Vladimír. Nemoci drůbeže a ptactva - virové infekce. 1. vyd. Brno: Ediční středisko VFU. Brno, 2002. 184 s. ISBN 80-7305-436-1.
Malhotra S, Justice J 4th, Lee N, Li Y, Zavala G, Ruano M, Morgan R, Beemon K: Complete genome sequence of an american avian leukosis virus subgroup j isolate that causes hemangiomas and myeloid leukosis. Genome Announcements 3(2): pii: e01586-14, 2015
Plachý J, Reinišová M, Kučerová D, Senigl F, Stepanets V, Hron T, Trejbalová K, Elleder D, Hejnar J.: Identification of New World quails susceptible to infection with avian leukosis virus subgroup J. Journal of Virology 91(3): e02002-16, 2017
Reinišová M, Plachý J, Kučerová D, Senigl F, Vinkler M, Hejnar J.: Genetic Diversity of NHE1, Receptor for Subgroup J Avian Leukosis Virus, in Domestic Chicken and Wild Anseriform Species. PloS One 1 l(3):e0150589)

Claims (1)

1. Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru 5 podskupiny J, vyznačující se tím, že tato drůbež nese deleci W38 zavedenou do genu chNHEl pomocí homologní rekombinace mediované CRISPR/Cas9, případně že nese deleci W38 zavedenou pomocí CRISPR/Cas9 a specifickou sgRNA, za vzniku kúra domácího nebo krocana domácího rezistentního vůči ptačímu leukózovému viru ALV podskupiny J.
CZ2019-392A 2019-06-19 2019-06-19 Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J CZ308509B6 (cs)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-392A CZ308509B6 (cs) 2019-06-19 2019-06-19 Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J
EP20743052.1A EP4075964A1 (en) 2019-06-19 2020-06-18 Method of preparing genetically modified poultry resistent to subgroup j avian leukosis virus
CN202080044789.4A CN115003155A (zh) 2019-06-19 2020-06-18 抗j亚群禽白血病病毒转基因家禽的制备方法
PCT/CZ2020/000030 WO2020253894A1 (en) 2019-06-19 2020-06-18 Method of preparing genetically modified poultry resistent to subgroup j avian leukosis virus
KR1020227000427A KR20220018016A (ko) 2019-06-19 2020-06-18 J 아군 조류 백혈병 바이러스에 대한 저항성을 가진 유전자 변형된 가금류를 만드는 방법
AU2020297483A AU2020297483A1 (en) 2019-06-19 2020-06-18 Method of preparing genetically modified poultry resistent to subgroup J avian leukosis virus

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-392A CZ308509B6 (cs) 2019-06-19 2019-06-19 Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019392A3 true CZ2019392A3 (cs) 2020-10-07
CZ308509B6 CZ308509B6 (cs) 2020-10-07

Family

ID=72660639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-392A CZ308509B6 (cs) 2019-06-19 2019-06-19 Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4075964A1 (cs)
KR (1) KR20220018016A (cs)
CN (1) CN115003155A (cs)
AU (1) AU2020297483A1 (cs)
CZ (1) CZ308509B6 (cs)
WO (1) WO2020253894A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410808B (zh) * 2022-03-30 2022-07-01 华南农业大学 一种鸡a、k亚群禽白血病遗传抗性分子标记及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935675B (zh) * 2010-01-14 2012-06-06 山东农业大学 细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建与应用
CN102851355B (zh) * 2012-03-20 2014-12-10 华南农业大学 一种优质鸡抗a亚群禽白血病病毒的抗性分型方法
CN102876675A (zh) * 2012-06-20 2013-01-16 韩健宝 J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用
CZ307285B6 (cs) * 2013-01-28 2018-05-16 Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i. Polymorfismy v sekvenci NHE1 kura domácího asociované s rezistencí nebo sníženou senzitivitou k ALV-J
CN104152445A (zh) * 2014-07-30 2014-11-19 华南农业大学 鸡b、d、e-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标记及应用
CZ307102B6 (cs) * 2016-06-10 2018-01-10 Biopharm, Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S. Způsob produkce spermií a transgenních ptáků

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020253894A1 (en) 2020-12-24
EP4075964A1 (en) 2022-10-26
AU2020297483A1 (en) 2021-12-23
CN115003155A (zh) 2022-09-02
CZ308509B6 (cs) 2020-10-07
KR20220018016A (ko) 2022-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Koslová et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus
Crittenden et al. Influence of endogenous viral (ev) gene expression and strain of exogenous avian leukosis virus (ALV) on mortality and ALV infection and shedding in chickens
CN1056878C (zh) 重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗
CN1240272C (zh) 壳内鸟卵的卵内活化以及使产出的壳内鸟卵受精的方法
JP2020517301A5 (cs)
JP5843153B2 (ja) 生殖系列キメラを介して致死的魚類半数体に由来する生殖細胞から遺伝的に同一な配偶子を得る方法
JP6644276B2 (ja) 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵
CA3007066A1 (en) Methods for gender determination of avian embryos in unhatched eggs and means thereof
JP6923232B2 (ja) 遺伝子改変家禽卵
Adebiyi et al. Investigation of enteric viruses associated with runting and stunting in day-old chicks and older broilers in Southwest Nigeria
CN110218706A (zh) 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用
WO2020109780A2 (en) Polypeptide and uses thereof
CN110066769A (zh) 用于改善的病毒生产的禽类细胞
Wang et al. ALV-J-contaminated commercial live vaccines induced pathogenicity in three-yellow chickens: one of the transmission routes of ALV-J to commercial chickens
JPH03210136A (ja) ウシ成長ホルモンを発現する形質転換家禽
Adebiyi et al. Detection and characterization of chicken astrovirus associated with hatchery disease in commercial day-old turkeys in southwestern Nigeria
Choi et al. Avian reoviruses from wild birds exhibit pathogenicity to specific pathogen free chickens by footpad route
CZ2019392A3 (cs) Způsob přípravy geneticky upravené drůbeže, rezistentní k ptačímu leukózovému viru podskupiny J
Doran et al. Genome editing in poultry-opportunities and impacts
US20230313319A1 (en) Molecular marker for genetic resistance of chicken to infection by subgroups a and k avian leukosis virus and use thereof
WO2002047475A1 (fr) Procede de creation efficace d'oiseaux transgeniques et oiseaux transgeniques ainsi obtenus
CN106256909A (zh) 表达鸭rig-i蛋白的转基因鸡培育方法
JPH03210186A (ja) 形質転換家禽産生用ベクター
ES2795040T3 (es) Métodos para producir virus
Thu et al. Phylogenetic analysis of subgroup J avian leucosis virus from broiler and native chickens in Taiwan during 2000-2002