KR20220012863A - 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 생산성 및 감염성을 증가시키는 아데노바이러스 폴리펩타이드 ix - Google Patents

아데노바이러스 유전자 요법 벡터 생산성 및 감염성을 증가시키는 아데노바이러스 폴리펩타이드 ix Download PDF

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Abstract

아데노바이러스 폴리펩타이드 IX 또는 그것의 절단된 형태를 발현 또는 과발현하는 프로듀서 세포에서 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성하는 것은 현탁 세포 배양물에서 pIX-결실 아데노바이러스의 생성을 가능하게 한다. 또한, 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX 또는 그것의 절단된 형태를 발현 또는 과발현하는 프로듀서 세포의 사용은 그 아데노바이러스가 pIX-결실된 것인지 여부에 관계없이 아데노바이러스 벡터의 수율을 증가시킨다. 또한, 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX 또는 그것의 절단된 형태를 발현 또는 과발현하는 프로듀서 세포의 사용은 수득한 벡터의 형질도입 반응역학을 개선하며, 주어진 수준의 형질도입/감염을 달성하느데 필요한 pfu/표적 세포의 수를 감소시키고, 벡터가 표적 세포에 형질도입하거나 감염시키는데 필요한 시간을 단축시키고, 감염된 표적 세포가 자손 바이러스를 생성하는 시간을 단축시킨다.

Description

아데노바이러스 유전자 요법 벡터 생산성 및 감염성을 증가시키는 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX
관련 출원:
본 출원은 2019년 5월 7일자 제출된 미국 임시 특허출원 No. US62/844175 "The Effect of Protein IX Over Expression to Stability and Infectivity of Adenoviral Vector"(Saana LEPOLA 외), 2019년 5월 28일자 제출된 미국 실용신안 특허출원 No. 16/423215 "The Effect of Protein IX Over Expression to Stability and Infectivity of Adenoviral Vectors"(Vesa TURKKI 외) 및 2019년 9월 13일자 제출된 미국 실용신안 특허출원 No. 16/569742 "The Effect of Protein IX Over Expression to Stability and Infectivity of Adenoviral Vectors"(Vesa TURKKI 외)의 일부 연속 출원으로서 이들로부터의 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 본원에 참고로 통합된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 언급:
없음
공동 연구 협약 당사자의 이름:
없음
서열목록:
본 명세서는 본 출원에 수반된 전자 서열목록 파일을 참고자료로 포함한다.
본 발명자들에 의한 선행 발명에 관한 언급:
없음
아데노바이러스과 계통은 여러 속에 속한 수많은 바이러스를 함유한다. 이들은 광범한 척추동물 숙주를 가진다. 인간 아데노바이러스는 7개 종으로 세분되며, 50개가 넘는 상이한 아데노바이러스 혈청형이 공지되었다. 아데노바이러스는 광범한 질병을 유발하며, 대부분의 혈청형이 호흡기계의 질환과 관련된다. 물리적으로 아데노바이러스는 20면체의 뉴클레오캡시드 형태를 가진 중간 크기(90-100nm)의 비-외피 바이러스이다. 이들의 유전 물질은 약 36kb의 이중가닥 DNA 게놈으로 구성된다.
아데노바이러스는 엔도솜을 통해 숙주 세포로 들어간다. 비리온은 캡시드의 각 펜톤 베이스와 관련된 독특한 혹이나 섬유를 가지며, 이것은 숙주 세포 표면에서 수용체를 통해 숙주 세포에 바이러스가 부착되는 것을 보조한다.
아데노바이러스는 복제 및 비복제 세포 모두에 영향을 미치고 최대 8.5kb의 큰 이식유전자(transgene)를 수용할 수 있는 능력으로 인해 오랫동안 유전자 치료를 위한 인기 있는 바이러스 벡터였다. 아데노바이러스는 그들의 유전 물질을 숙주 세포 게놈에 통합시키지 않기 때문에 이식유전자의 발현이 일시적이다. 더 구체적으로, 예를 들어 악성 신경교종 또는 방광암을 치료하기 위해, 이들은 재조합 DNA, RNA 또는 단백질 형태로 표적 치료제를 투여하기 위한 비히클로서 사용된다.
아데노바이러스의 20면체 캡시드는 바이러스-암호화 단백질들로 이루어진다. 캡시드 구조는 복잡하지만 잘 연구되어 있다. 아데노바이러스 캡시드는 캡소머라고 하는 252개의 작은 빌딩 블록들로 구성된다. 아데노바이러스의 주 코트 단백질은 헥손 단백질이고, 따라서 대부분의 캡소머(240개)는 헥손 캡소머이다. 나머지 12개의 펜톤 캡소머가 캡시드의 5중 정점에 위치된다. 헥손 코트 단백질은 호모-트라이머를 형성하고, 이것이 헥손 캡소머를 구성한다. 헥손 트라이머는 캡시드의 20개 면 각각에 12개의 트라이머가 놓이도록 조직된다. 주변 펜톤과 베이스 펜톤(섬유를 제자리에 고정)에 의해 형성된 펜톤 복합체가 12개의 정점 각각에 위치된다.
단백질 IX는 포유류아노바이러스 과의 일원에 의해 발현되는 작은 다기능 단백질이다. 야생형 아데노바이러스에서 면 중앙의 9개 헥손은 단백질 IX(pIX)의 12개 카피를 포함한다. 단백질 IX는 바이러스 복제에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 당업계는 이식유전자 용량을 증가시키거나 복제 가능 아데노바이러스(RCA) 형성 가능성을 감소시키기 위해 유전자 요법 벡터로부터 이를 제거하는 것을 교시한다(KOVESDI(2010); PARKS(2003) 참조). 예를 들어, PARKS(2004)에는 "유전자 요법 연구에있어서 Ad 벡터 백본에서 pIX를 제거하는 것이 E1-결실 Ad 벡터의 클로닝 능력을 증가시키기 위해 사용되었다"라고 기술된다(PARKS(2004) 초록 참조). PARKS(2014)에는 또한 "초기 연구에서는 pIX가 없는 Ad 캡시드는 전장 바이러스 DNA를 포장할 수 없다고 제안되었지만", "선행 보고서와 달리 pIX 결핍 캡시드는 게놈 크기의 DNA를 수용할 수 있다"라고 기술한다(PARKS(2014) pg. 22 col. 2 (emphasis mine) 참조; 또한 SARGENT(2004) 참조). 유사하게, 인터페론 이식유전자를 운반하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터인 나도파라진 라데노벡이 pIX-게놈(즉, 이식유전자를 위한 공간을 만들고 및/또는 복제 가능 아데노바이러스 위험을 감소시키기 위해 pIX가 결실된 게놈)을 가진다.
유사하게, 박테리오파지 람다 결실 돌연변이체는 야생형 파지보다 열에 더 안정한 것으로 알려져 있다(COLBY(1981) 참조). 따라서, 당업계는 폴리펩타이드 IX 유전자의 5' 부분을 결여한 아데노바이러스 결실 돌연변이체(d1313)를 교시한다. Colby는 바이러스 안정성을 증가시키기 위해 이 결실 돌연변이체를 만들었지만, 놀랍게도 폴리펩타이드 IX 유전자의 5' 부분을 결실시킴으로써 얻어진 바이러스가 야생형 아데노바이러스보다 실질적으로 더 낮은 열 안정성을 갖게 된다는 것이 밝혀졌다(RUSSEL(2009); ROSA-CALTRAVA(2001); ROSA-CALATRAVA(2003) 참조).
아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 특정한 변형은 특정 세포 타입에 아데노바이러스를 표적화하기 위해 사용되었다. MEULENBROEK(2004)에서는 비리온의 표면에 녹색 형광 단백질을 고정하기 위해 pIX를 사용하며, 이로써 생체내에서 바이러스의 추적이 가능하게 된다. Meulenbroek은 pIX가 아데노바이러스 위에 단일클론 항체나 세포독성 물질을 부착시킬 수 있어 표적 치료제가 될 수 있다고 추측한다. ROELVINK(2004)는 특정한 세포 타입에 바이러스를 표면상 표적화하는 자생 pIX 염기(캡시드에 부착)와 비-자생 말단 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 pIX를 만드는 것을 교시한다. SALISCH(2017)는 pIX를 분자 아교로 사용하여 아데노바이러스 표면에 말라리아 기생충 항원을 부착시킴으로써 말라리아 백신을 만드는 것을 교시한다.
당업계는 치료적 이식유전자를 위한 공간을 만들기 위해 바이러스 게놈으로부터 E1 단백질 코딩 영역을 결실시킨 다음, 게놈에 이들 E1 단백질 코딩 영역을 함유하는 인간 HEK293 세포에서 유전자 요법 벡터를 생성함으로써 아데노바이러스 벡터를 제조하는 것을 교시한다. 따라서, 이들 E1-결실 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 시험관내 성장할 수 있지만, 환자의 세포에서는 생체내 성장할 수 없다. 당업계는 또한 벡터 이식유전자 용량을 증가시키기 위해 바이러스 게놈으로부터 pIX 코딩 영역을 결실시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 상업적으로 이용가능한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터(예를 들어, ADSTILADRIN® 브랜드 나도파라진 라데노벡)의 게놈은 pIX 코딩 영역을 함유하지 않는다.
본 발명자는 수 년에 걸쳐서 재조합 아데노바이러스(혈청형 5 "Ad5"에 특히 관심을 집중) 제조 과정을 개발해왔다. Ad를 생산하기 위한 전통적인 소규모 과정은 점착성 HEK293 세포 및 세포 배양 플라스크/병을 사용한다. 이들은 학술 연구에는 유용하지만 상업적 제조까지는 쉽게 확장될 수 없다. 목표는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 혈청형 5 아데노바이러스(Ad5)를 위한 확장가능한 제조 과정을 개발하는 것이었다.
이 개발 과정에서 일련의 놀라운 발견이 가능했다. 가장 중요한 발견은, 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX를 발현하거나 과발현하는 프로듀서 세포에서 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성함으로써 pIX-결실 아데노바이러스를 현탁 세포 배양물에서 놀랄만큼 높은 수율로 생성할 수 있다는 것이었다. 본 발명자는 또한 아데노바이러스 게놈이 pIX-결실되든 아니든 관계없이 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX를 발현하거나 과발현하는 프로듀서 세포를 사용하는 것이 아데노바이러스 벡터의 수율을 증가시킨다는 것을 발견했다. 본 발명자는 또한 아데노바이러스 폴리펩타이드 IX를 발현하거나 과발현하는 프로듀서 세포의 사용이 수득한 아데노바이러스 벡터의 형질도입 반응역학을 개선한다는 것, 즉 아데노바이러스는 주어진 수준의 형질도입/감염을 달성하기 위해 더 적은 pfu/표적 세포를 필요로 하고, 아데노바이러스는 표적 세포를 더 빨리 형질도입 또는 감염시키며, 감염된 표적 세포는 더 빨리 자손 바이러스를 생성한다는 것을 발견했다. 본 발명자는 또한 전장 pIX와 카르복시 말단에서 상당히 잘린 pIX 둘 다에서 이러한 이득을 달성할 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 이러한 발견은 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 제조를 근본적으로 개선하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 특히 프로듀서 세포에서 pIX를 발현함으로써 아데노바이러스(및 특히 아데노바이러스 벡터)의 생산성, 감염 반응역학 및 감염성을 증가시키는 것에 관한 것이다.
본 특허 출원은 적어도 하나의 컬러 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 필요한 비용을 지불하고 신청했을 때 사무국에 의해 제공될 것이다.
도 1은 pix-결실 아데노바이러스(즉, pix가 결실된 게놈을 가진 아데노바이러스)로 형질도입된 HEK293 세포에 의해 나타난 질량분광광도계 스펙트럼의 수를 비교한다. 약자: SC = 스펙트럼 수, 단백질 IX("pIX")와 관련된 MS2 스펙트럼의 수. Ad A: pix-결실 아데노바이러스. Ad A2: 무혈청 조건에서 pix-결실 아데노바이러스로 감염. Ad B: pix를 함유하는 게놈을 갖는, 대조군 아데노바이러스 벡터. 통계: vs Ad A2 vs Ad B: pval_Ade = 1.392955e-24. 세포 vs 배지: pval_comp = 1.119278e-08. rep1 vs 2 vs 3 : pval_rep = 0.962930.
도 2는 넓은 MOI 범위(vg/세포)에서 2개의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터(하나는 pIX 코딩 영역을 갖고 나머지 하나는 갖지 않음) 각각의 감염성을 비교하며, 각 벡터는 정상 HEK293 세포 또는 HEK293-pIX(TF) 프로듀서 세포에서 생성된다. x 축 = MOI; y 축 = 감염되거나 형질도입된 표적 세포의 %
도 3은 정상 프로듀서 세포, 및 일시적으로 pIX를 발현하도록 pIX-코딩 플라스미드로 형질감염된 프로듀서 세포에서 생성된 2개의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터("Ad A" 및 "Ad B"라고 칭함) 각각의 감염성을 비교한다.
도 4는 항 아데노바이러스 항체로 염색된 감염된 세포로부터의 유세포계수법 결과를 도시한다. 이것은 완전한 감염의 후기 단계에서 나타난 세포 집단을 보여준다. 따라서, 이것은 도 3의 다양한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터로 형질전환된 표적 세포들의 세포용해 시간을 비교한다.
도 5는 pIX를 발현하는데 사용된 플라스미드의 도해이다.
도 6은 염색된 형질감염된 프로듀서 세포의 컬러 사진이다.
도 7은 항-pIX 단일클론 항체로 염색된 정제된(CsCl + 투석) 아데노바이러스 스톡의 PAGE 분리를 도시한다. 트랙 1: 크기 마커. 트랙 2: pIX-발현 HEK293 프로듀서 세포에서 생성된 Ad A(pIX 코딩 영역을 결여한 아데노바이러스). 트랙 3: 정상(pIX-음성) HEK293 프로듀서 세포에서 생성된 Ad A. 트랙 4: pIX-발현 HEK293 프로듀서 세포에서 생성된 Ad B(pIX 코딩 영역을 가진 아데노바이러스). 트랙 5: 정상(pIX-음성) HEK293 프로듀서 세포에서 생성된 Ad B.
도 8 및 9는 다양한 타입의 HEK293 프로듀서 세포에서 생성된 다양한 타입의 아데노바이러스로 감염/형질도입한 후 5일째에 다양한 타입의 HeLa 세포 배양물의 사진을 도시한다. ARM = 아데노바이러스 기준 물질. +pIX = 바이러스가 pIX를 발현했던 HEK293 프로듀서 세포에서 생성되었다. HeLa+pIX = 바이러스가 pIX를 발현했던 HeLa 표적 세포에 투여되었다. +pcDNA3.1 = 바이러스가 "빈" pcDNA3.1 플라스미드, 즉 pIX 이식유전자를 결여한 플라스미드로 형질감염된 HeLa 표적 세포에 투여되었다.
도 10은 pIX를 발현하는 프로듀서 세포 및 pIX를 발현하지 않는 프로듀서 세포를 사용한 점착성 및 현탁 배양으로부터의 수율을 비교한다.
당업계는 치료적 이식유전자를 위한 공간을 만들기 위해 야생형 아데노바이러스 게놈으로부터 E1a 및 E1b 단백질 코딩 영역을 결실함으로써 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 제조하는 것을 교시한다. 유사하게, 당업계는 벡터 이식유전자 용량을 증가시키기 위해 바이러스 게놈으로부터 pIX 코딩 영역을 결실시키는 것을 교시한다. 따라서, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터인 ADSTILADRIN® 브랜드 나도파라진 라데노벡은 pIX 코딩 영역을 함유하지 않는 게놈을 가진다.
실시예 1 - HEK293 세포는 상보성을 제공한다
HEK293 셀라인은 1973년에 규명된 아데노바이러스 타입 5 DNA로 인간 배아 신장("HEK") 세포를 형질전환함으로써 확립되었다. 4.5kb의 아데노바이러스 DNA 조각이 HEK 게놈의 19번 염색체에 통합되어 HEK293 셀라인을 생성한다. HEK293 게놈에서 아데노바이러스 DNA의 4.5kB 조각은 아데노바이러스 유전자 e1a, e1b 및 ix를 함유한다. 이것은 아데노바이러스 혈청형 5 게놈의 먼 5' 말단의 약 11%이다.
HEK293 세포는 아데노바이러스 유전자 e1a, e1b 및 ix를 포함한다. 따라서, E1-결실 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 성장할 수 있지만 정상 인간 세포(염색체 DNA에 통합된 아데노바이러스 유전자를 갖지 않는)에서는 성장할 수 없다. 따라서, E1-결실 아데노바이러스는 감염성(복제 가능) 바이러스를 형성할 위험을 줄인다. 당업계는 E1-결실 아데노바이러스를 "조건부 복제성"이라고 하는데, 이것은 바이러스가 조건부로만 복제할 수 있음을 의미한다. 즉, 바이러스 게놈으로부터 누락된 필요한 상보 기능을 제공하는 숙주 세포에서는 조건부로 복제할 수 있고, 필요한 상보 기능을 제공하지 않는 세포에서는 복제할 수 없다. 바이러스 게놈으로부터의 아데노바이러스 유전자 e1a, e1b 및 ix의 결실은 또한 벡터가 적절히 포장할 수 있는 이식유전자의 크기를 증가시킨다.
두 상이한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터인 "Ad A" 또는 "Ad B"를 HEK293 세포에 형질도입했다. Ad A는 pix가 결실된 아데노바이러스 게놈을 가진다. Ad B는 pix 유전자가 온전한 상태로 발현된 아데노바이러스 게놈을 가진다.
3일 후, 형질도입된 세포로부터 배지를 분리했다. 세포를 용해하고 겔 위에 로딩했다. 무세포 배양 배지를 그대로 로딩했다.
도 1은 혈청-함유 배지 중의 Ad A(레인 "Ad A"), 무혈청 배지 중의 Ad A(레인 "Ad A 2") 또는 Ad B로 형질도입된 HEK293 세포에 의해 생성된 pIX 수준을 비교한다.
이들 데이터는 혈청에서 Ad A가 검출가능한 pIX 발현을 초래하지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 또한 아데노바이러스 pix 유전자를 지니고 있음에도 불구하고 HEK293 세포가 단백질 IX를 발현하지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 초기 영역이 결실되고 HEK293 세포에서 생성된 아데노바이러스 벡터는 그들의 캡시드에 pIX를 갖지 않는다. 질량분광법 연구는 단백질 IX가 HEK293 세포에서 생성된 pix 음성인(즉, pix가 결실된 게놈을 가진) 아데노바이러스 벡터에서도 관찰될 수 없다는 것을 확인한다. 따라서, HEK293 세포가 pix 코딩 서열을 함유한다는 사실에도 불구하고 HEK293 세포가 실제로 단백질 IX를 발현하지 않으며 검출가능한 단백질 IX가 없다는 것을 발견했다. 문헌 검색 후, 이러한 관찰이 문헌에도 보고되었다는 것을 발견했다.
배양 배지로부터 혈청을 제거해도(순간적으로 세포 주기를 동기화하기 위해) 이것은 바뀌지 않는다(도 1의 칼럼 Ad A 2 참조).
온전한 상태로 발현가능한 pix 유전자를 포함하는 바이러스의 사용은 측정가능한 단백질 IX를 제공한다(도 1의 칼럼 Ad B 참조).
정제된 Ad A 비리온이 검출가능한 pIX를 지니지 않지만 야생형 아데노바이러스는 그것을 지닌다는 보여주는 또 다른 질량분광법 연구를 수행했다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 2 - 현탁 배양
일회용 생물반응기 시스템을 사용하여 광범위한 공정 개발 작업을 수행했다. 5년 동안 일회용 CultiBagRM™ 생물반응기에서 적어도 46개의 아데노바이러스 뱃치를 만들었다.
이 과정은 롤러 병 또는 쉐이커 플라스크에서 포유류 셀라인의 배양, 세포의 일회용 생물반응기로의 전달, 생물반응기에서 현탁-적응된 세포의 확장 및 세포가 재조합 아데노바이러스를 생성하게 되는 감염을 포함했다.
바이러스 물질은 화학적 세포용해 후 엔도뉴클레아제에 의한 숙주 세포 DNA의 효소절단에 의해 세포로부터 세포내 바이러스를 방출시킴으로써 수거되었다. 다음에, 얻어진 바이러스에 하류 정제 과정을 행할 수 있다.
게놈의 초기 영역의 다양한 부분이 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함하여, 여러 재조합 아데노바이러스를 생성했다. 평균적으로 현탁 배양에서 HEK293 세포는 세포당 약 3.16 x 104 ± 2.61 x 103 바이러스 입자를 생성했다.
실시예 3 - 현탁 배양 대 점착성 배양
벡터 제조를 위한 현탁 세포 배양과 점착성 세포 배양의 생산성을 비교했다. 이를 위해, 혈청형 5 아데노바이러스를 사용했다. 상기 실시예 1과 마찬가지로, 초기-영역 결실된 아데노바이러스를 사용했다. 즉, Ahmed et al (2001)에 의해 설명된 대로, 야생형 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에서 E1a, E1b 및 pIX가 결실되도록 바이러스 게놈을 변형시켰다. 따라서, 아데노바이러스는 E1a-, E1b- 및 pix-음성 게놈을 가졌다. 벡터는 표준 DNA 조작 기술을 사용하여 구성했고, 바이러스 게놈은 또한 일부 아데노바이러스 혈청형 2("Ad2") 유전자 서열을 포함한다.
1-5 L 작업 부피의 쉐이커 플라스크에서 몇 가지 소규모 MOI-변화 테스트를 사용하여, 다양한 현탁 배양 시스템에서 이 벡터의 제조를 비교했다. 놀랍게도, 이들 각 뱃치 각각에서 수율 및 생산성이 현저히 낮았다는 것을 발견했다. 최대 생산성은 세포당 6 x 103 vp이었다. 이것은 세포당 3.16 x 104라는 예전 평균(실시예 1 참조)을 훨씬 하회했다.
현탁 배양을 점착성 배양으로 대체했다. 10% FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고 T-플라스크에서 점착성 HEK293 세포를 사용했을 때 소규모에서 현저히 더 높은 벡터 생산이 달성되었음을 발견했다. 벡터 생산은 현탁 배양보다 점착성 배양을 사용했을 때 최대 2배 더 높았다.
점착성 배양 조건을 사용하여 가장 높은 생산성(9.7 x 104 vp/세포)을 달성했다. 하기 표 "현탁/점착성 과정 비교"를 참조한다. 이러한 결과는 점착성 배양이 현탁 배양보다 생산성이 최대 2배 더 컸다는 것을 보여준다. 추가의 현탁 연구를 수행했는데(데이터는 도시되지 않음), 이들 중 어느 것도 점착성 배양과 비교하여 현탁 배양의 현저히 낮은 생산성을 개선하지 못했다.
Figure pct00001
현탁액에서의 낮은 생산성의 이유는 밝혀지지 않았다.
실시예 4 - pIX는 감염성을 개선한다
표적 HEK293 세포에 형질도입하기 위해 상이한 벡터 게놈 용량을 사용했다. 형질도입된 세포의 수를 형질도입 후 48시간째에 계수했다(표 "pIX는 감염성을 증가시킨다" 참조). 이러한 데이터는 바이러스 게놈당 감염성이 pIX를 발현하는 프로듀서 세포에서 생성된 벡터에서 증가한다는 것을 보여준다.
다음에, 유사한 실험(실시예 5의 표 "pIX-발현 프로듀서 세포에서 제조된 벡터는 더 감염성이다" 참조)을 수행하여, 2개의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 Ad A(pix-결실)와 Ad B(pix-함유)의 감염성을 비교했으며, 여기서 각 바이러스는 정상(pix-음성) 프로듀서 세포 또는 pIX를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 프로듀서 세포에서 생성되었다. 이전 실험(MOI의 범위를 비교한)과 달리, 이 시험에서는 하나의 MOI만을 사용했고, 결과의 통계적 신뢰성을 높이기 위해 더 많은 수의 복제물을 시험했다.
Figure pct00002
이들 데이터는 pix-결실 아데노바이러스 게놈이 pix를 발현하는 프로듀서 세포에서 생성된 경우 더 감염성인 것을 나타낸다. 예를 들어, 상기 표에서 라인 k와 p를 비교한다. 정상 세포에서 생성된 Ad A는 세포당 2.9 vg로 사용되었을 때 표적 세포의 단지 0.5%만을 감염시킨다(라인 k). pix-발현 세포에서 생성된 것은 세포당 2.8 vg으로 감염시 표적 세포의 0.7%를 감염시킨다(라인 p). 즉, pix-발현 세포에서 생성된 경우 더 적은 바이러스 게놈이 40% 더 많은 표적 세포를 감염시킨다.
유사하게, 상기 표에서 라인 l과 q를 비교한다. 정상 세포에서 생성된 Ad A는 세포당 14.5 vg을 사용하여 감염시 표적 세포의 단지 2.1%만을 감염시킨다(라인 l). pix-발현 세포에서 생성된 것은 세포당 14.1 vg으로 감염시 표적 세포의 4.3%를 감염시킨다(라인 q). 즉, pix-발현 세포에서 생성된 경우 약간 더 적은 바이러스 게놈이 더 많은 표적 세포를 감염시킨다. 이들 결과가 도 2에도 도시된다.
서로 모순되지 않는 pIX의 효과에 대한 상이한 가설을 세웠다. 이론과 결부되는 것은 아니지만,
1. 바이러스가 pix-발현 세포에서 생성되었고, 그것이 다른 감염 사례에 사용되는 경우, 그것은 도입 후 표적 세포로 방출될 수 있는 더 많은 pIX 적재량을 가진다. 이 pIX는 숙주 세포 방어를 무너뜨리므로 pIX가 없는 경우보다 더 많은 바이러스가 그들의 수명 사이클을 완료할 수 있다. 또한, 바이러스가 pix를 발현하는 프로듀서 세포를 감염시키는데 사용된 경우, 모든 프로듀서 세포가 1차 라운드에서 감염되는 것은 아니며, 항바이러스 메커니즘이 적어도 일부 세포에서 2차 감염을 늦추거나/방지한다. pIX는 인접한 감염된 세포들에 의해 방출된 항바이러스 신호를 차단함으로써 다음 번의 감염를 위해 프로듀서 세포를 열어두는데 도움이 된다.
2. 단백질 IX를 발현하는 프로듀서 세포는 바이러스 게놈을 적절하게 포장하여 기능적인 감염성 바이러스를 만드는데 더 좋다. 프로듀서 세포가 화학양론적 양보다 많은 양의 단백질 IX, 즉 바이러스 게놈당 12개를 넘는 단백질 IX 분자를 생산함으로써 이것을 가능하게 한다고 생각한다. 여분의 단백질 IX가 바이러스 게놈이 효율적이고 적절하게 포장되도록 하여 게놈당 감염성 입자의 상대적 수율을 증가시킨다고 가정한다.
3. pix를 결여한 아데노바이러스, 특히 여기서 사용된 Ad A는 숙주 세포 핵으로 들어갈 수 없을 수도 있다. 프로듀서 세포에서의 pIX의 발현은 바이러스가 세포내 차단을 제거하여 생산적인 감염을 확립하는데 도움을 준다.
이 반복 실험에 대한 결과는 도 3에 제공된다. 이들 데이터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터가 pIX 폴리펩타이드를 발현하는 프로듀서 세포에서 생산되는 경우 대략 250% 더 감염성이라는 것을 확인한다.
실시예 5 - pIX는 감염 반응역학에 영향을 미친다
더 큰 부피의 바이러스 벡터를 제조하는 방법을 연구하는 것에 더하여, 또한 수득한 벡터를 개선하는 방법을 연구해왔다. 이를 위해, pix-결실 벡터에 pIX를 추가하는 것이 바이러스 안정성에 영향을 미칠 수 있는지를 연구했다.
발현가능한 pIX 유전자를 함유하는 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켜 pIX를 발현하는 HEK293-pIX 세포를 생성했다. pIX를 안정적으로 발현하는 HEK293-pIX 세포("HEK293-pIX(stbl)") 및 pIX를 일시적으로 발현하는 HEK293-pIX 세포("HEK293-pIX(TF)")를 만들었다.
기능적 pix 유전자를 결여한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터("Ad A"), 및 기능적 pix 유전자를 가진 아데노바이러스 유전자 요법 벡터("Ad B")를 획득했고, HEK293 세포 및 HEK293-pIX 세포 각각에서 각 벡터 및 야생형 아데노바이러스(기능적 pix 유전자를 가진)를 제조했다.
문헌 및 본 연구에 따라서, pIX를 발현하지 않는 HEK293 세포를 획득했다. 다음에, 발현가능한 pIX 유전자를 함유하는 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켜, 높은 수준의 pIX를 일시적으로("HEK293-pIX(TF)") 또는 안정적으로("HEK293-pIX(stbl)") 발연하는 HEK293-pIX 세포를 생성했다. 또한 기능적 pIX 유전자를 결여한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 게놈("Ad 벡터 A"), 및 기능적 pIX 유전자를 가진 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 게놈("Ad 벡터 B"), 및 야생형 아데노바이러스 타입 5를 획득했고, HEK293 세포와 HEK293-pIX 세포 둘 다에서 각 벡터 및 바이러스를 제조했다.
하기에서 재료 및 방법을 설명한 후, 결과를 기술한다.
재료 및 방법
재료
이 연구에서, American Type Culture Collection로부터 입수가능한 HEK-293 세포(인간배아신장세포)(카탈록 No. CRL-1573)를 사용했다. 이들 HEK293 세포는 pIX의 코딩 서열을 함유하지만 pIX를 발현하지는 않는다(예를 들어, GRAHAM (1977) pp. 65-66; SPECTOR (1980) 참조). HEK293를 출발 물질로 사용하여 안정적으로 pIX를 발현하는 HEK293-pIX(stbl) 계통을 생성했다.
본 연구에 사용된 pIX 삽입물은 상기 언급된 HEK293 세포 게놈으로부터 중합효소 연쇄반응에 의해 그것을 증폭시킴으로써 생성되었다.
2개의 아데노바이러스 타입 5 바이러스 벡터를 사용했다. 하나의 벡터("B" 벡터)는 완전한 pIX 코딩 영역을 가진 아데노바이러스 벡터 게놈을 함유했다. 다른 하나의 벡터("A" 벡터)는 pIX-암호화 영역이 결실되고 Ad2 서열의 일부를 함유하는 아데노바이러스 벡터 게놈을 함유했다. 이들에 더하여, 야생형(pIX 함유) 아데노바이러스 타입 5가 사용되었다.
방법
플라스미드 제조
아데노바이러스 단백질 IX(pIX) 서열을 함유하는 트랜스제닉 플라스미드를 제조했다. 중합효소 연쇄반응에 의해 HEK293 세포 게놈으로부터 pIX 서열을 증폭시켰고, pcDNA3.1™ 벡터 베이스(Thermo Scientific의 Adgene로부터 상업적으로 입수가능)에 클로닝했다. pIX 이식유전자를 XbaI+EcoRV 개방형 pcDNA3.1 플라스미드에 삽입했다(도 5 참조). pIX는 CMV 프로모터 하에 있고, 그것의 배향은 도 5에 도시된 대로 코딩 영역이 CMV의 하류에서 시작하도록 배향된다. pIX-코딩 플라스미드로 세포가 형질감염된 후 pIX를 항-pIX 항체로 염색함으로써 세포에서 pIX 발현을 확인했다. 이 pIX 양성 신호에 더하여, 핵에서 pIX의 세포내 위치는 문헌에서 높은 pIX 발현시 보였던 것과 일치한다(감염된 세포 핵에서 pIX의 얼룩덜룩한 분포, Rosa-Calatrava et al., 2001).
단백질 암호화 서열 IX의 효소절단 및 정제
PCR에 의한 증폭 후, pIX DNA 코딩 영역을 XbaI 엔도뉴클레아제로 효소절단했다. 효소절단은 CutSmart™ 버퍼(New England Biolabs, 미국 매사츄세츠)에 현탁된 PCR 생성물 50μl를 사용하여 행했으며, 60 유닛 XbaI(New England Biolabs)와 뉴클레아제-무함유, 분자생물학 등급 물(ThermoScientific, 미국 매사츄세츠)을 사용했다. 인큐베이션 및 비활성화를 하기 표, "플라스미드 pcDNA3.1-pIX의 제조에 사용된 효소"에 따라서 수행했다.
제한 효소의 비활성화 후, SYBR safe™ DNA 겔 스테인(Invitrogen, 미국 캘리포니아) 및 사이즈 마커로서 Generuler™ DNA 래더 믹스(Thermo Scientific) 5μl를 사용하여 1% 아가로오스 겔에서 샘플을 전개시켰다. 겔은 50분 동안 110 V에서 Horizon 11.14™(Life Technologies, 미국 캘리포니아)를 사용하여 전개되었다. ChemiDoc™ Touch Imaging System(Biorad, 미국 캘리포니아)을 사용하여 겔을 촬영했다. DNA를 함유하는 밴드를 잘라서 Qiaquick™ 겔 추출 키트(Qiagen GmbH, 독일 힐덴)를 사용하여 DNA를 분리했다. NanoDrop™ ND-1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 농도를 측정했다.
Figure pct00003
다음에, 이 DNA 샘플에 폴리뉴클레오타이드 5'-하이드록실 키나제 처리(PNK)를 행하여 삽입물의 5' 말단에 감마 포스페이트를 추가했다. 반응 혼합물은 샘플(56μl), 버퍼(T4 DNA 리가제 버퍼 + 10 mM ATP, New England Biolabs), PNK(T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 3' 포스페이트, BioLabs, 미국 매사츄세츠) 10 유닛 및 물로 구성되었다. 상기 표 "플라스미드 pcDNA3.1-pIX의 제조에 사용된 효소"에 따라서 반응물을 인큐베이션했다.
pcDNA 3.1™의 효소절단 및 정제
XbaI 50 유닛과 EcoRV-HF 제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs) 50 유닛과 물이 첨가된 CutSmart™ 버퍼에서 제한 효소 반응을 수행하여 플라스미드 주형(7μg pcDNA3.1™)을 효소절단했다. 반응 혼합물을 표 "플라스미드 pcDNA3.1-pIX의 제조에 사용된 효소"에 따라서 반응물을 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 혼합물을 물 40μl, 상기 버퍼 및 쉬림프 알칼리성 포스파타제(SAP) 5 유닛으로 희석하여 DNA 사슬 말단으로부터 포스페이트를 제거해서 자체-리게이션을 방지했다. 샘플(70μl)에 로딩 컬러 14μl를 첨가했다. 다음에, 샘플을 1% 아가로오스 겔 상의 2개 웰에 피펫팅했다. 또한, 겔 위에 마커 6μl를 피펫팅했다. 겔을 55분 동안 100 V에서 전개시켰다. 효소절단된 플라스미드 DNA를 QIAquick™ 겔 추출 키트의 설명서에 따라서 겔로부터 분리했다. NanoDrop™ 분광광도계를 사용하여 농도를 측정했다.
pcDNA3.1에 단백질 IX 서열의 리게이션
리게이션 반응물은 pcDNA3.1™ 플라스미드(50 ng 겔-정제 플라스미드), 버퍼(T4 DNA 리가제 버퍼, ATP 10Mm 함유), 리가제(T4 DNA 리가제 400 유닛, New England Biolabs), 삽입물(41.6 ng 겔-정제 삽입물) 및 물로 구성되었다. 인큐베이션 및 비활성화 조건은 표 "플라스미드 pcDNA3.1-pIX의 제조에 사용된 효소"에 따랐다.
pcDNA3.1-pIX 플라스미드를 사용하여 박테리아의 형질전환
리게이션 샘플을 열충격법을 사용하여 One Shot™ Omnimax™ 브랜드의 화학적으로 적합한 E. coli(Invitrogen)에 넣어 형질전환했다. 세포를 얼음 위에서 해동한 후, 리게이션 샘플 2μl를 세포 40μl와 조합했다. 양성 대조군으로 Puc19 DNA 플라스미드(Invitrogen) 1μl를 사용했다. 샘플을 30분 동안 얼음 위에 방치했다. 다음에, 이들을 30초 동안 +42℃에서 가열했다. 다음에, 샘플을 2분 동안 그대로 유지했다. 다음에, SOC 배지(Invitrogen) 250μl를 첨가하고, 튜브를 70분 동안 37℃ 및 225rpm에서 인큐베이션했다. 세포(100μl)를 암피실린 플레이트, 50μg/ml AMP(Sigma Chemical Co., 미국 미주리) 상에 평판하고, 16시간 동안 +37℃에서 인큐베이션했다.
정확한 pcDNA3.1-pIX 클론을 위해 콜로니를 스크리닝하기 위한 콜로니-PCR
플레이트로부터 박테리아 콜로니 샘플을 96-웰 플레이트의 웰에 50μl 배양 배지(용원성 브로스(+ AMP), Sigma-Aldrich, 미국 미주리) 중에 수거했다. 플레이트를 2시간 45분 동안 +37℃ 및 225rpm에서 인큐베이션했다. 배양된 콜로니에 하기 표 "콜로니 PCR에 사용된 반응 혼합물"에 따라서 PCR 반응을 행했다. 사용된 프라이머는 하기 표 "프라이머"에 제시된다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Peltier PTC-200™ 서머 사이클러(Bio-Rad)에서 하기 표 "콜로니 PCR에 사용된 프로그램"에 따른 프로그램 대로 PCR을 수행했다.
Figure pct00006
40분 동안 120 V에서 1% 아가로오스 겔(생성물 10μl/웰 + 2μl 로딩 버퍼) 상에서 PCR 생성물을 분리했다. 또한, 상기 설명된 대로 마커를 포함시켰다. 상기 설명된 대로 겔을 촬영했다. 겔에 근거하여, 배양될 pcDNA3.1-pIX 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니를 선택했다. 선택된 콜로니를 LB-AMP 배양 배지 4ml에 넣고, 16시간 동안 170rpm에서 +37℃에서 배양물을 성장시켰다.
미니프렙 정제
정확한 플라스미드를 지닌다고 생각되는 박테리아를 증식시키기 위해, 콜로니 PCR 후 4ml LB-Amp에서 성장된 pcDNA3.1-pIX-형질감염 박테리아에 대해 미니프렙 DNA 정제를 수행했다. Macherey-Nagel GmbH(독일) 사의 미니프렙 키트를 사용했다. NanoDrop™ 분광광도계를 사용하여 샘플 농도를 체크했다.
pcDNA3.1-pIX 구조를 확인하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 반응
정제된 플라스미드에 SmaI 제한 효소절단을 행하여 사용가능한 정확한 삽입물을 가진 플라스미드 프렙을 확인했다. 효소절단 반응물은 플라스미드(300 ng/반응물), 1 x CutSmart™(New England Biolabs), 제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs) 10 유닛 및 물로 구성되었다. 인큐베이션 및 비활성화 조건은 표 "플라스미드 pcDNA3.1-pIX의 제조에 사용된 효소"에 따랐다. 레인당 샘플 20μl와 로딩 버퍼 4μl를 사용하여 상기 설명된 대로 1% 아가로오스 겔 상에서 효소절단된 샘플을 분리했다. 또한, 마커 5μl를 하나의 레인에 피펫팅했다. 겔을 45분 동안 110 V 그리고 15분 동안 130V에서 전개시켰다. 상기 설명된 대로 겔을 촬영했다. 제한 효소 절단에 의해 정확한 pcDNA3.1-pIX 플라스미드를 확인한 후 그것을 서열화했다(Gatc-biotech.com/lightrun). 이 서열화에 사용된 프라이머는 표 "프라이머"에 제시된다.
세포 배양
바이러스 생성과 수득한 바이러스의 감염성 분석에 모두 HEK293 세포를 사용했다. 세포 배양 배지로는 10% 우태혈청(FBS), 2mM 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, 미국 뉴욕)으로 보충된 듈베코스 변형 이글 배지(DMEM)를 사용했다. 세포를 Hera Cell 150™ 인큐베이터((Heraeus, 독일)에서 +37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰고, 배양물을 2주마다 두 번 분할했다. 세포 계수를 위해 배양 배지를 제거하고, 세포를 포스페이트 완충 식염수(Gibco, 미국 뉴욕)로 세척했다. TrypLE Select™(Gibco)를 사용하여 세포를 해리하고 신선한 배양 배지에 현탁했다. 0.2%의 최종 농도로 트리판 블루(Invitrogen)를 사용하여 세포를 염색하고 2분 동안 실온에서 인큐베이션했다. Countess II™ 세포 계수기(Invitrogen)를 사용하여 세포를 계수했다. 하기 식을 사용하여, 얻어진 세포의 수에 따른 감염에 필요한 바이러스의 수를 계산했다:
바이러스 ÷ [웰 당 배지 mL] = [세포 당 바이러스 게놈 × 웰 당 세포] ÷ 배지 mL 당 바이러스 게놈
안정적으로 pIX를 발현하는 HEK293-pIX(stbl) 셀라인
HEK293 세포를 pcDNA3.1-pIX 플라스미드를 사용하여 형질감염시켰고, 선택 시약(Geneticin, 200-600μg/ml)의 존재하에 배양했다. 세포 은행을 제조했고, 웨스턴 블롯 겔 상에서 pIX의 발현을 확인했다.
바이러스 생성
바이러스 생성 목적은 새로운 뱃치의 아데노바이러스 벡터와 아데노바이러스를 생성하기 위한 것이었고, 이들 중 일부는 pIX의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 세포내 환경에서 생성될 수 있었다. (만약 있다면) 벡터들의 차이가 제어되지 않은 제조상의 변화로 인한 결과가 아니었음을 검증하기 위해 몇 개의 별개의 제조 사례를 만들었다.
아데노바이러스 벡터 및 바이러스 생성
바이러스 감염 전 세포의 일부를 형질감염시킨 것을 제외하고는 표준 아데노바이러스 생성 기술을 사용하여 점착성 세포 배양물에서 벡터 및 바이러스를 생성했다. 25, 75 또는 175cm2 세포 배양 플라스크 또는 500cm2, 3-층 플라스크(Thermo Fisher Scientific) 위에 형질감염 당일 약 70-90% 컨플루언스를 제공할 수 있는 밀도로 HEK293 및 HEK293-pIX(stbls) 세포를 평판했다. 바이러스당 총 1-5개의 플라스크에 평판했다. 플라스크의 일부는 바이러스 감염 전에 단백질 IX-발현 플라스미드로 형질감염시켰다.
항-pIX 항체를 사용하여 정제된(CsCl + 투석) 아데노바이러스 스톡에서 pIX의 존재 또는 부재를 확인했다. 도 7은 이들 분석의 결과를 도시한다. pIX-코딩 영역을 포함하는 아데노바이러스, 및 pIX를 발현하는 프로듀서 세포에서 생성된 아데노바이러스에서는 pIX의 존재가 염색에 의해 드러나지만, pIX 코딩 영역을 결여하고 pIX를 발현하지 않는 프로듀서 세포에서 생성된 아데노바이러스에서는 그렇지 않았다. 이러한 데이터는 pIX를 코딩하지 않는 아데노바이러스인 Ad, A는, 바이러스 프로듀서 세포가 pcDNA3.1-pIX 플라스미드로 형질감염되지 않는다면 pIX를 함유하지 않는다는 것을 확인한다.
형질감염
형질감염을 위해, 형질감염 당일 세포 배양 배지를 신선한 배지로 교체했다. 배지 교환 후 배지 부피는 당해 플라스크에 권장된 표준 배지 부피의 약 50%였다. pIX 코딩 영역을 지닌 플라스미드(100-200ng/cm2 배양 면적)를 신선한 배지 또는 NaCl 용액(플라스크당 약 3ml)에 현탁했다. PEIpro 또는 JetPEI(Polyplus™) 폴리에틸렌이민 형질감염 시약을 등가의 부피로 희석했다. PEI를 플라스미드에 대해 1-2배 질량비로 사용했다. GFP 또는 mCherry-함유 플라스미드를 성공적인 형질감염의 형광 현미경 확인을 위한 형질감염 대조군으로 사용했다. 희석된 PEI를 희석된 DNA에 첨가, 혼합했고, 이 용액을 15-25분 동안 인큐베이션했다. 다음에, 이 형질감염 혼합물을 세포 위에 첨가했다. 4시간 후, 10% FBS를 함유하는 신선한 배지로 배지를 교환했다.
pcDNA3.1-pIX 플라스미드에 의한 형질감염이 pIX 발현을 초래하는지 확인하기 위해, HEK293 세포를 형질감염시키고, 48시간 인큐베이션 후 항-pIX 항체로 염색했다. 도 6은 이에 대한 전형적인 결과를 도시한다. 항-pIX(2차 염색된 적색)에 더하여, 또한 핵(청색) 및 세포 튜불린(녹색)을 염색했다. 표준 형광 현미경을 사용하여 세포를 연구했다. 도 6은 항체가 단백질을 인식한 것을 보여주며, pIX에 대해 보고된 것과 유사한 방식으로 핵이 편재화된 것을 나타낸다.
벡터 및 바이러스 감염
형질감염된 플라스크의 일부에 Ad 벡터 B(pIX 코딩 영역을 가진)를 첨가했다. 다른 플라스크에는 Ad 벡터 A(pIX 코딩 영역을 결여한) 또는 야생형 아데노바이러스를 첨가했다. 각각에 세포 당 40-200개 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈으로 첨가되었다. 플라스크 중 일부(예컨대 mCherry 및 GFP 리포터 플라스크 및 무작위 pcDNA3.1-pIX 형질전환 플라스크)는 대조군으로 사용했다. 2시간 후, 각 플라스크에 배양 배지를 권장된 배양 부피만큼 첨가했다. 다음에, 플라스크를 48-72시간 더 인큐베이션했다. 감염된 세포를 배양 배지에 분리하고, 실온에서 10분 동안 약 1100 x g에서 배지를 원심분리하여 세포 펠릿을 만들었다. 펠릿을 1-4ml PBS에 재현탁한 다음, 3번 반복하여 -80℃에서 동결한 후 +20-37℃에서 해동함으로써 세포를 용해시켜 벡터/바이러스를 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포 단편들을 분리했다(500-2000 x g, 10-20분, +4℃).
필요한 경우, 상청액으로부터 바이러스와 벡터 입자를 정제했다. 바이러스 정제를 위해, 한외여과 튜브(Beckman, 미국 캘리포니아)에서 CsCl 구배를 만들었다(1.45 g/ml CsCl 6ml 및 1.33 g/ml CsCl 14ml). 튜브를 세포 용해 상청액으로 채우고, CsCl 구배를 SW28™ 로터(Beckman)를 구비한 Optima™ LE-80K 한외원심분리기(Beckman Coulter)를 사용하여 28,000rpm 및 76,220 x g, +21℃에서 19시간 동안 한외원심분리했다. 바늘(Microlance™ 23 XG, Becton Dickinson, 미국 뉴저지)과 주사기(Terumo, 일본)를 사용하여 한외원심분리된 튜브로부터 바이러스 띠를 수집했다. 다음에, 바이러스를 Slide-A-lyzer™ 10,000 MWCO 투석 카트리지(Thermo Scientific)에 주입했고, 이 카트리지를 멸균 PBS 2리터에 침지시켰다. 4시간부터 하룻밤까지 상이한 뱃치에 대해 상이한 지속기간을 두고 투석 버퍼 교환을 수행했는데, 대략 2리터 부피로 CsCl을 PBS로 교환했다. 투석 카트리지로부터 바늘로 바이러스를 수집한 다음, 이 바이러스를 -80℃에 보관했다.
ddPCR 역가 분석을 사용하여 바이러스 물질의 역가를 결정했다. 형질감염 효율을 검토하기 위해 Olympus IX81, LUCPlan FLN 40X / 0.60 Pl2 ∞ / 0-2 / FN22(Olympus Corp., 일본)을 사용하여 형광 현미경으로 형질감염 대조군을 검사했다.
또한, 유세포계수법에 의해 형질감염 효율을 결정했다. 이를 위해, 세포를 PBS로 세척하고 TryPLE Select™을 사용하여 세포를 해리하고 이 세포를 PBS에 재현탁했다. 다음에, 5분 동안 300 x g에서 세포를 원심분리했고, 펠릿을 500μl PBS에 재현탁했다. 다음에, 튜브에 PBS(Sigma-Aldrich) 중의 4% 파라포름알데하이드 500μl를 첨가한 다음, 15분 동안 +4℃에서 튜브를 인큐베이션했다. 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 만든 후, 상기와 같이 PBS로 세척하고 원심분리했다. 펠릿을 PBS에 다시 재현탁하고, 유세포계수법에 의해 양성 세포의 양을 측정했다.
ddPCR에 의한 아데노바이러스 역가의 결정
샘플에 DNase 및 프로테이나제 K 처리를 행했다. 반응 혼합물은 샘플(10μl), DNAs(2U, Invitrogen) 및 버퍼(0.05 vol.% Pluronic F-68을 첨가한 DNAse 버퍼(Gibco))로 구성되었다. 혼합물을 30분 동안 +37℃에서 인큐베이션한 후, 10분 동안 +95℃에서 비활성화시켰다. 프로테이나제 K(2U, 스위스 로체)와 버퍼를 첨가했다. 다음에, 30분 동안 +50℃에서 인큐베이션한 다음, 20분 동안 +95℃에서 비활성화시켰다. ddPCR을 위한 반응 혼합물은 하기 표 "ddPCR에 사용된 반응 혼합물"에 제시되고, 사용된 프라이머는 상기 표 "프라이머"에 제시된다.
Figure pct00007
제조자의 지시에 따라서 반응을 전개시켰다(Automated Droplet Generator, C1000 Touch Thermal Cycler, QX200 Droplet Reader, Bio-Rad). 프로그램은 하기 표 "ddPCR에 사용된 프로그램"에 제시된다. Quantasoft™ 1.7.4.0917(Bio-Rad) 프로그램에서 결과를 분석했다.
Figure pct00008
아데노바이러스 샘플의 웨스턴 블롯 및 코마시 염색
바이러스 및/또는 세포에 함유된 단백질을 웨스턴 블롯 및/또는 코마시 염색을 사용하여 검사했다. 일부 경우, +60℃에서 60분 동안 분석 전에 샘플을 농축했다(콘센트레이터 플러스/바큐퓨즈 플러스, Eppendorf, 독일). 로딩 버퍼(Laemmli, Bio-Rad)를 샘플에 로딩하고 이것을 +96℃에서 10분 동안 가열했다. Mini-PROTEAN™ TGX 프레-캐스트 겔 4-20%(Bio-Rad)을 사용했고, 웰 당 샘플 22μl를 피펫팅하고, Precision Plus™ 단백질 마커(Standard Dual Color, Bio-Rad) 8μl를 더 피펫팅했다. 소듐 라우릴 설페이트 버퍼(Bio-Rad)에서 PowerPac™ 베이직 파워 서플라이(Bio-Rad)를 사용하여 15분 동안 80 V에서 겔을 전개시킨 다음, 30분 동안 180 V에서 전개시켰다. 다음에, Trans-Blot Turbo™ 멤브레인, 0.2μm PVDF(Bio-Rad) 위에 겔을 블롯팅했다. 블롯팅 용액(5% 밀크파우더(Valio, 핀란드)와 0.05% Tween™ 20(Merck)를 첨가한 PBS) 중에서 1시간 동안 멤브레인을 인큐베이션했다. 블롯팅 용액을 블롯팅 용액에 1:500 희석된 1차 항체 항-pIX(α-pIX 토끼) 혈청(워싱턴 유니버시티 세인트 루이스 메디슨 스쿨의 David Curiel 및 Igor Dmitriev 교수가 제공)으로 교환했다. 다음에, 멤브레인을 20시간 동안 +4℃, 100rpm에서 인큐베이션했다. 멤브레인을 PBS(0.05% Tween™ 20 첨가)로 10분씩 4번 세척한 후, 블롯팅 용액에 1:3000 희석된 2차 항체(염소 항-토끼 IgG (H + L) - HRP 콘쥬게이트, Bio-Rad)를 첨가했다. 다음에, 멤브레인을 3시간 동안 실온에서 100rpm으로 인큐베이션했다. ChemiDoc™ Touch Imaging System(Bio-Rad)에서 Chemi/UV/스테인-프리 트레이를 사용하여 이미지를 디지털화했다.
코마시 블루 염색에서는 산출물과 HEK-293 음성 대조군의 바이러스 겔의 샘플을 염색했다. 상기 설명된 대로 겔을 전개시켰다. 이후, 겔을 100rpm에서 15분 동안 에탄올과 아세트산(40%-10%)의 혼합물에 고정했다. 다음에, 겔을 각 5분씩 4번 물로 세척하고, 20시간 동안 100rpm, +4℃에서 QC 콜로이드 코마시 스테인(Bio-Rad)으로 염색했다. 다음에, 겔을 각 10분씩 4번 물로 세척한 다음, ChemiDoc™ Touch Imaging System(Bio-Rad)의 화이트 트레이를 사용하여 디지털화했다.
아데노바이러스 샘플의 감염성 시험
HEK293 세포를 웰 당 2.4 x 105로 12-웰 플레이트에 피펫팅했다. 각 웰에 10% FBS가 첨가된 배양 배지 1ml를 첨가했다. 플레이트를 약 24시간 동안 +37℃, 5% CO2에서 인큐베이션했다. 세포를 앞서 설명된 대로 플레이트당 하나의 웰로부터 계수했다. 바이러스를 원하는 양(40-200vg/세포)으로 웰에 피펫팅했다. 또한, 음성 대조군에는 바이러스를 첨가하지 않았다. 바이러스에 더하여, 각 웰에 무혈청 성장 배지를 최종 부피가 500μl가 되도록 첨가했다. 플레이트를 5% CO2, +37℃에서 인큐베이션했다. 2시간 후, 배지를 10% FBS가 첨가된 신선한 배지 1ml로 교환했다. 다음에, 세포를 5% CO2, +37℃에서 46시간 동안 인큐베이션했다.
배양 용액을 흡인하고 TryPLE Select 300μl를 사용하여 세포를 제거했다. TryPLE Select에 PBS 900μl를 첨가하고 세포를 에펜트로프 튜브로 옮겼다. 혼합물에 2mM MgCl2 및 벤조나제(Merck Millipore, 덴마크) 50 유닛을 첨가했다. 혼합물을 10분 동안 +37℃에서 인큐베이션했다. 세포를 5분 동안 500 x g에서 원심분리했다. 세포를 고정하기 위해, PBS 및 1:1 아세톤(VWR Chemicals, 미국 펜실베니아)과 메탄올(Sigma-Aldrich)의 혼합물 500μl를 첨가했다. 세포가 고정되도록 45분 동안 4℃에서 방치했다. 다음에, PBS 1ml를 첨가했고, 혼합물을 +4℃에 보관했다.
다음에, 세포를 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고 PBS로 세척하고 다시 원심분리했다. 상청액을 제거했고, 차단 용액으로서 PBS 중의 1% BSA 500μl를 첨가하고 상기 설명된 대로 원심분리했다. 튜브에 차단 용액 50μl를 남겨두고 DFA Reagent™ 항-헥손 단일클론 항체(Millipore Corp, 메사츄세츠) 25μl를 첨가했다. 다음에, 20분 동안 +4℃에서 인큐베이션한 다음, PBS 925μl를 첨가하고 앞서 설명된 대로 원심분리했다. 상청액을 제거하고 펠릿을 PBS 150μl에 재현탁했다. 다음에, 샘플을 96-웰 플레이트에 피펫팅했고, CytoFlex S Ordiorflow 세포계수계(Beckman Coulter)를 사용하여 판독하고, CytExpert™ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석했다.
pIX 발현 확인을 위한 세포 염색 및 형광 현미경
HEK293 세포를 Ibidi μ-slide™#80826 8-웰 플레이트(ibiTreat GmbH, 독일)에 10% FBS가 첨가된 DMEM 200μl 중에 평판했다. 이 슬라이드를 5% CO2, +37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.
100μl 배양 배지 중의 플라스미드(pcDNA3.1-pIX) 0.2μg로 보충된 100μl 배양 배지 중의 PEIpro 0.28μl의 형질감염 혼합물을 만들었다. 혼합물을 교반하고 20분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 세포에 첨가했다. 4시간 후, 배지를 신선한 배지로 교환한 다음, 48시간 동안 5% CO2, +37℃에서 세포를 인큐베이션했다. 세포를 PBS로 세척하고 2% PFA로 고정했다. 20분 후, 0.1% Triton™ X-100(Fluka, 스위스)을 세포에 첨가했고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 PBS 중의 1% 우태 알부민 차단 용액으로 세척했다. 차단 용액으로 1:500 희석된 항-pIX 단일클론 항체를 1차 항체로 사용했다. 다음에, +4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 세포를 2번 세척한 다음, 차단 용액으로 1:500 희석된 Alexa Fluor 647 당나귀 항-토끼 항체(카탈록 #150075; Abcam Limited, 영국)을 ml당 1.98mg 사용하여 처리했고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 차단 용액으로 2번 세척했다.
다음에, 웰에 NucBlu™(Invitrogen) 150μl를 첨가했다(ml당 2방울). 또한, 1:250 DMIA, FITC-콘쥬게이트 α-튜불린 항체 차단 용액(카탈록 #Ab64503; Abcam Inc.)를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션했다. 오일렌즈를 구비한 Olympus™ IX81 형광 현미경(60x / 1.35 UplanSApo ∞ / 0.17 / FN26.5)를 사용하여 샘플을 촬영했고, CellSens™ 표준 소프트웨어(Olympus)로 분석했다.
결과
본 연구의 원래 목적은 아니지만, 놀랍게도 프로듀서 세포에서의 pIX의 과발현이 벡터 생산 속도와 수득한 아데노바이러스 벡터가 표적 세포에 형질도입하는 속도를 모두 증가시킨다는 것을 발견했다. 또한 이들 아데노바이러스가 표적 세포에 투여되었을 때 정상(단백질 IX가 없는) HEK293 세포에서 생성된 대응물보다 더 빠른 감염을 나타내는 것을 확인했다.
놀랍게도 프로듀서 세포에서의 pIX의 발현이 pix-결실 바이러스를 생성하는데 뿐만 아니라 야생형 아데노바이러스를 생성하는 것을 포함하여 pix-함유 바이러스에 대해서도 유익한 효과를 가진다는 것을 발견했다.
놀랍게도 프로듀서 세포가 단백질 IX를 가지는 경우, 이들 프로듀서 세포에서 생성된 바이러스가 단백질 IX를 결여한 프로듀서 세포에서 생성된 바이러스보다 더 빠르게 세포변성 효과(CPE, 바이러스 감염의 징후)를 달성한다는 것을 발견했다. 더 구체적으로, 낮은 감염 다중도("MOI") 후, ARM 바이러스는 3일만에 pIX 과발현 세포에서 CPE를 보인 반면, 정상 HEK 세포는 4일만에 CPE를 나타냈다.
또한 프로듀서 세포가 pIX를 발현하는 경우, 이 프로듀서 세포는 pIX를 발현하지 않는 프로듀서 세포보다 훨씬 빠르게 벡터를 생성한다는 것을 발견했다.
또한 놀랍게도 pIX-발현 세포에서 생성된 벡터는 pIX를 발현하지 않는 프로듀서 세포에서 생성된 유사한 벡터보다 더 효과적으로 표적 세포에 형질도입한다는 것을 발견했다.
pIX를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 pIX가 없는 벡터보다 더욱 빠르게 표적 세포를 감염시키고 형질도입한다는 결론을 내렸다. 놀랍게도, 또한 pIX 발현 세포에서 생성된 벡터의 바이러스 감염성(감염성/바이러스 입자)이 증가한 것도 확인했다.
본 실험은 pIX 폴리펩타이드가 없는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 및 pIX를 가진 아데노바이러스 유전자 요법 벡터(예를 들어 야생형 아데노바이러스 게놈에서와 같이, 아데노바이러스 게놈의 일부로서 발현된, 또는 별도의 플라스미드에서 발현된)의 제조를 평가한다. 이들 결과는 pIX 폴리펩타이드를 사용한 환경에서 제조된 아데노바이러스 벡터는 pIX 폴리펩타이드가 없는 환경에서 생성된 것들보다 더 감염성인 아데노바이러스 바이러스 벡터 입자를 생성한다는 것을 나타낸다. 감염성을 증가시킴으로써, 필요한 수의 표적 세포를 형질변형하는데 필요한 벡터 입자의 수를 감소시킬 수 있다. 또한, 증가한 감염성은 유전자 요법 벡터의 치료적 용량을 투여하는 것과 이식유전자 발현의 특정한 수준을 달성하는 것 사이의 지연 시간을 감소시킨다.
pIX-발현 프로듀서 세포에서 제조된 벡터는 더 감염성이다
2개의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터인 Ad A(pix-결실) 및 Ad B(pix-함유)를 정상 HEK293 세포(pIX를 발현하지 않음) 또는 pIX를 일시적으로 발현하도록 형질감염된 HEK293 세포에서 각각 생성했다. 이들 4개의 벡터를 CsCl 구배 원심분리 및 투석 기술을 사용하여 정제했다. 캡시드로 둘러싸인 벡터 게놈의 농도를 알아보기 위해 ddPCR 방법을 사용하여 벡터를 적정했다. 도 3은 감염성에 대한 pIX의 효과를 예시한다. 이러한 데이터는 pix-발현 프로듀서 세포에서 pix-결실 아데노바이러스를 생성하는 것은 수득한 벡터의 감염성을 2배 이상 증가시킨다는 것을 보여준다. 놀랍게도 이러한 데이터는 또한 pix-발현 프로듀서 세포에서 pix-함유 아데노바이러스를 생성하는 것도 수득한 벡터의 감염성을 2배 이상 증가시킨다는 것을 보여준다. 이것은, 당업계에 의하면 pix-발현 프로듀서 세포에서는 아데노바이러스 게놈에 있는 pix 유전자는 불필요해서 추가적인 이득을 제공하지 않을 것이라고 예상하고 있기 때문에 놀라운 발견이다.
Figure pct00009
실시예 6 - pIX는 표적 세포 형질도입을 가속한다
프로듀서 세포에서의 pIX의 발현은 표적 세포에 더 빠르게 형질도입할 수 있는 바이러스 벡터를 생성하는 것으로 나타났다.
도 4는 4개의 상이한 아데노바이러스 벡터 각각으로 형질전환된 표적 숙주 세포의 유세포계수 분석을 도시한다. 패널 A는 게놈에 pIX 코딩 영역을 포함하는(따라서 생성되었을 때 pIX 폴리펩타이드를 발현하는) 아데노바이러스 유전자 요법 벡터에 대한 결과를 도시한다. 패널 B는 pIX 폴리펩타이드를 발현하는 플라스미드로 형질감염된(따라서 pIX 폴리펩타이드를 발현하는) HEK293 세포에서 생성된 동일한 벡터에 대한 결과를 도시한다. 패널 C는 pix를 결여한 게놈으로부터 제조된 아데노바이러스 유전자 요법 벡터로서, HEK293 세포에서 생성되고, 따라서 HEK293 세포에서 제조되었을 때 pIX를 결여하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터에 대한 결과를 도시한다. 패널 D는 pIX 폴리펩타이드를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포에서 생성된 동일한 벡터에 대한 결과를 도시하며, 따라서 이들 바이러스 입자는 생성되었을 때 pIX를 가진다. 각각의 산포도에서, 바이러스 생성의 명백한 종점이 x 축의 중앙을 향하여 산포도 하단에 어두운 클러스터로 표시되며, 이것은 용해한 죽은 세포의 집단을 나타낸다.
제조되었을 때 pIX를 포함하는 3개의 벡터는 각각 실험 기간 내에 용해되거나 죽은 세포들의 플럼을 생성한다. pIX를 완전히 결여한 1개의 벡터(pIX-음성 프로듀서 세포에서 생성된 pIX-음성 바이러스, 패널 C)는 실험 기간 내에 이러한 플럼을 생성하지 않았다. 플럼이 생길 것으로 예상되는 장소는 도면에 화살표로 표시된다.
이들 결과는 감염 유전자 요법 비리온이 pIX를 가지는 경우 아데노바이러스 유전자 요법 벡터가 표적 세포 집단에 더 빠르게 형질도입할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7 - pIX는 감염성을 증가시킨다
pIX는 여러 가지 방법으로 바이러스 감염성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. pIX는 바이러스 프로듀서 세포에서 발현 또는 과발현될 수 있으며, 수득한 바이러스는 pIX가 없는 프로듀서 세포에서 생성된 바이러스와 비교하여 더 효율적으로 또는 더 빠르게 진행하는 것 같은 감염을 일으켜, 주어진 시간에 더 많은 감염된 세포를 생성할 수 있다. 다른 한편, pIX를 발현하는 세포에서 생성된 바이러스는 또한 표적 세포에 투여되었을 때 더 많은 세포를 감염시키는 것 같다. 앞선 분석에서, 표적 세포당 한정된 수의 바이러스 게놈을 사용했다. 이것은 pIX가 실제로 게놈당 감염성을 증가시키는지, 아니면 미지의 메커니즘을 통해 단지 게놈 역가 효능에 영향을 미치는지에 대한 질문을 제기한다.
게놈 적정 단계를 생략하기 위해, 앞서 사용된 것과 동일한 부피 및 동일한 상황에서 pix-함유 바이러스를 생성했다(3회 동결-해동 및 1ml로 희석 후 5μl). 이 바이러스를 사용하여, 2일 전에 7 x 104 HEK293 세포가 파종된 웰을 감염시켰다. 감염 시간은 21-23분이었다. 각 웰로부터 약 2.8-4.8 x 104 세포를 분석했다.
이러한 데어터는 pIX가 대부분의 경우 부피당 생성되는 감염 단위의 수를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 야생형 Ad의 경우, 일시적으로 형질감염된 HEK293은 감염성을 증가시켰다. Ad B(게놈에 pix를 함유하는 아데노바이러스)의 경우, 안정적으로 pIX를 발현하는 세포가 형질도입 단위 생산성을 가장 많이 증가시켰다.
또한 표준(pIX-음성) HEK293 세포에 비해 안정적으로 pIX를 발현하는 세포에서의 ARM 감염성의 감소를 관찰했다. 이러한 감소는 사용된 HEK293(stbl)에서 관찰된 준최적 배양 밀도로 인한 것 같았다. 현미경 관찰은 이들 세포에서의 ARM 복제 속도가 이전 테스트에서 사용된 대조군과 비교하여 약간 증가했음을 보여준다(데이터는 도시되지 않음). Ad A + pcDNA3.1이 중요한 대조군이었으며, 이것은 발현 플라스미드 단독으로는(pIX 없는 경우) 감염성이 증가한 이유가 아니었음을 보여준다.
Figure pct00010
실시예 8 - pIX는 RCA를 야기하지 않는다
이들 데이터는 벡터 생산성의 증가가 복제 가능 아데노바이러스("RCA"), 예를 들어 야생형 바이러스의 형성을 야기하는 pIX 발현으로 인한 것이었을 수 있었는지에 대한 질문을 제기했다.
이것을 연구하기 위해, HeLa 세포를 사용했다. 상기 사용했던 다양한 타입의 아데노바이러스는 HeLa 세포에서 정상적으로 복제할 수 없었는데, 왜냐하면 HEK293 세포와 달리 HeLa 세포는 필수적인 아데노바이러스 상보 서열을 결여하기 때문이다. 그러나, 야생형 아데노바이러스는 wt 바이러스가 RCA이고, 따라서 상보 서열이 필요하지 않기 때문에 HeLa 세포에서 복제할 수 있다. 따라서, 비슷한 수의 벡터 또는 야생형 바이러스로 세포를 감염시켰고, 감염 5일 후에 세포를 촬영했다. 얻어진 사진은 바이러스 복제의 징후를 보이는 유일한 세포(시각적으로 둥글고 부유하는 세포로 보임)가 야생형 아데노바이러스로 감염되었던 것들임을 나타낸다. 반면, pIX 자체는 pIX가 바이러스 게놈에 의해 코딩되거나 또는 재조합 HeLa 세포에서 발현되었는지 여부에 관계없이 바이러스 복제를 초래하지 않았다. 이들 결과를 도 8 및 9에 도시한다. 또한, 다양한 웰로부터의 배지를 종래의 감염성 분석에서 시험했을 때, 아데노바이러스 기준 물질("ARM", 야생형 아데노바이러스)를 사용했을 때만 RCA가 발견되었다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 9 - pIX는 현탁 배양 수율을 증가시킨다
상기 결과는 pIX를 함유하는 환경에서 생산된 경우 아데노바이러스가 더 감염성이고 개선된 감염 반응역학, 즉 더 빠른 표적 세포 형질도입, 더 적은 감염성 입자 또는 플라크 형성 단위에 의해 주어진 수준의 형질도입의 달성, 및 더 빠른 자손 아데노바이러스 생성을 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, 단백질 IX는 개선된 아데노바이러스 벡터를 만든다.
프로듀서 세포에서 발현된 단백질 IX는 또한 또 다른 놀라운 이득을 가진다. 당업계는 두 가지 일반적인 타입의 프로듀서 세포 배양물, 즉 점착성 배양물 및 현탁 배양물을 교시한다. 이 둘은 바이러스를 제조할 수 있는 세포 배양물을 제공한다는 공통된 목표를 공유한다. 그러나, 두 세포 배양물 타입은 두 가지의 차이점을 가진다.
먼저, 현탁 세포 배양물은 점착성 배양물보다 현저히 더 저렴하며, 따라서 바람직하다.
둘째, 두 배양 방법은 예측할 수 없는 정도의 상이한 수율을 제공한다. 특정 아데노바이러스 변이체에 대해, 점착성 배양물은 현탁 배양물보다 훨씬 더 효율적이다(상기 실시예 2 참조). 어떤 세포 배양 방법이 특정한 아데노바이러스 변이체를 가장 효율적으로 생성하는지 알아내는 것은 현재까지 시행착오의 문제였는데, 왜냐하면 어떤 세포 배양 방법이 주어진 아데노바이러스를 생성하는데 최선인지를 예측할 수 있는 결과에 결정적인 변수(들)를 확인하지 못하기 때문이다.
우연히 그리고 놀랍게도 결과에 결정적인 변수를 발견했다. 현탁 배양물에서 프로듀서 세포에서 안정한 pIX 발현의 효과를 시험했다. 상기 논의된 대로, CMV 프로모터의 제어하에 pIX 코딩 플라스미드에 의한 일시적 형질감염이 높은 수준의 pIX 발현을 가져왔음을 발견했다. 다음에, 이들 pIX-발현 세포를 사용하여, 그것의 게놈 내에 발현된 pIX 유전자를 가진 아데노바이러스를 제조했다. 프로듀서 세포에서 높은 수준의 pIX가 수득한 벡터에서 바이러스 게놈 당 형질도입 단위의 비("TU:vg" 비)를 증가시켰음을 발견했다. 이것은 프로듀서 세포에 의해 발현된 pIX가, 생산된 바이러스 게놈이 성공적으로 포장될 수 있는 가능성을 개선했음을 의미한다. 그러나, 벡터 생산성에 대한 전체적인 영향은 긍정적이지 않았다.
형질감염이 프로듀서 세포에 스트레스를 준다고 추론했다. 또한, "빈" pcDNA3.1 플라스미드 형질감염 후, 실시예 7의 바이러스 생성에서의 소수의 감염 단위는 형질감염으로 인해 바이러스 생산성이 저하된 것을 암시한다(이 현상에 대한 유일한 예는 아니다). 상이한 pIX 농도는 상이한 결과를 나타낼 수 있다고 가정했다. 또한 안정적으로 pIX를 발현하는 셀라인은 일시적으로 형질감염된 세포보다 pIX 발현이 더 적다는 것을 예상할 수 있었다. 따라서, 현탁 배양물에서의 낮은 pIX 발현의 효과를 시험하기로 했다. 안정적으로 pIX를 발현하는 HEK293 세포(상기 설명된 대로 구성된) 및 정상 HEK293 세포를 현탁 배양에 맞게 적응시켰다. 다음에, 현탁-적응된 세포를 Corning® 50mL 미니 생물반응기에서 성장시켰다. 두 셀라인(HEK293 및 HEK293+pIX)의 2개 생물반응기를 기능성의 발현된 pIX 유전자를 함유한 아데노바이러스 또는 pIX-결실 게놈을 가진 아데노바이러스로 감염시켰다. 현탁 세포를 아데노바이러스로 감염시킨 지 3일 후, 배지를 샘플링하고 세포를 용해시켜 내부의 모든 바이러스를 방출시켰다. 배지로부터 바이러스 게놈 역가를 측정했고(이것은 세포외 바이러스 게놈의 척도를 제공함), 또한 미정제 수집 물질로부터도 바이러스 게놈 역가를 측정했다(이것은 세포내 바이러스 게놈의 척도를 제공함). 다음에, 세포외 + 세포내 바이러스로서 총 생산성을 계산했다.
현탁 배양을 위한 재료 및 방법
점착 방식으로 성장하는 세포는 점착성 세포를 탈착하고 원심분리(209-400 x g, 5분)를 사용하여 세포 펠릿을 만듦으로써 현탁 배양에 맞게 적응시켰다. 상청액(점착성 세포 배양 배지)을 제거하고, 세포를 현탁 배양 배지(EX-CELL® 293 무혈청 배지, Sigma-Aldrich)에 현탁했다. 세포를 다시 원심분리하고 상청액을 제거했다. 세포를 현탁 배양 배지에 재현탁하고 계수했다. 계수 후, 세포를 3-20 ml 부피로 5e5-1e6 세포/ml로 희석해서 50 ml 미니 생물반응기에 넣은 다음, 정상 세포 배양 인큐베이터 내에서 쉐이커 플랫폼에서 성장시켰다(180rpm 진탕, 45도 각도 튜브). 세포를 매주 2-3회 계수 및/또는 관찰했고, 배양물을 새로운 배지로 희석하거나 또는 배지를 상기 설명된 대로 새로 갈았다. 감염을 위해, 세포를 5 ml 부피에 5 x 105 세포/ml로 파종했다. 세포 당 50 vg를 사용하여 파종 다음날 세포를 감염시켰고, 감염물을 3일 동안 인큐베이션했다. 세포 현탁액 4 ml를 테스트 튜브에 취해서 세포를 20℃에서 5분 동안 209 x g로 원심분리했다. 상청액을 제거하고 ddPCR에 대해 샘플링했다. 세포 펠릿을 3ml PBS에 현탁하고 -80℃에 보관했다. 앞서 설명된 대로 3회의 동결-해동 사이클 후 ddPCR을 수행했다.
발현된 pIX 유전자를 포함하는 바이러스가 현탁 배양 프로듀서 세포가 pIX를 발현하는지 여부에 관계없이 거의 동일한 수율로 생산된다는 것을 발견했다. 프로듀서 세포에 pIX 플라스미드를 포함시키는 것은 수율을 단지 3% 증가시킨다. 반면, 발현된 pIX 유전자를 포함하지 않는 바이러스는 현탁 배양 프로듀서 세포가 pIX를 발현하는지 여부에 따라 상당히 상이한 양들로 생성된다는 것을 발견했다. 프로듀서 세포에 pIX 플라스미드를 포함시키는 것은 수율을 약 1,400%까지 증가시킨다:
Figure pct00011
이러한 수율 증가는 점착성 세포 배양물을 사용하여 달성된 것과 유사한 수율로 현탁 세포 배양물에서 pIX-결실 아데노바이러스를 생성하는 것을 최초로 가능하게 한 것이기 때문에 중요하다. pIX가 바이러스 생성 동안 발현되지 않는다면, 아데노바이러스는 아마 더 비싸고 복잡한 점착성 세포 배양 접근법을 사용하여 제조되어야 할 것이다. 반면, pIX가 바이러스 생성 동안 발현되는 경우(예를 들어, 바이러스 게놈의 발현된 부분으로서, 또는 프로듀서 세포에서 플라스미드-매개 pIX 이식유전자로서), 보다 경제적이고 간단한 현탁 세포 배양을 사용하여 유사한 바이러스 수율을 달성할 수 있다.
실시예 10
pIX가 C 말단 단부에서 잘려도 그리고 그 절단이 상당하더라도 그 효과를 유지한다는 것을 발견했다.
야생형 아데노바이러스 단백질 IX는 약 140개의 아미노산을 함유하지만 정확한 길이는 혈청형과 종에 따라서 변한다. 인간 아데노바이러스 혈청형 1, 2 및 5의 야생형 단백질 IX는 140개의 아미노산을 함유한다(SEQ ID NO. 9, 10 및 11 참조). 반면, 인간 포유류아데노바이러스 혈청형 E로부터의 야생형 단백질 IX는 142개의 아미노산을 함유하고(SEQ ID NO. 12 참조), 유인원 아데노바이러스 혈청형 21로부터의 야생형 단백질 IX는 138개의 아미노산을 함유한다(SEQ ID NO. 13 참조). C 말단에서 절단된 단지 111개의 아미노산을 함유한 단백질 IX의 변이체를 시험했다(SEQ ID NO. 14 참조). 이 절단된 형태가 전장 야생형 단백질 IX만큼 잘 작동했음을 발견했다. 따라서, 다른 절단된 형태들도 동등하게 작동할 것이라고 가정한다(SEQ ID NO. 15, 16 참조).
따라서, 첨부된 적법한 청구항들에서, "아데노바이러스 단백질 IX"라는 용어는 전장 (야생형) 단백질 IX 및 전장 pIX에서 관찰된 상기 논의된 이점들을 보유하는 야생형 단백질의 절단된 형태들을 모두 포함한다. 이것은 예를 들어 야생형 폴리펩타이드의 70%만을 남기도록 절단된 형태, 또는 야생형 폴리펩타이드의 적어도 75%, 80% 또는 90%를 남기도록 절단된 형태를 포함한다. 이것은 또한 야생형 서열 또는 그것의 일부와 90%, 95%, 98% 및 99% 상동성인 아미노산 서열을 가진 단백질 IX 돌연변이체를 포함한다. 적법한 청구항이 특정한 아미노산 서열을 필요로 하고 기능적으로 동등한 절단된 형태나 돌연변이체를 배제하는 경우, 그 청구항은 특정한 아미노산 서열에 대한 서열번호(SEQ ID NO.)를 서술하고 기능적으로 동등한 절단된 형태나 돌연변이체를 명시적으로 배제한다.
요약
Ad 벡터 A와 같은 모든 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 pIX를 함유하지 않는다. 반면, 놀랍게도 정상적인 양보다 많은 pIX를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터가 표적 세포에서 더 빠른 감염, 형질도입 및 복제를 행한다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명은 벡터에 초-생리학적 양의 pIX를 포함시킴으로써 아데노바이러스 유전자 요법 벡터의 감염성을 증가시키는 것에 관한 것이다.
의심을 피하기 위해, 첨부된 적법한 청구항들에서 사용된 "발현가능한 유전자"라는 용어는 기능적 생성물을 직접 또는 간접적으로 생성하는 핵산 서열을 포함한다. 기능적 생성물은 폴리펩타이드일 수 있다. 대안으로, 기능적 생성물은 안티센스 RNA 서열, siRNA 서열, 또는 다른 타입의 기능적 RNA일 수 있다. 이것은 당업계에서 사용되는 용법과 일치한다. 예를 들어, 위키페디아에는 "유전자는 어떤 기능을 가진 분자를 코딩하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열이다. 유전자 발현 동안 DNA는 먼저 RNA에 카피된다. RNA는 직접 기능하거나 또는 기능을 수행하는 단백질의 중간 주형일 수 있다."라고 쓰여 있다. 유사하게, NIH의 웹사이트에는 "일부 유전자는 단백질이라고 하는 분자를 만들기 위한 지시 역할을 한다. 그러나, 대부분의 유전자는 단백질을 코딩하지 않는다."라고 쓰여 있다(https://ghr.nlm.nih.gov/primer/basics/gene 참조).
구체적인 실험 결과가 주어지면, 당업자는 동등한 변이 또는 변형을 쉽게 만들 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구체적인 실험은 점착성 인간 프로듀서 세포에서 아데노바이러스를 만드는 것이지만, 현탁 계통이나 곤충 세포를 사용하여 동등한 아데노바이러스를 제조할 수 있다. 유사하게, 여기서 구체적인 실험은 야생형 pIX를 사용했지만, 당업자는 동일한 방식으로 동일한 기능을 수행하여 야생형 단백질과 동일한 결과를 달성할 수 있는 pIX 유사체, 변이체 및 돌연변이체를 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 단백질 IX의 his-택 부탁 버전이 본 연구실에서 이미 구성되었다. 유사하게, 이식유전자의 경우, 당업계는 짧은 형태의 VEGF-D3, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 티미딘 키나제, 인간 인터페론 알파-2b, ABCA4, ABCD-1, 미오신 VIIA, 시클로옥시게나제-2, PGF2-알파 수용체, 도파민, 인간 헤모글로빈 서브유닛 베타 및 항체 서브유닛이 아데노바이러스 벡터에서 이식유전자로서 사용하기에 적합하다는 것을 교시한다. 따라서, 본 특허의 적법한 적용범위는 구체적인 예들에 의해서가 아니라 적법한 청구항들 및 그것의 등가물에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kuopio Center for Gene and Cell Therapy Oy <120> Adenoviral Polypeptide IX Increases Adenoviral Gene Therapy Vector Productivity and Infectivity <130> US62/844175 <150> US62/844175 <151> 2019-05-07 <150> US16/423215 <151> 2019-05-28 <150> US16/569742 <151> 2019-09-13 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 1 gccatgagca ccaactcgtt tgatgg 26 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 2 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 3 gccatgagca ccaactcgtt tgatgg 26 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 4 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 5 taatacgact cactataggg 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 6 catgacctta tgggactttc ct 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 7 ctatccacgc ccattgatgt a 21 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 8 ccatggtgat 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Claims (90)

  1. 아데노바이러스 단백질 IX 및 발현가능한 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터로서, 상기 아데노바이러스 유전자 요법 벡터가 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 인간 세포에서 생성된 것인 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 입자 당 약 12개의 아데노바이러스 단백질 IX 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  3. 제 1 항에 있어서, 인간 세포는 화학량론적 양보다 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서, 인간 세포는 1의 감염 다중도로 야생형 아데노바이러스로 감염된 유사한 인간 세포보다 더 많은 양의 아데노바이러스 단백질 IX를 생성하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 조건부 복제성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서, 발현가능한 이식유전자는 인간 환자에서 치료적 이식유전자인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 발현된 pix 유전자를 함유하지 않는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  9. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  10. 제 1 항에 있어서, 벡터는 형질전환 후 48시간째 측정되었을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 벡터보다 적어도 2배 더 감염성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  11. 제 1 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터보다 적어도 약 25% 더 빠르게 표적 세포에 대한 세포변성 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  12. 제 1 항의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터와 비-감염성 아데노바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)의 혼합물로서, 플라크 형성 분석에 의해 감염성이 측정된 경우, 유전자 요법 벡터 대 VLP의 비가 1:100을 초과하는 것인 혼합물.
  13. 제 1 항에 있어서, 벡터는 35 kb보다 큰 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  14. 제 1 항에 있어서, 인간 세포는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성할 때 비-점착성, 현탁 배양물에서 성장되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  15. 제 1 항에 있어서, 프로듀서 세포는 발현된 pix 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  16. 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 프로듀서 세포에서 생성된, 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 입자 당 약 12개의 아데노바이러스 단백질 IX 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  18. 제 16 항에 있어서, 인간 세포는 화학량론적 양보다 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  19. 제 16 항에 있어서, 인간 세포는 1의 감염 다중도로 야생형 아데노바이러스로 감염된 유사한 인간 세포보다 더 많은 양의 아데노바이러스 단백질 IX를 생성하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  20. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 조건부 복제성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  21. 제 16 항에 있어서, 발현가능한 이식유전자는 인간 환자에서 치료적 이식유전자인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  22. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  23. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 발현된 pix 유전자를 함유하지 않는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  24. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  25. 제 16 항에 있어서, 벡터는 형질전환 후 48시간째 측정되었을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 벡터보다 적어도 2배 더 감염성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  26. 제 16 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터보다 적어도 약 25% 더 빠르게 표적 세포에 대한 세포변성 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  27. 제 16 항의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터와 비-감염성 아데노바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)의 혼합물로서, 플라크 형성 분석에 의해 감염성이 측정된 경우, 유전자 요법 벡터 대 VLP의 비가 1:100을 초과하는 것인 혼합물.
  28. 제 16 항에 있어서, 벡터는 35 kb보다 큰 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  29. 제 16 항에 있어서, 인간 세포는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성할 때 비-점착성, 현탁 배양물에서 성장되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  30. 제 16 항에 있어서, 프로듀서 세포는 발현된 pix 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  31. 아데노바이러스 단백질 IX 및 발현가능한 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터로서, 상기 아데노바이러스 유전자 요법 벡터가 발현된 pix 유전자를 갖지 않는 게놈을 갖는 것인 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  32. 제 31 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 입자 당 약 12개의 아데노바이러스 단백질 IX 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  33. 제 31 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 인간 세포에서 생성되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  34. 제 33 항에 있어서, 인간 세포는 화학량론적 양보다 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  35. 제 33 항에 있어서, 인간 세포는 1의 감염 다중도로 야생형 아데노바이러스로 감염된 유사한 인간 세포보다 더 많은 양의 아데노바이러스 단백질 IX를 생성하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  36. 제 31 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 조건부 복제성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  37. 제 31 항에 있어서, 발현가능한 이식유전자는 인간 환자에서 치료적 이식유전자인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  38. 제 31 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  39. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  40. 제 31 항에 있어서, 벡터는 형질전환 후 48시간째 측정되었을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 벡터보다 적어도 2배 더 감염성인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  41. 제 31 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터보다 적어도 약 25% 더 빠르게 표적 세포에 대한 세포변성 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  42. 제 1 항의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터와 비-감염성 아데노바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)의 혼합물로서, 플라크 형성 분석에 의해 감염성이 측정된 경우, 유전자 요법 벡터 대 VLP의 비가 1:100을 초과하는 것인 혼합물.
  43. 제 31 항에 있어서, 벡터는 35 kb보다 큰 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  44. 제 33 항에 있어서, 인간 세포는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성할 때 비-점착성, 현탁 배양물에서 성장되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  45. 제 33 항에 있어서, 프로듀서 세포는 발현된 pix 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터.
  46. 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하고, 1 이하의 감염 다중도로 야생형 아데노바이러스로 감염된 유사한 세포보다 더 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 세포.
  47. 제 46 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  48. 제 47 항에 있어서, 세포는 인간 배아 신장 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  49. 제 46 항에 있어서, 세포는 이식유전자를 갖는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 더 생성하는 것을 특징으로 하는 세포.
  50. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 입자 당 약 12개의 아데노바이러스 단백질 IX 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  51. 제 49 항에 있어서, 세포는 화학량론적 양보다 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  52. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 조건부 복제성인 것을 특징으로 하는 세포.
  53. 제 49 항에 있어서, 발현가능한 이식유전자는 인간 환자에서 치료적 이식유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
  54. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
  55. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 발현된 pix 유전자를 함유하지 않는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
  56. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
  57. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 형질전환 후 48시간째 측정되었을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 벡터보다 적어도 2배 더 감염성인 것을 특징으로 하는 세포.
  58. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터보다 적어도 약 25% 더 빠르게 표적 세포에 대한 세포변성 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 세포.
  59. 제 49 항에 있어서, 세포는 비-감염성 아데노바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)를 더 생성하며, 플라크 형성 분석에 의해 감염성이 측정된 경우, 유전자 요법 벡터 대 VLP의 비가 1:100을 초과하는 것을 특징으로 하는 세포.
  60. 제 49 항에 있어서, 벡터는 35kb보다 큰 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
  61. 제 46 항에 있어서, 비-점착성, 현탁 배양물에서 성장된 것을 특징으로 하는 세포.
  62. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성할 때 비-점착성, 현탁 배양물에서 성장된 것을 특징으로 하는 세포.
  63. 제 46 항에 있어서, 세포는 발현된 pix 유전자를 갖는 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  64. 제 49 항에 있어서, 세포는 세포 당 약 3231개를 넘는 바이러스 게놈을 생성하는 것을 특징으로 하는 세포.
  65. 제 49 항에 있어서, 세포는 배양 배지 ml당 적어도 약 4.7 x 109 바이러스 게놈을 생성하는 것을 특징으로 하는 세포.
  66. 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 현탁-배양된 세포.
  67. 제 66 항에 있어서, 세포는 1 이하의 감염 다중도로 야생형 아데노바이러스로 감염된 유사한 세포보다 더 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  68. 제 66 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  69. 제 69 항에 있어서, 세포는 인간 배아 신장 세포인 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  70. 제 66 항에 있어서, 현탁-배양된 세포는 이식유전자를 갖는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 더 생성하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  71. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 입자 당 약 12개의 아데노바이러스 단백질 IX를 포함하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  72. 제 70 항에 있어서, 세포는 화학량론적 양보다 많은 양으로 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  73. 제 49 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 조건부 복제성인 것을 특징으로 현탁-배양된 세포.
  74. 제 70 항에 있어서, 발현가능한 이식유전자는 인간 환자에서 치료적 이식유전자인 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  75. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  76. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 발현된 pix 유전자를 함유하지 않는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  77. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 측면에 cre/lox 부위가 없는 아데노바이러스 포장 신호를 포함하는 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  78. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 형질전환 후 48시간째 측정되었을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 벡터보다 적어도 2배 더 감염성인 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  79. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 유사한 프로듀서 세포에서 생성된 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터보다 적어도 약 25% 더 빠르게 표적 세포에 대한 세포변성 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  80. 제 70 항에 있어서, 현탁-배양된 세포는 비-감염성 아데노바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)를 더 생성하며, 플라크 형성 분석에 의해 감염성이 측정된 경우, 유전자 요법 벡터 대 VLP의 비가 1:100을 초과하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  81. 제 70 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 35kb보다 큰 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  82. 제 70 항에 있어서, 현탁-배양된 세포는 발현된 pix 유전자를 갖는 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  83. 제 70 항에 있어서, 세포는 배양 배지 ml당 적어도 약 4.7 x 109 바이러스 게놈을 생성하는 것을 특징으로 하는 현탁-배양된 세포.
  84. 현탁 세포 배양물에서 pix-결실 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 제조하는 방법으로서, 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 프로듀서 세포를 현탁 세포 배양물에서 배양하는 단계, 세포를 pix-결실 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 게놈으로 형질전환하는 단계, 세포가 pix-결실 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성하는 동안 현탁 상태로 세포를 배양하는 단계, 및 이어서 아데노바이러스 단백질 IX 및 치료적 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 수거하는 단계를 포함하는 방법.
  85. 제 1 항에 있어서, 세포는 ml당 적어도 약 4.7 x 109 바이러스 게놈을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 인간 세포를 획득하는 단계, 이들 세포를 아데노바이러스를 코딩하는 발현가능한 핵산 및 아데노바이러스 단백질 IX를 코딩하는 발현가능한 핵산, 및 이식유전자를 코딩하는 핵산으로 형질도입하거나 형질감염시키는 단계, 아데노바이러스 단백질 IX 및 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성하도록 세포를 현탁 배양물에서 배양하는 단계, 및 이어서 아데노바이러스 단백질 IX 및 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 수거하는 단계를 포함하는, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 제조 방법.
  87. 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 인간 프로듀서 세포를 획득하는 단계, 이들 세포를 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 코딩하는 핵산으로 형질도입하거나 형질감염시키는 단계, 아데노바이러스 단백질 IX 및 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성하도록 세포를 현탁 배양물에서 배양하는 단계, 및 이어서 아데노바이러스 단백질 IX를 포함하는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 수거하는 단계를 포함하는, 바이러스 제조 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 코딩하는 핵산은 pix-음성인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  89. 아데노바이러스 유전자 요법 벡터의 수율을 증가시키기 위한 제조 방법으로서, 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때도 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하는 프로듀서 세포에서 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 제조하는 단계 및 이어서 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 수거하는 단계를 포함하며, 이로써 생성된 감염성 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 대 생성된 바이러스 게놈의 비가 아데노바이러스에 의해 감염되거나 형질도입되지 않았을 때 아데노바이러스 단백질 IX를 발현하지 않는 프로듀서 세포에서 동일한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 생성할 때 얻어진 비보다 적어도 약 20% 더 크게 되는 것인 방법.
  90. 제 1 항의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터를 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 인간의 치료 방법.
KR1020217039663A 2019-05-07 2020-05-01 아데노바이러스 유전자 요법 벡터 생산성 및 감염성을 증가시키는 아데노바이러스 폴리펩타이드 ix KR20220012863A (ko)

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