CN103387605B - 一种rtn4b多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的制备与应用 - Google Patents

一种rtn4b多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RTN4B多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的制备与应用。本发明的RTN4B多肽，含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。本发明还进一步公开了利用所述RTN4B多肽制备的单克隆抗体、产生单抗的杂交瘤细胞株以及他们在肿瘤治疗或预防中的相关应用。

Description

一种RTN4B多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的 制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种RTN4B相关多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的制备与应用。
背景技术
RTN4B属于reticolon家族（RTNs），因含有特殊的内质网定位而得名，具有保守的RHD结构框（reticulon-homology domain）。该家族含有四个基因，RTN1、RTN2、RTN3和RTN4，其中关于RTN4的研究报道较多。RTN4（又名Nogo/ASY/RTN-X）基因有多个可变剪接本，主要编码RTN4A（GenBank登录号AF148537），RTN4B（GenBank登录号AF148538）和RTN4C（GenBank登录号AF087901）三种蛋白，其它一些剪接本多在睾丸中特异性表达。
RTN4B在正常组织中广谱表达，且研究发现RTN4B与肿瘤的发生发展密切相关。首先RTN4B参与肿瘤细胞的凋亡调控。Tsujimoto等人发现RTN4B能够和Bcl-2，Bcl-xL相互作用并将Bcl-XL及Bcl-2招募到内质网上，逆转Bcl-XL及Bcl-2的凋亡抑制作用。Yutsudo等人发现RTN4B在小细胞肺癌的样本中出现转录抑制，而过量表达RTN4B可以显著促进肿瘤细胞的凋亡。其次，近年来的报道进一步发现RTN4B很可能与血管重建、甚至血管新生有关。2004年，Acevedo,L等人发现RTN4B在哺乳动物血管内皮细胞和平滑肌细胞中都有表达。RTN4B重组蛋白可以促进血管内皮细胞的迁移并抑制平滑肌细胞的迁移。其次，RTN4A/B基因敲除小鼠在血管损伤后出现了异常加厚的血管壁，血管内腔缩小。再次，通过腺病毒载体将RTN4B重新导入到小鼠体内，这种异常增厚的血管壁又能够恢复正常的形态。因此，RTN4B很可能是哺乳动物维持血管形态，调节血管重建的关键分子。随后，该小组进一步鉴定了RTN4B在内皮细胞表面的受体分子，NgBR。敲减实验证明NogoB和NgBR之间的相互作用是VEGF血管源性分子诱导血管新生所必需的。Miao等人在斑马鱼中则进一步证明NogoB-NgBR的相互作用能够通过激活细胞内的Akt通路调控血管新生。
发明内容
本发明的目的是提供一种RTN4B相关多肽、其单抗、产生单抗的杂交瘤细胞株及他们的制备与应用。
本发明第一方面公开了一种分离的RTN4B多肽，含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其保守型变异多肽。
SEQ ID NO:1：DEDEDLEELEVLERK。
本发明的所述RTN4B多肽是以序列为SEQ ID NO:2的RTN4B蛋白为基础设计的。所述分离的RTN4B多肽至少应包括RTN4B蛋白全长的第44-58位氨基酸残基。所述RTN4B蛋白全长373个氨基酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2：
MEDLDQSPLVSSSDSPPRPQPAFKYQFVREPEDEEEEEEEEEEDEDEDLEELEVLERKPAAGLSAAPVPTAPAAG
APLMDFGNDFVPPAPRGPLPAAPPVAPERQPSWDPSPVSSTVPAPSPLSAAAVSPSKLPEDDEPPARPPPPPPAS
VSPQAEPVWTPPAPAPAAPPSTPAAPKRRGSSGSVVVDLLYWRDIKKTGVVFGASLFLLLSLTVFSIVSVTAYIA
LALLSVTISFRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNSALGHVNCTIKELRRLFLVDDLVDSL
KFAVLMWVFTYVGALFNGLTLLILALISLFSVPVIYERHQAQIDHYLGLANKNVKDAMAKIQAKIPGLKRKAE
如本发明实施例具体列举的，所述分离的RTN4B多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。基于利用该RTN4B多肽采用杂交瘤技术制备的单克隆抗体能识别天然的RTN4B蛋白，因此认为只要是包含SEQ ID NO:1的RTN4B蛋白非全长片段均可产生识别天然RTN4B蛋白的单抗。由上认为，所述RTN4B多肽可以是包含SEQ ID NO:1的RTN4B蛋白非全长片段。较佳的，所述RTN4B蛋白非全长片段氨基酸残基数为15-27个,较佳为15-23个。
本发明第二方面公开了一种分离的多核苷酸，编码所述RTN4B多肽。
所述多核苷酸可用于构建表达所述RTN4B多肽的载体，以制备所述RTN4B多肽。
进一步的，所述多核苷酸还可用作一种靶标，用于筛选或制备与RTN4B蛋白或RTN4B基因表达的促进或抑制相关的药物或制剂。
所述与RTN4B蛋白或RTN4B基因表达的促进或抑制相关的药物或制剂的活性成分可以选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒等。
本发明第三方面公开了一种能与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体。
所述单克隆抗体可以以所述RTN4B多肽为免疫原免疫哺乳动物，分离获得B细胞后，采用杂交瘤技术制备并筛选获得杂交瘤细胞株，再在合适的条件下培养所述杂交瘤细胞株后获得。
所述哺乳动物可以选自各种常见哺乳动物，如鼠、兔、猴、猪、人等。
本发明实施例具体列举的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.5863的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。
所述单克隆抗体还可以采用基因工程的方法将编码所述单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸克隆入适当的载体并导入合适的宿主表达获得。
在采用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞后，可以采用本领域的常规技术来分析获知杂交瘤细胞分泌表达的单克隆抗体的重链及轻链的全长及其可变区的序列，从而推知其编码基因，进而可以采用基因工程的方法并利用已知的序列构建表达所述单克隆抗体的工程菌或工程细胞。
所述工程菌或工程细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，酵母菌，乳酸杆菌，双歧杆菌，肠球菌，链霉菌，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO,COs.293细胞等。
较佳的，所述单克隆抗体包括重链与轻链，其中，重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:3）：
PGASVKLSCKASGYTFTTYWINWIKQRPGQGLEWIGRIAPGSGSTYYNEMFKSKATLTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSAVYFCARDGMGYYYGSRYWYFDVWGAG
其中第12-23位为CDR1（第一高变区），第37-55位为CDR2（第二高变区），第85-101位为CDR3（第三高变区）。
重链可变区编码核苷酸序列为（SEQ ID NO:5）：
CCTGGGGCCT CAGTGAAGCT GTCCTGCAAG GCTTCTGGCT ACACCTTCAC CACCTACTGGATTAACTGGA
TAAAACAGAG GCCTGGACAG GGCCTTGAGT GGATAGGACG TATTGCTCCT GGAAGTGGTAGTACTTACTA
CAATGAAATG TTCAAGAGCA AGGCAACACT GACTGTAGAC ACATCCTCCA GCACAGCCTACATTCAGCTC
AGCAGCCTGT CATCTGAGGA CTCTGCTGTC TATTTCTGTG CAAGAGATGG GATGGGATATTACTACGGTA
GTAGGTACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG CAGGG
轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:4）
ASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEGDD
SAMYFCQQSKEVPRTRSEG
其中第15-32位为CDR1，第45-52位为CDR2，第84-94位为CDR3。
轻链可变区编码核苷酸序列（SEQ ID NO:6）：
GCTTCTTTGG CTGTGTCTCT AGGGCAGAGG GCCACCATCT CCTGCAGAGC CAGCGAAAGTGTTGATAATT
ATGGCATTAG TTTTATGAAC TGGTTCCAAC AGAAACCAGG ACAGCCACCC AAACTCCTCATCTATGCTGC
ATCCAACCAA GGATCCGGGG TCCCTGCCAG GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTTCAGCCTCAAC
ATCCATCCTA TGGAGGGGGA TGATTCTGCA ATGTATTTCT GTCAGCAAAG TAAGGAGGTTCCTCGTACAC
GTTCGGAGGG G
所述单克隆抗体可以为全长抗体、Fab抗体、嵌合抗体、单链抗体(ScFv)、F（ab）2抗体、F（ab’）2抗体,或其他改形抗体。
所述单克隆抗体可以是PEG化的或非PEG化的。
本发明第四方面，公开了一种生产所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
所述杂交瘤细胞株可以为鼠-鼠杂交瘤细胞株、鼠-人杂交瘤细胞株、人-人杂交瘤细胞株等。
所述杂交瘤细胞株是以所述RTN4B多肽为免疫原，采用杂交瘤技术获得。
较佳的，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC NO.5863。
该菌株已于2012年3月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市曹阳区北辰西路1号院3号）注册保藏，保藏号为CGMCC NO.5863，分类命名为：鼠杂交瘤细胞。
本发明第五方面公开了所述RTN4B多肽、所述单克隆抗体或所述杂交瘤细胞株在制备治疗、预防或诊断肿瘤的药物或试剂中的用途，或者在筛选治疗或预防肿瘤的药物或试剂中的用途。
具体的，与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体及与所述杂交瘤细胞株可用于制备治疗或预防肿瘤的药物或试剂，所述RTN4B多肽或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体可用于制备诊断肿瘤的药物或制剂，所述RTN4B多肽或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体可用于筛选治疗或预防肿瘤的药物或试剂。
所述RTN4B多肽或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体用于筛选治疗或预防肿瘤的药物或试剂是指：将所述RTN4B多肽或所述单克隆抗体作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标或者是比照对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进RTN4B蛋白表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。
所述RTN4B多肽和/或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体用于制备诊断肿瘤的药物或制剂是指：将所述RTN4B多肽和/或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体用于制备以RTN4B蛋白含量为指标的肿瘤诊断药物或制剂。
本发明第五方面还同时公开了一种治疗或预防肿瘤的方法，为向肿瘤细胞施用与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体。
所述肿瘤细胞选自其生长或增殖与RTN4B蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。
进一步的，所述肿瘤为肝癌，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
本发明第六方面，公开了一种用于治疗或预防肿瘤的药物，所述药物的活性成分含有所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体。
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在制备所述药物时，通常将活性成分与辅料混合，或用辅料稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。合适的辅料剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
所述药物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液各种常用剂型。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中，如可参考已知单克隆抗体的用量。
本发明第七方面，公开了一种肿瘤诊断试剂，所述肿瘤诊断试剂中含有所述RTN4B多肽和/或与所述RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体。
可以利用免疫反应原理制备所述的肿瘤诊断试剂，比较典型的有ELISA诊断试剂、胶体金诊断试剂、光激化学法诊断试剂等等。
本发明根据RTN4B的蛋白序列设计了一种RTN4B多肽，合成该多肽后，利用该多肽制备获得了可产生其特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能稳定分泌该RTN4B多肽的单抗，并经研究表明，该单抗能有效的封阻肿瘤细胞在裸鼠皮下的生长，有望用于临床抗肿瘤治疗。本发明还进一步公开了所述RTN4B多肽及其特异性单克隆抗体的各项应用，为RTN4B蛋白相关应用的进一步拓展打下基础。
附图说明
图1是抗体的ELISA及Western blot结果。
9：6F2
11:1% milk-PBST
12:免疫小鼠血清
图2抗肿瘤动物试验结果
图3抗肿瘤动物试验瘤体重量统计图
纵坐标表示：瘤体总量，单位：g
对照抗体为阴性对照鼠抗人IgG，阳性抗体为avastin。
P值（生理盐水VS对照抗体）：0.288297
P值（6F2 VS对照抗体）：0.000168
P值（阳性抗体VS对照抗体）：0.000058
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 杂交瘤细胞株的获得及单克隆抗体的制备
1材料和仪器
1.1细胞株、组织标本和动物
a.骨髓瘤细胞（SP2/0）
b.BALB/C小鼠
1.2主要试剂
a.弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、ABTS、PEG（分子量4000）
b.HRP标记兔抗鼠IgG
c.RPMI 1640培养基：Hyclone公司
d.硝酸纤维素膜（NC）：Hybond公司
e.小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司
f.鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒
g.包被缓冲液：每500ml去离子水中加入0.795g的碳酸钠和1.465g的碳酸氢钠组成，pH值为9.6
h.底物缓冲液：每500ml去离子水中加入9.2g的十二水磷酸氢二钠和2.55g的柠檬酸组成，pH值为5.0
i.ABTS显色液：每10ml底物缓冲液中加入5mg的ABTS和3%的双氧水20μl组成。
j.1640培养液原液：每500ml去离子水中加入5.2g的1640干粉、1.7μl的β-巯基乙醇和23.83g的HEPES组成，氢氧化钠调pH值到7.2
k.不完全1640培养液：每500ml的1640培养液原液中加入7.5%的碳酸氢钠15ml组成
l.完全1640培养液：每80ml不完全1640培养液中加入20ml的小牛血清组成
m.抗体稀释液：每100ml的PBS加入0.1g的BSA组成
n.洗涤缓冲液：每100ml的PBS加入0.5ml的Tween-20组成
o.PEG配制液：每8.9ml不完全1640培养液中加入1ml的DMSO和0.1ml的7.5%碳酸氢钠组成。
1.3主要仪器
a.二氧化碳培养箱：Forma Scientific公司；
b.超净工作台：苏州净化设备仪器厂；
c.倒置显微镜：Olympus公司
d.37℃恒温水浴锅：
e.酶标板、细胞培养板：NUNC公司
f.台式高速离心机：湖南湘雅仪器表厂
g.核酸蛋白检测仪：
h.纯水仪：Millipore公司
i.微型垂直平板电泳槽：Bio-Rad公司
j.电转移仪：Bio-Rad公司
2方法
2.1细胞培养：骨髓瘤细胞及杂交瘤细胞培养于完全1640培养液中，置于37℃、5%的二氧化碳细胞培养箱，隔天换液，3-4天传代一次。
2.2抗原制备：人工合成序列为SEQ ID NO:1的多肽，以此多肽为抗原，用来免疫小鼠。
2.3单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备具体过程参照《细胞和分子免疫学实验技术》第二章（金伯泉主编。第四军医大学出版社，2001.11，ISBN 7-81086-027-5）进行，具体分述如下：
2.3.1小鼠免疫
以人工合成多肽（SEQ ID NO:1）免疫BALB/C小鼠（4-8周龄，雌性），具体步骤如下：
a.第一次免疫：多肽500μg/只，加等体积弗氏完全佐剂充分混匀后以1ml/只皮下多点注射BALB/C小鼠，0.2ml/点，间隔3周。
b.第二次免疫：剂量及途径同上，此次加等体积的弗氏不完全佐剂，间隔3周
c.第三次免疫：剂量同上，不加佐剂，改用等体积的生理盐水，腹腔注射BALB/C小鼠。10天后取被免疫小鼠的尾静脉血（采集后即置4℃冰雪过夜，次日以2000转/分离心10分钟后留上清备用），用RTN4B蛋白包被，通过ELISA测定血清效价。
d.第四次免疫：剂量及途径同第三次免疫，取血清效价大于1:10000的小鼠于融合前3天腹腔注射。
2.3.2 ELISA法检测被免疫小鼠血清效价流程：
a.检测前一天，用包被缓冲液稀释RTN4B至1μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，置4℃冰箱过夜；
b.次日倒出已包被的酶标板内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；
c.分别加入用PBS梯度稀释的待检血清（血清：PBS分别为1:100、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000）100μl/孔，以未免疫的BALB/C小鼠的血清为阴性对照，置37℃恒温水浴箱中1小时；
d.倒出酶标板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤3次，每次拍干；
e.每孔加入HRP标记的兔抗鼠IgG抗体（用抗体稀释液作1:5000的稀释）100μl，置37℃恒温水浴箱中1小时；
f.倒出酶标板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤3次，每次拍干；
g.显色，每孔加入ABTS显色液（现配现用）100μl，置37℃恒温水浴箱中10-15分钟；
h.结果判定：于白色背景上，直接用肉眼观察反应孔内颜色，越深阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
2.3.3饲养细胞的制备（融合前一天取小鼠腹腔巨噬细胞）：
采用6周龄的BALB/C雌性小鼠，拉颈处死，浸泡于75%酒精中消毒5分钟，用无菌剪刀剪开腹部皮肤以暴露腹膜，用无菌注射器每次注射8ml不完全1640培养液，反复冲洗，吸出冲洗液放入50ml离心管中（共用约40ml），以1300转/分钟离心5分钟；弃上清后以完全1640培养液重悬沉淀，调整细胞数为1×105个/ml，加入96孔细胞培养板，100μl/孔，放入37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养。
2.3.4细胞融合过程
观察骨髓瘤细胞SP2/0状态（要求在对数生长期最佳），将配制好的45% PEG及20ml不完全1640培养液放入37℃细胞培养箱预热（45%PEG的配制：于融合前一天配制好45%的PEG置4℃冰箱备用，1g的PEG放入青霉素小瓶后置高压锅内高压灭菌后约得液体0.9ml，于其内加入1.1ml的PEG配制液即得45%的PEG）
b.将SP2/0细胞收集于50ml无菌离心管并计数（要求细胞总数为1×106个），离心1300转/分钟，共7分钟。
c.准备好无菌平皿、筛网、青霉素小瓶，拉颈处死已被四次免疫的BALB/C小鼠，置75%酒精中浸泡5分钟。
d.无菌条件下取出被免疫小鼠脾脏放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培养液冲洗后即将脾脏移于筛网内（此筛网置于平皿中），加入约40ml不完全1640培养液，以无菌的5ml玻璃注射器针芯研磨至脾脏为细末状，取平皿中的研磨液于50ml无菌离心管中（计数细胞，要求细胞总数为1×107个），1300转/分钟离心7分钟；
e.分别去除离心后的SP2/0细胞的上清和脾细胞的上清，以不完全1640培养液重悬两种细胞沉淀后将两细胞混匀于同一个50ml无菌离心管中，1300转/分钟离心7分钟；
f.去除混合细胞的上清后，再次以不完全1640培养液重悬细胞沉淀，1300转/分钟离心7分钟；
h.去除混合细胞上清后，保持离心管管口向下，吸干残留液体；
i.轻弹离心管管底，使细胞沉淀略为松动；
j.于室温下，30秒内沿管壁加入预热的45% PEG，轻轻搅拌后吸入1ml吸管内静置90秒；
k.将吸管内液体轻柔地打入离心管底，用预热的不完全1640培养液终止：吸1ml不完全1640培养液，2分钟内沿管壁加入；接着以每分钟1ml的速度加入持续2分钟，改为每分钟2ml持续2分钟；再改为每分钟4ml直到20ml不完全1640培养液加入完全，即800转/分钟离心6分钟；
l.弃上清，先用6ml的1640完全培养液轻轻混匀沉淀，补加完全培养液至40ml左右；
m.将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔板内，100μl/孔，置37℃、5%的二氧化碳细胞培养箱内。
2.3.5杂交瘤的选择
融合24小时后开始加入选择培养液，具体过程如下：
a.融合24小时后，以HAT 1.6ml及HT 0.4ml加入20ml完全1640培养液中混匀，加入96孔板内，50μl/孔；
b.隔2天后换液，将96孔板内每孔吸出150μl后，加入拟换的完全1640培养液（每60ml完全1640培养液中加入0.6ml的HAT和0.6ml的HT组成）
c.再隔2天后换液，将96孔板内每孔吸出150μl后，加入拟换的完全1640培养液（每60ml完全1640培养液中加入1.2ml的HT组成）
d.2天后ELISA法检测杂交瘤上清：检测前一天，用包被缓冲液稀释RTN4B蛋白至1μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，置4℃冰箱过夜。第二天用洗涤缓冲液洗涤包被板3次，每次拍干。分别加入96孔细胞板内的上清，以未免疫的BALB/C小鼠的血清为阴性对照，以效价大于1:10000的小鼠的血清为阳性对照，置37℃恒温水浴箱中1小时。用洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次拍干。每孔加入HRP标记的抗鼠IgG抗体100μl，以抗体稀释液稀释为1:5000，置37℃恒温水浴箱中1小时。用洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次拍干。每孔加入ABTS显色液100μl，置37℃恒温水浴箱中10-15分钟。结果判定：于白色背景上，直接用肉眼观察反应孔内颜色，越深阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅f.标记阳性孔，选用阳性孔内的细胞进行克隆化。
2.3.6杂交瘤的克隆化、扩大培养及冻存
杂交瘤的克隆化采用有限稀释法进行，具体方法如下：
a.制备饲养细胞悬液（脾细胞悬液）：拉颈处死未免疫的BALB/C小鼠，置75%酒精中浸泡5分钟，无菌条件下取出小鼠脾脏放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培养液冲洗后即将脾脏移于筛网内（此筛网置于平皿中），加入约20ml完全1640培养液，以无菌的5ml玻璃注射器针芯研磨至脾脏为细末状，取平皿中的研磨液于无菌玻璃瓶中，加入完全1640培养液至80ml后再加入3.2ml的HT混匀，将此混匀的悬液分别加入96孔细胞培养板内，100μl/孔，每块板的右下角的最后三孔（H10、H11、H12）不加饲养细胞悬液以备稀释用，将加好的板放入37℃、5%的二氧化碳细胞培养箱；
b.将要克隆化的孔里的细胞悬浮（以200μl的移液器轻轻吹打即可）并计数，将此细胞悬液移于有饲养细胞的板中的稀释孔H10中，从H10孔中取出20μl细胞悬液放入H11孔中用完全1640培养液作10倍稀释，再从H11孔中取出20μl细胞悬液放入H12孔中用完全1640培养液作10倍稀释；
c.取H12孔中的细胞悬液用完全1640培养液稀释至理论上为1个细胞/100μl，再将此稀释液分别滴入含有饲养细胞悬液的96孔板中（每孔稀释后分滴为48孔），每孔100μl；置37℃、5%的二氧化碳细胞培养箱中培养
d.一周后标记单克隆孔，以ELISA法（同前2.5.2.d）对单克隆孔的上清进行检测，选阳性孔内的细胞进行下一次的克隆化，如此反复三次后得到能稳定分泌单抗的杂交瘤（进行克隆化的一株细胞下一次克隆化的所有单克隆孔均为阳性）；
f.选取阳性最强的单克隆孔中的细胞转入24孔板中培养（1孔转1孔），3天后于24孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后将此4孔的细胞一并转入50ml细胞培养瓶扩大培养。
g.杂交瘤细胞的冻存：待50ml培养瓶内细胞铺满瓶底面积约70%时，将培养瓶中的细胞用吸管吹打，使其完全悬浮，将细胞悬液移于50ml无菌离心管内并计数，1200转/分钟离心6分钟。弃上清，以细胞冻存液（50%小牛血清，40%不完全1640培养液和10% DMSO）重悬沉淀，调节细胞密度为1×107/ml。分装于冻存管，1ml/支，置4℃冰箱1小时，转入-20℃冰箱放置2小时，再转入-70℃冰箱过夜，次日将冻存的细胞冻存于液氮罐内。
获得的杂交瘤细胞株进行保藏，其保藏号为：CGMCC NO.5863，标记为6F2。
实施例2 重组单克隆抗体的制备
重链可变区与轻链可变区序列的获得：
1.培养收集杂交瘤细胞，
2，常规方法提取杂交瘤细胞总RNA
3.逆转录RNA为CDNA
4.以制备的CDNA为模板，常规PCR扩增获得重链和轻链的可变区序列
5.经检测，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，重链可变区的编码序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4,轻链可变区的编码序列为SEQ IDNO:6。
6.在测序获得重、轻链可变区编码序列后，通过全合成或者拼接PCR的方法，根据已知鼠的重、轻链恒定区序列来获得两边带有限制性酶切位点的重、轻链Fab基因。
7.将获得的重、轻链Fab基因插入表达载体pGP1，构成Fab抗体的表达载体。表达载体还可以是phCMV-II、pcDNA3.1、或pCI-Neo等载体。
8.经鉴定正确后，将构建的Fab抗体的表达载体按照常规方法转染CHO细胞。转染后的CHO细胞培养后进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测抗体的表达，并挑选表达较高的克隆用于制备重组Fab抗体表达产物。
上述制备重组单克隆抗体的详细方法还可参考文献(Cloning immunoglobulinvariable domains for expression by the polymerase chain reactionProc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.86,pp.3833-3837,May 1989,Medical Sciences)。
还可用类似的方法制备恒定区为人或鼠的重组全长抗体或重组嵌合抗体。
实施例3 单克隆抗体的大量生产及其功能研究
应用此株杂交瘤细胞以1×106个细胞/只小鼠的量腹腔注射预先用液体石蜡致敏的8-10周龄的BALB/C雌性小鼠，10-14天后采集腹水，用RTN4B蛋白（参考ZL00111791.2制备）。包被，通过ELISA检测腹水阳性（结果如表1所示），并用此腹水进行蛋白印迹法证明其能识别RTN4B蛋白，同时将此腹水用于免疫组化证明其能识别天然的RTN4B蛋白，结果如图1所示。此株杂交瘤细胞分泌的单抗为进一步研究新基因RTN4B奠定了基础。
表1 ELISA结果（OD450值）
抗原浓度 100ng/孔 10ng/孔 1ng/孔 0.1ng/孔
6F2 3.289 2.667 0.448 0.093
PC 3.415 3.001 1.156 0.371
NC 0.044 0.043 0.053 0.043
6F2：杂交瘤细胞CGMCC NO.5863接种小鼠后获得的腹水
PC（阳性对照）：免疫小鼠血清（由步骤2.3.1获得）
NC（空白对照）：5% milk-PBS
实施例4 单抗抗肿瘤试验
试验步骤：
1、采用肝癌细胞SMMC7721，培养细胞。收集细胞，稀释成2X107浓度的细胞悬液。
2、SMMC7721细胞悬液接种裸鼠，采用皮下接种，每只老鼠接种200ul。
3、将杂交瘤细胞CGMCC NO.5863接种小鼠后获得的腹水，腹水用普通的亲和柱纯化，纯化后透析至生理盐水，并用0.2um滤膜过滤后制得单克隆抗体浓度为2ug/ul的单克隆抗体注射液。
4、细胞接种后第二天开始注射步骤3制得的单克隆抗体注射液。动物分成4组，生理盐水组、阴性抗体（鼠抗人IgG(购自上海酶联生物)、阳性avastin组、实验组6F2（注射步骤3制得的单克隆抗体注射液），每组8只。
剂量：
生理盐水组：100ul/只
阴性抗体1B2组：200ug抗体/100ul/只
阳性avastin组：200ug/100ul/只
实验组6F2：200ug（以注射液中单克隆抗体重量计）/100ul/只。
5、每周注射两次，连续接种4周。
6、4周后取瘤拍照，结果如图2、3所示。从结果看生理盐水组和阴性对照1B2组，瘤体大小没有差异。阳性对照AVASTIN组，瘤体明显小于阴性对照组，实验组6F2虽抑制瘤体效果没有阳性药物明显，但与阴性对照相比也产生了明显的抑制瘤体的效果。
结论：结果说明，与不具有封阻性的对照抗体相比，本发明的单克隆抗体6F2能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721在裸鼠体内的生长，有望用于临床抗肿瘤治疗。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (13)

1.一种分离的RTN4B多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种分离的多核苷酸，编码权利要求1所述的RTN4B多肽。
3.一种能与权利要求1所述的RTN4B多肽特异性结合的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.5863的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。
5.如权利要求3所述单克隆抗体，包括重链与轻链，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
6.如权利要求3所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为PEG化的或非PEG化的。
7.如权利要求3-6任一权利要求所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体、Fab抗体、嵌合抗体、单链抗体、F(ab)2抗体、F(ab’)2抗体,或其他改形抗体。
8.一种生产权利要求3-7任一权利要求所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
9.如权利要求8所述杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是以权利要求1所述RTN4B多肽为免疫原，采用杂交瘤技术获得。
10.如权利要求8所述杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCCNO.5863。
11.如权利要求1所述RTN4B多肽、权利要求3-7任一所述的单克隆抗体或权利要求8-10任一所述的杂交瘤细胞株在制备治疗或诊断肿瘤的药物或试剂中的用途，所述肿瘤为肝癌。
12.一种用于治疗肝癌的药物，所述药物的活性成分含有权利要求3-7任一权利要求单克隆抗体。
13.一种肝癌诊断试剂，所述肝癌诊断试剂中含有权利要求1所述RTN4B多肽和/或权利要求3-7任一权利要求所述单克隆抗体。
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