JP2012510500A - ポリペプチド精製 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)陰イオン交換クロマトグラフィー材料に前記サンプルをロードする工程;
(b)酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び酢酸ナトリウムから選択される少なくとも1つの塩を含むpH9.0未満のpHの溶液を使用して前記ポリペプチドを溶出する工程;
(c)前記溶出によって得られた画分を選択する工程であって、前記画分のポリペプチドが所望の含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有する、工程
を含む、方法を提供する。
(a)9.0未満のpHのバッファーで陰イオン交換材料を平衡化する工程;
(b)陰イオン交換材料に前記サンプルをロードする工程;
(c)場合によって、9.0未満のpHのバッファーで陰イオン交換材料を洗浄する工程;
(d)酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び酢酸ナトリウムから選択される少なくとも1つの塩を含む9.0未満のpHの溶液を使用して、陰イオン交換材料から前記ポリペプチドを溶出する工程;及び
(e)前記溶出によって得られた画分を選択する工程であって、前記画分のポリペプチドが所望の含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有する、工程
を含む。
− 溶出バッファーが5.0から8.5の間のpHを有してよい。
− 酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は酢酸ナトリウムが、0.1Mから2.0Mの間、好ましくは約0.6Mで溶出バッファー中に存在してよい。
− イオン交換クロマトグラフィーが、5.0から8.5の間のpHの平衡化バッファーを使用してよい。
(1)ポリペプチドがγカルボキシル化認識部位を含む、及び
(2)γカルボキシル化認識部位の40残基内にグルタミン酸残基が存在する。
- サンプル中の#1−12−Glaの割合の増加;
- サンプル中の#1−11−Glaの割合の増加;
- サンプル中の#1−10−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−9−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−8−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−7−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−6−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−5−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−4−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−3−Glaの割合の減少;
- サンプル中の#1−2−Glaの割合の減少;及び
- サンプル中の#1−1−Glaの割合の減少
のいずれか1つ又は複数によって増加し得ることが予測できる。
組換えヒト第IX因子(FIX)は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で生成した。FIXの非活性は、約50%であると測定された。
組換えヒト第IX因子(rhFIX)について、異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、6mlのベッドボリューム、3ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 15Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 8.0,0.01% Tween80;
溶出バッファー:20mM Tris/HCl,1.5M酢酸アンモニウム,pH 8.0,0.01% Tween80;
CIP:1M NaOH。
A−バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 9.0;
B−バッファー:20mM Tris/HCl,pH9.0,1.5M酢酸アンモニウム。
0 - 5 分 0 - 30 % B
5 - 55 分 30 - 55 % B
55 - 65 分 55 - 100 % B。
組換えヒトFIXの異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、6mlのベッドボリューム、2ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 30Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 8.0,0.01% Tween80;
溶出バッファー:20mM Tris/HCl,1.5M酢酸アンモニウム,pH 8.0,0.01% Tween80;
CIP:1M NaOH。
組換えヒト第VIIa因子(FVII)の異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、1.7mlのベッドボリューム、0.75ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 15Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 8.0;
溶出バッファー:20mM Tris/HCl,1.5M酢酸アンモニウム,pH 8.0;
CIP:1M NaOH。
組換えヒトFIXの異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、1.7mlのベッドボリューム、0.75ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 15Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 8.5;
溶出バッファー:20mM Tris/NaOH,1.0M塩化アンモニウム,pH 8.5;
CIP:1M NaOH。
組換えヒトFIXの異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、1.7mlのベッドボリューム、0.75ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 15Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris/NaOH,pH 8.0;
溶出バッファー:20mM Tris/HCl,1.0M酢酸ナトリウム,pH 8.0;
CIP:1M NaOH。
FX活性化ペプチドをフィブリノペプチドA活性化ペプチド(DFLAEGGGVR)に交換し、かつ、HPC4タグをC末端に付加した(DQVDPRLIDGK)、組換えヒトFX構築物の異なるγカルボキシル化された形態の分離に、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。前記方法では、1.7mlのベッドボリューム、0.75ml/分の流速、及び4℃の温度でSOURCE 15Qカラム(GE Healthcare)を使用した。
平衡化バッファー:20mM Tris,pH 8.0;
溶出バッファー:20mM Tris/HCl,1.5M酢酸アンモニウム,pH 8.0;
CIP:1M NaOH。
Claims (14)
- 異なる含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有する複数の種のポリペプチドの混合物を含むサンプルから、所望の含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有するポリペプチドを精製するための方法であって、
(a)陰イオン交換クロマトグラフィー材料に前記サンプルをロードする工程;
(b)酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び酢酸ナトリウムから選択される少なくとも1つの塩を含むpH9.0未満のpHの溶液を使用して前記ポリペプチドを溶出する工程;
(c)前記溶出によって得られた画分を選択する工程であって、前記画分のポリペプチドが所望の含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有する、工程
を含む、方法。 - 以下の工程:
(a)9.0未満のpHのバッファーで陰イオン交換材料を平衡化する工程;
(b)陰イオン交換材料に前記サンプルをロードする工程;
(c)場合によって、9.0未満のpHのバッファーで陰イオン交換材料を洗浄する工程;
(d)酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び酢酸ナトリウムから選択される少なくとも1つの塩を含む9.0未満のpHの溶液を使用して、陰イオン交換材料から前記ポリペプチドを溶出する工程;及び
(e)前記溶出によって得られた画分を選択する工程であって、前記画分のポリペプチドが所望の含有量のγ−カルボキシグルタミン酸を有する、工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 精製するポリペプチドが、第IX因子、第VII因子、第VIIa因子、第X因子、プロトロンビン、タンパク質S、タンパク質C、タンパク質Z、オステオカルシン、マトリックス−gla−タンパク質、増殖停止特異的6、プロリンリッチGla1、プロリンリッチGla2、プロリンリッチGla3、及びプロリンリッチGla4から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが第IX因子である、請求項3に記載の方法。
- 精製するサンプル中の#1−11−Gla及び/又は#1−12−Glaの形態の第IX因子の割合と比較して、#1−11−Gla及び/又は#1−12−Glaの形態の第IX因子の割合が増大している、前記溶出によって得られる画分を選択する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 精製するサンプル中の#1−10−Glaの形態の第IX因子の割合と比較して、#1−10−Glaの形態の第IX因子の割合が減少している、前記溶出によって得られる画分を選択する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが第VII因子又は第VIIa因子である、請求項3に記載の方法。
- 精製するサンプル中の#1−10−Gla及び/又は#1−11−Glaの形態の第VII因子又は第VIIa因子の割合と比較して、#1−10−Gla及び/又は#1−11−Glaの形態の第VII因子又は第VIIa因子の割合が増大している、前記溶出によって得られる画分を選択する工程を含む、請求項7に記載の方法。
- 精製するサンプル中の#1−9−Glaの形態の第VII因子又は第VIIa因子の割合と比較して、#1−9−Glaの形態の第VII因子又は第VIIa因子の割合が減少している、前記溶出によって得られる画分を選択する工程を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが5.0から8.5の間のpHを有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は酢酸ナトリウムが、0.1Mから2.0Mの間で溶出バッファー中に存在する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は酢酸ナトリウムが、約0.6Mで溶出バッファー中に存在する請求項11に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが5.0から8.5の間のpHの平衡化バッファーを利用する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド製剤。
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