ES2349112T3

ES2349112T3 - Método de purificación de factor vii.

Info

Publication number: ES2349112T3
Application number: ES06700982T
Authority: ES
Inventors: Rikkle Bolding Jensen; Frank Bech Nygaard
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2006-01-13
Publication date: 2010-12-28
Anticipated expiration: 2026-01-13
Also published as: ATE476501T1; DE602006015907D1; CY1110867T1; US20090047723A1; WO2006074664A1; PL1841863T3; EP1841863B1; DK1841863T3; PT1841863E; EP1841863A1

Abstract

Un procedimiento para purificar el Factor VII recombinante (rFVII) o Factor VII recombinante activado (rFVIIa), que comprende someter el rFVII o rFVIIa a cromatografía líquida sobre una columna de hidroxiapatita (HAP), en el que el rFVII o rFVIIa se eluye a partir de la columna de HAP usando un gradiente lineal o por etapas de tampón fosfato o desplazador no fosfato con una concentración de fosfato / desplazador en aumento, y en el que: el procedimiento además comprende una etapa de elución en la que el pH se aumenta por etapas según un valor de 1 - 3 subsiguiente a la elución en gradiente de concentración, o el gradiente de fosfato o desplazador se combina con un gradiente de pH con pH en aumento.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a un procedimiento para purificación de la proteína de Factor VII usando hidroxiapatita.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El factor VII (FVII), una proteína importante en la cascada de coagulación de la sangre, es una proteína del plasma dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre en forma de una glucoproteína de una sola cadena con un peso molecular de 53 kDa. El zimógeno FVII se convierte en una forma activada (FVIIa) por escisión proteolítica en un solo sitio, R152–I153, dando como resultado dos cadenas unidas por un solo puente disulfuro. El FVIIa recombinante humano está disponible en el mercado de Novo Nordisk bajo la denominación NovoSeven® y se usa para el tratamiento de episodios de extracción, por ejemplo, en hemofilia o traumatismo. También se han reseñado variantes de FVII humano producidas de forma recombinante.

La purificación del Factor VII recombinante (rFVII) o Factor VII recombinante activado (rFVIIa) se lleva a cabo por lo general usando una combinación de intercambio de iones y cromatografía de inmunoafinidad basada en un reconocimiento dependiente de Ca2+ de la región Gla de FVII (residuos aminoácidos 1 a 45 de FVII humano). Aunque la etapa de purificación basada en cromatografía de inmunoafinidad es muy selectiva y proporciona alta pureza a la proteína FVII, existen desventajas en esta etapa. Por ejemplo, la lixiviación potencial del anticuerpo en el producto farmacéutico puede afectar la seguridad del fármaco final, y el coste de producir la matriz de inmunoafinidad del anticuerpo monoclonal (mAb) es considerable en comparación con matrices de purificación no basadas en anticuerpos, más convencionales.

Aunque el reemplazo de la etapa de inmunoafinidad por una técnica de purificación diferente sería ventajoso, esto precisaría la eliminación de contaminantes no relacionados con FVII así como la capacidad de separar cualquier isoforma no deseada de FVII que puede estar presente en los sobrenadantes del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un indicio UV de una muestra de FVII eluida a partir de una columna de hidroxiapatita de acuerdo con la invención, como se describe en el Ejemplo 1.

La figura 2 muestra un análisis SDS–PAGE de la muestra de la figura 1.

La figura 3 muestra un indicio UV de una muestra de FVII eluida a partir de una columna

de hidroxiapatita de acuerdo con la invención, como se describe en el Ejemplo 2.

La figura 4 muestra un análisis SDS–PAGE de la muestra de la figura 3.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han explorado las posibilidades de usar procedimientos no basados en anticuerpos para la purificación de la proteína FVII y la posible separación de isoformas de FVII capturadas a partir de los sobrenadantes del cultivo, y sorprendentemente se ha descubierto que se obtienen resultados excelentes usando hidroxiapatita. De este modo, la presente invención se refiere a un procedimiento adecuado para purificar rFVII o rFVIIa, que comprende someter el rFVII o rFVIIa a cromatografía líquida en una columna de hidroxiapatita (HAP), en la que el rFVII

o rFVIIa se eluye como se define en la reivindicación 1.

Definiciones

En la descripción y reivindicaciones dadas a continuación, se aplican las definiciones siguientes:

El término “FVII” o “polipéptido de FVII” se refiere a una molécula de FVII proporcionada en forma de una sola cadena.

El término “FVIIa” o “polipéptido de FVIIa” se refiere a una molécula de FVIIa proporcionada en su forma de doble cadena activada, en la que el enlace peptídico entre R152 y I153 de la forma de doble cadena se ha escindido.

Los términos “rFVII” o “rFVIIa” se refieren a moléculas de FVII y FVIIa producidas por medio de técnicas recombinantes, respectivamente. Éstas pueden tener la secuencia humana de tipo salvaje o pueden ser variantes de la secuencia humana.

Los términos “FVIIh” y FVIIha” se refieren a FVII y FVIIa humano de tipo salvaje, respectivamente.

A menos que se indique otra cosa o sea evidente a partir del contexto, se pretende que los términos “FVII”, “proteína FVII” y Factor VII”, como se usa en la presente memoria descriptiva, incluyan tanto las formas activadas como inactivadas de FVII, la secuencia recombinante de tipo salvaje de FVII humano así como variantes de los mismos.

Descripción detallada

Las proteínas FVII que se pueden purificar por medio del procedimiento de la invención incluyen cualquier proteína FVII o FVIIa, en particular FVII o FVIIa recombinante humano y variantes de las mismas. La secuencia de aminoácidos de FVII humano de tipo salvaje es bien conocida y se describe, por ejemplo, en el documento WO 01/58935. Las variantes de interés que se pueden purificar por medio del procedimiento de la invención incluyen, por ejemplo, las descritas en los documentos WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091, WO 2004/111242, WO 99/20767, WO 00/66753, WO 88/10295, WO 92/15656, WO 02/29025, WO 01/70763, WO 01/83725, WO 02/02764, WO 02/22776, WO 02/38162, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 03/037932, WO 2004/000366, WO 2004/029090, y WO 2004/108763.

Las variantes de FVII o FVIIa pueden incluir una o más sustituciones, inserciones o deleciones en comparación con FVII humano de tipo salvaje, por ejemplo dando como resultado un variante que difiere en 1 – 15 residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de FVII humano de tipo salvaje, típicamente en 1 – 10 o en 2 – 10 residuos aminoácidos, por ejemplo, en 1 – 8 o en 2 – 8 residuos aminoácidos, tal como en 3 – 7 o en 4

– 6 residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos, en la que las diferencias en la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje son típicamente sustituciones. Tales sustituciones se pueden llevar a cabo por ejemplo con el objetivo de introducir uno o más sitios de glucosilación in vivo o sitios de polietilenglicolización en la proteína y/o para mejorar o modificar de otra forma la actividad de coagulación de la proteína de tipo salvaje; tales variantes se describen en los documentos WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091 y WO 2004/111242. Las variantes de FVII o FVIIa pueden tener de forma alternativa una actividad de coagulación reducida con el fin de funcionar como anti–coagulantes.

La proteína de FVII / FVIIa o variante de las mismas se puede producir por medio de cualquier organismo adecuado, por ejemplo en mamíferos, células de levaduras o bacterianas, aunque se prefieren las células eucarióticas, más preferiblemente las células mamíferas tales como células CHO, células HEK o células BHK.

La hidroxiapatita (HAP) es un material inorgánico poroso de cromatografía basado en fosfato cálcico que es útil para la purificación de proteínas, incluyendo enzimas y anticuerpos monoclonales, así como ácidos nucleicos. Como la HAP está constituida por fosfato cálcico, contiene tanto cargas positivas como negativas. La cromatografía líquida usando HAP se realiza típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,5 a 9, por ejemplo aproximadamente 6 – 9.

La columna de HAP se puede equilibrar con un tampón de fuerza iónica baja, por ejemplo aproximadamente de 5 mM a 10 mM, siendo un tampón adecuado por ejemplo un tampón fosfato tal como fosfato sódico o de forma alternativa un tampón no fosfato tal como imidazol, TRIS, histidina, MES (ácido 2–(N–morfolino) etano sulfónico) o borato. El tampón puede incluir opcionalmente una sal tal como NaCl.

La propia columna puede tener cualquier tamaño y volumen adecuados, dependiendo por ejemplo de la cantidad de proteína y sobrenadante que se va a purificar. Las personas expertas en la técnica serán capaces de seleccionar fácilmente una columna adecuada basada en las necesidades de purificación reales.

Se ha descubierto que HAP es particularmente adecuada para la purificación de rFVII así como la separación de isoformas de FVII no deseadas. La proteína de FVII se une estrechamente a HAP a concentraciones bajas de tampón, por ejemplo una concentración de fosfato de aproximadamente 1 mM, tal como desde aproximadamente 5 mm, por ejemplo desde aproximadamente 10 mM, y hasta aproximadamente 20 mM, a un pH desde aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5, por ejemplo aproximadamente 6,0 a 7,5, o en ausencia de fosfato a un pH desde aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 9,0 ó 9,5, de forma típica aproximadamente 6,0 – S,6. La presencia de una concentración baja de CaCl2, por ejemplo una concentración de hasta aproximadamente 1 mM, o una concentración más alta, por ejemplo hasta aproximadamente 5, 10 ó 20 mM, o incluso más alta tal como hasta aproximadamente 50 mM, no evita la unión de la proteína de FVII a la matriz de HAP.

La elución de no impurezas de FVII e isoformas de FVII no deseadas, por ejemplo isoformas con un nivel insuficiente de gamma–carboxilación en la región Gla de FVII, se puede conseguir por medio del uso de condiciones de elución suaves a un pH desde aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, por ejemplo lavando con una concentración de fosfato desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM o superior, tal como hasta aproximadamente 100 mM ó 150 mM, a un pH de aproximadamente 6,0 – 7,0. Una alternativa adicional para la elución de no impurezas de FVII e isoformas de FVII no deseadas es el uso de una concentración elevada de NaCl, por ejemplo hasta 1 M o incluso superior, tal como hasta 1,5 M, en presencia de fosfato.

La elución de la proteína de FVII se puede llevar a cabo aumentando la concentración de fosfato, siendo eluida la proteína de FVII a partir de la columna usando una combinación apropiada de pH y fosfato, por ejemplo un gradiente que comienza a aproximadamente fosfato 10 mM – 20 mM y que aumenta hasta una concentración máxima de fosfato de por ejemplo aproximadamente 400 mM – 500 mM a un pH de aproximadamente 5,5 o superior, típicamente aproximadamente 6,0 o superior, por ejemplo hasta aproximadamente 9,0 ó 9,5, tal como hasta aproximadamente 8,6. La concentración de fosfato se puede aumentar de una manera lineal o por etapas, como se conoce por lo general en la técnica. De forma alternativa, la elución se puede llevar a cabo de una manera por etapas o con un gradiente usando una concentración en aumento de un desplazador no fosfato de una forma similar a la elución con un tampón fosfato. En este caso, el desplazador podría ser, por ejemplo, calcio en forma de cloruro cálcico o sulfato de calcio, con un pH de por ejemplo aproximadamente pH 5,5 – 9,5, por ejemplo 6,0 – 9,0. Habitualmente se preferirá la elución con fosfato.

La regeneración de la columna de HAP se puede realizar con un tampón fosfato, por ejemplo en una concentración de aproximadamente 0,5 M.

Bajo ciertas condiciones de elución la proteína de FVII eluye en picos discretos, posiblemente debido a la separación de isoformas diferentes. En este caso son posibles diferentes enfoques para separar las fracciones diferentes. Un enfoque es aumentar la concentración de fosfato u otro desplazador como se describe anteriormente mientras que se mantiene un pH constante. Después de alcanzar la concentración máxima de fosfato / desplazador el pH se puede aumentar después por etapas, típicamente aumentando el pH en una sola etapa por un valor de 1 – 3, por ejemplo aproximadamente 1,5 – 2,5, tal como aproximadamente 2, sobre el pH usado durante la elución del gradiente. Por ejemplo, la proteína de FVII se puede eluir a un pH de aproximadamente 6 –7 y una concentración máxima de fosfato u otro desplazador de 400 mM – 500 mM, después de lo cual se aumenta el pH desde aproximadamente 6 – 7 hasta aproximadamente 8 – 9, por ejemplo desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente S o desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 9, mientras que se mantiene el nivel alto de fosfato / desplazador.

De forma alternativa, la elución se puede llevar a cabo usando una concentración combinada y un gradiente de pH, en la que tanto la concentración de fosfato / desplazador y el pH se aumentan de forma simultánea. Esto puede tener lugar comenzando con una concentración baja de fosfato / desplazador de, por ejemplo aproximadamente 10 mM – 20 mM,

o después de que la concentración de fosfato / desplazador se aumente inicialmente hasta un nivel intermedio de por ejemplo aproximadamente 100 mM ó 150 mM. Por ejemplo, después de un aumento inicial de la concentración de fosfato hasta un nivel intermedio de 100 mM – 150 mM, se puede usar un gradiente de concentración de fosfato comenzando a este nivel y aumentando hasta por ejemplo 400 mM – 500 mM junto con un gradiente de pH, típicamente comenzando con un pH inicial de 5,5 – 7,0 y aumentando hasta un pH final de aproximadamente 7,5 – 9,0, por ejemplo comenzando con un pH de aproximadamente 6 y aumentando hasta un pH de aproximadamente 8. Una variante de este enfoque es usar una elución por etapas en la que la concentración de eluyente y/o el pH se alteran de tal forma que va directamente a las condiciones de elución desde el nivel intermedio hasta el final. Un ejemplo de una elución por etapas como tal es ir desde una concentración de fosfato / desplazador de por ejemplo aproximadamente 100 mM ó 150 mM y un pH de por ejemplo aproximadamente 6 en una sola etapa hasta una concentración de fosfato / desplazador de por ejemplo aproximadamente 400 mM ó 500 mM y un pH de por ejemplo aproximadamente 8 ó 9. En caso conveniente, el gradiente combinado de fosfato / desplazador y pH se puede combinar adicionalmente con un gradiente de sal, por ejemplo, comenzando con una concentración de NaCl de 0,5 M a 1,5 M, tal como

aproximadamente 1,0 M, y disminuyendo típicamente hasta 0 M.

Se ha descubierto que la proteína de FVII eluida por medio del procedimiento de la invención tiene una pureza mayor de aproximadamente el 80%, y en algunos casos aproximadamente el 90% o más, como se determina por LDS PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de litio).

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

La proteína de FVII recombinante humana aplicada sobre la columna de HAP se produjo en células CHO–K1. Los sobrenadantes del cultivo se filtraron por esterilización, ultrafiltración y diafiltración contra Tris 10 mM pH 8,6. La muestra se capturó posteriormente en una columna de Q–SepharoseTM FF previamente equilibrada con Tris 10 mM, pH 8,6. Después de lavar en Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,6 la proteína de FVII ligada se eluyó en Tris 10 mM, CaCl2 35 mM, NaCl 25 mM, pH 8,6. Esta muestra se desaló para reducir la conductividad en Tris–HCl 20 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 7,5 antes de la aplicación sobre la columna de hidroxiapatita.

El tipo 1 de hidroxiapatita cerámica era de Biorad (cat nº 157–0400). Las columnas se compactaron a volúmenes de 3 – 10 ml con diámetros de columna de 5 ó 10 mm (Amersham Biosciences) en Na–Fosfato 0,2 M, pH 9 – 10 y posteriormente se equilibraron con Tris 10 mM, pH 8,6. Las columnas se procesaron a temperatura ambiente y típicamente hasta 30 CV/h.

Resultados

El FVII eluido a partir de una captura de intercambio de aniones como se describe anteriormente se unió en Tris–HCl 20 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 7,5 a la columna de hidroxiapatita. La proteína ligada se lavó en primer lugar en Tris–HCl 20 mM, pH 7,5, después usando Na– Fosfato 20 mM, pH 6,0. La proteína ligada se eluyó después con un gradiente de Na–Fosfato 20 mM – 500 mM a pH 6,0 seguido de una etapa de Na–Fosfato 500 mM, pH 8,0. La figura 1 muestra un indicio de UV de muestra eluida a partir de una columna de HAP, en la que las letras A a E indican reservas que se analizaron por SDS–PAGE como se muestra en la figura 2, en la que la banda 1 es un patrón de peso molecular promedio en peso, la banda 2 es la solución de proteína cargada en la columna de HAP, la banda 3 es la reserva A, la banda 4 es la reserva B, la banda 5 es la reserva C, la banda 6 es la reserva D, y la banda 7 es la reserva E. La elución muy selectiva de FVIIa al final de un gradiente lineal de fosfato de 20 mM a 500 mM a pH 6,0 y a fosfato 500 mM, pH 8,0 se muestra en las bandas 6 y 7, respectivamente.

La proteína de FVII eluida en dos reservas separadas en pocillos, una última en el gradiente y una con la etapa de pH 8,0. La proteína tenía una pureza mayor al 90% en ambas reservas como se evaluó en SDS–PAGE (figura 2).

Ejemplo 2

Materiales y procedimientos

La proteína de FVII recombinante humana aplicada sobre la columna de HAP se produjo en células CHO–K1. Los sobrenadantes del cultivo se filtraron por esterilización, ultrafiltración y diafiltración contra imidazol 25 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Posteriormente se añadió EDTA 5 mM a la muestra diafiltrada antes de capturar en una columna Q–SepharoseTM FF previamente equilibrada con imidazol 25 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Después de lavar en imidazol 25 mM, NaCl 25 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,0 la proteína de FVII ligada se eluyó en imidazol 25 mM, CaCl2 75 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Esta muestra se diluyó en con imidazol 25 mM, pH 6,5 para reducir la conductividad antes de la aplicación sobre la columna de hidroxiapatita.

La hidroxiapatita cerámica es como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las columnas se compactaron y se procesaron como se describe anteriormente, equilibrando con imidazol 25 mM, pH 6,5, con un volumen de columna de 30 ml y un diámetro de columna de 16 mm. La presencia de isómeros de FVII se calcula por medio de la relación entre dos ELISA, dirigidos hacia el dominio Gla (“Sigma ELISA”) y el dominio PD (residuos aminoácidos 153 – 406 de FVII humano) (“PD ELISA”), respectivamente. El Sigma ELISA reconoce la proteína de FVII con dominios Gla correctamente doblados y muy gamma–carboxilados, y es de ese modo un cálculo cuantitativo de la población de FVII con dominios Gla funcionales. El PD ELISA reconoce todas las moléculas de FVII en la muestra independientemente de la condición del dominio Gla. La relación entre los dos ELISA es un indicador de la pureza de la población de FVII con un dominio Gla funcional.

Resultados

El FVII eluido a partir de una captura de intercambio de aniones como se describe anteriormente se unió en imidazol 25 mM, aproximadamente NaCl 6 mM, aproximadamente CaCl2 18 mM, pH 6,5 a la columna de hidroxiapatita. La proteína ligada se lavó en primer lugar en imidazol 25 mM, pH 6,5, después usando Na–Fosfato 100 mM, pH 6,3, seguido de Na–Fosfato 150 mM, NaCl 1 M para eluir contaminantes e isoformas de FVII no deseadas. Después se eluyó la proteína de FVII que contiene las isoformas muy gamma–carboxiladas deseadas usando Na– Fosfato, NaCl 1 M, con un gradiente de concentración en Na–Fosfato de 150 mM a 500 mM junto

5 con un gradiente de pH de 6,3 a 8,0.

La figura 3 muestra un indicio de UV de muestra eluida a partir de la columna de HAP, en la que las letras A a F indican reservas que se analizaron por medio de SDS-PAGE, en la que la banda 1 es un patrón de peso molecular promedio en peso, la banda 2 es el material de partida que está constituido por el eluido de captura, la banda 3 es la solución de proteína diluida

10 cargada en la columna de HAP, la banda 4 es la reserva A (pasante / lavado), la banda 5 es la reserva B (lavado con Na-Fosfato 100 mM), la banda 6 es la reserva C (lavado con Na-Fosfato 150 mM, NaCl 1 M), la banda 7 es la reserva D, y la banda 8 es la reserva E (en la que las reservas D y E comprenden un gradiente lineal combinado de fosfato / pH / sal que va desde Na-Fosfato 150 mM hasta 500 mM, de pH 6,3 a pH 8,0, y de NaCl 1 M a 0 M, siendo la reserva D la

15 pre-elución de borde anterior y siendo la reserva E la reserva de producto), y la banda 9 es la reserva F (Na-Fosfato 500 mM, pH 8,0, post-elución de borde posterior). La elución muy selectiva de FVII usando un gradiente lineal de concentración de Na-Fosfato, pH y sal se puede ver en la banda 8 de la figura 4. La proteína de FVII eluida bajo dos conjuntos diferentes de condiciones: uno en

20 concentraciones moderadas de Na-Fosfato de hasta 150 mM, con una concentración en NaCl hasta 1 M, a un pH entre 6,0 y 6,5, y uno en la que FVII se eluye en el gradiente combinado de fosfato / pH / sal que termina en Na-Fosfato 500 mM, y pH 8,0. La proteína era pura al >80% en la reserva de producto final (figura 4, banda 8) como se calculó por medio de SDS-PAGE. Las relaciones Sigma: PD ELISA de las reservas de FVII eluidas eran 0 (figura 4, banda 5) y 1 (figura

25 4, banda 8), respectivamente, sugiriendo una eliminación muy eficiente de la proteína de FVII con dominios Gla que no son reconocibles por medio de Sigma ELISA (es decir, con dominios Gla insuficientemente gamma-carboxilados) en los lavados iniciales. Esto también se ha confirmado por medio de un análisis cuantificador por HPLC de intercambio de Gla-anión.

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para purificar el Factor VII recombinante (rFVII) o Factor VII recombinante activado (rFVIIa), que comprende someter el rFVII o rFVIIa a cromatografía líquida sobre una columna de hidroxiapatita (HAP), en el que el rFVII o rFVIIa se eluye a partir de la columna de HAP usando un gradiente lineal o por etapas de tampón fosfato o desplazador no fosfato con una concentración de fosfato / desplazador en aumento, y en el que:

el procedimiento además comprende una etapa de elución en la que el pH se aumenta por etapas según un valor de 1 – 3 subsiguiente a la elución en gradiente de concentración, o el gradiente de fosfato o desplazador se combina con un gradiente de pH con pH en aumento.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el rFVII o rFVIIa es rFVII o rFVIIa humano.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el rFVII o rFVIIa es una variante de rFVII o rFVIIa humano, en el que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de FVII humano de tipo salvaje en 1 -15 residuos aminoácidos.
4.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rFVII o rFVIIa se aplica a la columna de HAP en un tampón fosfato que tiene un pH de 5,5 a 7,5.
5.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3, en el que el rFVII o rFVIIa se aplica a la columna de HAP en un tampón no fosfato que tiene un pH de 5,5 a 9,0.
6.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5, que comprende una etapa de elución final usando un pH en el intervalo de 5,5 – 7,5.
7.

El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la etapa de elución inicial se realiza con fosfato en una concentración de hasta aproximadamente 150 mM.
8.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la elución se realiza usando un tampón fosfato con un pH en el intervalo de 5,5 – 9,0.
9.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH se aumenta de 6 – 7 a 8 – 9.
10.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la elución se realiza usando un gradiente de tampón fosfato y un gradiente de pH.
11.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH se aumenta desde un pH inicial de 5,5 -7,0 hasta un pH final de 7,5 -9,0.