ES2635595T3 - Un nuevo procedimiento para la purificación del activador tisular del plasminógeno - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la purificación del activador tisular del plasminógeno que comprende: a) cargar la mezcla cruda de activador tisular del plasminógeno con impurezas en una matriz de columna adecuada; b) eluir las impurezas de dicha matriz de columna con un disolvente orgánico adecuado en la concentración apropiada, en que la concentración apropiada es de menos del 15 % del disolvente orgánico adecuado; c) eluir la forma deseada de dicha proteína de dicha matriz de columna con un disolvente orgánico adecuado en la concentración apropiada, en que la concentración apropiada es del 15 al 30 % del disolvente orgánico adecuado; d) obtener dicha proteína en la forma deseada; y e) opcionalmente, se usa una etapa con una columna de intercambio iónico después de usar dicha matriz de columna adecuada, en que la matriz de columna adecuada corresponde a una cromatografía de interacción hidrófoba; y en que el disolvente orgánico adecuado se selecciona entre etanol, metanol y alcohol isopropílico.

Description

DESCRIPCION
Un nuevo procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno
5 [0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento de purificacion de la protelna activadora tisular del
plasminogeno (tPA) a partir de una mezcla que comprende dicha protelna y otras impurezas. Especlficamente, la presente invencion describe la purificacion del tPA en la forma deseada, que principalmente comprende la forma monocatenaria de dicha protelna, usando una cromatografla de interaccion hidrofoba en presencia de un disolvente adecuado.
10
Antecedentes de la invencion:
[0002] Los activadores del plasminogeno son proteasas de serina que convierten el plasminogeno zimogeno
catallticamente inactivo en su forma activa, plasmina, que es la requerida para la disolucion de la fibrina. Debido a
15 esta propiedad, actualmente se usan varios activadores del plasminogeno como agentes fibrinollticos in vivo en el tratamiento del infarto de miocardio agudo. Uno de tales activadores del plasminogeno es el activador tisular del plasminogeno que ha sido el foco de una atencion considerable a causa de su actividad fibrinolltica intensificada en el tratamiento del infarto de miocardio agudo y la embolia pulmonar.
20 [0003] El activador tisular del plasminogeno humano, una proteasa de serina que contiene 527 aminoacidos
con 17 pares de puentes S-S, es una glucoprotelna de cadena polipeptldica sencilla con una masa molecular de aproximadamente 70 kDa. Se ha encontrado que el tPA glucosilado aparece con dos formas diferentes: el tipo I y el tipo II. La fraccion de carbohidrato comprende principalmente glucosilaciones unidas a N o unidas a O en las posiciones Asn448, Asn117 y Asn184 (unidas a N) y Thr61 (unidas a O) y contribuye aproximadamente al 7 % del peso
25 molecular total de la protelna. Se sabe que el tPA del tipo I contiene la fraccion glucosilada en todos los restos especificados anteriormente, mientras que la poblacion del tipo II del tPA no presenta glucosilacion en la posicion Asn184 (Kayuza Mori, J. Biol. Chem., 17 de febrero de 1995; 270(7): 3261-7). El tPA humano aislado presenta un pH isoelectrico de aproximadamente 7,5. Aunque el tPA se sintetiza dentro de la celula como un polipeptido monocatenario, se ha descrito que tras su liberacion al medio extracelular, el tPA sufre una escision proteolltica por
30 parte de la plasmina en el extremo C de la Arg275 (Kayuza Mori, J. Biol. Chem., 17 de febrero de 1995; 270(7): 32617). La escision proteolltica convierte el tPA monocatenario en una forma de dos cadenas que se mantienen unidas por un unico enlace S-S. Sin embargo, es sabido en la tecnica que las formas monocatenaria y bicatenaria del tPA no muestran ninguna diferencia significativa en actividad fibrinolltica.
35 [0004] La TNKasa (TNK-tPA), una forma recombinante del tPA humano, se produce en celulas CHO como
protelna de secrecion y se sabe que desempena el mismo papel que el tPA humano. El tPA recombinante se usa como agente terapeutico para el tratamiento del infarto de miocardio agudo. El TNK-tPA tiene tres conjuntos de mutaciones en su esqueleto polipeptldico en las posiciones T103N, N117Q, KHRR<296-299>AAAA, segun se muestra en (Proc. Natl. Acad. Sci. vol 91, pags. 3670-3674, abril de 1994) y tambien en la patente de los EE. UU. 5.612.029. De
40 manera similar al tPA, el TNK-tPA recombinante tambien consta de glucoformas del tipo I y el tipo II y se ha observado que aparece como una mezcla de formas monocatenaria y bicatenaria.
[0005] Se ha descrito que la especie monocatenaria del tPA recombinante (producido por CHO) con mas del 70 % de pureza de la forma monocatenaria se mantiene estable durante mas de 2,5 anos si se almacena en forma
45 liofilizada, en condiciones de temperatura ambiente (Journal of Interventional Cardiology, vol. 2, n.° 2, 1989). Tambien se ha demostrado que la especie bicatenaria del tPA recombinante (forma escindida) obtenida de celulas CHO permanece bastante estable durante al menos un ano cuando se almacena a 0-4 °C. Estas observaciones indican que ambas formas, monocatenaria y bicatenaria, del tPA se mantienen razonablemente estables en diversas condiciones de almacenamiento.
50
[0006] Con fines comerciales, el activador tisular del plasminogeno recombinante o el TNK-tPA se han sobreexpresado en celulas CHO y purificado con ayuda de diversas etapas de cromatografla en columna. Estas etapas cromatograficas comprenden fundamentalmente ciertas matrices para cromatografla en columna de afinidad para aislar el tPA con sus especies variantes, como el tipo I y el tipo II, de manera selectiva. Una de tales
55 cromatograflas de afinidad de uso extendido es la cromatografla en columna de lisina-sefarosa. La matriz de lisina- sefarosa se une al tPA por el sitio de union a la lisina de su dominio kringle 2. Por lo tanto, la etapa de esta columna ha resultado ser util para capturar la molecula del tPA de manera selectiva a partir de una mezcla cruda durante la purificacion en columna (Byeon I. J., Kelley R. F., Linas M., Eur. J. Biochem., 10 de abril de 1991; 197(1): 155-65). Ademas, el documento US 4.898.825 describe el uso del inhibidor de tripsina de Erythrina como un agente de
afinidad para la purificacion del tPA. El documento US 5.411.864 describe el uso de anticuerpos para la purificacion del tPA. De manera similar, el documento 5.015.583 describe el uso de una columna de afinidad de heparina y sefarosa para la purificacion del tPA. El documento US 5.141.863 describe el uso de una columna de hidroxiapatito para la purificacion del tPA.
5
[0007] Por consiguiente, se ha aplicado una gran diversidad de procedimientos cromatograficos, por ejemplo,
afinidad e hidroxiapatito, para la purificacion del tPA. Sin embargo, el coste de las matrices de afinidad y de hidroxiapatito es muy elevado y, por lo tanto, no muy rentable para uso industrial. Ademas, todavla no se ha descrito que ninguno de los procedimientos produzca la mezcla deseada de las formas monocatenaria y bicatenaria del tPA 10 a la vez que se elimina la cantidad excesiva de la forma bicatenaria de dicha protelna durante la purificacion. En ausencia de un procedimiento adecuado, el proceso de purificacion del tPA sigue siendo problematico. Por consiguiente, se necesita desarrollar un procedimiento de purificacion de la preparacion de tPA deseada que sea industrialmente viable y rentable.
15 [0008] Por tanto, la presente invencion resuelve el problema asociado con el procedimiento descrito en la
tecnica anterior y tambien aporta progreso cientlfico que hace que el procedimiento presente sea ventajoso en relacion con los procedimientos conocidos en la tecnica anterior para la purificacion del tPA en la forma deseada. En el presente procedimiento de purificacion, el tPA se captura primeramente de una mezcla cruda sin ninguna perdida significativa de la protelna deseada y se eluye de manera diferencial de una columna hidrofoba en presencia de un 20 disolvente organico, a la vez que se eliminan las protelnas contaminantes y la especies variantes no deseadas.
Objetivos de la invencion
[0009] La presente invencion proporciona un procedimiento para la purificacion del activador tisular del 25 plasminogeno que comprende:
a) cargar la mezcla cruda de activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna adecuada;
b) eluir las impurezas de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la concentracion apropiada, en que la concentracion apropiada es de menos del 15 % del disolvente organico adecuado;
30 c) eluir la forma deseada de dicha protelna de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la concentracion apropiada, en que la concentracion apropiada es del 15 al 30 % del disolvente organico adecuado;
d) obtener dicha protelna en la forma deseada; y
e) opcionalmente, se usa una etapa con una columna de intercambio ionico despues de usar dicha matriz de columna adecuada,
35
en que la matriz de columna adecuada corresponde a una cromatografla de interaccion hidrofoba; y en que el disolvente organico adecuado se selecciona entre etanol, metanol y alcohol isopropllico.
[0010] En una realizacion, el procedimiento de la invencion proporciona un activador tisular del plasminogeno 40 purificado que comprende una mezcla adecuada de la forma monocatenaria y la forma bicatenaria.
[0011] En una realizacion, el procedimiento de la invencion proporciona una mezcla de la forma deseada de tPA, que comprende predominantemente la forma monocatenaria del activador tisular del plasminogeno. En otra realizacion, el procedimiento de la invencion proporciona la forma deseada de preparacion del activador tisular del
45 plasminogeno que contiene al menos el 55 % de la forma monocatenaria del tPA. En otra realizacion, el procedimiento de la invencion proporciona una preparacion de tPA que comprende predominantemente la forma bicatenaria del activador tisular del plasminogeno.
[0012] En una realizacion, la invencion proporciona el uso de un disolvente organico, alcohol isopropllico en 50 una concentracion de aproximadamente el 5 % al 30 %, para la purificacion del activador tisular del plasminogeno en
la forma deseada.
[0013] En una realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno que comprende:
55
a) cargar la mezcla cruda del activador tisular del plasminogeno con otras impurezas en una matriz de columna de interaccion hidrofoba;
b) lavar la matriz de columna de interaccion hidrofoba con menos del 15 % de alcohol isopropllico (API) para eluir las impurezas que comprenden principalmente la forma bicatenaria del tPA;
c) eluir el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada que comprende predominantemente la forma monocatenaria del tPA en presencia del 15 % al 30 % de alcohol isopropllico a traves de la matriz de columna hidrofoba; y
d) opcionalmente, el activador tisular del plasminogeno eluido en la forma deseada se somete posteriormente a una 5 cromatografla en columna de intercambio ionico.
[0014] En otra realizacion, la presente invencion proporciona un procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno que comprende:
10 i. cargar la mezcla cruda del activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna de interaction hidrofoba;
ii. eluir el activador tisular del plasminogeno mediante alcohol isopropllico en concentraciones de mas del 18 % de la matriz de columna de interaccion hidrofoba; y
iii. el activador tisular del plasminogeno eluido se somete posteriormente a al menos una matriz adecuada para eluir 15 el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada.
Resumen de la invencion
[0015] La presente invencion proporciona un procedimiento de purificacion del activador tisular del 20 plasminogeno (tPA) en la forma deseada, a partir de una mezcla cruda de protelnas que contiene la protelna tPA
con otras impurezas, mediante el uso de una cromatografla en columna de interaccion hidrofoba, opcionalmente en combination con una cromatografla en columna de intercambio ionico. En el procedimiento de purificacion, la protelna tPA se purifica en la forma deseada a partir de una mezcla cruda, principalmente mediante el uso de una columna hidrofoba, a la vez que se eliminan las impurezas de la forma deseada del activador tisular del 25 plasminogeno. En una realizacion, la molecula de tPA purificada en la forma deseada obtenida de dicha columna despues de la elucion comprende predominantemente la variante monocatenaria (intacta) de dicha protelna: en la realizacion, la forma deseada del tPA comprende del 55 % al 80 % de la forma monocatenaria del tPA. En una realizacion preferida, la forma deseada del tPA comprende el 60 % de la forma monocatenaria del tPA. Ademas, la presente invencion proporciona tambien un procedimiento mediante el cual la variante monocatenaria o la variante 30 bicatenaria de la molecula de tPA pueden aislarse en dos fracciones diferentes a partir de una mezcla cruda por elucion diferencial de la protelna en presencia de concentraciones variables de un disolvente organico adecuado a traves de una columna de interaccion hidrofoba. Opcionalmente, en el procedimiento de purificacion de dicha molecula de protelna se usa una cromatografla en columna de intercambio ionico para eliminar los contaminantes indeseados.
35
Breve descripcion de las figuras
[0016]
40 La figura 1 ilustra un cromatograma de la purificacion de TNK-tPA a partir de una obtencion cruda por cromatografla en columna de interaccion hidrofoba. Pico 1 - con el 12,5 % de alcohol isopropllico; pico 2 - con el 20 % de alcohol isopropllico.
La figura 2 ilustra el perfil de polipeptidos del TNK-tPA eluido de la columna por SDS-PAGE reductora despues de la purificacion en la etapa de cromatografla en columna de interaccion hidrofoba. Carril 1 - obtencion cruda; carril 2 - 45 fracciones de flujo a traves de la columna y lavado; carril 3 - predominantemente la forma bicatenaria eluida con el 12,5 % de alcohol isopropllico; carril 4 - forma deseada del tPA eluida con el 20 % de alcohol isopropllico.
La figura 3 ilustra un cromatograma de la purificacion de TNK-tPA a partir de una obtencion cruda por cromatografla en columna de interaccion hidrofoba. Pico 1 - lavado con tampon (sin NaCl); pico 2 - con el 5 % de alcohol isopropllico; pico 3 - con el 10 % de alcohol isopropllico; pico 3 - con el 20 % de alcohol isopropllico; pico 4 - con el 50 30 % de alcohol isopropllico.
La figura 4 ilustra un cromatograma de la purificacion de TNK-tPA a partir de una obtencion cruda por cromatografla en columna de interaccion hidrofoba. Pico 1 - con el 20 % de alcohol isopropllico; pico 2 - lavado con NaOH.
La figura 5 ilustra un cromatograma de la purificacion de TNK-tPA a partir de una obtencion cruda por cromatografla en columna de interaccion hidrofoba. Pico 1 - con el 10 % de alcohol isopropllico; pico 2 - con el 20 % de alcohol 55 isopropllico y pico 3 - con el 30 % de alcohol isopropllico.
Descripcion detallada de la invencion:
[0017] Segun se usa en este documento, el termino “activador tisular del plasminogeno” se refiere al
activador del plasminogeno extrlnseco (de tipo tisular) humano con actividad fibrinolltica que tiene tlpicamente una estructura con cinco dominios (dominios de dedo, factor de crecimiento, kringle-1, kringle-2 y proteasa), pero que sin embargo puede tener menos dominios o puede tener algunos de los dominios repetidos y actuar como un agente trombolltico y que retiene los sitios de glucosilacion unida a N en las posiciones 117, 184 y 448. Como mlnimo, el 5 activador tisular del plasminogeno consta de un dominio de proteasa que es capaz de convertir el plasminogeno en plasmina y una region N-terminal que se cree que es al menos parcialmente responsable de las posiciones de union a fibrina correspondientes a las posiciones aminoacldicas 1l7, 184 y 448 del activador tisular del plasminogeno humano natural. La retencion de estos sitios de glucosilacion se debe al hecho de que la ocupacion variable de los sitios del activador tisular del plasminogeno recombinante y de tipo natural derivado de melanoma conduce a la 10 produccion de dos variantes designadas como activador tisular del plasminogeno del tipo I y activador tisular de plasminogeno del tipo II, respectivamente. El activador tisular del plasminogeno del tipo I contiene oligosacaridos unidos a N en las posiciones 117, 184 y 448. El activador tisular del plasminogeno del tipo II contiene oligosacaridos unidos a N en las posiciones 117 y 448. Tambien se entiende que existen variaciones alelicas naturales y que pueden presentarse entre individuos, como demuestran las una o mas diferencias de aminoacidos en la secuencia 15 aminoacldica del activador tisular del plasminogeno de cada individuo.
[0018] El termino “tPA” usado en este documento se refiere al “activador tisular del plasminogeno”, el cual incluye el activador tisular del plasminogeno humano o sus mutantes o variantes basadas en el patron de glucosilacion (tipo I y tipo II), producido endogenamente por celulas o por tecnologla de ADN recombinante.
20
[0019] La “forma bicatenaria (cadena A y cadena B) o forma escindida del tPA” se refiere al activador tisular del plasminogeno humano, o sus mutantes o variantes, que esta formado por escision autocatalltica o proteolltica de dicha protelna entre Arg275 e Ile276, lo que resulta en la formacion de dos cadenas separadas en funcion de su peso molecular aparente en SDS-PAGE reductora y denominadas cadena A (forma de movimiento lento) y cadena B
25 (forma de movimiento rapido). Las cadenas A y B se mantienen unidas por un puente S-S en condiciones nativas.
[0020] Por otro lado, la “forma monocatenaria o intacta del tPA” se refiere a una forma monocatenaria del activador tisular del plasminogeno humano, o sus mutantes o variantes, que no muestra ninguna escision en el esqueleto de la cadena polipeptldica.
30
[0021] El termino “TNK-tPA”, segun se usa en este documento, se refiere al “activador tisular del plasminogeno”, el cual incluye el activador tisular del plasminogeno humano o sus mutantes o variantes, basado en las mutaciones T103N, N117Q y KHRR(296_299)AAAA y producido endogenamente por celulas o producido usando la tecnologla de ADN recombinante. Ademas, el TNK-tPA adecuado comprende la relacion apropiada entre las
35 especies monocatenaria y bicatenaria. Un ejemplo de tPA incluye la TNKasa o TNK-tPA, que son bien conocidos en la tecnica. En lo sucesivo, la TNKasa o TNK-tPA, una forma genomanipulada del tPA natural se considera una especie del tPA.
[0022] El termino “forma deseada del tPA” usada en lo sucesivo en este documento describe una preparacion 40 del tPA que comprende principalmente la forma monocatenaria con alguna cantidad de la forma bicatenaria de la
protelna tPA.
[0023] El termino “celulas de ovario de hamster chino” (celulas CHO) son celulas obtenidas originalmente de ovarios de hamster chino. Estas se transfectan con el gen de interes para poder expresar la protelna de interes en
45 condiciones experimentales adecuadas.
[0024] El termino “impurezas” usado en este documento se refiere a la contaminacion y/o protelnas relacionadas con el producto que se obtienen junto con la protelna de interes de la celula hospedadora.
50 [0025] El termino “mezcla cruda” se refiere al sobrenadante que se obtiene del cultivo de celulas CHO por un
procedimiento convencional de fermentacion adherente, en suspension o perfusion, en que la protelna se secreta al medio extracelular y puede obtenerse del sobrenadante.
[0026] El termino “mezcla parcialmente purificada” de la protelna tPA se refiere a una mezcla que contiene la 55 protelna tPA con impurezas relacionadas con el producto y relacionadas con el procedimiento que se obtiene en
cualquier procedimiento de purificacion conocido en la tecnica.
[0027] La presente invention proporciona un procedimiento para la purificacion del activador del
plasminogeno o sus especies usando una matriz de purificacion adecuada en presencia de una concentration
adecuada de disolventes organicos.
[0028] La presente invention proporciona un procedimiento para la purification del activador del plasminogeno (tPA) que comprende:
5
a) cargar la mezcla cruda de activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna adecuada;
b) eluir las impurezas de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la concentration apropiada, en que la concentracion apropiada es de menos del 15 % del disolvente organico adecuado;
c) eluir la forma deseada de dicha protelna de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la 10 concentracion apropiada, en que la concentracion apropiada es del 15 al 30 % del disolvente organico adecuado;
d) obtener dicha protelna en la forma deseada; y
e) opcionalmente, se usa una etapa con una columna de intercambio ionico despues de usar dicha matriz de columna adecuada,
15 en que la matriz de columna adecuada corresponde a una cromatografla de interaction hidrofoba; y en que el disolvente organico adecuado se selecciona entre etanol, metanol y alcohol isopropllico.
[0029] La matriz de columna de interaccion hidrofoba usada en la presente invencion incluye, pero no se limita a butilsefarosa 6FF, fenilsefarosa 6 de flujo rapido y octilsefarosa 4 de flujo rapido. El activador del
20 plasminogeno es el activador del plasminogeno (tPA) o TNK-tPA, r-tPA, r-PA o n-PA, preferentemente TNK-tPA. Segun se menciona anteriormente, el disolvente adecuado se selecciona entre etanol, metanol y alcohol isopropllico (AIP), preferentemente alcohol isopropllico. La concentracion apropiada de alcohol isopropllico es importante para aislar la forma deseada del tPA de la columna de interaccion hidrofoba, a la vez que se eliminan las impurezas. En una realization, se usa de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 30 % de alcohol isopropllico para 25 purificar la protelna tPA de manera diferencial a traves de la columna hidrofoba. En una realizacion preferida, se usa del 5 % a menos del 15 % de alcohol isopropllico para eliminar las impurezas que comprenden la forma bicatenaria del tPA de dicha matriz de columna y se usa del 15 % al 30 % de alcohol isopropllico para eluir la forma deseada del tPA de la columna. En una realizacion mas preferida, se lleva a cabo una elimination sustancial de las impurezas que comprenden la forma bicatenaria con del 10 % al 12,5 % de alcohol isopropllico y la elucion de la forma deseada 30 del tPA se realiza con del 18 % al 20 % de alcohol isopropllico. En la realizacion mas preferida, la eliminacion de las impurezas de lleva a cabo con el 12,5 % de alcohol isopropllico y la elucion de la forma deseada de la protelna tPA se realiza con el 20 % de alcohol isopropllico. La forma deseada del tPA eluido comprende principalmente la forma monocatenaria del tPA. En una realizacion, la forma deseada del tPA comprende del 55 % al 80 % de la forma monocatenaria del tPA. En una realizacion preferida, la forma deseada del tPA comprende el 60 % de la forma 35 monocatenaria del tPA. El dicho procedimiento no implica ninguna etapa de cromatografla de afinidad para la purificacion de la forma deseada del tPA.
[0030] En una de las realizaciones preferidas, la invencion proporciona un procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno que comprende:
40
a) cargar la mezcla cruda del activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna de interaccion hidrofoba;
b) lavar la matriz de columna de interaccion hidrofoba con menos del 15 % de alcohol isopropllico para eluir las impurezas que comprenden principalmente la forma bicatenaria del tPA;
45 c) eluir el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada que comprende predominantemente la forma monocatenaria en presencia del 15 % al 30 % de alcohol isopropllico a traves de la matriz de columna hidrofoba; y d) opcionalmente, el activador tisular del plasminogeno eluido en la forma deseada se somete posteriormente a una cromatografla en columna de intercambio ionico.
50 [0031] En tal realizacion, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa (b) es de
aproximadamente el 5 % y en una realizacion preferida, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa
(b) es de aproximadamente el 10 %. En la realizacion mas preferida, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa (b) es de aproximadamente el 12,5 %. Las impurezas que se eliminan en la etapa (b) comprenden la forma bicatenaria del tPA e impurezas relacionadas con el procedimiento. En la etapa (b), las impurezas se eliminan
55 total o sustancialmente en presencia de alcohol isopropllico.
[0032] En tal realizacion, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa (c) es de
aproximadamente el 18 % y, en una realizacion preferida, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa
(c) es de aproximadamente el 20 %. La presente invencion tambien proporciona opcionalmente el uso de una
cromatografla en columna de intercambio cationico para la eliminacion posterior de impurezas de la forma deseada del tPA.
[0033] En una realizacion, la forma deseada del tPA mencionada en la etapa (c) comprende del 55 % al 80 % 5 de la forma monocatenaria del tPA. En una realizacion preferida, la forma deseada del tPA comprende el 60 % de la
forma monocatenaria del tPA.
[0034] En otra realizacion, el procedimiento de la invencion para la purification de la forma deseada del activador tisular del plasminogeno comprende:
10
i. cargar la mezcla del activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna de interaction hidrofoba;
ii. eluir el activador tisular del plasminogeno mediante alcohol isopropllico en concentraciones de mas del 18 % de la matriz de columna de interaccion hidrofoba; y
15 iii. el activador tisular del plasminogeno eluido se somete posteriormente a al menos una matriz adecuada para eluir el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada.
[0035] En tal realizacion, la concentration de alcohol isopropllico usada en la etapa (b) es de aproximadamente el 18 % al 40 % y, en una realizacion preferida, la concentracion de alcohol isopropllico usada en
20 la etapa ii. es de aproximadamente el 18 %. En la realizacion mas preferida, la concentracion de alcohol isopropllico usada en la etapa ii. es de aproximadamente el 20 %. La matriz adecuada se selecciona entre las correspondientes a cromatografla de intercambio ionico, en hidroxiapatito o de afinidad y cromatografla de interaccion hidrofoba.
[0036] En la presente invencion, se obtiene una preparation cruda de tPA a partir de celulas CHO 25 genomanipuladas que contienen el gen que codifica dicha protelna como protelna secretada en el sobrenadante del
cultivo. Esta preparacion cruda se somete primeramente a cromatografla en columna de interaccion hidrofoba para su purificacion en un modo de captura y elucion. Opcionalmente, puede usarse una columna de intercambio ionico despues de la etapa de la columna de interaccion hidrofoba para eliminar otras impurezas presentes en la mezcla cruda. En una realizacion preferida, la columna de interaccion hidrofoba se usa en primer lugar como la primera 30 etapa de purificacion en modo de captura y elucion.
[0037] Alternativamente, el tPA se obtiene de celulas CHO genomanipuladas como una protelna secretada al sobrenadante del cultivo que se purifica parcialmente por un procedimiento de purificacion conocido en la tecnica y despues se purifica adicionalmente usando una etapa de cromatografla en columna de interaccion hidrofoba, en que
35 dicha protelna se purifica en la forma deseada usando dicha columna en un modo de captura y elucion. Opcionalmente, despues de la etapa de la columna de interaccion hidrofoba puede usarse una cromatografla de intercambio ionico para una purificacion adicional. En una realizacion preferida, la columna de interaccion hidrofoba se usa en primer lugar como la etapa de captura para la purificacion del tPA de una preparacion semipurificada, despues de la cual, opcionalmente, puede usarse una cromatografla de intercambio ionico para eliminar otras 40 impurezas. Dicha columna de intercambio ionico se usa en un modo de union y elucion, en que la elucion de la columna se lleva a cabo en presencia de alta concentracion de sal, por ejemplo, se usan NaCl, KCl, Na2SO4 o (NH4)2SO4 con un tampon adecuado. La columna de intercambio ionico usada segun la presente invencion es una columna de intercambio cationico. Se usa preferentemente una columna de fuerte intercambio cationico, lo que incluye pero no se limita a SP sefarosa, SP-5PW, etc.
45
[0038] La presente invencion es ventajosa con respecto a los procedimientos conocidos de purificacion del tPA, ya que proporciona una captura directa de la protelna tPA mediante la matriz de columna hidrofoba a partir de una mezcla cruda de tPA sin perdidas significativas de la protelna deseada y sin el uso de ninguna cromatografla en columna de afinidad. Ademas, el presente procedimiento tambien hace posible aislar la forma deseada del tPA a la
50 vez que se eliminan las otras impurezas de manera selectiva. La forma deseada de la preparacion del tPA aislado comprende principalmente la forma monocatenaria del tPA. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un procedimiento de purificacion de la protelna tPA de alto rendimiento, robusto y rentable.
[0039] La presente invencion proporciona ademas una composition farmaceutica del activador tisular del 55 plasminogeno en la que el tPA esta purificado en la forma deseada, que comprende principalmente la forma
monocatenaria de dicha protelna, usando una matriz de columna de interaccion hidrofoba en presencia de un disolvente organico.
[0040] La composicion farmaceutica comprende el activador tisular del plasminogeno, que se obtiene
mediante el procedimiento de purificacion descrito en la presente invencion, y un diluyente o vehlculo farmaceuticamente aceptable. La composicion de la presente invencion puede formularse en forma liofilizada.
[0041] La invencion se explica mas detalladamente mediante los ejemplos mostrados a continuacion, que se
5 proporcionan solo a modo de ilustracion y por lo tanto no deberan interpretarse como limitantes del alcance de la invencion.
Ejemplo 1
10 [0042] El gen de la tPA se modifico para incorporar las mutaciones deseadas T103N, N117Q y KHRR(296
299)AAAA para producir TNK-tPA, segun se describe en PNAS, 1994, vol. 91, 3670-3674). Este gen modificado se clono en un vector derivado de pZRC (documento WO 2007/017903) y el vector de expresion final con el gen de TNK-tPA se uso para producir transfectantes estables de celulas CHO K1. La produccion de TNK-tPA a partir de las celulas CHO K1 transfectadas de manera estable fue como sigue. El crecimiento y la produccion se llevaron a cabo 15 en modo por lotes o lotes alimentados usando un medio qulmicamente definido sin suero disponible en el comercio. Ademas, en el proceso por lotes alimentados, la alimentacion de los lotes alimentados se realizo usando un suministro concentrado del mismo medio a partir del 3.er dla de crecimiento y a intervalos regulares hasta el 10.° dla del proceso. Las celulas se cultivaron a 37 °C en un ambiente humidificado con el 5 % de CO2 en condiciones de agitacion, oscilando las velocidades de agitacion entre 50 rpm y 200 rpm, con el uso de botellas giratorias. Las 20 celulas se cultivaron hasta densidades celulares de 3,0 a 4,0 millones de celulas/ml y la viabilidad de las celulas se mantuvo superior al 75 % para obtener una expresion optima de la protelna deseada. El proceso se continuo en las condiciones mencionadas anteriormente durante un periodo de 8 a 11 dlas. El sobrenadante cultivado que contenla la protelna TNK-tPA se cargo en una columna de butilsefarosa 6 de flujo rapido. La columna se equilibro con un tampon de Tris-Cl 20 mM, pH 7, que contenla NaCl 750 mM. Despues de la carga, la columna se lavo con el 12,5 % 25 de alcohol isopropllico en el tampon de equilibrado. La forma deseada de tPA se eluyo con el 20 % de alcohol isopropllico en el mismo tampon, segun se muestra en la figura 1 y la figura 2. En la fraccion de la columna del 12,5 % de alcohol isopropllico se observo la salida de la columna principalmente de la forma bicatenaria de TNK-tPA e impurezas contaminantes, mientras que la forma deseada de TNK-tPA, que comprende fundamentalmente la forma monocatenaria de TNK-tPA, resulto eluir en la fraccion del 20 % de alcohol isopropllico.
30
Ejemplo 2
[0043] El sobrenadante del cultivo que contenla la protelna TNK-tPA, segun se describe en el ejemplo 1, se cargo en una columna de butilsefarosa 6 de flujo rapido. La columna se equilibro con un tampon de Tris-Cl 20 mM,
35 pH 7,0, que contenla NaCl 750 mM. Despues de la carga, la columna se lavo con el tampon de equilibrado sin NaCl seguido de un segundo lavado con el tampon con el 5 % de alcohol isopropllico. La protelna deseada se eluyo con tampon que contenla el 20 % de alcohol isopropllico. La columna se lavo despues con tampon con el 30 % de alcohol isopropllico para recuperar la protelna tPA firmemente unida. La fraccion eluida con el 20 % de alcohol isopropllico resulto contener la forma deseada de la protelna tPA que comprende principalmente la forma 40 monocatenaria de TNK-tPA, segun se muestra en la figura 3.
Ejemplo 3
[0044] El sobrenadante del cultivo que contenla la protelna TNK-tPA, segun se describe en el ejemplo 1, se 45 cargo en una columna de butilsefarosa 6 FF. La columna se equilibro con un tampon de Tris-Cl 20 mM, pH 7,0, que
contenla NaCl 750 mM. Despues de la carga, la protelna unida a la matriz de la columna se eluyo con el mismo tampon de equilibrado con el 20 % de alcohol isopropllico. La mayorla de la protelna tPA resulto eluida de la columna con el 20 % de alcohol isopropllico, segun se muestra en la figura 4.
50 Ejemplo 4
[0045] El sobrenadante del cultivo que contenla la protelna TNK-tPA, segun se describe en el ejemplo 1, se cargo en una columna de butilsefarosa 6 FF. La columna se equilibro con un tampon de Tris-Cl 20 mM, pH 7,0, que contenla NaCl 750 mM. Despues de la carga, la columna se lavo con el 10 % de alcohol isopropllico en el tampon de
55 equilibrado. La mayorla de las impurezas presentes en la mezcla cruda resultaron lavadas de la columna con el 10 % de alcohol isopropllico. La protelna tPA deseada se eluyo de la columna con tampon que contenla el 20 % de alcohol isopropllico. La columna se lavo despues con tampon con el 30 % de alcohol isopropllico para eliminar la protelna tPA firmemente unida junto con otras impurezas. El cromatograma se muestra en la figura 5.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la purification del activador tisular del plasminogeno que comprende:
    5 a) cargar la mezcla cruda de activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna adecuada;
    b) eluir las impurezas de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la concentration apropiada, en que la concentracion apropiada es de menos del 15 % del disolvente organico adecuado;
    c) eluir la forma deseada de dicha protelna de dicha matriz de columna con un disolvente organico adecuado en la concentracion apropiada, en que la concentracion apropiada es del 15 al 30 % del disolvente organico adecuado;
    10 d) obtener dicha protelna en la forma deseada; y
    e) opcionalmente, se usa una etapa con una columna de intercambio ionico despues de usar dicha matriz de columna adecuada,
    en que la matriz de columna adecuada corresponde a una cromatografla de interaction hidrofoba; y en que el disolvente organico adecuado se selecciona entre etanol, metanol y alcohol isopropllico.
    15
  2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en que el activador tisular del plasminogeno se selecciona entre TNK-tPA, r-tPA, r-PA y n-PA, preferentemente TNK-tPA.
  3. 3. El procedimiento segun la reivindicacion 2, en que la forma deseada del activador tisular del 20 plasminogeno comprende predominantemente la forma monocatenaria del tPA.
  4. 4. El procedimiento segun la reivindicacion 3, en que la forma deseada del activador tisular del plasminogeno comprende predominantemente al menos el 55 %, preferentemente del 60 % al 80 % de la forma monocatenaria del t PA.
    25
  5. 5. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en que las impurezas comprenden predominantemente la forma bicatenaria.
  6. 6. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en que la concentracion apropiada usada en la etapa (b) es 30 del 12,5 % del disolvente organico adecuado.
  7. 7. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en que la concentracion apropiada usada en la etapa (c) es del 20 % del disolvente organico adecuado.
    35 8. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en que el disolvente organico apropiado es alcohol
    isopropllico.
  8. 9. El del 5 % al 30 %.
    40
  9. 10. El que comprende:
    a) cargar la mezcla cruda del activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna de 45 interaccion hidrofoba;
    b) lavar la matriz de columna de interaccion hidrofoba con menos del 15 % de alcohol isopropllico para eluir las impurezas que comprenden principalmente la forma bicatenaria del tPA;
    c) eluir el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada que comprende predominantemente la forma monocatenaria en presencia del 15 % al 30 % de alcohol isopropllico a traves de la matriz de columna hidrofoba; y
    50 d) opcionalmente, el activador tisular del plasminogeno eluido en la forma deseada se somete posteriormente a una cromatografla en columna de intercambio ionico.
  10. 11. El procedimiento segun la reivindicacion 10, en que la concentracion del alcohol isopropllico en la etapa (b) es del 5 % a menos del 15 %, preferentemente del 10 %, mas preferentemente del 12,5 %.
    55
  11. 12. El procedimiento segun la reivindicacion 10, en que la concentracion de alcohol isopropllico en la etapa (c) es del 20 %.
  12. 13. El procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno segun la reivindicacion 1
    procedimiento segun la reivindicacion 8, en que el alcohol isopropllico se usa en una concentracion procedimiento para la purificacion del activador tisular del plasminogeno segun la reivindicacion 1
    que comprende:
    i. cargar la mezcla cruda del activador tisular del plasminogeno con impurezas en una matriz de columna de interaction hidrofoba;
    5 ii. eluir el activador tisular del plasminogeno mediante alcohol isopropllico en concentraciones de mas del 18 % de la matriz de columna de interaccion hidrofoba; y
    iii. el activador tisular del plasminogeno eluido se somete posteriormente a al menos una matriz adecuada para eluir el activador tisular del plasminogeno en la forma deseada; en que la matriz adecuada se selecciona entre las correspondientes a cromatografla de intercambio ionico, en hidroxiapatito o de afinidad y cromatografla de 10 interaccion hidrofoba.
  13. 14. El procedimiento segun la revindication 13, en que la concentration de alcohol isopropllico en la
    etapa ii. es de hasta el 40 %, preferentemente del 20 %.
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