JP2011517951A

JP2011517951A - 修飾された第ｉｘ因子ポリペプチドおよびそれらの使用

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Publication number: JP2011517951A
Application number: JP2011505204A
Authority: JP
Inventors: アラン・ブルックス; ジョン・イー・マーフィー; マリアン・セト; シャオキアオ・ジアン; チャンドラ・ペーテル; ウヴェ・グリッツァン; コルネリア・キルヒナー; ウルリッヒ・ハウプツ
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2011-06-23
Also published as: CN102083856A; SG189790A1; WO2009137254A2; SV2010003704A; CR11737A; WO2009137254A3; DOP2010000311A; EP2288622A2; CA2721683A1; ECSP10010551A; KR20110005862A; AU2009244633A1; CO6311000A2; RU2010146387A; MX2010011345A; IL208718A0; EP2288622A4; BRPI0910702A2

Abstract

修飾された第ＩＸ因子ポリペプチド、例えば、１つ以上の導入されたグリコシル化部位を有する第ＩＸ因子ポリペプチドを記載している。修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドは、インビトロまたはインビボ安定性の増加、例えば、血漿中の半減期の延長を示し得る。また、修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドを製造する方法、および、例えば、血友病Ｂに罹患している患者を処置するための、修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドを使用する方法を記載している。

Description

本出願は、２００８年４月１６日に提出された米国仮出願第６１／１２４，５６７号および２００８年４月１７日に出願された米国仮出願第６１／０４５，９６１号（これらの内容は、その全体において出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。

技術分野
本発明は、修飾された第ＩＸ因子ポリペプチド、例えば、１つ以上の導入されたグリコシル化部位を有する第ＩＸ因子ポリペプチドに関する。修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドは、インビトロまたはインビボの安定性の増加、例えば、血漿中の半減期の延長を示し得る。本発明は、また、修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドを製造する方法、および、例えば、血友病Ｂに罹患している患者を処置するための、修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドを使用する方法に関する。

発明の背景
血友病Ｂは、男性３４，５００人に一人であり、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする遺伝子における種々の遺伝子異常により引き起こされ、ＦＩＸタンパク質が血液中で少ない、または検出できないものとなる（Kurachi, et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6:991-997, 1992; Lillicrap, Haemophilia 4:350-357, 1998）。不十分なレベルのＦＩＸは、凝血障害および出血が止まらなくなる症状を引き起こす。血友病Ｂは、すでに起こっている出血を止めるため、または出血が起こることを防止するため（予防）に、血漿由来または組換えＦＩＸタンパク質のいずれかの静脈内注入により、有効に処置される（Dargaud, et al., Expert Opin. Biol. Ther. 7:651-663; Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005）。有効な予防は、正常レベルの約１％のＦＩＸの最小トラフレベルを維持することが必要である（Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005）。天然のＦＩＸ（血漿由来または組換え）の半減期は約１８から２４時間であるため、ＦＩＸレベルは、ボーラス注射後３から４日以内に正常レベルの１％未満に落ち、これは有効な予防を達成するために平均３日ごとの反復注射を必要とする（Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005）。このような頻繁な静脈内注射は、患者、とりわけ子供にとって問題であり、有効な予防を達成するための障害である（Petrini, Haemophilia 13 Suppl 2:16-22, 2007）。長い半減期を有するＦＩＸタンパク質は頻繁な投与をより少なくすることが可能であり、したがって、医学的な利点から重要である。

発明の概要
本出願は、１つ以上のグリコシル化部位を導入することにより修飾されているアミノ酸配列を含むＦＩＸポリペプチド（修飾されたＦＩＸポリペプチド、ＦＩＸ変異タンパク質またはＦＩＸ変異体としても称される）を提供する。いくつかの態様において、１つ以上のグリコシル化部位はＮ結合型グリコシル化部位であり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは凝固活性を有する。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、少なくとも１つの置換、例えば、限定はしないがＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａを含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドはＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換の両方を含み得る。

本出願は、また、１つ以上のグリコシル化部位を導入することにより修飾されているアミノ酸配列を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。ＦＩＸポリペプチドは、１つ以上の導入されたグリコシル化部位に結合した炭水化物鎖を更に含み得る。いくつかの態様において、炭水化物鎖はＮ結合型炭水化物鎖であり得る。いくつかの態様において、炭水化物鎖は哺乳動物の炭水化物鎖構造を有し得る。いくつかの態様において、炭水化物鎖はヒトの炭水化物鎖構造を有し得る。いくつかの態様において、１つ以上の導入されたグリコシル化部位での炭水化物鎖の結合は、例えば、導入されたグリコシル化部位を欠いているポリペプチドと比較して、ポリペプチドの血清半減期を少なくとも３０％増加させ得る。いくつかの態様において、１つ以上の導入されたグリコシル化部位での炭水化物鎖の結合は、例えば、導入されたグリコシル化部位を欠いている分泌されるポリペプチドの量と比較して、分泌されるポリペプチドの量を５０％以上減少させない。いくつかの態様において、１つ以上の導入されたグリコシル化部位での炭水化物鎖の結合は、例えば、導入されたグリコシル化部位での炭水化物鎖を欠いているポリペプチドとＦＶＩＩＩ、ＦＸＩまたはＦＸとの相互作用と比較して、ポリペプチドと少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）または第Ｘ因子（ＦＸ）との相互作用を５０％以上阻害しない。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのｍｇあたり少なくとも１００単位の比活性を有し得る。

１つ以上のグリコシル化部位は、１つ以上のアミノ酸置換を介して導入され得る。置換は、表面に暴露された残基であり得、そして／または、血友病Ｂと関連することが知られている変異を導入しない置換に限定され得る。典型的な態様は、１つ以上の置換、例えば、限定はしないが以下のものを含むＦＩＸポリペプチドを含む：
（ａ）Ｇ４Ｔ；Ｅ３３Ｎ；Ｅ３６Ｔ；Ｅ３６Ｎ；Ｒ３７Ｎ；Ｆ７５Ｎ；Ｆ７７Ｔ；Ｅ８３Ｔ；Ｄ８５Ｎ；Ｖ８６Ａ；Ｋ９１Ｔ；Ａ１０３Ｔ；Ｖ１０７Ｔ；Ｋ１２２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ｔ１４８Ｎ；Ｆ１５０Ｔ；Ｐ１５１Ｎ；Ｔ１５９Ｎ；Ａ１６１Ｔ；Ａ１６１Ｎ；Ｔ１６９Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｄ１７７Ｅ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２０１Ｔ；Ｋ２１４Ｔ；Ｖ２２３Ｎ；Ｇ２２６Ｎ；Ｙ２２６Ｔ；Ｋ２２８Ｎ；Ｋ２２８Ｔ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｒ３３８Ａ；Ｒ３３８Ｎ；Ｋ３４１Ｎ；Ｆ３５３Ｎ；Ｈ３５４Ｖ；Ｈ３５４Ｉ；Ｅ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ；Ｔ３７１Ｖ；Ｔ３７１Ｉ；Ｅ３７２Ｔ；Ｅ３７４Ｎ；Ｍ３９１Ｎ；Ｋ３９２Ｖ；Ｇ３９３Ｔ；Ｅ４１０Ｎ；Ｋ４１３Ｎ；Ｌ４１４Ｉ；

（ｂ）Ｙ１ＮおよびＳ３Ｔ；Ｓ３ＮおよびＫ５Ｔ；Ｇ４ＮおよびＬ６Ｔ；Ｋ５ＮおよびＥ７Ｔ；Ｌ６ＮおよびＥ８Ｔ；Ｅ７ＮおよびＦ９Ｔ；Ｆ９ＮおよびＱ１１Ｔ；Ｖ１０ＮおよびＧ１２Ｔ；Ｑ１１ＮおよびＮ１３Ｔ；Ｇ１２ＮおよびＬ１４Ｔ；Ｎ１３およびＥ１５Ｔ；Ｌ１４ＮおよびＲ１６Ｔ；Ｅ１５ＮおよびＥ１７Ｔ；Ｍ１９ＮおよびＥ２１Ｔ；Ｅ２０ＮおよびＫ２２Ｔ；Ｓ２４ＮおよびＥ２６Ｔ；Ｆ２５ＮおよびＥ２７Ｔ；Ｅ２６ＮおよびＡ２８Ｔ；Ｅ２７ＮおよびＲ２９Ｔ；Ａ２８ＮおよびＥ３０Ｔ；Ｒ２９ＮおよびＶ３１Ｔ；Ｅ３０ＮおよびＦ３２Ｔ；Ｖ３１ＮおよびＥ３３Ｔ；Ｆ３２ＮおよびＮ３４Ｔ；Ｔ３５ＮおよびＲ３７Ｔ；Ｔ３８ＮおよびＥ４０Ｔ；Ｔ３９ＮおよびＦ４１Ｔ；Ｅ４０ＮおよびＷ４２Ｔ；Ｆ４１ＮおよびＫ４３Ｔ；Ｗ４２ＮおよびＱ４４Ｔ；Ｋ４３ＮおよびＹ４５Ｔ；Ｑ４４ＮおよびＶ４６Ｔ；Ｙ４５ＮおよびＤ４７Ｔ；Ｖ４６ＮおよびＧ４８Ｔ；Ｅ５２ＮおよびＮ５４Ｔ；Ｓ５３ＮおよびＰ５５Ｔ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｉ６６ＮおよびＳ６８Ｔ；Ｓ６８ＮおよびＥ７０Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｅ７８ＮおよびＫ８０Ｔ；Ｅ８３ＮおよびＤ８５Ｔ；Ｌ８４ＮおよびＶ８６Ｔ；Ｉ９０ＮおよびＮ９２Ｔ；Ｋ１００ＮおよびＳ１０２Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｋ１０６ＮおよびＶ１０８Ｔ；Ｒ１１６ＮおよびＡ１１８Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ａ１２７ＮおよびＰ１２９Ｔ；Ｖ１３５ＮおよびＶ１３７Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｖ１３７ＮおよびＱ１３９Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｓ１４１ＮおよびＬ１４３Ｔ；Ｅ１４７ＮおよびＶ１４９Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｙ１５５ＮおよびＮ１５７Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｔ１５９ＮおよびＡ１６１Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｌ１６５ＮおよびＮ１６７Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｔ１６９ＮおよびＳ１７１Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｇ１８４ＮおよびＤ１８６Ｔ；Ｅ１８５ＮおよびＡ１８７Ｔ；Ｄ１８６ＮおよびＫ１８８Ｔ；Ａ１８７ＮおよびＰ１８９Ｔ；Ｐ１８９ＮおよびＱ１９１Ｔ；Ｇ２００ＮおよびＶ２０２Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｖ２２７ＮおよびＩ２２９Ｔ；Ｈ２３６ＮおよびＩ２３８Ｔ；Ｉ２３８ＮおよびＥ２４０Ｔ；Ｅ２４０ＮおよびＥ２４２Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｈ２４３ＮおよびＥ２４５Ｔ；Ｋ２４７ＮおよびＮ２４９Ｔ；Ｖ２５０ＮおよびＲ２５２Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６１ＮおよびＩ２６３Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｄ２７６ＮおよびＰ２７８Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｆ３０２ＮおよびＳ３０４Ｔ；Ｓ３０４ＮおよびＹ３０６Ｔ；Ｒ３１２ＮおよびＦ３１４Ｔ；Ｖ３１３ＮおよびＨ３１５Ｔ；Ｆ３１４ＮおよびＫ３１６Ｔ；Ｈ３１５ＮおよびＧ３１７Ｔ；Ｋ３１６ＮおよびＲ３１８Ｔ；Ｇ３１７ＮおよびＳ３１９Ｔ；Ｓ３１９ＮおよびＬ３２１Ｔ；Ａ３２０ＮおよびＶ３２２Ｔ；Ｒ３２７ＮおよびＰ３２９Ｔ；Ｐ３２９ＮおよびＶ３３１Ｔ；Ｄ３３２ＮおよびＡ３３４Ｔ；Ｌ３３７ＮおよびＳ３３９Ｔ；Ｓ３３９ＮおよびＫ３４１Ｔ；Ｔ３４０ＮおよびＦ３４２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；Ｇ３５２ＮおよびＨ３５４Ｔ；Ｆ３５３ＮおよびＥ３５５Ｔ；Ｈ３５４ＮおよびＧ３５６Ｔ；Ｅ３５５ＮおよびＧ３５７Ｔ；Ｇ３５６ＮおよびＲ３５８Ｔ；Ｇ３５７ＮおよびＤ３５９Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｗ３８５ＮおよびＥ３８７Ｔ；Ｇ３８６ＮおよびＥ３８８Ｔ；Ａ３９０ＮおよびＫ３９２Ｔ；

（ｃ）Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｅ１２５Ｎ、Ｐ１２６ＡおよびＡ１２７Ｔ；Ｐ１２６Ｎ、Ｖ１２８ＴおよびＰ１２９Ａ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０ＴおよびＰ１５１Ａ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＡ１６１Ｎ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎ；Ｖ１５３Ｎ、Ｙ１５５ＴおよびＥ２９４Ｎ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＶおよびＥ３５５Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＩおよびＥ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＶおよびＥ３７２Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＩおよびＥ３７２Ｔ；Ｍ３９１Ｎ、Ｋ３９２ＶおよびＧ３９３Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２ＮおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７Ｅ、Ｆ１７８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；ならびにＰ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；ならびにそれらの任意の組合せ。

１つ以上のグリコシル化部位は、ＦＩＸの触媒ドメインまたは活性化ペプチドに導入され得る。典型的な態様は、１つ以上の置換、例えば、限定はしないが以下のものを含むＦＩＸポリペプチドを含む：Ｒ３７Ｎ；Ｄ８５Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ａ１６１Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２２８Ｎ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｅ３７４Ｎ；およびＥ４１０Ｎ。他の態様は、１つ以上の置換、例えば、以下のものを含むＦＩＸポリペプチドを含み得る：Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；ならびにＥ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、少なくとも１つの置換、例えば、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａの両方の置換をさらに含み得る。

１つ以上のグリコシル化部位は、Ｏ結合型グリコシル化部位をＮ結合型グリコシル化部位に変換することにより導入され得る。典型的な態様は、置換、例えば、限定はしないがＴ１６９Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；ならびにＴ１５９ＮおよびＡ１６１Ｔを含む。いくつかの態様において、置換はＴ１７２Ｎ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；ならびにＴ１５９ＮおよびＡ１６１Ｔであり得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、少なくとも１つの置換、例えば、限定はしないがＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａの両方の置換をさらに含み得る。

１つ以上のグリコシル化部位は、１から１２アミノ酸残基をアミノ酸残基１６０−１６４間に挿入することにより導入され得る。グリコシル化部位は、アミノ酸残基１６０−１６１間、アミノ酸残基１６１−１６２間、アミノ酸残基１６２−１６３間またはアミノ酸残基１６３−１６４間に導入され得る。いくつかの態様において、配列番号：２は、アミノ酸残基１６０−１６１間、アミノ酸残基１６１−１６２間、アミノ酸残基１６２−１６３間またはアミノ酸残基１６３−１６４間に導入され得る。他の態様において、グリコシル化部位は、１から１２個のアミノ酸残基をＦＩＸポリペプチドのＣ末端に付加することにより導入され得る。いくつかの態様において、配列番号：４、５、６または７は、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に導入され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔをさらに含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔをさらに含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｔ１７２Ｎをさらに含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎをさらに含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔをさらに含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドはアミノ酸置換Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは少なくとも１つの置換、例えば、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドはＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａの両方の置換をさらに含み得る。

典型的な態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、１つ以上の置換、例えば以下のものを含むものを提供する：Ｄ８５Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２２８Ｎ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ａ１６１およびＥ１６２間への配列番号：２の挿入；ならびにＧ２２６Ｎ、Ｋ２２８Ｔ、および、Ａ１６１およびＥ１６２間への配列番号：２の挿入。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、少なくとも１つの置換、例えば、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａの両方の置換をさらに含み得る。

本出願は、また、Ｒ３３８Ａ置換およびＶ８６Ａ置換を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドのｍｇあたり少なくとも７００単位の比活性を有し得る。

本出願は、また、修飾されたＦＩＸポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬品を提供する。

本出願は、また、治療有効量の本明細書に記載されている医薬品を必要とする対象に投与することを含む、血友病Ｂを処置するための方法を提供する。

本出願は、また、修飾されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列ならびに該ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた真核生物宿主細胞を提供する。

本出願は、また、（ｉ）１つ以上のグリコシル化部位を導入することによりポリペプチドのアミノ酸配列を修飾し；（ｉｉ）１つ以上のグリコシル化部位でグリコシル化することが可能である様式におけるポリペプチドを発現し；そして（ｉｉｉ）該ポリペプチドを精製することを含む、修飾されたＦＩＸポリペプチドを生産する方法を提供する。

図１は、８つの種由来の活性化ペプチド内のＦＩＸ配列の多数の配列アラインメントを記載している図２は、ＦＩＸのグリコシル化部位変異タンパク質をトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を記載している。ＦＩＸタンパク質は抗−ＦＩＸ−ＨＲＰ抗体を使用して検出された。図３は、ＨＫＢ１１細胞におけるＦＩＸグリコシル化部位変異タンパク質の発現および活性の表を記載している。発現はＥＬＩＳＡにより、活性はａＰＴＴアッセイにより測定した。比活性を国際単位としてＦＩＸタンパク質のｍｇあたりで計算する。値は同じトランスフェクション実験において駆動させたＦＩＸ−Ｒ３３８Ａのパーセントに変換させた。（ｎｏｎｅ）：移動度の変化無し、（＋）：＋の数が示す程度で移動度の減少、（−）：移動度の増加。図４は、ＨＫＢ１１細胞におけるＦＩＸグリコシル化部位変異タンパク質の発現レベル、凝固活性および比活性を記載している。値はＦＩＸ−Ｒ３３８Ａ変異タンパク質のパーセントとして表した。構築物は図３に記載されている。図５は、ＦＩＸのＧ２２６Ｎ、Ｋ２２８Ｔグリコシル化部位変異タンパク質をトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を記載している。ＦＩＸタンパク質は、抗−ＦＩＸ−ＨＲＰ抗体を使用して検出した。

発明の説明
本出願は、１つ以上のＯまたはＮ結合型グリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。治療用タンパク質のグリコシル化の増加は、１）免疫原性の減少；２）タンパク質の投与の頻度の減少；３）タンパク質安定性の増加、例えば、血清半減期の増加；および４）有害な副作用、例えば、炎症の減少を達成するために使用され得る。

本出願は、１つ以上のさらなるグリコシル化部位を有するヒトＦＩＸの変異体を提供する。修飾されたＦＩＸポリペプチドは、また、例えば、血友病Ｂ患者における出血に対する長時間の保護を提供する、血漿中の半減期の増加を有し得る。修飾されたＦＩＸポリペプチドは、血友病Ｂ患者が、野生型ＦＩＸタンパク質の現在利用されている治療で可能である注射よりも、より少ないＦＩＸの注射で出血に対する保護を達成することを可能にする。

本出願は、機能性グリコシル化部位が触媒ドメインおよび活性化ペプチドの両方において創造された、多くの典型的なＦＩＸの変異体を提供する。さらに、本出願は、これらの変異体が哺乳動物細胞において発現され得、グリコシル化の増加を示す見かけの分子量を増加させ、凝固アッセイにおいて５０％から１００％の活性を維持することを証明する。最後に、これらの修飾部位は、ＦＩＸの比活性を増強する変化（限定はしないがＲ３３８Ａ置換および／またはＶ８６Ａ置換を含む）と組み合わされ得る（Chang, et al., J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998 and Chang, et al., J. Biol. Chem. 277:25393-25399, 2002）。Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換の１つまたはその両方が、修飾されたポリペプチドの比活性が野生型ＦＩＸと同等または野生型ＦＩＸより高くなり得るように、グリコシル化部位の付加による活性の何らかの減少を補う。

発現すると、野生型ＦＩＸは約５５，０００ダルトンの一本鎖糖タンパク質である。それは、構造的に、４つのドメイン：Ｇｌａまたはガンマカルボキシグルタミン酸−リッチドメイン；ＥＧＦ様領域；活性化ペプチド；および活性部位を含む触媒ドメインを有すると考えられ得る（Thomson, Blood 67:565-572, 1986）。ＦＩＸは、４６１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドとして肝臓で合成され、ゴルジ体および小胞体を介する輸送中の大規模な翻訳後修飾を受ける（Nemerson, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 9:45-48, 1980; Stenflo, et al., Annu. Rev. Biochem. 46:157-172, 1977）。シグナル配列およびプロペプチドの両方が除去され、４１５アミノ酸（配列番号：１）の成熟タンパク質となる（Choo, et al., Nature 299:178-180, 1982; Kurachi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464, 1982）。効率的なガンマカルボキシル化がＦＩＸの凝固活性のために必須であり、ヒトにおいて１２のＧｌａ残基がＮ末端Ｇｌａドメイン内に生成されるが、Ｇｌａ３６およびＧｌａ４０におけるガンマカルボキシル化は機能に必要ではない（DiScipio, et al., Biochemistry 18:899-904, 1979; Gillis, et al., Protein Sci. 6:185-196, 1997）。加えて、ＦＩＸは、２つのＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ１５７、Ｎ１６７）、６つのＯ結合型グリコシル化部位（Ｓ５３、Ｓ６１、Ｔ１５９、Ｔ１６９、Ｔ１７２、Ｔ１７９）ならびにＳｅｒリン酸化（Ｓ１５８）、チロシン硫酸化（Ｙ１５５）およびβ−ヒドロキシル化（Ｄ６４）のためのそれぞれ１つの部位を含む（McMullen, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 115:8-14, 1983)。

活性化因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）は、血管壁損傷の結果として暴露されたとき、組織因子（ＴＦ）と複合体を形成することにより通常の止血プロセスを開始する。次に複合体はＦＩＸを活性化する；活性型はＦＩＸａと称される。ＦＩＸの活性化ペプチドは、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）または組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子複合体のいずれかによる２つの部位でのタンパク質分解により除去され、触媒活性分子の第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を生産する。ＦＩＸａおよび第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＸを第Ｘａ因子（ＦＸａ）に変換し、同様にプロトロンビンをトロンビンに変換する。次にトロンビンはフィブリノゲンをフィブリンに変換し、フィブリン塊の形成をもたらす。

野生型ＦＩＸは多数の翻訳後修飾を有し、これらのいくつかはインビボ薬物動態学プロファイルにおいて役割を果たすと示唆されているため、異所性グリコシル化部位はこれらの他の修飾に影響しない位置に導入され得る。生産されると、ＦＩＸは、血友病Ｂの処置に有効であるために、酵素的活性を保持し、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩおよびＦＸと相互作用するべきである。導入されるグリコシル化部位は、これらの相互作用および機能を乱すべきでない。本出願は、１つにおいて、機能の最小の摂動にてグリコシル化部位の数の増加をもたらす可能性があり、したがってＦＩＸのバイオアベイラビリティに対する有用性の増加を有するＦＩＸの修飾を提供する。最後に、これらの修飾部位は、ＦＩＸの比活性を増強する変化（限定はしないがＲ３３８Ａ置換および／またはＶ８６Ａ置換を含む）と組み合わされ得る。ＦＩＸの比活性を増強する変化は、凝固活性を失う可能性を補い得、また、低いレベルのタンパク質で有効性を与えることにより修飾された分子の有効性を延長する可能性がある。

修飾されたＦＩＸポリペプチド
本出願は、１つ以上の導入されたグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチド、すなわち、修飾されたＦＩＸポリペプチドを提供する。本明細書において使用される“第ＩＸ因子”は、内因性凝固経路のメンバーであり、血液凝固に必須であるヒト血漿ＦＩＸ糖タンパク質を意味する。この定義はヒト血漿ＦＩＸ糖タンパク質の天然ならびに組換え形態を含むと理解されるべきである。特記されない限り、本明細書において使用されるＦＩＸは、フラグメント、類似物、変異体および誘導体を含む、凝固において通常の役割のあらゆる機能性ヒトＦＩＸタンパク質分子を意味する。本出願のポリペプチドにおいて言及するとき、“フラグメント”、“誘導体”、“類似物”、“変異タンパク質”および“変異体”なる用語は、実質的に同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似物、変異タンパク質および変異体を意味する。

ＦＩＸポリペプチドの非限定的な例は、ＦＩＸ、ＦＩＸａおよびＦＩＸ活性を有するＦＩＸの不完全バージョンを含む。少なくともある程度のＦＩＸ活性を維持する、前記いずれかの生物学的に活性なフラグメント、欠失変異体、置換変異体または付加変異体も、ＦＩＸポリペプチドとして働くことができる。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号：１と少なくとも約７０、８０、９０または９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、生物学的に活性である。生物学的活性は、例えば、本明細書に記載されている凝固アッセイにより、決定することができる。

修飾されたＦＩＸポリペプチドは、また、アミノ酸の保存的置換を含み得る。保存的置換は、同様の特性を有し、例えば以下のものを含む１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換として、当分野で認識されている：アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンの変化。いくつかの態様において、配列番号：１のＦＩＸポリペプチドは、１つ以上のグリコシル化部位の導入に加えて、１−３０、１−２０または１−１０の保存的アミノ酸置換を含む。

特定のアミノ酸に対する１文字略語、その対応するアミノ酸および３文字略語は、以下のとおりである：Ａ、アラニン（Ａｌａ）；Ｃ、システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ、グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ、イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ、リシン（Ｌｙｓ）；Ｌ、ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ、メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ、アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ、プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ、グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ、アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ、セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ、スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ、バリン（Ｖａｌ）；Ｗ、トリプトファン（Ｔｒｐ）；Ｙ、チロシン（Ｔｙｒ）；およびノルロイシン（Ｎｌｅ）。

ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒおよびＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、Ａｓｎ側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、Ｎ結合型グリコシル化部位の可能性を生み出す。本発明のために有用な典型的なＮ結合型グリコシル化部位は、また、Ｘ１−Ａｓｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４；（Ｘ１は所望によりＡｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＩｌｅであり；Ｘ２はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３はＳｅｒまたはＴｈｒであり；そしてＸ４は所望によりＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＩｌｅである）として示され得る。いくつかの態様において、Ｘ１は所望によりＡｓｐであり；Ｘ２はＳｅｒであり；Ｘ３はＴｈｒであり；そしてＸ４はＧｌｎである。いくつかの態様において、Ｘ１はＡｓｐであり；Ｘ２はＩｌｅであり；Ｘ３はＴｈｒであり；そしてＸ４はＧｌｎである。ＦＩＸポリペプチドへのＮ結合型グリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列が導入されるように、アミノ酸配列を変化させることにより達成される。

Ｏ結合型グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンへの結合も可能であるが、ヒドロキシアミノ酸、通常セリンまたはスレオニンへの糖の１つ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの結合を意味する。ＦＩＸポリペプチドへのＯ結合型グリコシル化部位の付加は、１つ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基が導入されるように、アミノ酸配列を変化させることにより達成され得る。

グリコシル化部位は、例えば、１つ以上のアミノ酸残基を欠失するか、１つ以上の内因性ＦＩＸのアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換するか、または１つ以上のアミノ酸残基を付加することにより、導入され得る。アミノ酸残基の付加は、天然のＦＩＸ分子の存在する２つのアミノ酸残基間またはＮまたはＣ末端のいずれかであり得る。

使用されるアミノ酸置換に関する専門用語は以下のとおりである。第１の文字は、ヒトＦＩＸの位置に天然に存在するアミノ酸残基を示す。次の数は、成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列（配列番号：１）における位置を示す。第２の文字は、（置き換わる／置換する）天然のアミノ酸に置き換わる異なるアミノ酸を示す。１つの例として、Ｒ３３８Ａは、配列番号：１の位置３３８のＡｒｇ残基がＡｌａ残基で置換されていることを示す。ヒトＦＩＸポリペプチドのさらなる５’アミノ酸配列（４６アミノ酸）を含む配列番号：２６に対して、配列番号：１の位置３３８は配列番号：２６の位置３８４に対応する。

本明細書で使用されるＦＩＸ残基の番号方式は、成熟ヒトＦＩＸタンパク質の番号を示し、残基１が、シグナル配列およびプロペプチドの両方の除去後の成熟ＦＩＸポリペプチドの第１のアミノ酸を示す。天然または野生型ＦＩＸは、配列番号：１に示されるとおりの全長成熟ヒトＦＩＸ分子である。

いくつかの態様において、グリコシル化部位は、ＦＩＸにおいて、細胞におけるタンパク質の機能またはその発現を破壊されない位置で加工される。１つ以上の導入されたグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを設計するために、いくつかの基準が適用され得る。いくつかの態様において、導入されるグリコシル化部位は表面暴露である。表面暴露は、Autin, et al., (J. Thromb. Haemost. 3:2044-56, 2005)において決定されているとおりの溶媒接触可能表面積に基づいて決定することができる。いくつかの態様において、導入されるグリコシル化部位は、血友病Ｂと関連することが知られている変異を導入しない。既知の変異は、ワールドワイドウェブ kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.htmlおよび表１で見出すことができる。
表１

１つ以上の導入されたグリコシル化部位を有する修飾されたＦＩＸポリペプチドの特性を対照ポリペプチドと比較することが望ましいこともある。比較のための特性は、例えば、溶解性、活性、血漿中の半減期、グリコシル化状態および結合特性を含む。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドはグリコシル化され得る。比較のための最も適当な対照ポリペプチドを選択することは、当業者の範囲内である。いくつかの態様において、対照ポリペプチドは、１つ以上の導入されたグリコシル化部位を除けば、修飾されたポリペプチドと同一であり得る。典型的なポリペプチドは、野生型ＦＩＸポリペプチドおよび１つ以上の活性化置換、例えば、Ｒ３３８Ａおよび／またはＶ８６Ａを含むＦＩＸポリペプチドを含む。

本出願の１つの局面は、対照ポリペプチドを越える増加したインビトロまたはインビボ安定性を有する修飾されたＦＩＸポリペプチドを提供する。増強した血清半減期およびインビボ安定性は、治療有効性を達成するために必要な投与の頻度を減少するために望ましい。したがって、１つの態様において、グリコシル化されたＦＩＸポリペプチドは、対照タンパク質と比較して約２０、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００％増加した血清半減期を有する。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０または少なくとも２０日またはそれ以上の血清半減期を有し得る。

ポリペプチド薬物を患者に投与する文脈において、本明細書において使用される“半減期”なる用語は、患者における薬物の血漿濃度に関して１／２に減少するために必要とされる時間として定義される。薬物動態学分析ならびに半減期およびインビボ安定性の測定のための方法は、当業者によく知られている。詳細はKenneth, et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters, et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)において見出される。“Pharmacokinetics” M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)も参照のこと、これは薬物動態パラメータ、例えば、ｔ−アルファおよびｔ−ベータの半減期および濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を記載している。

修飾されたＦＩＸポリペプチドの活性は、例えば、単位における絶対値、または対照ポリペプチドの活性のパーセントとしてのいずれかとして記載され得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照タンパク質と比較して約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０％以上で減少しない比活性を有し得る。例えば、修飾されたポリペプチドが対照の比活性と比較して少なくとも約２０％の比活性を維持するとき、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照ＦＩＸポリペプチドと比較して約８０％以上で減少しない比活性を有し得る。ＦＩＸの比活性は、凝固カスケードにおいて機能するか、活性化血小板におけるＦＶＩＩＩａとの相互作用を介してＦＸａの形成を誘導するか、または血塊の形成を支持する能力として定義され得る。活性は、例えば、McCarthy, et al., (Thromb. Haemost. 87:824-830,2002)に記載されている技術、例えば、塊分析、および当業者に既知の他の技術により、インビトロで評価され得る。活性は、また、生産された動物がＦＩＸを欠乏しているように、血友病Ｂに関する遺伝子変異を有するように意図的に交配させた、いくつかの動物系の１つを使用してインビボで評価され得る。このような系は、種々の源、例えば、限定はしないが、the Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N.Y.およびthe Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, N.Cから入手できる。これらの源の両方は、例えば、イヌ血友病Ｂに罹患しているイヌを提供する。あるいは、ＦＩＸ欠損マウスも利用することができる(Sabatino, et al., Blood 104:2767-2774, 2005)。ＦＩＸ活性に関して試験するために、試験ポリペプチドを罹患している動物に注射し、小さい傷を作り、出血時間を健常対照と比較した。

ヒト野生型ＦＩＸは、ｍｇあたり約２００単位の比活性を有する。ＦＩＸの１単位は、通常（プール）ヒト血漿の１ミリリットルにおいて存在するＦＩＸの量として定義されている（１００％のＦＩＸレベルに対応する）。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのｍｇあたり少なくとも約１００単位の比活性を有し得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのｍｇあたり少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０単位またはそれ以上の比活性を有し得る。いくつかの態様において、ＦＩＸの比活性は、ＡＰＴＴまたは活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（例えば、Proctor, et al., Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961に記載されている、および実施例参照）を使用して測定され得る。

細胞、例えば、肝臓または腎臓細胞において発現されるとき、ＦＩＸポリペプチドは、細胞機構により合成され得、翻訳後修飾を受け、次に細胞外環境に細胞により分泌される。細胞から分泌されるＦＩＸポリペプチドの量は、したがってタンパク質翻訳および細胞外分泌の両方のプロセスに依存している。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照タンパク質の分泌される量と比較して、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０％以上で減少しない量で分泌され得る。例えば、修飾されたポリペプチドが対照と比較して少なくとも約２０％の量で分泌されるとき、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照ＦＩＸポリペプチドと比較して約８０％以上で減少しない量で分泌され得る。分泌されるＦＩＸポリペプチドの量は、例えば、当分野で既知の何らかの方法を使用して細胞外培地中のタンパク質レベルを決定することにより、測定され得る。タンパク質定量化のための慣用の方法論は、２Ｄゲル電気泳動法、質量分析および抗体結合を含む。生物学的サンプルにおけるタンパク質レベルをアッセイするための典型的な方法は、抗体ベース技術、例えば、免疫ブロット法（ウエスタンブロット法）、免疫組織学的アッセイ、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。

いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照タンパク質と少なくとも１つのＦＶＩＩＩ、ＦＸＩまたはＦＸとの相互作用と比較して、約４０、５０、６０、７０または８０％以上減少しないレベルで、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ、ＦＸＩまたはＦＸと相互作用する。例えば、修飾されたポリペプチドが対照と比較して少なくとも約２０％のレベルで少なくとも１つのＦＶＩＩＩ、ＦＸＩまたはＦＸと相互作用するとき、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対照ＦＩＸポリペプチドと比較して約８０％以上減少しないレベルで少なくとも１つのＦＶＩＩＩ、ＦＸＩまたはＦＸと相互作用し得る。凝固カスケードの他のメンバーへのＦＩＸの結合は、例えば、Chang, et al., (J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998)に記載されている方法を含む、当業者に既知の任意の方法により決定することができる。

上記のとおり、ＦＩＸは、異なる生物学的機能を有する４つの構造ドメインを含む。本発明の１つの局面は、特定のドメイン、例えば、活性化ペプチドおよび触媒ドメインにおいて修飾されているＦＩＸポリペプチドを提供することである。本出願は、１つにおいて、ＦＩＸの活性化ペプチドに導入された１つ以上のグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。ＦＩＸにおける天然グリコシル化部位は、ＥＧＦ１ドメイン（２つのＯ結合型部位Ｓｅｒ５３およびＳｅｒ６１）および活性化ペプチド（４つのＯ結合型部位Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、Ｔｈｒ１７２およびＴｈｒ１７９ならびに２つのＮ結合型部位Ａｓｎ１５７およびＡｓｎ１６７）に位置する。したがって、８つの天然グリコシル化部位の６つは活性化ペプチドに位置する。導入されたグリコシル化部位は、天然グリコシル化部位を有するＦＩＸの領域、例えば、活性化ペプチドに導入したとき、活性または発現における悪影響は小さいであろう。加えて、ＦＩＸが活性化されるとき、活性化ペプチドは開裂されるため、ＦＩＸａの触媒活性のために必要でない。しかしながら、活性化ペプチドは酵素前駆体に存在するため、活性化ペプチドは酵素前駆体の循環半減期を改善するためのグリコシル化部位を導入するために注目される領域である。

本出願は、また、１つにおいて、１つ以上のグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の置換を含むものを提供する：Ｇ４Ｔ；Ｅ３３Ｎ；Ｅ３６Ｔ；Ｅ３６Ｎ；Ｒ３７Ｎ；Ｆ７５Ｎ；Ｆ７７Ｔ；Ｅ８３Ｔ；Ｄ８５Ｎ；Ｖ８６Ａ；Ｋ９１Ｔ；Ａ１０３Ｔ；Ｖ１０７Ｔ；Ｋ１２２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ｔ１４８Ｎ；Ｆ１５０Ｔ；Ｐ１５１Ｎ；Ｔ１５９Ｎ；Ａ１６１Ｔ；Ａ１６１Ｎ；Ｔ１６９Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｄ１７７Ｅ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２０１Ｔ；Ｋ２１４Ｔ；Ｖ２２３Ｎ；Ｇ２２６Ｎ；Ｙ２２６Ｔ；Ｋ２２８Ｎ；Ｋ２２８Ｔ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｒ３３８Ａ；Ｒ３３８Ｎ；Ｋ３４１Ｎ；Ｆ３５３Ｎ；Ｈ３５４Ｖ；Ｈ３５４Ｉ；Ｅ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ；Ｔ３７１Ｖ；Ｔ３７１Ｉ；Ｅ３７２Ｔ；Ｅ３７４Ｎ；Ｍ３９１Ｎ；Ｋ３９２Ｖ；Ｇ３９３Ｔ；Ｅ４１０Ｎ；Ｋ４１３Ｎ；Ｌ４１４Ｉ；またはそれらの任意の組合せ。

いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の置換を含むものを提供する：Ｙ１ＮおよびＳ３Ｔ；Ｓ３ＮおよびＫ５Ｔ；Ｇ４ＮおよびＬ６Ｔ；Ｋ５ＮおよびＥ７Ｔ；Ｌ６ＮおよびＥ８Ｔ；Ｅ７ＮおよびＦ９Ｔ；Ｆ９ＮおよびＱ１１Ｔ；Ｖ１０ＮおよびＧ１２Ｔ；Ｑ１１ＮおよびＮ１３Ｔ；Ｇ１２ＮおよびＬ１４Ｔ；Ｎ１３およびＥ１５Ｔ；Ｌ１４ＮおよびＲ１６Ｔ；Ｅ１５ＮおよびＥ１７Ｔ；Ｍ１９ＮおよびＥ２１Ｔ；Ｅ２０ＮおよびＫ２２Ｔ；Ｓ２４ＮおよびＥ２６Ｔ；Ｆ２５ＮおよびＥ２７Ｔ；Ｅ２６ＮおよびＡ２８Ｔ；Ｅ２７ＮおよびＲ２９Ｔ；Ａ２８ＮおよびＥ３０Ｔ；Ｒ２９ＮおよびＶ３１Ｔ；Ｅ３０ＮおよびＦ３２Ｔ；Ｖ３１ＮおよびＥ３３Ｔ；Ｆ３２ＮおよびＮ３４Ｔ；Ｔ３５ＮおよびＲ３７Ｔ；Ｔ３８ＮおよびＥ４０Ｔ；Ｔ３９ＮおよびＦ４１Ｔ；Ｅ４０ＮおよびＷ４２Ｔ；Ｆ４１ＮおよびＫ４３Ｔ；Ｗ４２ＮおよびＱ４４Ｔ；Ｋ４３ＮおよびＹ４５Ｔ；Ｑ４４ＮおよびＶ４６Ｔ；Ｙ４５ＮおよびＤ４７Ｔ；Ｖ４６ＮおよびＧ４８Ｔ；Ｅ５２ＮおよびＮ５４Ｔ；Ｓ５３ＮおよびＰ５５Ｔ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｉ６６ＮおよびＳ６８Ｔ；Ｓ６８ＮおよびＥ７０Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｅ７８ＮおよびＫ８０Ｔ；Ｅ８３ＮおよびＤ８５Ｔ；Ｌ８４ＮおよびＶ８６Ｔ；Ｉ９０ＮおよびＮ９２Ｔ；Ｋ１００ＮおよびＳ１０２Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｋ１０６ＮおよびＶ１０８Ｔ；Ｒ１１６ＮおよびＡ１１８Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ａ１２７ＮおよびＰ１２９Ｔ；Ｖ１３５ＮおよびＶ１３７Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｖ１３７ＮおよびＱ１３９Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｓ１４１ＮおよびＬ１４３Ｔ；Ｅ１４７ＮおよびＶ１４９Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｙ１５５ＮおよびＮ１５７Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｔ１５９ＮおよびＡ１６１Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｌ１６５ＮおよびＮ１６７Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｔ１６９ＮおよびＳ１７１Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｇ１８４ＮおよびＤ１８６Ｔ；Ｅ１８５ＮおよびＡ１８７Ｔ；Ｄ１８６ＮおよびＫ１８８Ｔ；Ａ１８７ＮおよびＰ１８９Ｔ；Ｐ１８９ＮおよびＱ１９１Ｔ；Ｇ２００ＮおよびＶ２０２Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｖ２２７ＮおよびＩ２２９Ｔ；Ｈ２３６ＮおよびＩ２３８Ｔ；Ｉ２３８ＮおよびＥ２４０Ｔ；Ｅ２４０ＮおよびＥ２４２Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｈ２４３ＮおよびＥ２４５Ｔ；Ｋ２４７ＮおよびＮ２４９Ｔ；Ｖ２５０ＮおよびＲ２５２Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６１ＮおよびＩ２６３Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｄ２７６ＮおよびＰ２７８Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｆ３０２ＮおよびＳ３０４Ｔ；Ｓ３０４ＮおよびＹ３０６Ｔ；Ｒ３１２ＮおよびＦ３１４Ｔ；Ｖ３１３ＮおよびＨ３１５Ｔ；Ｆ３１４ＮおよびＫ３１６Ｔ；Ｈ３１５ＮおよびＧ３１７Ｔ；Ｋ３１６ＮおよびＲ３１８Ｔ；Ｇ３１７ＮおよびＳ３１９Ｔ；Ｓ３１９ＮおよびＬ３２１Ｔ；Ａ３２０ＮおよびＶ３２２Ｔ；Ｒ３２７ＮおよびＰ３２９Ｔ；Ｐ３２９ＮおよびＶ３３１Ｔ；Ｄ３３２ＮおよびＡ３３４Ｔ；Ｌ３３７ＮおよびＳ３３９Ｔ；Ｓ３３９ＮおよびＫ３４１Ｔ；Ｔ３４０ＮおよびＦ３４２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；Ｇ３５２ＮおよびＨ３５４Ｔ；Ｆ３５３ＮおよびＥ３５５Ｔ；Ｈ３５４ＮおよびＧ３５６Ｔ；Ｅ３５５ＮおよびＧ３５７Ｔ；Ｇ３５６ＮおよびＲ３５８Ｔ；Ｇ３５７ＮおよびＤ３５９Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｗ３８５ＮおよびＥ３８７Ｔ；Ｇ３８６ＮおよびＥ３８８Ｔ；Ａ３９０ＮおよびＫ３９２Ｔ；またはそれらの任意の組合せ。

いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の置換を含むものを提供する：Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｅ１２５Ｎ、Ｐ１２６ＡおよびＡ１２７Ｔ；Ｐ１２６Ｎ、Ｖ１２８ＴおよびＰ１２９Ａ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０ＴおよびＰ１５１Ａ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＡ１６１Ｎ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎ；Ｖ１５３Ｎ、Ｙ１５５ＴおよびＥ２９４Ｎ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＶおよびＥ３５５Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＩおよびＥ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＶおよびＥ３７２Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＩおよびＥ３７２Ｔ；Ｍ３９１Ｎ、Ｋ３９２ＶおよびＧ３９３Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２ＮおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７Ｅ、Ｆ１７８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；およびＰ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；またはそれらの任意の組合せ。

いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の置換を含むものを提供する：
（ａ）Ｇ４Ｔ；Ｅ３３Ｎ；Ｅ３６Ｔ；Ｅ３６Ｎ；Ｒ３７Ｎ；Ｆ７５Ｎ；Ｆ７７Ｔ；Ｅ８３Ｔ；Ｄ８５Ｎ；Ｖ８６Ａ；Ｋ９１Ｔ；Ａ１０３Ｔ；Ｖ１０７Ｔ；Ｋ１２２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ｔ１４８Ｎ；Ｆ１５０Ｔ；Ｐ１５１Ｎ；Ｔ１５９Ｎ；Ａ１６１Ｔ；Ａ１６１Ｎ；Ｔ１６９Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｄ１７７Ｅ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２０１Ｔ；Ｋ２１４Ｔ；Ｖ２２３Ｎ；Ｇ２２６Ｎ；Ｙ２２６Ｔ；Ｋ２２８Ｎ；Ｋ２２８Ｔ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｒ３３８Ａ；Ｒ３３８Ｎ；Ｋ３４１Ｎ；Ｆ３５３Ｎ；Ｈ３５４Ｖ；Ｈ３５４Ｉ；Ｅ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ；Ｔ３７１Ｖ；Ｔ３７１Ｉ；Ｅ３７２Ｔ；Ｅ３７４Ｎ；Ｍ３９１Ｎ；Ｋ３９２Ｖ；Ｇ３９３Ｔ；Ｅ４１０Ｎ；Ｋ４１３Ｎ；Ｌ４１４Ｉ；

（ｃ）Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｅ１２５Ｎ、Ｐ１２６ＡおよびＡ１２７Ｔ；Ｐ１２６Ｎ、Ｖ１２８ＴおよびＰ１２９Ａ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０ＴおよびＰ１５１Ａ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＡ１６１Ｎ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎ；Ｖ１５３Ｎ、Ｙ１５５ＴおよびＥ２９４Ｎ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＶおよびＥ３５５Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＩおよびＥ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＶおよびＥ３７２Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＩおよびＥ３７２Ｔ；Ｍ３９１Ｎ、Ｋ３９２ＶおよびＧ３９３Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２ＮおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７Ｅ、Ｆ１７８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；およびＰ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；ならびにそれらの任意の組合せ。

本出願は、一部において、内因性Ｏ結合型グリコシル化部位をＮ結合型グリコシル化部位に変換することにより導入された１つ以上のグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。Ｎ結合型グリコシル化部位はＯ結合型グリコシル化部位よりもよりシアル化されやすい傾向があることが報告されており、高いシアル酸含有量がタンパク質半減期の延長を与えることが証明されている。付加的なＮ結合型グリコシル化により提供されるシアル酸含有量の増加が、血液中の半減期の延長に関与し得ると一般的に考えられる（White, et al., Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997）。このような修飾されたＦＩＸポリペプチドの典型的な態様は、以下のとおりである。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドはＴ１６９Ｎ置換を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドはＴ１７２Ｎ置換を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドはＴ１４８Ｎ置換およびＦ１５０Ｔ置換を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドはＴ１５９Ｎ置換およびＡ１６１Ｔ置換を含むものを提供する。

本発明の他の局面は、１つ以上のグリコシル化部位を生産するための、活性化ペプチドへのアミノ酸の挿入を提供する。本出願は、一部において、ヒトＦＩＸのアミノ酸残基１６０から１６４間に導入された１つ以上のグリコシル化部位を含むＦＩＸポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、導入されたアミノ酸残基はグリコシル化部位を含む。いくつかの態様において、導入されたアミノ酸残基は、野生型ＦＩＸアミノ酸残基と組み合わさってグリコシル化部位を形成する。８つの種由来のＦＩＸ配列の多数の配列アラインメントは、マウス、ラットおよびテンジクネズミ配列の全てが、活性化ペプチドにおいて、他の種（ヒト、アカゲザル、イヌ、ウサギ、ブタ）（図１）において見出されない、さらなるアミノ酸（７から１０残基間）を有することが証明された。これらのさらなる配列は、ヒトＦＩＸのＥ１６０からＥ１６２間に位置する。これは、この部位での少なくとも１０個のアミノ酸残基の挿入がＦＩＸ構造において許容されることを示唆する。活性が有意に減少しなかったため、この領域はさらなるアミノ酸の導入のために標的とされ、良い位置であることが見出された。いくつかの態様において、最大３０、２５、２０、１８、１６、１４または１２個のアミノ酸残基が、ヒトＦＩＸのアミノ酸残基１６０から１６４の間に挿入され得る。いくつかの態様において、最大１０個のアミノ酸が挿入され得る。いくつかの態様において、最大９個のアミノ酸が挿入され得る。

８つの種由来のＦＩＸ間の多数の配列アラインメントを行うために使用される基準によって、ラット、マウスおよびテンジクネズミにおけるさらなるアミノ酸が見出される見かけの部位は、該部位がヒトＦＩＸのＥ１６０からＡ１６１間、Ａ１６１からＥ１６２間、Ｅ１６２からＴ１６３間またはＴ１６３からＩ１６４間のいずれかであり得るように変化することができる。いくつかの態様において、Ｅ１６０からＡ１６１間に挿入されるアミノ酸配列は配列番号：２であり得る。いくつかの態様において、Ａ１６１からＥ１６２間に挿入されるアミノ酸配列は配列番号：２であり得る。いくつかの態様において、Ｅ１６２からＴ１６３間に挿入されるアミノ酸配列は配列番号：２であり得る。いくつかの態様において、Ｔ１６３からＩ１６４間に挿入されるアミノ酸配列は配列番号：２であり得る。いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸がＥ１６０からＡ１６１間に挿入され、１つ以上のアミノ酸がＡ１６１からＥ１６２間に挿入され得る。いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸がＥ１６０からＡ１６１間に挿入され、１つ以上のアミノ酸がＥ１６２からＴ１６３間に挿入され得る。いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸がＡ１６１からＥ１６２間に挿入され、１つ以上のアミノ酸がＥ１６２からＴ１６３間に挿入され得る。いくつかの上記態様において、１つ以上のアミノ酸がＴ１６３からＩ１６４間に挿入され得る。いくつかの態様において、最大全約３０、２５、２０、１８、１６、１４または１２個のアミノ酸残基が、ヒトＦＩＸのアミノ酸残基１６０から１６４間に挿入され得る。いくつかの態様において、最大全約１０個のアミノ酸が、ヒトＦＩＸのアミノ酸残基１６０から１６４間に挿入され得る。いくつかの態様において、最大全約９個のアミノ酸がヒトＦＩＸのアミノ酸残基１６０から１６４間に挿入され得る。いくつかの態様において、１つ、２つ、３つまたは４つのグリコシル化部位が導入され得る。

本出願はさらに、本明細書に記載されている１つ以上の導入されたグリコシル化部位を含む修飾されたＦＩＸポリペプチドを提供する。ＦＩＸポリペプチドは、触媒ドメインにおいて少なくとも１つの導入されるグリコシル化部位および活性化ペプチドにおいて少なくとも１つの導入されるグリコシル化部位を含むものを提供する。ＦＩＸポリペプチドは、触媒ドメインにおいて少なくとも２つの導入されたグリコシル化部位を含むものを提供する。ＦＩＸポリペプチドは、活性化ペプチドにおいて少なくとも２つの導入されたグリコシル化部位を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは１つ以上の以下の置換を含み得る：Ｒ３７Ｎ；Ｄ８５Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ａ１６１Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２２８Ｎ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｅ３７４Ｎ；およびＥ４１０Ｎ。他の態様は１つ以上の以下の置換を含み得る：Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；ならびにＡ１６１およびＥ１６２間への配列番号：２の挿入。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは少なくとも１つの置換、例えば、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａをさらに含み得る。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドはＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａの両方の置換をさらに含み得る。

本出願は、さらにＦＩＸポリペプチドのＣ末端（すなわち、ＦＩＸポリペプチドのアミノ酸残基４１５の後）に少なくとも１つの導入されたグリコシル化部位を含む修飾されたＦＩＸポリペプチドを提供する。ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ以上のグリコシル化部位を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に配列番号：４のアミノ酸配列の付加を含み得る。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に配列番号：５のアミノ酸配列の付加を含み得る。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に配列番号：６のアミノ酸配列の付加を含み得る。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に配列番号：７のアミノ酸配列の付加を含み得る。

本出願の１つの局面は、少なくとも１つ以上のグリコシル化部位およびＦＩＸの活性を増加する１つ以上の置換を含む修飾されたＦＩＸポリペプチドを提供する。活性化置換の例はＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換を含む。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドはＲ３３８Ａ置換を含み得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドはＶ８６Ａ置換を含み得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドはＲ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換の両方を含み得る。

本出願のさらなる局面は、増加した比活性を有するＦＩＸポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドはＲ３３８Ａ置換およびＶ８６Ａ置換を含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドのｍｇあたり少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００単位の比活性を有し得る。比活性は、例えば、ＡＰＴＴアッセイを使用して、前記のとおりに測定することができる。これらのポリペプチドは、特に血友病Ｂに罹患している患者における、治療剤として有用である。これらのポリペプチドは、さらなる置換または修飾（例えば、本明細書に記載されているグリコシル化部位）を含み得る。

本出願の１つの局面は、以下のアミノ酸配列を含む修飾された第ＩＸ因子ポリペプチドを提供する：
ＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＸ_８５Ｘ_８６ＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＸ_１０４ＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＸ_１２１ＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＸ_１３８ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＸ_１４８ＶＸ_１５０Ｘ_１５１Ｘ_１５２Ｘ_１５３ＤＹＶＮＳＸ_１５９ＥＺ_１Ｘ_１６１Ｚ_２ＥＺ_３ＴＺ_４ＩＬＤＮＩＸ_１６９ＱＳＸ_１７２ＱＸ_１７４ＦＮＸ_１７７Ｘ_１７８ＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＸ_２２６ＶＸ_２２８ＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＸ_３３８ＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＸ_３５３Ｘ_３５４Ｘ_３５５ＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＸ_３７０Ｘ_３７１Ｘ_３７２ＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＸ_３９１Ｘ_３９２Ｘ_３９３ＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＸ_４１３Ｘ_４１４Ｔ（配列番号：３）；
ここで、Ｘ_８５はＤおよびＥから選択され；
ここで、Ｘ_８６はＡ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＶから選択され；
ここで、Ｘ_１０４はＤ、ＮおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１２１はＮ、ＱおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１３８はＮ、ＳおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１４８およびＸ_１５０は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１４８はＴであり、そしてＸ_１５０はＦである；
（ｉｉ）Ｘ_１４８はＮであり、そしてＸ_１５０はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１４８はＮであり、そしてＸ_１５０はＳである；
ここで、Ｘ_１５１はＡ、ＰおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１５１およびＸ_１５３は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１５１はＰであり、そしてＸ_１５３はＶである；
（ｉｉ）Ｘ_１５１はＮであり、そしてＸ_１５３はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１５１はＮであり、そしてＸ_１５３はＳである；
ここで、Ｚ_１、Ｚ_２、Ｚ_３およびＺ_４は、独立して以下から選択され
（ｉ）０から１２のアミノ酸残基、および
（ｉｉ）配列番号：２；
ここで、Ｘ_１５２はＤ、ＮおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１５９およびＸ_１６１は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１５９はＴであり、そしてＸ_１６１はＡである；
（ｉｉ）Ｘ_１５９はＮであり、そしてＸ_１６１はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１５９はＮであり、そしてＸ_１６１はＳである；
ここで、Ｘ_１６９はＴおよびＮから選択され；
ここで、Ｘ_１７２はＴおよびＮから選択され；
ここで、Ｘ_１７４はＳおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１７７およびＸ_１７８は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１７７はＤであり、そしてＸ_１７８はＦである；
（ｉｉ）Ｘ_１７７はＥであり、そしてＸ_１７８はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１７７はＥまたはＤであり、そしてＸ_１７８はＳである；
ここで、Ｘ_２２６およびＸ_２２８は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_２２６はＧであり、そしてＸ_２２８はＫである；
（ｉｉ）Ｘ_２２６はＮであり、そしてＸ_２２８はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_２２６はＮであり、そしてＸ_２２８はＳである；
ここで、Ｘ_３３８はＲおよびＡから選択され；
ここで、Ｘ_３５３、Ｘ_３５４およびＸ_３５５は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３５３はＦであり、Ｘ_３５４はＨであり、Ｘ_３５５はＥである；
（ｉｉ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＶであり、Ｘ_３５５はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＩであり、Ｘ_３５５はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＨ、ＶまたはＩであり、Ｘ_３５５はＳである；
ここで、Ｘ_３７０、Ｘ_３７１およびＸ_３７２は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３７０はＶであり、Ｘ_３７１はＴであり、Ｘ_３７２はＥである；
（ｉｉ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＶであり、Ｘ_３７２はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＩであり、Ｘ_３７２はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＴ、ＶまたはＩであり、Ｘ_３７２はＳである；
ここで、Ｘ_３９１、Ｘ_３９２およびＸ_３９３は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３９１はＭであり、Ｘ_３９２はＫであり、Ｘ_３９３はＧである；
（ｉｉ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ_３９２はＫであり、Ｘ_３９３はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ_３９２はＶであり、Ｘ_３９３はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ３９２はＶまたはＫであり、Ｘ３９３はＳである；
ここで、Ｘ_４１３およびＸ_４１４は以下から選択される：
（ｉ）Ｘ_４１３はＫであり、そしてＸ_４１４はＬである；
（ｉｉ）Ｘ_４１３はＮであり、そしてＸ_４１４はＬである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_４１３はＮであり、そしてＸ_４１４はＩである；（そして
ここで、該ＦＩＸポリペプチドは、配列番号：１を有するＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくとも１つの導入されるグリコシル化部位を含む）。

少なくとも１つのグリコシル化部位の導入は、少なくとも１つのＸ位置における置換または少なくとも１つのＺ位置における挿入の結果である。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、約１−３０、１−２０または１−１０個の保存的アミノ酸変化をさらに含み、そしてＦＩＸ活性を維持している。いくつかの態様において、修飾されたポリペプチドは、配列番号：１と少なくとも約８０、８５、９０、９５または９９％同一であり、そしてＦＩＸ活性を維持している。

修飾されたＦＩＸポリペプチドの生産
アミノ酸残基は、非天然グリコシル化部位を導入するために導入、欠失または置換され得る。例えば、グリコシル化部位はＦＩＸのアミノ酸配列を変化することにより導入され得る。アミノ酸配列変化は、種々の技術により、例えば、部位特異的突然変異により対応する核酸配列を修飾することにより成し遂げられ得る。部位特異的突然変異のための技術は当分野で知られており、例えば、Zoller et al., (DNA 3:479-488, 1984)またはHorton, et al., (Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68)に記載されている。したがって、ＦＩＸのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用して、１つに選択された変化が導入され得る。同様に、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡ構築物を製造するための方法は当業者に知られている（例えば、PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA、参照）。

ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸構築物は、また、確立された標準方法、例えば、Beaucage, et al., によるホスホラミダイト法（Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983）により合成的に製造され得る。ホスホアミダイト法にしたがって、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、アニールされ、結合され、そして適当なベクターにおいてクローン化される。ヒトＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、また、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；またはSaiki, et al., (Science 239:487-491, 1988)に記載されているとおりに、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により製造され得る。さらに、核酸構築物は、合成およびゲノム由来の混合物、合成およびｃＤＮＡ由来の混合物またはゲノムおよびｃＤＮＡ由来の混合物（標準技術にしたがって、全体の核酸構築物の種々の部分に対応する、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ由来（適当なとき）のフラグメントを結合することにより製造される）であり得る。

ＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ方法を使用して、組換えベクターに挿入され得る。ベクターの選択は、しばしば、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。ベクターは自律的に複製するベクターまたは組込みベクターであり得る。自律的に複製するベクターは染色体外の存在物として存在し、その複製は染色体複製、例えば、プラスミドと独立している。組込みベクターは、宿主細胞ゲノムに組込まれ、組込まれている染色体と共に複製するベクターである。

ベクターは、修飾されたＦＩＸをコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡの転写、翻訳またはプロセシングのために必要とされるさらなる断片、例えば、プロモーター、ターミネーターおよびポリアデニル化部位に作動可能に連結した発現ベクターであり得る。一般的に、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来であるか、または両方の成分を含み得る。“作動可能に連結した”なる用語は、断片が意図される目的のために機能する、例えば、転写がプロモーターで開始し、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通過するように配置されていることを示す。

ＦＩＸポリペプチドの発現において使用される発現ベクターは、クローン化した遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向することができるプロモーターを含み得る。プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すあらゆる好ましいＤＮＡ配列であり得、宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。

哺乳動物細胞におけるＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を指向するための適当なプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981）、ＭＴ−Ｉ（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983）、ＣＭＶプロモーター（Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985）またはアデノウイルス２主要後期プロモーター（Kaufman et al.,, Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982）である。

ＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、また、必要なとき、適当なターミネーター、例えば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983）またはＴＰＩｌ（Alber et al., J. MoI. Appl. Gen. 1:419-434, 1982）またはＡＤＨ３（McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985）ターミネーターと作動可能に結合していてもよい。発現ベクターは、また、挿入部位の下流の位置にポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来の前期または後期ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ＥＩｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981）またはヒトＦＩＸ遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含む。発現ベクターは、また、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサーを含み得る。

宿主細胞の分泌経路に本発明のＦＩＸポリペプチドを指向するために、天然ＦＩＸ分泌シグナル配列が使用され得る。あるいは、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている）は組換えベクターにおいて提供され得る。分泌シグナル配列は正しいリーディング・フレームにおいてＦＩＸ類似物をコードするＤＮＡ配列に結合され得る。分泌シグナル配列は、一般的にペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する。典型的なシグナル配列は、例えば、ＭＰＩＦ−１シグナル配列およびスタニオカルシンシグナル配列を含む。

ＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーターならびに所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列を結合するため、ならびに、複製のために必要な情報を含む適当なベクターにそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に既知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989、参照）。

哺乳動物細胞にトランスフェクトし、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現する方法は、例えば、Kaufman, et al., (J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982); Southern, et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982); Loyter, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982); Wigler, et al., (Cell 14:725-731, 1978); Corsaro, et al., (Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981), Graham, et al., (Virology 52:456-467, 1973);およびNeumann, et al., (EMBO J. 1:841-845, 1982)に記載されている。クローン化されたＤＮＡ配列は、例えば、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、微量注入、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス送達、エレクトロポレーション、ソノポレーション、レーザー照射、マグネトフェクション、自然変換およびバイオリスティック形質転換（例えば、Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005、参照）により培養哺乳動物細胞に導入され得る。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定および選択するために、選択可能な表現型（選択可能なマーカー）を与える遺伝子を、一般的に興味ある遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入する。選択可能なマーカーは、例えば、薬物、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を与える遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、配列が結合されているとき、マーカーおよび外因性ＤＮＡの増幅が可能である増幅可能な選択可能なマーカーであり得る。典型的な増幅可能な選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびアデノシン・デアミナーゼを含む。適当な選択可能なマーカーを選択することは当業者の範囲内である（例えば、米国特許第５，２３８，８２０号、参照）。

細胞がＤＮＡをトランスフェクトされた後、細胞は興味ある遺伝子を発現するために適当な培養培地で培養される。本明細書において使用される“適当な培養培地”なる用語は、細胞の増殖および活性なＦＩＸポリペプチドの発現のために必要とされる栄養物および他の成分を含む培地を意味する。

培地は、一般的に、例えば、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須の糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含み、ビタミンＫ依存性タンパク質、例えば、ＦＩＸの場合、ビタミンＫも提供され得る。次に薬物選択は、安定な様式において選択可能なマーカーを発現する細胞の増殖に対して選択するために適用される。増幅可能な選択可能なマーカーをトランスフェクトされている細胞において、薬物濃度は、クローン配列のコピー数の増加、それによる発現レベルの増加に関して選択するために増加され得る。次に安定にトランスフェクトされた細胞のクローンをＦＩＸポリペプチドの発現に関してスクリーニングする。

本発明において使用するための哺乳動物細胞系の例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨＫＢ１１細胞（Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002）およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３；Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞系である。加えて、多くの他の細胞系が本発明の範囲内で使用され、ラットＨｅｐＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣＣＲＬ１６００）、ラットＨｅｐＩＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ１３９）、Ｈｅｐ−Ｇ２（ＡＴＣＣＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）およびＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）を含む。

ＦＩＸポリペプチドは、細胞培養培地から回収され得、次に、限定はしないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水、クロマト分画およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取分画電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度差（例えば、硫安分画））、抽出（例えば、Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989、参照）またはそれらの種々の組合せを含む当分野で既知の種々の方法により精製され得る。典型的な態様において、ポリペプチドは抗ＦＩＸ抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。さらなる精製は、慣用の化学精製方法、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより達成され得る。精製の他の方法は当分野で既知であり、修飾されたＦＩＸポリペプチドの精製に適用され得る（例えば、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982、参照）。

一般的に、“精製された”は、種々の他の成分を除去するために分別に付され、その示される生物学的活性を実質的に維持している、タンパク質またはペプチド組成物を示す。“実質的に精製された”なる用語が使用されるとき、この意味は、タンパク質またはペプチドが組成物の主な成分を形成する、例えば、組成物においてタンパク質が約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上を占める組成物を示す。

ポリペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法は当業者に既知である。これらは、例えば、活性画分の比活性を測定するか、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの量を評価することを含む。画分の純度を評価するための典型的な方法は、最初の抽出物の比活性に対する活性と比較して画分の比活性を計算し、したがって本明細書において“−倍の精製”により評価される純度の程度を計算することである。活性の量を示すために使用される実際の単位は、もちろん、特定のアッセイ技術に依存する。

いくつかの態様において、ＦＩＸポリペプチドは組織培養細胞において組換え的に発現され、グリコシル化は宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞の通常の翻訳後細胞機能の結果である。

あるいは、グリコシル化は化学的または酵素的修飾を介して達成され得る。ＦＩＸポリペプチドは、例えば、タンパク質へアルファ−（２，６）−結合型シアル酸を加える酵素を使用することにより、グリコシル化され得る。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失ＣＨＯ細胞は、組換え糖タンパク質生産のために一般的に使用される宿主細胞である。ＣＨＯ細胞は、マンノースアルファ−１，３分岐上のガラクトースへ２，６結合においてシアル酸を加えるために使用される、酵素ベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアリルトランスフェラーゼを内因的に発現しない。ＣＨＯ細胞において生産されたタンパク質にこの結合にてシアル酸を加えるために、ＣＨＯ細胞は、所望のガラクトースへの２，６結合におけるシアル酸の取り込みを可能にするために、機能性ベータ−ガラクトシダーゼアルファ−２，６シアリルトランスフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトされ得る（例えば、Lee, et al., J. Biol. Chem. 264:13848-13855, 1989、参照）。

同様に、分岐しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、このオリゴ糖結合を内因的に生産しない宿主細胞に分岐しているＧｌｃＮＡｃ構造の形成を触媒することが報告されている、酵素Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに関する機能性遺伝子をトランスフェクトすることにより、ＦＩＸに結合され得る。系は、また、哺乳動物グリコシル化パターンでタンパク質を生産する植物細胞においてタンパク質を発現することが確立されている（例えば、コケ植物細胞、ＷＯ２００４／０５７００２、参照）。

Ｎ結合型グリコシル化に関して、Ｎ−グリカンの最終構築物は、一般的にポリペプチドが生産される生物体に依存している。一般的に、細菌において生産されるポリペプチドは完全にグリコシル化されない。昆虫細胞において発現されるポリペプチドは、特に高マンノースおよび少(pauci)−マンノースＮ結合型オリゴ糖鎖を含む。哺乳動物細胞培養において生産されるポリペプチドは、通常、例えば、種および細胞培養条件に依存して異なってグリコシル化される。さらに、植物細胞において生産されるポリペプチドは、動物細胞において生産されるものと非常に異なっているグリカン構造を含む。組換えポリペプチドの生産の当分野の目的は、特にポリペプチドが治療剤として使用されるとき、正確にグリコシル化されるポリペプチドを生産することができること、すなわち、天然形態のポリペプチドに存在するものと似ているか、または同一であるグリカン構造を有するポリペプチドを生産することができることである。

種々の方法が当分野でポリペプチドのグリコシル化パターンをカスタマイズするために提案されている（例えば、ＷＯ９９／２２７６４；ＷＯ９８／５８９６４；ＷＯ９９／５４３４２；ＵＳ公報第２００８／００５０７７２号；および米国特許第５，０４７，３３５号、参照）。本質的に、ポリペプチドのインビトロのグリコシル化のために必要とされる酵素の多くがクローニングされ、シーケンシングされている。場合によっては、これらの酵素は、ポリペプチド上の不完全なグリカン分子に特定の糖を加えるためにインビトロで使用されている。他の例では、細胞は、発現されるポリペプチドへの所望の糖部分の付加が細胞内で起こるように、酵素および所望のポリペプチドの組合せを発現するように遺伝的に加工されている。

Ｏ結合型グリコシル化に関して、Ｏ−グリカンは主にセリンおよびスレオニン残基に結合し、ヌクレオチド糖から糖の段階的付加により形成される(Tanner, et al., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-99, 1987); Hounsell, et al., Glycoconj. J. 13:19-26, 1996)。ポリペプチド機能は存在しているＯ結合型グリカンの構造に影響され得る。Ｏ結合型グリカン構造の概説のために、例えば、Schachter and Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pp. 1-26 (Great Britain)、参照。

ＦＩＸポリペプチドがＮ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化を有するか否かは、標準技術を使用して決定され得る（例えば、Techniques in Glycobiology, R. Townsend and A. Hotchkiss, eds. (1997) Marcel Dekker; and Glycoanalysis Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 76), E. Hounsell, ed. (1998) Humana Press、参照）。化学的または酵素的脱グリコシル化（例えば、エンドグリコシダーゼおよび／またはエキソグリコシダーゼを使用して）での処置前後におけるタンパク質の電気泳動移動度の変化は、日常的にタンパク質のグリコシル化状態を決定するために使用される。酵素的脱グリコシル化は、限定はしないが、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３などを含む任意の種々の酵素を使用して実施され得る。例えば、タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を、ＰＮＧａｓｅＦで前処理またはＰＮＧａｓｅＦで未処理のいずれかで、実施され得る。ＰＮＧａｓｅＦでの処置後のバンド幅の著しい減少および移動位置の変化がＮ結合型グリコシル化の診断に考えられ得る。グリコシル化されるタンパク質の炭水化物含有量も、タンパク質ブロットのレクチン分析を使用して検出することができる（例えば、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、支持体、例えば、ナイロン膜に移される）。種々の植物組織由来の炭水化物結合タンパク質であるレクチンは、糖タンパク質グリカン上に見られる広範囲の定義される糖エピトープに対する高親和性および狭い特異性の両方を有する（Cummings, Methods Enzymol. 230:66-86, 1994）。レクチンは、グリコシル化されるタンパク質上の炭水化物へのレクチンの結合を検出することを可能にするために（直接的または間接的にのいずれかで）標識化され得る。例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンと結合したとき、グリコシル化されるタンパク質へ結合したレクチンは、アビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体を酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させ、検出可能な生成物を得ることを利用する反応を介して膜ブロットで容易に同定することができる。明確に定義された特異性を有するレクチンの一団でのスクリーニングは、糖タンパク質の炭水化物補体についての多数の情報を提供する。修飾されたＦＩＸポリペプチドの電気泳動移動度は、また、参照タンパク質の移動度と比較され得る。

本出願は、１つにおいて、グリコシル化部位に結合した炭水化物鎖が哺乳動物の炭水化物鎖構造、すなわち、哺乳動物のグリコシル化パターンを有し得る、導入されたグリコシル化部位を有するＦＩＸポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、炭水化物鎖はヒトグリコシル化パターンを有する。本明細書において使用されるグリコシル化のパターンは、ＦＩＸポリペプチドの得られる群内の特定のオリゴ糖構造の代表を示す。このようなパターンの非限定的な例は、（ｉ）少なくとも１つのシアル酸残基を有するか；（ｉｉ）いずれかのシアル酸残基を欠いているか（すなわち、中性である）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端ガラクトース残基を有するか；（ｉｖ）少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するか；（ｖ）少なくとも１つの“キャップされていない”アンテナを有するか、すなわち、少なくとも１つの末端ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有するか；または（ｖｉ）アンテナＮ−アセチルグルコサミン残基に少なくとも１つのアルファ１−＞３結合フコースを有する、オリゴ糖鎖の相対的比率を含む。

グリコシル化のパターンは、限定はしないが：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）；イオン化技術を使用する質量分析（ＭＳ）、例えば、高速原子衝撃、エレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）；ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）；およびエキソグリコシダーゼでの処理と陰イオン交換（ＡＩＥ）−ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはＭＳとの組合せを含む当分野で既知の任意の方法を使用して決定され得る（例えば、Weber, et al., Anal. Biochem. 225:135-142, 1995; Klausen, et al., J. Chromatog. 718:195-202, 1995; Morris, et al., in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397-407, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554-573, 1990; Sutton, et al., Anal. Biochem. 218:34-46, 1994; Harvey, et al., Organic Mass Spectrometry 29:753-766, 1994、参照）。

医薬組成物
哺乳動物において上記同定された状態の処置のための有効性を決定するために使用される既知のアッセイに基づいて、および、これらの結果をこれらの状態を処置するために使用される既知の薬物の結果と共に比較することにより、本発明のポリペプチドの有効量は、それぞれの所望の適応の処置のために容易に決定され得る。これらの状態の１つの処置において投与される活性成分の量は、使用される特定のポリペプチドおよび投与単位、投与経路、処置期間、処置される患者の年齢および性別ならびに処置される状態の性質および程度にしたがって広範に変化することができる。

本出願は、一部において、本明細書に記載されているとおりの１つ以上の導入されたグリコシル化部位を有するＦＩＸポリペプチドを含む組成物を提供する。該組成物はインビボ投与のために適当であり得、パイロジェンフリーである。該組成物は薬学的に許容される担体も含み得る。“薬学的または薬理学的に許容される”なるフレーズは、動物またはヒトに投与されるとき、有害な、アレルギー性の、または他の都合の悪い反応を引き起こさない化合物および組成物を示す。本明細書において使用される“薬学的に許容される担体”は、あらゆるおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような溶媒および剤の使用は当分野で既知である。補足的活性成分も該組成物に包含され得る。

本発明の組成物は古典的な医薬品を含む。本発明のこれらの組成物の投与は、任意の一般的な経路を介してであり得る。該医薬組成物は、任意の慣用の方法により、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内、経口、舌下、経鼻、肛門、膣または経皮送達により、または特定の部位への外科的移植により対照に導入され得る。該処置は単回投与または期間にわたって複数回投与からなり得る。

活性な化合物は、適当なとき界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと組み合わせられた遊離塩基または薬理学的に許容される塩の水溶液として投与のために製造され得る。分散媒も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中で製造され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの製造物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。

注射用使用のために適当な医薬形態は、滅菌水溶液または分散媒および滅菌注射可能溶液または分散媒の即時調整のための滅菌粉末を含む。該形態は滅菌されるべきであり、容易にシリンジ可能な存在の流体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、スクロース、Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート８０または適当なそれらの混合物および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用により、分散媒の場合において必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。注射可能組成物は等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含み得る。注射可能組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によりもたらされ得る。

滅菌注射可能溶液は、上記種々の他の成分を有する適当な溶媒中に必要量の活性な化合物（例えば、ＦＩＸポリペプチド）を混合し、必要なとき、次にフィルター滅菌することにより製造され得る。

一般的に、分散媒は、種々の滅菌された活性成分を基本的な分散媒および上記のものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに混合することにより製造され得る。滅菌注射可能溶液の製造のための滅菌粉末の場合、製造方法は、例えば、あらかじめ滅菌フィルターを通した溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。

製剤において、溶液は、投与製剤と適合する様式および治療的に有効である量において投与され得る。“治療有効量”は、血流または標的組織における所望のレベルのポリペプチドを提供するために必要とされるポリペプチドの量を示すように本明細書で使用される。正確な量は、多数の因子、例えば、特定のＦＩＸポリペプチド、治療組成物の成分および物理的特性、意図される患者集団、送達様式、個々の患者の検討などに依存し、本明細書で提供される情報に基づいて当業者により容易に決定することができる。

製剤は種々の投与形態、例えば、注射可能溶液などで容易に投与され得る。水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は適当に緩衝されているべきであり、必要なとき、最初に十分な塩水またはグルコースで等張にされた液体希釈剤である。これらの特定の水溶液は、とりわけ静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適当である。

ＦＩＸの用量は通常、単位で表される。１単位のＦＩＸ／体重ｋｇは血漿レベルを０．０１Ｕ／ｍｌ、すなわち１％上げ得る。他の点では、健常患者は１単位のＦＩＸ／血漿ｍｌ、すなわち１００％を有する。血友病Ｂの軽度の場合はＦＩＸ血漿濃度が６−６０％、中程度の場合は１−５％、そして血友病Ｂの場合の約半分の割合である重度の場合はＦＩＸ１％未満と定義する。軽度の出血の予防処置または処置は、通常、ＦＩＸレベルを１５−３０％に上げる必要がある。軽度の出血の処置は、通常、レベルを３０−５０％に上げる必要があるが、重度の外傷の処置はレベルを５０から１００％に上げる必要があり得る。患者の血中濃度を上げるために必要とされる総単位数は、以下のとおりに決定することができる：１．０単位／ｋｇ×体重（ｋｇ）×所望の増加パーセント（正常の％）。薬物の治療循環レベルを維持するために、非経口投与は最初のボーラス後に連続的な注入を実施され得る。いくつかの態様において、１５から１５０単位／ｋｇのＦＩＸポリペプチドを投与され得る。当業者は、個々の患者の良い医療習慣および臨床状態による決定により有効量および投与レジメンを容易に最適化することができる。

投与の頻度は薬物の薬物動態パラメーターおよび投与経路に依存する。最適な医薬処方は投与経路および所望の用量に依存して当業者により決定され得る（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20^th edition, 2000（出典明示により本明細書に包含される）、参照）。このような処方は、物理的状態、安定性、インビボ放出の速度および投与される薬物のインビボクリアランスの速度に影響され得る。投与経路に依存して、適当な用量は体重、体表面積または臓器サイズにしたがって計算され得る。適当な処置用量を決定するために必要な計算のさらなる改善が、日常的に、過度の実験なしに、とりわけ本明細書に記載されている投与情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒト臨床試験において観察される薬物動態学データに照らして当業者により行われる。典型的な投与スケジュールは、１日に５回、１日に４回、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、１月に２回、１月に１回の投与ならびにそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。

適当な用量は、凝固レベルを決定するための確立されたアッセイを関連の用量応答データと共に使用することにより確認され得る。最終投与レジメンは、主治医が薬物の作用を修飾する因子、例えば、薬物の比活性、損傷の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、あらゆる感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床学的因子を考慮することにより決定され得る。

組成物は、また、微生物増殖を防止または阻止するための抗菌剤を含み得る。本発明に適当な抗菌剤の非限定的な例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサールおよびそれらの組合せを含む。

同様に、抗酸化剤は組成物において存在し得る。抗酸化剤は酸化を防止するために使用され得、それにより製造物の悪化を防止する。本発明において使用するための適当な抗酸化剤は、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、二亜硫酸ナトリウムおよびそれらの組合せを含む。

界面活性剤は賦形剤において存在し得る。典型的な界面活性剤は：ポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）およびプルロニック、例えば、Ｆ６８およびＦ８８（これら両方はBASF, Mount Olive, N.J.から入手できる）；ソルビタンエステル；脂質、例えば、リン脂質、例えば、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸および脂肪酸エステル；ステロイド、例えば、コレステロール；ならびにキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、亜鉛および他のこのような適当なカチオンを含む。

酸または塩基は組成物において賦形剤として存在し得る。使用され得る酸の非限定的な例は、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸およびそれらの組合せを含む。適当な塩基の例は、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

組成物におけるあらゆる個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性および組成物の特定の必要性に依存して変化し得る。一般的に、あらゆる個々の賦形剤の最適量は、日常の実験から、すなわち、種々の量の賦形剤（低いものから高いもの）を含む組成物を製造し、安定性および他のパラメーターを試験し、そして有意な有害な効果を有さず所望の能力が達成される範囲を測定することにより決定され得る。一般的に、賦形剤は、約１％から約９９重量％、約５％から約９８重量％、約１５から約９５重量％の量の賦形剤、３０重量％未満の濃度で、組成物において存在し得る。これらの前記医薬賦形剤は他の賦形剤と共に“Remington: The Science & Practice of Pharmacy,” 19 ed., Williams & Williams, (1995); the “Physician’s Desk Reference,” 52 ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998);およびKibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000に記載されている。

典型的な使用
本明細書に記載されている組成物は、ＦＩＸの機能的欠陥またはＦＩＸの欠失、例えば、ＦＩＸのインビボ半減期の短縮、ＦＩＸの結合特性の変化、ＦＩＸの遺伝子異常およびＦＩＸの血漿濃度の減少と関連するあらゆる出血障害を処置するために使用され得る。ＦＩＸの遺伝子異常は、例えば、ＦＩＸをコードする核酸配列における塩基の欠失、付加および／または置換を含む。１つの態様において、出血障害は血友病Ｂであり得る。このような出血障害の症状は、例えば、重度の鼻出血、経口粘膜出血、関節血症、血腫、持続性血尿、消化器出血、後腹膜出血、舌／咽頭後出血、頭蓋内出血および外傷関連出血を含む。

本発明の組成物は予防適用のために使用され得る。いくつかの態様において、修飾されたＦＩＸポリペプチドは、対象自身の凝固性能力を増強するために、該疾患状態または損傷を起こしやすい、または他の点では、それらの危険性がある対象に投与され得る。このような量は“予防有効量”と定義され得る。予防のための修飾されたＦＩＸポリペプチドの投与は、血友病Ｂに罹患している患者がまさに手術を受ける状況を含み、ポリペプチドが手術の１から４時間前に投与される。加えて、ポリペプチドは、所望により血友病に罹患していない患者における制御されていない出血に対する予防としての使用に適用である。したがって、例えば、ポリペプチドは手術前に制御されていない出血の危険性がある患者に投与され得る。

本明細書に記載されているポリペプチド、原料、組成物および方法は本発明の代表的な例であることを意図し、本発明の範囲が実施例の範囲に限定されないと理解する。本発明が記載されているポリペプチド、原料、組成物および方法を変化させて実施され得ることが当業者は理解でき、このような変化させたものは本発明の範囲内と見なされる。

以下の実施例は本明細書に記載されている本発明を説明するために存在するが、多少なりとも本発明の範囲を限定するために解釈してはならない。

実施例
本発明をより理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明の目的のみであり、どのような形であれ本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に記載されているすべての文献は出典明示によりそれら全体を包含させる。

実施例１：コンピュータ分析
溶媒の接近可能性、既知の二次構造、既知の血友病Ｂ変異の位置、ＦＶＩＩＩおよびＦＸ両方との相互作用の予測される部位への近接、ならびにＦＩＸタンパク質安定性における与えられる変異の予測される効果に関するＦＩＸ配列のコンピュータ分析を、新しいＮ−グリコシル化部位コンセンサス配列の付加のための可能性のある部位を同定するために実施した。

この分析に基づいて、５つの部位が新しいＮ結合型グリコシル化部位の創造に関して触媒ドメイン内で同定された。選択された部位および設計された変化したアミノ酸配列は、表２に示されている。
表２

実施例２：活性化ペプチドの配列アラインメント
活性化ペプチドにおける保存された、および保存されていない残基は、図１において示されているとおり多数の種の配列アラインメントにより同定された。

Ｎ結合型グリコシル化部位のコンセンサス配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、また、アスパラギン酸は恐らく望ましくない）である。ＦＩＸの活性化ペプチドにおいて新しいＮ結合型グリコシル化部位を設計するために、これらはＦＩＸの薬物動態学のために重要であるため、これらの翻訳後修飾を崩壊させないように、種間で保存されている活性化ペプチド内のアミノ酸ならびに他のＮ結合型部位に関するコンセンサス配列およびチロシン硫酸化に関するコンセンサス配列は避けた。これらの基準を使用して、活性化ペプチド内に新しいＮ結合型グリコシル化部位を加えるための３つの部位が表３において示されるとおりに同定された。
表３

実施例３：Ｎ結合型グリコシル化部位を生産するためのアミノ酸の挿入
多数の配列アラインメント（図１）は、また、ヒト、アカゲザル、ブタ、イヌおよびウサギのＦＩＸと比較して、マウス、ラットおよびテンジクネズミは残基Ａ１６１からＥ１６２にさらなるアミノ酸を有することを示した。これらのさらなるアミノ酸は３つの種間で７から１０のサイズで変化し、ほとんどＡｓｐおよびある程度Ｉｌｅ残基を含む。この観察は、７から１０のさらなる残基がＦＩＸ活性において有意な効果なしにラット、マウスおよびテンジクネズミにおいてこの部位で許容されていることを証明する。８つの種由来のＦＩＸ間の多数の配列アラインメントを成し遂げるために使用される基準に依存して、ラット、マウスおよびテンジクネズミにおけるさらなるアミノ酸が見られる見かけの部位は、部位がヒトＦＩＸのＥ１６０からＡ１６１間、Ａ１６１からＥ１６２間、Ｅ１６２からＴ１６３間またはＴ１６３からＩ１６４間のいずれかで変化させることができる。

配列Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｑ−Ｄ−Ｎ−Ｉ−Ｔ−Ｑ（配列番号：２）を有する９つの特別なアミノ酸を、活性化ペプチドにおけるＡ１６１からＥ１６２間に挿入した。配列“Ｎ−Ｓ−Ｔ”および“Ｎ−Ｉ−Ｔ”は、天然ＦＩＸ活性化ペプチド由来のＮ結合型コンセンサス配列である。両方の場合において、これらは、天然ＦＩＸ配列における、続いてグルタミン（Ｑ）があり、先行してアスパラギン酸（Ｄ）である。したがって、グルタミンならびにアスパラギン酸は天然部位を真似る試みで包含させた。Ｎ−グリコシル化部位に関する１から３のコンセンサス配列を含むさらなる配列（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）も、Ａ１６１からＥ１６２間に挿入され得ることも想定される。

修飾されたＦＩＸポリペプチドのさらなる実施例は、表４ａ、４ｂおよび４ｃにおいて記載されている。
表４ａ

比活性は、細胞培養上清中で測定された活性を同じ上清中のＦＩＸ抗原濃度で割ることにより計算され、新しいグリコシル化部位を欠いている対照ＦＩＸ分子のパーセントとして表されている。ＮＴ：試験していない。

表４ｂ

表４ｃ

野生型対照と比較して発現および活性は、１から５（１＝＜１０％；２＝１０−５０％；３＝５０−１００％；４＝１００−２００％；５＝＞２００％）の尺度（スケール）で表される。

実施例４：Ｏ結合型をＮ結合型グリコシル化部位へ変換するための置換
表５はＯ結合型グリコシル化部位をＮ結合型グリコシル化部位へ変換するために設計された置換を示す。
表５

実施例５：ＨＫＢ１１細胞におけるＦＩＸ変異体の発現
変化したタンパク質配列を有するＦＩＸ遺伝子が哺乳動物細胞から発現され、分泌されるか否かを決定し、そしてＦＩＸ凝固活性におけるこれらの置換の効果を決定するために、これらのＦＩＸ変異体をコードする発現プラスミドをＨＫＢ１１細胞にトランスフェクトした。ＨＫＢ１１はＨＥＫ２９３細胞およびＢ細胞リンパ腫の融合により生産されたヒト細胞株である。この実施例において、それぞれのグリコシル化部位の置換を、図３におけるＨＧ１からＨＧ８において見られるとおり第２の置換Ｒ３３８Ａと組み合わせた。Ｒ３３８Ａ置換は、ａＰＴＴアッセイにより測定されるとおりＦＩＸの比活性を３から４倍に増加させる。２つのグリコシル化部位変異タンパク質およびＲ３３８Ａのさらなる組合せも創造し、試験した（図３）。

トランスフェクション３日後、細胞培地を回収し、ＦＩＸに特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによりＦＩＸ発現に関して分析した。結果は、試験されたＦＩＸ変異タンパク質が野生型ＦＩＸまたはＲ３３８Ａ置換のみを有するＦＩＸと同様のレベルで発現し、培地に分泌されたことを証明した（図２）。

ＦＩＸ変異タンパク質の活性もａＰＰＴアッセイを使用して試験した。結果は、第ＩＸ因子変異タンパク質が野生型ＦＩＸと比較して同様の、または増加した活性を有することを証明した（図３および４）。Ｒ３３８Ａと比較して、変異タンパク質の活性は１４％から１０９％の間で変化した。特に、変異タンパク質ＨＧ１、ＨＧ３、ＨＧ４、ＨＧ５、ＨＧ６、ＨＧ７、ＨＧ８およびＨＧ３プラスＨＧ８は、Ｒ３３８Ａの少なくとも５５％および野生型ＦＩＸの少なくとも３００％である凝固活性を有した。

実施例６：ＨＫＢ１１細胞における第ＩＸ因子変異体のグリコシル化
変異タンパク質ＨＧ１からＨＧ８（図３）およびＨＧ９（図５）の初期分析は、ＨＧ２、ＨＧ３、ＨＧ５、ＨＧ６、ＨＧ８およびＨＧ９がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける見かけの分子量の増加により証明されるとおりグリコシル化が増加したことを証明した。ＨＧ２、ＨＧ３、ＨＧ５、ＨＧ６およびＨＧ８に存在する置換の種々の組合せを含むさらなるＦＩＸポリペプチドを生産した。例えば、以下の組合せを生産した：ＨＧ２／ＨＧ３、ＨＧ８／ＨＧ２、ＨＧ８／ＨＧ３、ＨＧ８／ＨＧ２／ＨＧ３。他の可能な組合せは、例えば、ＨＧ３／ＨＧ５、ＨＧ５／ＨＧ８、ＨＧ３／ＨＧ５／ＨＧ８、ＨＧ３／ＨＧ６、ＨＧ５／ＨＧ６、ＨＧ８／ＨＧ６、ＨＧ３／ＨＧ５／ＨＧ６、ＨＧ３／ＨＧ６／ＨＧ８、ＨＧ５／ＨＧ６／ＨＧ８およびＨＧ３／ＨＧ５／ＨＧ６／ＨＧ８を含む。ＨＧ９との組合せもまた生産され得る。

グリコシル化はタンパク質の分子量を増加させ、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける移動度の減少として視覚化することができる。図２および３において証明されるとおり、ＨＧ２、ＨＧ３、ＨＧ５、ＨＧ６、ＨＧ８およびＨＧ９における置換は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動度の減少を起こした。これらの８つの単一変異タンパク質中、Ａ１６１およびＥ１６２間に挿入された２つのさらなるＮ結合型コンセンサス配列を有するＨＧ８は、両方のＮ結合型部位が機能性であることを提案する見かけの分子量における最も大きな増加を示した。Ｏ結合型部位がＮ結合型部位に変異した４つの変異タンパク質（ＨＧ４からＨＧ７）の中で、ＨＧ４は、この置換がＯ結合型部位を破壊し（したがってＦＩＸタンパク質の分子量を減少させる）、機能性Ｎ結合型部位を創造することに失敗したことを証明するゲルにおける移動度の増加を示した。対照的に、ＨＧ５およびＨＧ６は、これらのクローンにおける置換が機能性Ｎ結合型グリコシル化部位を創造したことを証明するゲルにおける移動度の減少を示した。また、Ｏ結合型部位がＮ結合型部位に変異した変異タンパク質ＨＧ７は、野生型ＦＩＸまたはＦＩＸ−Ｒ３３８Ａと比較してゲルにおける移動度の変化がなかったことを示した。ＨＧ７における置換はＯ結合型部位が除去され、ゲルにおける移動度の増加を期待される事実を考えると、移動度の変化がない発見は、導入されたＮ結合型部位が機能性であり得ることを提案する。

ＨＧ２／ＨＧ３、ＨＧ８／ＨＧ２、ＨＧ８／ＨＧ３およびＨＧ８／ＨＧ２／ＨＧ３に存在する置換の組合せは、個々の変異タンパク質と比較して移動度においてより顕著な減少を起こし、単一ＦＩＸ分子で組み合わさっているとき、これらの組合せにおいて存在する種々の新しいグリコシル化部位が機能性であることを示した。全４つの新しいＮ結合型部位を含むＨＧ８／ＨＧ２／ＨＧ３変異タンパク質は、移動度において最大の減少を示した。

実施例７：Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換の組合せ
ＦＩＸのアミノ酸Ｖ８６は、野生型ＦＩＸ（ＷＴ−ＦＩＸ）またはＦＩＸ−Ｒ３３８Ａのいずれかの文脈の中では部位特異的突然変異によりアラニンに変化していた。これらの構築物を含む発現ベクターをＨＫＢ１１細胞にトランスフェクトし、培地を３日後に回収し、ＥＬＩＳＡによりＦＩＸタンパク質レベルおよびａＰＴＴアッセイによりＦＩＸ凝固活性をアッセイした。両方の変異タンパク質は、ＷＴ−ＦＩＸおよびＦＩＸ−Ｒ３３８Ａと同様のレベルで発現した。単一実験のデータは表６ａに要約している。表６ｂは３つの実験の平均を要約している。
表６ａ

表６ｂ

結果は、Ｖ８６Ａ置換のみで比活性において約１．８倍の増加をもたらすが、Ｒ３３８Ａのみでは比活性において４．５倍の増加をもたらすことを証明する。Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａの組合せは、野生型ＦＩＸと比較して比活性において８．１倍の増加をもたらした。これらの結果は、Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａ置換の陽性効果が相加され、ＷＴ−ＦＩＸと比較して比活性において８倍の増加を有する第ＩＸ因子変異タンパク質をもたらすことを示す。Ｒ３３８Ａ−Ｖ８６Ａ変異タンパク質は、８倍低い用量のタンパク質で現在利用できる組換えＷＴ−ＩＸと同じ治療効果を達成することが可能であるため、血友病Ｂ患者に対して改善された治療的有用性を与える。加えて、活性における減少がグリコシル化に由来し得るグリコシル化形態のＦＩＸを創造するとき、Ｒ３３８Ａ−Ｖ８６Ａの比活性の増加は有益である。

実施例８：ヒトＦＩＸｃＤＮＡのクローニング
ヒトＦＩＸｃＤＮＡのコード領域の５’および３’末端の配列に相補的なＰＣＲプライマー対を、公開されたｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿０００１３３）から設計した。５’プライマー（ＦＩＸＦ１；

（配列番号：８）、ＦＩＸの開始コドンは太字である）は、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（下線）の次にＡＴＧ開始コドンを含むＦＩＸコード領域の最初の１８のヌクレオチドおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含んだ。３’プライマー（ＦＩＸＲ３、ＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧ）（配列番号：９）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の次のＦＩＸコード領域の末端の４５ヌクレオチド３’側に位置するＦＩＸ配列の２２のヌクレオチドを含んだ。これらのプライマーおよび高い忠実性の校正ポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用する正常ヒト肝臓（Stratagene, San Diego CA）からの第１の鎖のｃＤＮＡの増幅は、ヒトＦＩＸｃＤＮＡに対して予期されるサイズ（１４６４ｂｐ）の単一のバンドをもたらした。ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、次にプラスミドｐＡＧＥ１６のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。ＦＩＸｃＤＮＡがベクターにおけるＣＭＶプロモーターに対してフォワード方向に挿入されたクローンを制限酵素消化により同定した。二本鎖ＤＮＡシーケンシングをいくつかのクローンの挿入物に対して実施し、公開されたＦＩＸ配列への得られた配列のアラインメントはｃＤＮＡが成熟タンパク質のアミノ酸１４８にスレオニンを有するヒトＦＩＸをコードすることを証明した。このプラスミドをｐＡＧＥ１６−第ＩＸ因子（ｐＡＧＥ１６−ＦＩＸ）と表した。

実施例９：修飾されたＦＩＸポリペプチドの生産
ヒトＦＩＸ配列内の種々のアミノ酸を変化させるために、一対のプライマーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから利用できるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ^ＴＭプライマー設計プログラムを使用して設計した。これらのプライマーは、製造業者の指示にしたがってＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ^ＴＭＩＩＸＬ部位特異的突然変異キット（Stratagene, San Diego, CA)を使用して、ｐＡＧＥ１６−ＦＩＸプラスミドにおける変異を構築するために使用した。所望の置換を含むクローンは、全体のＦＩＸコード領域のＤＮＡシーケンシングにより同定した。以下の表７は置換を構築するために使用したセンス鎖オリゴヌクレオチドの配列を示す。
表７

下線の残基は、Ｎ結合型グリコシル化に関するコンセンサス配列を創造するために、野生型ＦＩＸと比較して、変化した残基である。

上記置換に加えて、Ｎ−グリコシル化に関する２つのコンセンサス配列を含む９つのアミノ酸配列を活性化ペプチド残基Ａ１６１からＥ１６２間に挿入した。このＦＩＸの変異体を生産するために、Ｙ１５５およびＩ１６４にＳｎａＢ１およびＸｂａＩに関する唯一の制限部位を、プライマーｔ８２１６ｃ＿ｇ８２１８ａおよびｔ８１８８ｃ（表８）で部位特異的突然変異によるアミノ酸配列の変化なしに生産した。得られたプラスミドをＳｎａＢ１およびＸｂａＩで消化し、残基Ｖ１５６からＩ１６４に対応する２７ｂｐのフラグメントを除去し、次にオリゴヌクレオチド２プライマーＦおよび２プライマーＲ（表８）のアニーリングにより生産された二本鎖フラグメントに結合させた。得られたプラスミドの配列が、Ｎ結合型グリコシル化に関する２つのコンセンサス配列（ＮＸＴ）を含む配列ＮＳＴＱＤＮＩＴＱ（配列番号：２）を有する９つのアミノ酸をコードする２７ｂｐの挿入を有することを、二本鎖ＤＮＡシーケンシングにより決定した。
表８

太字／下線残基は、新しい制限部位またはＮ−リンカーグリコシル化に関する２つのコンセンサス配列をコードする９つのさらなるアミノ酸の挿入のいずれかを創造するために、野生型第ＩＸ因子と比較して変化したものである。

実施例１０：細胞培養および一過性トランスフェクション
ＨＫＢ１１細胞（ＨＥＫ２９３およびＢｕｒｋｉｔｔＢ細胞リンパ腫系のハイブリッド、２Ｂ８）を、ＣＯ_２（５％）インキュベーター中で３７℃で１０ｎｇ／ｍＬの水溶性ビタミンＫ_３（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を補った無血清培地（ＲＦ＃２７７）中で、オービタルシェーカー（１００−１２５ｒｐｍ）上で懸濁液培地を培養し、０．２５から１．５×１０^６細胞／ｍＬ密度で維持した。

トランスフェクションのための細胞を１０００ｒｐｍで５分遠心分離により回収し、次にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３発現培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で１．１×１０^６細胞／ｍＬで懸濁した。細胞を６ウェルプレート（４．６ｍＬ／ウェル）に播種し、３７℃のＣＯ_２インキュベーター中でオービタルローター（１２５ｒｐｍ）上でインキュベートした。それぞれのウェルにおいて、５μｇのプラスミドＤＮＡを０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen）と混合した。それぞれのウェルにおいて、７μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地と穏やかに混合し、室温で５分インキュベートした。希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎ^ＴＭを希釈したＤＮＡ溶液に加え、穏やかに混合し、室温で２０−３０分インキュベートし、次に５×１０^６（４．６ｍＬ）のＨＫＢ１１細胞で播種されたそれぞれのウェルに加えた。次に細胞をＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で３日間オービタルローター（１２５ｒｐｍ）上でインキュベートし、その後に細胞を１０００ｒｐｍで５分遠心分離によりペレット状にし、上清を回収し４℃で保存した。

場合によっては、ＨＥＫ２９３細胞に標準リポフェクションプロトコールおよび市販の試薬を使用して、３８４ウェルプレート中でＦＩＸ変異体のための発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をさらなる分析のために上清を回収できる７２時間培養した。

実施例１１：ＦＩＸのウエスタンブロット
細胞培養上清（５０μＬ）を２０μＬの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング色素と混合し、９５℃で５分加熱し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％ＳＤＳＰＡＧＥゲルに付し、次にニトロセルロース膜に移した。５％ミルク粉末で３０分ブロッキング後、膜をヒトＦＩＸに対するＨＲＰ−標識ヤギポリクローナル抗体（US Biological, Swampscott, Massachusetts, Catalog No. F0017-07B）と６０分室温でインキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０バッファーを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄後、ＨＲＰ由来のシグナルをＳｕｐｅｒシグナル（登録商標）Ｐｉｃｏ（Pierce, Rockford, IL）およびｘ線フィルムへの暴露を使用して検出した。

実施例１２：ＦＩＸＥＬＩＳＡ
細胞培養上清におけるＦＩＸ抗原レベルは、ＦＩＸＥＬＩＳＡキット（Hyphen Biomed/Aniara, Mason, OH）を使用して測定した。細胞培養上清をサンプル希釈剤バッファー（キットにて提供される）で希釈し、標準曲線の範囲内でシグナルを達成させる。サンプル希釈剤で希釈されたヒト血漿（Hyphen Biomed/Aniara, Catalog No. RK032A、比活性１９６Ｕ／ｍｇ）から精製されたＦＩＸタンパク質を、１００ｎｇ／ｍＬから０．２ｎｇ／ｍＬの標準曲線を作成するために使用した。希釈されたサンプルおよび標準を、ポリクローナル抗−ＦＩＸ捕捉抗体であらかじめ被覆されているＥＬＩＳＡプレートに加えた。ポリクローナル検出抗体を加えた後、プレートを室温で１時間インキュベートし、大規模に洗浄し、次にキット製造業者により記載されているとおりＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用して現像し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）プレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して４５０ｎＭでシグナルを測定した。標準曲線を２成分プロットに合わせ、未知の値を曲線から推定した。

ＦＩＸ発現レベルも市販されているＦＩＸＥＬＩＳＡ試薬（Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen, Germany）を製造業者の指示にしたがって使用して定量した。小麦胚芽凝集素（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）で３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭプレート（Nunc^TM, Rochester, NY）上を被覆した。ウェルをブロックし、洗浄し、次に上清を加えた。さらなる洗浄後、検出をＨＲＰ−結合ポリクローナル抗ＦＩＸ抗体（Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen, Germany）を使用して行った。

実施例１３：ＦＩＸ凝固アッセイ
ＦＩＸ凝固活性は、Ｅｌｅｃｔｒａ^ＴＭ１８００Ｃ自動凝固分析器（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を使用して、ＦＩＸ欠損ヒト血漿におけるａＰＴＴアッセイを使用して測定した。簡潔には、凝固希釈剤における上清サンプルの３つの希釈物を装置により製造し、次に１００μＬを１００μＬのＦＩＸ欠損血漿（Aniara, Mason, OH）および１００μＬの自動ａＰＴＴ試薬（ウサギ脳リン脂質および微粉化シリカ（bioMerieux, Inc., Durham, NC）と混合した。１００μＬの２５ｍＭのＣａＣｌ_２溶液の添加後、血塊形成のための時間を記録した。標準曲線を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて標準として使用される同じ精製されたヒトＦＩＸ（Hyphen Biomed/Aniara）の連続希釈物を使用してそれぞれのに対して作成した。標準曲線は、日常的に０．９５またはそれより良い相関係数を有する直線であり、未知のサンプルのＦＩＸ活性を測定するために使用された。

実施例１４：循環ＦＩＸの測定
ＦＩＸポリペプチドの循環半減期はインビトロアッセイを使用して測定される。このアッセイは、肝細胞におけるアデノウイルス（Ａｄ）の蓄積を介在するインビボおよびインビトロでのＦＩＸの能力に基づく。簡潔には、ＦＩＸはＡｄ線維ノブドメインに結合し、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を介してウイルス摂取への橋渡しを提供することができることが示されている（Shayakhmetov, et al., J. Virol 79:7478-7491, 2005）。線維ノブドメインにおいて変異を含むアデノウイルスベクター変異体のＡｄ５ｍｕｔは、ＦＩＸに結合しない。Ａｄ５ｍｕｔはインビボでの肝細胞に感染する能力および肝臓毒性を有意に減少させ、ＦＩＸが肝細胞へのＡｄベクターの標的化において主な役割を果たすことを示す（Shayakhmetov, et al., 2005）。肝細胞へＡｄベクターを標的化するＦＩＸの能力は、タンパク質−ＨＳＰＧ相互作用の阻害剤によりブロックすることができる（Shayakhmetov, et al., 2005）。

さらに、ＦＩＸのＨＳＰＧ介在摂取はＦＩＸクリアランスに非常に寄与し、結果として、ＨＳＰＧ相互作用との干渉がＦＩＸの半減期を増加させると期待される。したがって、肝細胞におけるＦＩＸおよび／またはＦＩＸ変異体のインビトロ摂取を測定し、摂取が減少した変異体は、インビボ半減期の増加を有することが期待される。

ＦＩＸのインビトロ半減期を測定するために、哺乳動物細胞をＦＩＸまたはＦＩＸ変異体の存在または非存在下でアデノウイルスとインキュベートする。ウイルス摂取は、野生型ＦＩＸにより介在され、ウイルスゲノムにコードされるレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ発現の発現により測定される。ＦＩＸ変異体の存在下でのアデノウイルスの摂取の減少は、野生型ＦＩＸと比較して、レポーター遺伝子発現の減少、例えば、ＧＦＰ蛍光の減少またはルシフェラーゼ酵素活性の減少として測定される。

ＦＩＸ循環半減期は当業者によく知られている標準技術を使用してインビボで測定される。簡潔には、ＦＩＸまたはＦＩＸ変異体のそれぞれの投与は静脈内注射により対象に投与される。血液サンプルは注射後の多くの時点で得られ、ＦＩＸ濃度は適当なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により検出される。半減期、すなわち投与直後にＦＩＸの濃度がＦＩＸの濃度の半分になる時間を測定するために、種々の時点でのＦＩＸ濃度をＦＩＸの投与直後に予期される、または測定されるＦＩＸ濃度と比較する。インビトロアッセイにおける細胞取り込みの減少とインビボアッセイにおける半減期の増加の相関関係が予期される。

本明細書に挙げられている全ての文献および特許は出典明示により本明細書に包含される。本発明の記載されている方法の種々の修飾または変化が本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。

本発明が特定の態様と関連して記載されているが、本発明このような特定の態様に不都合に限定されるべきでないと理解されるべきである。実際に、生化学または関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための上記様式の種々の修飾は、特許請求の範囲内であることを意図する。当業者は、ほんの日常の実験を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の態様の多数の均等を認識するか、または確かめることができる。このような均等は特許請求の範囲により包含されることを意図する。

Claims

１つ以上のアミノ酸置換または挿入を導入することにより修飾されているアミノ酸配列を含む、第ＩＸ因子ポリペプチド。
アミノ酸配列が１つ以上のグリコシル化部位を導入することにより修飾されている、請求項１に記載のポリペプチド。
１つ以上のグリコシル化部位がＮ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
１つ以上の導入されたグリコシル化部位に結合した炭水化物鎖をさらに含む、請求項２または３に記載のポリペプチド。
１つ以上のアミノ酸置換が以下のものから選択される、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド：Ｇ４Ｔ；Ｅ３３Ｎ；Ｅ３６Ｔ；Ｅ３６Ｎ；Ｒ３７Ｎ；Ｆ７５Ｎ；Ｆ７７Ｔ；Ｅ８３Ｔ；Ｄ８５Ｎ；Ｖ８６Ａ；Ｋ９１Ｔ；Ａ１０３Ｔ；Ｖ１０７Ｔ；Ｋ１２２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ｔ１４８Ｎ；Ｆ１５０Ｔ；Ｐ１５１Ｎ；Ｔ１５９Ｎ；Ａ１６１Ｔ；Ａ１６１Ｎ；Ｔ１６９Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｄ１７７Ｅ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２０１Ｔ；Ｋ２１４Ｔ；Ｖ２２３Ｎ；Ｇ２２６Ｎ；Ｙ２２６Ｔ；Ｋ２２８Ｎ；Ｋ２２８Ｔ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｒ３３８Ａ；Ｒ３３８Ｎ；Ｋ３４１Ｎ；Ｆ３５３Ｎ；Ｈ３５４Ｖ；Ｈ３５４Ｉ；Ｅ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ；Ｔ３７１Ｖ；Ｔ３７１Ｉ；Ｅ３７２Ｔ；Ｅ３７４Ｎ；Ｍ３９１Ｎ；Ｋ３９２Ｖ；Ｇ３９３Ｔ；Ｅ４１０Ｎ；Ｋ４１３Ｎ；Ｌ４１４Ｉ；Ｙ１ＮおよびＳ３Ｔ；Ｓ３ＮおよびＫ５Ｔ；Ｇ４ＮおよびＬ６Ｔ；Ｋ５ＮおよびＥ７Ｔ；Ｌ６ＮおよびＥ８Ｔ；Ｅ７ＮおよびＦ９Ｔ；Ｆ９ＮおよびＱ１１Ｔ；Ｖ１０ＮおよびＧ１２Ｔ；Ｑ１１ＮおよびＮ１３Ｔ；Ｇ１２ＮおよびＬ１４Ｔ；Ｎ１３およびＥ１５Ｔ；Ｌ１４ＮおよびＲ１６Ｔ；Ｅ１５ＮおよびＥ１７Ｔ；Ｍ１９ＮおよびＥ２１Ｔ；Ｅ２０ＮおよびＫ２２Ｔ；Ｓ２４ＮおよびＥ２６Ｔ；Ｆ２５ＮおよびＥ２７Ｔ；Ｅ２６ＮおよびＡ２８Ｔ；Ｅ２７ＮおよびＲ２９Ｔ；Ａ２８ＮおよびＥ３０Ｔ；Ｒ２９ＮおよびＶ３１Ｔ；Ｅ３０ＮおよびＦ３２Ｔ；Ｖ３１ＮおよびＥ３３Ｔ；Ｆ３２ＮおよびＮ３４Ｔ；Ｔ３５ＮおよびＲ３７Ｔ；Ｔ３８ＮおよびＥ４０Ｔ；Ｔ３９ＮおよびＦ４１Ｔ；Ｅ４０ＮおよびＷ４２Ｔ；Ｆ４１ＮおよびＫ４３Ｔ；Ｗ４２ＮおよびＱ４４Ｔ；Ｋ４３ＮおよびＹ４５Ｔ；Ｑ４４ＮおよびＶ４６Ｔ；Ｙ４５ＮおよびＤ４７Ｔ；Ｖ４６ＮおよびＧ４８Ｔ；Ｅ５２ＮおよびＮ５４Ｔ；Ｓ５３ＮおよびＰ５５Ｔ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｉ６６ＮおよびＳ６８Ｔ；Ｓ６８ＮおよびＥ７０Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｅ７８ＮおよびＫ８０Ｔ；Ｅ８３ＮおよびＤ８５Ｔ；Ｌ８４ＮおよびＶ８６Ｔ；Ｉ９０ＮおよびＮ９２Ｔ；Ｋ１００ＮおよびＳ１０２Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｋ１０６ＮおよびＶ１０８Ｔ；Ｒ１１６ＮおよびＡ１１８Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ａ１２７ＮおよびＰ１２９Ｔ；Ｖ１３５ＮおよびＶ１３７Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｖ１３７ＮおよびＱ１３９Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｓ１４１ＮおよびＬ１４３Ｔ；Ｅ１４７ＮおよびＶ１４９Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｙ１５５ＮおよびＮ１５７Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｔ１５９ＮおよびＡ１６１Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｌ１６５ＮおよびＮ１６７Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｔ１６９ＮおよびＳ１７１Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｇ１８４ＮおよびＤ１８６Ｔ；Ｅ１８５ＮおよびＡ１８７Ｔ；Ｄ１８６ＮおよびＫ１８８Ｔ；Ａ１８７ＮおよびＰ１８９Ｔ；Ｐ１８９ＮおよびＱ１９１Ｔ；Ｇ２００ＮおよびＶ２０２Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｖ２２７ＮおよびＩ２２９Ｔ；Ｈ２３６ＮおよびＩ２３８Ｔ；Ｉ２３８ＮおよびＥ２４０Ｔ；Ｅ２４０ＮおよびＥ２４２Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｈ２４３ＮおよびＥ２４５Ｔ；Ｋ２４７ＮおよびＮ２４９Ｔ；Ｖ２５０ＮおよびＲ２５２Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６１ＮおよびＩ２６３Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｄ２７６ＮおよびＰ２７８Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｆ３０２ＮおよびＳ３０４Ｔ；Ｓ３０４ＮおよびＹ３０６Ｔ；Ｒ３１２ＮおよびＦ３１４Ｔ；Ｖ３１３ＮおよびＨ３１５Ｔ；Ｆ３１４ＮおよびＫ３１６Ｔ；Ｈ３１５ＮおよびＧ３１７Ｔ；Ｋ３１６ＮおよびＲ３１８Ｔ；Ｇ３１７ＮおよびＳ３１９Ｔ；Ｓ３１９ＮおよびＬ３２１Ｔ；Ａ３２０ＮおよびＶ３２２Ｔ；Ｒ３２７ＮおよびＰ３２９Ｔ；Ｐ３２９ＮおよびＶ３３１Ｔ；Ｄ３３２ＮおよびＡ３３４Ｔ；Ｌ３３７ＮおよびＳ３３９Ｔ；Ｓ３３９ＮおよびＫ３４１Ｔ；Ｔ３４０ＮおよびＦ３４２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；Ｇ３５２ＮおよびＨ３５４Ｔ；Ｆ３５３ＮおよびＥ３５５Ｔ；Ｈ３５４ＮおよびＧ３５６Ｔ；Ｅ３５５ＮおよびＧ３５７Ｔ；Ｇ３５６ＮおよびＲ３５８Ｔ；Ｇ３５７ＮおよびＤ３５９Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｗ３８５ＮおよびＥ３８７Ｔ；Ｇ３８６ＮおよびＥ３８８Ｔ；Ａ３９０ＮおよびＫ３９２Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｅ１２５Ｎ、Ｐ１２６ＡおよびＡ１２７Ｔ；Ｐ１２６Ｎ、Ｖ１２８ＴおよびＰ１２９Ａ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０ＴおよびＰ１５１Ａ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＡ１６１Ｎ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎ；Ｖ１５３Ｎ、Ｙ１５５ＴおよびＥ２９４Ｎ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＶおよびＥ３５５Ｔ；Ｆ３５３Ｎ、Ｈ３５４ＩおよびＥ３５５Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＶおよびＥ３７２Ｔ；Ｖ３７０Ｎ、Ｔ３７１ＩおよびＥ３７２Ｔ；Ｍ３９１Ｎ、Ｋ３９２ＶおよびＧ３９３Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２ＮおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ１４８Ｎ、Ｆ１５０Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｄ１７７Ｅ、Ｆ１７８ＴおよびＲ３３８Ａ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；およびＰ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６Ｎ、Ｋ２２８ＴおよびＲ３３８Ａ；ならびにそれらの任意の組合せ。
１つ以上のアミノ酸置換が以下のものから選択される、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド：Ｒ３７Ｎ；Ｄ８５Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ａ１４６Ｎ；Ａ１６１Ｎ；Ｑ１７０Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｄ１７７Ｎ；Ｆ１７８Ｔ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２２８Ｎ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｅ３７４Ｎ；Ｅ４１０Ｎ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｋ６３ＮおよびＤ６５Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｖ１５３ＮおよびＹ１５５Ｔ；Ｄ１５４ＮおよびＶ１５６Ｔ；Ｖ１５６ＮおよびＳ１５８Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｅ１６０ＮおよびＥ１６２Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｉ１６４ＮおよびＤ１６６Ｔ；Ｄ１６６ＮおよびＩ１６８Ｔ；Ｉ１６８ＮおよびＱ１７０Ｔ；Ｓ１７１ＮおよびＱ１７３Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｓ１７４ＮおよびＮ１７６Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｖ２０２ＮおよびＡ２０４Ｔ；Ｅ２２４ＮおよびＧ２２６Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｔ２４１ＮおよびＨ２４３Ｔ；Ｉ２５１ＮおよびＩ２５３Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｔ３４３ＮおよびＹ３４５Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｐ１５１、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ。
１つ以上のアミノ酸置換が以下のものから選択される、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド：Ｄ８５Ｎ；Ｋ１２２Ｔ；Ｓ１３８Ｎ；Ｔ１７２Ｎ；Ｋ２０１Ｎ；Ｋ２２８Ｎ；Ｅ２３９Ｎ；Ｅ２４２Ｎ；Ｉ２５１Ｔ；Ａ２６２Ｔ；Ｅ２９４Ｎ；Ｇ５９ＮおよびＳ６１Ｔ；Ｇ７６ＮおよびＥ７８Ｔ；Ｓ１０２ＮおよびＤ１０４Ｔ；Ａ１０３ＮおよびＮ１０５Ｔ；Ｄ１０４ＮおよびＫ１０６Ｔ；Ｅ１１９ＮおよびＱ１２１Ｔ；Ｑ１２１ＮおよびＳ１２３Ｔ；Ｓ１３６ＮおよびＳ１３８Ｔ；Ｑ１３９ＮおよびＳ１４１Ｔ；Ｔ１４０ＮおよびＫ１４２Ｔ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｖ１４９ＮおよびＰ１５１Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｄ１５２ＮおよびＤ１５４Ｔ；Ｓ１５８ＮおよびＥ１６０Ｔ；Ｅ１６２ＮおよびＩ１６４Ｔ；Ｔ１６３ＮおよびＬ１６５Ｔ；Ｔ１７２ＮおよびＳ１７４Ｔ；Ｑ１７３ＮおよびＦ１７５Ｔ；Ｋ２０１ＮおよびＤ２０３Ｔ；Ｔ２２５ＮおよびＶ２２７Ｔ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｉ２５３ＮおよびＰ２５５Ｔ；Ａ２６２ＮおよびＮ２６４Ｔ；Ｖ２８０ＮおよびＮ２８２Ｔ；Ｅ３７２ＮおよびＥ３７４Ｔ；およびＤ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｆ１５０Ｎ、Ｐ１５１ＡおよびＤ１５２Ｔ；Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＫ２２８Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＩ２５１Ｔ；Ｐ１５１、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｄ８５Ｎ、Ｋ１２２Ｔ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＥ２４２Ｎ；Ｄ８５Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｓ１３８Ｎ、Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３Ｔ、Ｔ１７２Ｎ、Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ。
以下のアミノ酸配列を含む第ＩＸ因子ポリペプチド：
ＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＸ_８５Ｘ_８６ＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＸ_１０４ＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＸ_１２１ＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＸ_１３８ＱＴＳＫＬＴＲＡＥＸ_１４８ＶＸ_１５０Ｘ_１５１Ｘ_１５２Ｘ_１５３ＤＹＶＮＳＸ_１５９ＥＺ_１Ｘ_１６１Ｚ_２ＥＺ_３ＴＺ_４ＩＬＤＮＩＸ_１６９ＱＳＸ_１７２ＱＸ_１７４ＦＮＸ_１７７Ｘ_１７８ＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＸ_２２６ＶＸ_２２８ＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＸ_３３８ＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＸ_３５３Ｘ_３５４Ｘ_３５５ＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＸ_３７０Ｘ_３７１Ｘ_３７２ＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＸ_３９１Ｘ_３９２Ｘ_３９３ＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＸ_４１３Ｘ_４１４Ｔ（配列番号：３）；
ここで、Ｘ_８５はＤおよびＥから選択され；
ここで、Ｘ_８６はＡ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＶから選択され；
ここで、Ｘ_１０４はＤ、ＮおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１２１はＮ、ＱおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１３８はＮ、ＳおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１４８およびＸ_１５０は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１４８はＴであり、そしてＸ_１５０はＦである；
（ｉｉ）Ｘ_１４８はＮであり、そしてＸ_１５０はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１４８はＮであり、そしてＸ_１５０はＳである；
ここで、Ｘ_１５１はＡ、ＰおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１５１およびＸ_１５３は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１５１はＰであり、そしてＸ_１５３はＶである；
（ｉｉ）Ｘ_１５１はＮであり、そしてＸ_１５３はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１５１はＮであり、そしてＸ_１５３はＳである；
ここで、Ｚ_１、Ｚ_２、Ｚ_３およびＺ_４は、独立して以下から選択され
（ｉ）０から１２のアミノ酸残基、および
（ｉｉ）配列番号：２；
ここで、Ｘ_１５２はＤ、ＮおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１５９およびＸ_１６１は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１５９はＴであり、そしてＸ_１６１はＡである；
（ｉｉ）Ｘ_１５９はＮであり、そしてＸ_１６１はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１５９はＮであり、そしてＸ_１６１はＳである；
ここで、Ｘ_１６９はＴおよびＮから選択され；
ここで、Ｘ_１７２はＴおよびＮから選択され；
ここで、Ｘ_１７４はＳおよびＴから選択され；
ここで、Ｘ_１７７およびＸ_１７８は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_１７７はＤであり、そしてＸ_１７８はＦである；
（ｉｉ）Ｘ_１７７はＥであり、そしてＸ_１７８はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_１７７はＥまたはＤであり、そしてＸ_１７８はＳである；
ここで、Ｘ_２２６およびＸ_２２８は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_２２６はＧであり、そしてＸ_２２８はＫである；
（ｉｉ）Ｘ_２２６はＮであり、そしてＸ_２２８はＴである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_２２６はＮであり、そしてＸ_２２８はＳである；
ここで、Ｘ_３３８はＲおよびＡから選択され；
ここで、Ｘ_３５３、Ｘ_３５４およびＸ_３５５は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３５３はＦであり、Ｘ_３５４はＨであり、Ｘ_３５５はＥである；
（ｉｉ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＶであり、Ｘ_３５５はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＩであり、Ｘ_３５５はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３５３はＮであり、Ｘ_３５４はＨ、ＶまたはＩであり、Ｘ_３５５はＳである；
ここで、Ｘ_３７０、Ｘ_３７１およびＸ_３７２は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３７０はＶであり、Ｘ_３７１はＴであり、Ｘ_３７２はＥである；
（ｉｉ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＶであり、Ｘ_３７２はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＩであり、Ｘ_３７２はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３７０はＮであり、Ｘ_３７１はＴ、ＶまたはＩであり、Ｘ_３７２はＳである；
ここで、Ｘ_３９１、Ｘ_３９２およびＸ_３９３は以下から選択され：
（ｉ）Ｘ_３９１はＭであり、Ｘ_３９２はＫであり、Ｘ_３９３はＧである；
（ｉｉ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ_３９２はＫであり、Ｘ_３９３はＴである；
（ｉｉｉ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ_３９２はＶであり、Ｘ_３９３はＴである；および
（ｉｖ）Ｘ_３９１はＮであり、Ｘ３９２はＶまたはＫであり、Ｘ３９３はＳである；
ここで、Ｘ_４１３およびＸ_４１４は以下から選択される：
（ｉ）Ｘ_４１３はＫであり、そしてＸ_４１４はＬである；
（ｉｉ）Ｘ_４１３はＮであり、そしてＸ_４１４はＬである；および
（ｉｉｉ）Ｘ_４１３はＮであり、そしてＸ_４１４はＩである；（そして
ここで、該ＦＩＸポリペプチドは、配列番号：１を有するＦＩＸポリペプチドと比較して、少なくとも１つの導入されたグリコシル化部位を含む）。
Ｒ３３８ＡおよびＶ８６Ａから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項６または７に記載のポリペプチド。
アミノ酸配列が、１から１０個のアミノ酸残基をヒト第ＩＸ因子のアミノ酸残基１６０−１６４間に導入することにより修飾されることにより、１つ以上のグリコシル化部位が導入されたものである、請求項１−９のいずれかに記載のポリペプチド。
アミノ酸残基が、アミノ酸残基１６０−１６１間、アミノ酸残基１６１−１６２間、アミノ酸残基１６２−１６３間またはアミノ酸残基１６３−１６４間に挿入されている、請求項１０に記載のポリペプチド。
配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドがアミノ酸残基１６０−１６１間、アミノ酸残基１６１−１６２間、アミノ酸残基１６２−１６３間またはアミノ酸残基１６３−１６４間に導入されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
以下のものから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド：Ｖ８６Ａ；Ｒ３３８Ａ；Ｖ８６ＡおよびＲ３３８Ａ；Ｔ１４８ＮおよびＦ１５０Ｔ；Ｄ１７７ＥおよびＦ１７８Ｔ；Ｐ１５１ＮおよびＶ１５３Ｔ；Ｐ１５１Ｎ、Ｖ１５３ＴおよびＴ１７２Ｎ；Ｇ２２６ＮおよびＫ２２８Ｔ。
アミノ酸配列が、１から１０個のアミノ酸残基を第ＩＸ因子ポリペプチドのＣ末端に導入することにより、１つ以上のグリコシル化部位の導入をもたらされるように修飾された、請求項１−７のいずれかに記載のポリペプチド。
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが第ＩＸ因子ポリペプチドのＣ末端に導入されている、請求項１４に記載のポリペプチド。
Ｒ３３８Ａ置換およびＶ８６Ａ置換を含む第ＩＸ因子ポリペプチド。
１つ以上の導入されたグリコシル化部位での炭水化物鎖の結合が、導入されたグリコシル化部位を欠いているポリペプチドと比較して、ポリペプチドの血清半減期を少なくとも３０％増加させる、請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチド。
ポリペプチドがポリペプチドのｍｇあたり少なくとも１００単位の比活性を有する、請求項１から１７のいずれかに記載のポリペプチド。
請求項１−１８のいずれかに記載の第ＩＸ因子ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬品。
治療有効量の請求項１９に記載の医薬品を必要とする対象に投与することを含む、血友病Ｂを処置する方法。
請求項１−１８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
宿主細胞が第ＩＸ因子ポリペプチドを発現することを可能とする様式における、請求項２０に記載のＤＮＡ配列をトランスフェクトされた真核生物宿主細胞。
（ｉ）１つ以上のグリコシル化部位を導入することによりポリペプチドのアミノ酸配列を修飾し；（ｉｉ）１つ以上のグリコシル化部位でグリコシル化することを可能とする様式においてポリペプチドを発現させ；そして（ｉｉｉ）該ポリペプチドを精製することを含む、第ＩＸ因子ポリペプチドを生産する方法。