CN105695616A - 诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用 - Google Patents

诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用，该标志物为MPP6基因，其在甲状腺癌患者组织中呈差异性表达，增加MPP6的表达可以促进甲状腺癌细胞的凋亡，采用基因标志物进行甲状腺癌的诊断和治疗，大大提高了疾病诊断的敏感性和特异性，同时为疾病的基因治疗提供新的分子靶点。

Description

诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用，具体地涉及MPP6作为诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用。
背景技术
甲状腺是人体内重要的内分泌器官，分泌控制心率、血压、体温和体重等与代谢相关的激素。甲状腺癌是由甲状腺滤泡细胞发展而成的一种常见的头颈部恶性内分泌系统肿瘤，约占全身恶性肿瘤发病总数的3％，占头颈部恶性肿瘤发病的首位，多发于青壮年，常见于45-54岁的人群中，45岁以上高发，女性多见，男女发病比例约1:3。近年来甲状腺癌的发病呈现上升的趋势，2012年，美国约有四万多名女性和一万多名男性确诊为甲状腺癌，甲状腺癌的发病率上升至恶性肿瘤发病率从的第5位；在中国，甲状腺癌发病亦呈现出逐年增加的趋势，且为近20年来中国癌症谱中女性恶性肿瘤上升速度最快的肿瘤。甲状腺癌在各地均具有较高的发病率，其已经成为最常见并且发病率快速上升的恶性肿瘤之一。
甲状腺癌的临床体征以结节坚硬不平整为主要表现，同时伴有颈部淋巴结肿大，患者常感颈部压迫症状，甲状腺癌早期临床症状不明显，病程进展缓慢，患者多无自觉症状，疾病晚期可出现多种症状，包括声音嘶哑、吞咽困难以及耳、颈、肩等处疼痛的表现。甲状腺癌按照组织类型分为甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌。其中，甲状腺乳头状癌是最常见的，如早期诊断，预后良好，五年生存率可达到97.8％。
甲状腺癌的诊断包括术前实验室检查，超声检查、CT检查、MRI检查、核素显像等影像学检查以及细针穿刺活检，术中活检，术后石蜡病理确诊等。
随着分子生物学的发展，对肿瘤发病机理的研究也取得了一定的进展。基因结构的差异、基因功能的改变以及基因产物的表达异常与肿瘤的发生和发展存在密切的联系。自1965年癌胚抗原应用于临床以来，肿瘤标志物在恶性肿瘤的辅助诊断、疗效监测及诊断预后等方面起到了重要作用，长久以来人们一直希望能够找到一种能够特异而显著的肿瘤标志物。肿瘤标志物能够提供肿瘤发展进程、细胞病理性增殖及分化类型，对肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗发挥指导作用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诊断甲状腺癌的分析标志物-MPP6基因。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了MPP6基因及其表达产物在制备诊断甲状腺癌的产品中的应用。
进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MPP6基因的表达水平以诊断甲状腺癌的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断甲状腺癌的产品至少包括一对特异扩增MPP6基因的引物；所述用实时定量PCR诊断甲状腺癌的产品至少包括一对特异扩增MPP6基因的引物；所述用免疫检测诊断甲状腺癌的产品包括：与MPP6蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断甲状腺癌的产品包括：与MPP6基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断甲状腺癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MPP6蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MPP6基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述基因芯片可用于检测包括MPP6基因在内的多个基因(例如，与甲状腺癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括MPP6蛋白在内的多个蛋白质(例如与甲状腺癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与甲状腺癌的标志物同时检测，可大大提高甲状腺癌诊断的准确率。
本发明提供了一种诊断甲状腺癌的产品，所述产品能够通过检测甲状腺组织中MPP6基因的表达水平来诊断甲状腺癌。
进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MPP6基因转录水平的针对MPP6基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MPP6蛋白的特异性抗体；所述基因检测试剂盒包括用于检测MPP6基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MPP6蛋白的特异性抗体。
进一步，所述基因检测试剂盒可用于检测包括MPP6基因在内的多个基因(例如，与甲状腺癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括MPP6蛋白在内的多个蛋白质(例如与甲状腺癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将甲状腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高甲状腺癌诊断的准确率。
本发明提供了MPP6基因及其表达产物在制备治疗甲状腺癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括增加MPP6基因表达、增强MPP6表达功能、和/或增强MPP6表达产物活性的试剂。
进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性MPP6蛋白的核酸的试剂、MPP6蛋白的激活剂、含有MPP6蛋白质的试剂。
其中，所述含有能编码功能性MPP6蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的MPP6蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性MPP6蛋白，任何一种MPP6基因的携带方式均可。所述的MPP6蛋白激活剂是指刺激MPP6蛋白活性、增加MPP6蛋白活性、促进MPP6蛋白活性、增强MPP6蛋白激活、使MPP6蛋白活性敏感化或上调MPP6蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、MPP6启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、MPP6蛋白的激动剂(如激活抗体)等。
进一步，上述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。
所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。
添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
本发明还提供了一种治疗甲状腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括增加MPP6基因表达、增强MPP6表达功能、和/或增强MPP6表达产物活性的试剂。
本发明的药物可以用于补充内源性的MPP6蛋白的缺失或不足，通过提高MPP6蛋白的表达，从而治疗因MPP6蛋白减少导致的甲状腺癌。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
进一步，本发明中MPP6蛋白或编码MPP6蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。
本发明的药物组合物可以被配制成任何的给药类型，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射、口服给药、直肠给药。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有MPP6基因的药物或者含有MPP6蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有MPP6基因的药物或者含有MPP6蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗甲状腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，MPP6蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如MPP6蛋白或编码所述蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。
在疾病治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明中针对MPP6基因的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述MPP6蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MPP6蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MPP6蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
在本发明的上下文中，“MPP6基因”包括人MPP6基因以及人MPP6基因的任何功能等同物的多核苷酸。MPP6基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中MPP6基因(NC_000007.14)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，MPP6基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％，优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述MPP6基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，MPP6基因表达产物包括人MPP6蛋白以及人MPP6蛋白的部分肽。所述MPP6蛋白的部分肽含有与甲状腺癌相关的功能域。
“MPP6蛋白”包括MPP6蛋白以及MPP6蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括MPP6蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人MPP6的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，MPP6蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述MPP6蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MPP6蛋白的融合蛋白。对于与MPP6蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MPP6蛋白的生物学活性即可。
本发明的MPP6蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MPP6蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“治疗甲状腺癌”根据疾病的状态来分，包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预；根据药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了一种甲状腺癌的新的分子标志物-MPP6基因，通过检测受试者甲状腺组织中MPP6的表达水平，可以判断受试者是否患有甲状腺癌，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；利用分子标记物来实现疾病的诊断和治疗，相比传统手段，具有更高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1显示利用QPCR检测MPP6基因在甲状腺癌组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测MPP6基因在甲状腺癌细胞中的表达情况；
图3显示利用平板克隆形成实验检测MPP6基因表达对甲状腺癌细胞增殖能力的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与甲状腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集6例正常甲状腺组织和甲状腺癌组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备(利用miRNAkit进行操作)
上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：
1)RNA的分离：
A.组织匀浆或细胞中加入ReagentII1ml；
B.室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s；
C.置于冰上防止10min；
D.12000g，4℃离心15min；
E.转移80％的水相进入新的2mlEP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；
F.将小于700μl的上述液体转移至RNAMinicolumn，振摇后10000g室温离心60s。
2)RNA纯化：
A.向RNAMinicolumn加入500μlRWCWashBuffer，10000g离心30s；
B.加入500μlRWBWashBuffer，10000g离心30s，重复两次后采取最大离心完全干燥RNAMinicolumn；
C.向柱子加入15μl预热至70℃的DEPC水，室温放置2min后全速离心。
3、高通量转录组测序
1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3)差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，MPP6基因在甲状腺癌组织中的表达量显著低于正常甲状腺组织中的表达量。
实施例2QPCR测序验证MPP6基因的差异表达
1、对MPP6基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常甲状腺组织和甲状腺癌组织各50例。
2、QPCR具体操作步骤如下所示：
(1)RNA提取
RNA提取步骤如实施例1所述。
(2)逆转录
A.在Microtube中配置混合液：OligodT(50μM)1μl，dNTP混合液(10mM)1μl，RNA模板5μg，加ddH2O至10μl，混合均匀；
B.在PCR仪上按照下列反应条件进行变性、退火反应：65℃5min后，立即放置冰上；
C.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：
上述变性、退火后反应液10μl，5×Buffer4μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，RTase(200U/μl)1μl，ddH2O(RNase-free)4.5μl，混合均匀；
D.在PCR仪上按照下列反应条件进行反转录反应：
(30℃10min)×3、(42℃45min)×4、(95℃5min)×5，处理后，置于冰上；
E.按下列配方在冰上配制PCR反应液：
PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)12.5μl、正向引物(10μM)1μl、反向引物(10μM)1μl、DNA模板(<100ng)2.0μl、ddH2O8.5μl；
F.PCR的循环条件如下：
95℃30s，(95℃20s，60℃20s)×45，选取GAPDH作为内参。PCR的引物序列如下：
MPP6的引物序列：
正向引物：5’-AACAGGTTCATAGTATTG-3’(SEQIDNO.3)，
反向引物：5’-TAATATCTGCTTCCATCT-3’(SEQIDNO.4)
GAPDH的引物序列：
正向引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(SEQIDNO.5)
反向引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(SEQIDNO.6)
以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图1所示，与正常甲状腺组织相比，MPP6基因在甲状腺癌组织中下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3MPP6基因的过表达
1、细胞培养
人甲状腺癌细胞株FTC-133，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、MPP6基因的过表达
2.1MPP6基因表达载体的构建
根据MPP6基因的编码序列(如SEQIDNO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：
正向引物：5’-CCGGGATCCGCCACCATGCAGCAAGTCTTGGA-3’(SEQIDNO.7)
反向引物：5’-CGGGCGGCCGCGTAAACCCAGCTGATTG-3’(SEQIDNO.8)
从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的MPP6基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和NotI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-MPP6用于后续实验。
2.2转染
将甲状腺癌细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和MPP6过表达组(转染pcDNA3.1-MPP6)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MPP6的工作浓度均为0.5μg/ml。
2.3RT-PCR检测
具体步骤同实施例2。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MPP6的细胞中MPP6的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4MPP6基因对甲状腺癌细胞增殖的影响
1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。
2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×103个/ml。
3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。
4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO2温箱中备用。
5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×103个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。
6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。
7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。
8、结果
结果如图3所示，与其他组相比，转染pcDNA3.1-MPP6的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。
7、结果
结果如图3所示，与其他组相比，转染pcDNA3.1-MPP6的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。
实施例5MPP6基因对甲状腺癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测MPP6基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染pcDNA3.1-MPP6组的细胞凋亡率为(25.14±0.011)％，转染pcDNA3.1空载体组的细胞凋亡率为(7.54±0.015)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，MPP6基因的过表达促进甲状腺癌细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.MPP6基因及其表达产物在制备诊断甲状腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MPP6基因的表达水平以诊断甲状腺癌的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断甲状腺癌的产品至少包括一对特异扩增MPP6基因的引物；所述用实时定量PCR诊断甲状腺癌的产品至少包括一对特异扩增MPP6基因的引物；所述用免疫检测诊断甲状腺癌的产品包括：与MPP6蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断甲状腺癌的产品包括：与MPP6基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断甲状腺癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MPP6蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MPP6基因的核酸序列杂交的探针。
4.一种诊断甲状腺癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测甲状腺组织中MPP6基因的表达水平来诊断甲状腺癌。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。
6.MPP6基因及其表达产物在制备治疗甲状腺癌的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括增加MPP6基因表达水平、增强MPP6表达功能、和/或增强MPP6表达产物活性的试剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：含有能编码功能性MPP6蛋白的核酸的试剂、MPP6蛋白的激活剂、含有MPP6蛋白质的试剂。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
10.一种治疗甲状腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括增加MPP6基因表达水平、增强MPP6表达功能、和/或增强MPP6表达产物活性的试剂。
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