JP2003520806A - 抗トロンビンｉｉｉの精製の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、実質的に純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含む溶液の調製方法であって、カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤においてＡＴ−IIIβからイソ型ＡＴ−IIIαを分離することを含む、当該方法に関係する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、実質的に純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含む溶液の調製方法であって、
カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤においてＡＴ−IIIβからイ
ソ型ＡＴ−IIIαを分離することを含む、当該方法に関係する。

【０００２】 背景技術 抗トロンビンIII(ＡＴ−III)は、凝固カスケードにおいてセリンプロテアーゼ
を阻害する血漿グリコプロテインであり、そのため、血液凝固の制御において主
要な役割をする。抗トロンビンIIIは、ファクターＩＸａ、Ｘａ、ＸＩ、ＸIIａ
、およびトロンビンのインヒビターである。そのため、ＡＴ−IIIは、凝固カス
ケードの異なる段階で凝固形成を制御する。血液中のＡＴ−III含有の僅かな減
少により、血栓塞栓症の危険性は少なくなる。ＡＴ−III濃縮は、獲得性または
遺伝性抗トロンビン欠損の患者における血栓塞栓症異常の予防および処置に使用
される。更に、ＡＴ−IIIは、多くの他の生物学的応答、例えば、脈管形成およ
び炎症応答に含まれると報告されている。これら機構におけるＡＴ−IIIの機能
はまだ完全に理解されていない。

【０００３】 固相結合リガンドとしてヘパリンを用いるアフィニティークロマトグラフィー
によるＡＴ−III精製は、本分野に既知である。Miller-Andersson et al.(Throm
bosis Research 5, 439-452, 1974)は、ヒトＡＴ−IIIを精製するヘパリン−セ
ファロースの使用を開示する。イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを
含む全手順は、３４％収率である。

【０００４】 ヒト血漿において、抗トロンビンIIIは、アミノ酸組成物では相同ではあるが
、炭化水素含有率およびヘパリン結合の挙動が異なる、少なくとも２つの分子実
在物として存在する。ＡＴ−IIIβとして名付けられた抗トロンビン変異体は、
高イオン強度でヘパリン−セファロースマトリクスに強固に結合する効果により
、優性抗トロンビン種(ＡＴ−IIIαとして名付けられた)から独立してヒト血漿
から単離された(Peterson, C.B. & Blackburn, M.N. (1985) J. Biol. Chem. 26
0, 610-615)。

【０００５】 決定された分子量は、ヒトＡＴ−IIIαおよびヒトＡＴ−IIIβ、それぞれ５９
，８００および５６，９００であった。２つの抗トロンビンの分子量の相違によ
り、ＡＴ−IIIα亜種(subspecies)の炭化水素含有率を比較すると、ＡＴ−IIIβ
のシアル酸、中性糖(neutral sugar)、およびアミノ糖含有率において約２５−
３０％の減少が生じた(Peterson & Blackburn, 上記)。ＡＴ−IIIβは、４つの
オリゴサッカライド側鎖のうちの１つ、すなわち、アスパラギン１３５の側鎖を
欠いていることが示された(Brennan, S.O. et al.,(1987) FEBS Letters 219, 4
31-436)。ＡＴ−IIIα形成物は、ＡＴ−IIIβよりも陰性電荷である：ＡＴ−III
αとＡＴ−IIIβでは、ｐＩ：ｓはそれぞれ４．９と５．１であると説明されて
いる(Frebelius, S. et al. (1996) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascu
lar Biology 16: 1292-1297)。

【０００６】 精製ＡＴ−IIIβが得られることが望ましく、この型は、脈管壁における凝固
に特に効果を有する。バルーン創傷(balloon injury)後のウサギの大動脈におけ
る再狭窄をＡＴ−IIIβが防止することができることが示された(Swedenborg (19
98) Blood Coagulation and Fibrinolysis 9 (suppl. 3): S7-S10)。それゆえ、
ＡＴ−IIIβは、大動脈のバルーン拡張(balloon dilatation)を行うとき、再狭
窄の防止の、ヒト用の強力な薬物として考えられ得る。

【０００７】 ヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)は、１９７２年に原材料から
単離された単一鎖血漿タンパク質である。ＨＲＧＰの正確な生理学的機能はまだ
知られていない。ヘパリン、フィブリノーゲンおよびフィブリン、プラスミノー
ゲンおよび活性化血小板との相互作用のために、ＨＲＧＰは、凝固とフィブリン
溶解のモジュレーターであると考えられる(Koide, T. In: Fibrinolysis: Curre
nt Prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p.55-63
)。ポリペプチド鎖は、５０７アミノ酸残基からなり、他の血漿タンパク質、例
えば、抗トロンビンIIIとの相同性を有する(Koide, T. et al. (1986) Biochemi
stry 25, 2220-2225)。

【０００８】 上記のように、体内における２つのＡＴ−IIIイソ型およびＨＲＧＰの完全な
改善はまだ完全には理解されていない。従って、インビボおよびインビトロでの
研究を促進する、精製型のタンパク質を産生するための効率的な精製方法を提供
することが望ましい。

【０００９】 置換クロマトグラフィーの手段による、ヒドロキシアパタイトの使用は、抗ト
ロンビンIIIの精製で開示されている(Freitag & Breier (1995) J. Chromatogra
phy A, 691, 101-112)。しかし、別々のイソ型ＡＴ−IIIの精製は、従来、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーでは達成されていない。

【００１０】 図面の簡単な説明 図１は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαおよび
ＡＴ−IIIβの分離。

【００１１】 本発明の開示 抗トロンビンIIIイソ型、ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβが、カルシウムヒド
ロキシホスフェートベースの吸着剤を用い通常に分離され、精製され得ることが
驚くべきことに示された。

【００１２】 従って、本発明は、第一の態様において、カルシウムヒドロキシホスフェート
ベースの吸着剤においてＡＴ−IIIβからイソ型ＡＴ−IIIαを分離することを含
む、実質的に純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含む溶液の調製の方法を提供する。当該
方法は、次のステップ： (i) ＡＴ−IIIを主に含む溶液を調製すること、 (ii)当該溶液を、カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤、好ましく
はヒドロキシアパタイトと接触させること、 (iii)吸着クロマトグラフィー、好ましくはカラムクロマトグラフィーにより、
実質的に純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含むタンパク質画分を溶出および回収するこ
と、 を好ましくは含む。

【００１３】 ＡＴ−IIIを主に含む当該溶液は、通常、本分野に既知の方法により調製され
得る。適当な方法には、例えば、次のステップ： (i)既知の方法でヒト血漿からCohn Fraction I上清を調製すること(例えば、Coh
n et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475参照)、 (ii)当該Cohn Fraction I上清を、ＡＴ−IIIを結合することができるアフィニテ
ィーゲルと接触させること(例えば、Koide, T. et al. (1985) J. Biochem. 98, 1191-1200参照)；および (iii)当該アフィニティーマトリクスに結合するタンパク質画分を溶出および回
収すること、 を含み得る。

【００１４】 当該アフィニティーゲルは、アフィニティーリガンドとしてヘパリンを好まし
くは含む。適当なアフィニティーゲルには、ヘパリン−セファロース(商標)(Ame
rsham Pharmacia)；HeparinHyperD(Biosepra)、Fractogel TSK AF-Heparin 650
(Merck)、Heparin-Agarose(Sigma)、TSKgel Heparin (Tosohaas)、Heparin-Agar
ose 6XL (ACL)が含まれる。

【００１５】 以下の実施例１に示すように、ＡＴ−IIIαは、通常、約５０から約１５０ｍ
Ｍのホスフェート濃度を有する緩衝液を用いてカルシウムヒドロキシホスフェー
トベースの吸着剤から溶出する。ＡＴ−IIIβは、通常、約１５０ｍＭから約４
００ｍＭ、好ましくは約２００から約３００ｍＭのホスフェート濃度を有する緩
衝液を用いてカルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤から溶出する。
実施例１および図１に示すように、ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβは、約１１０
ｍＭおよび約２５０ｍＭのそれぞれ濃度でクロマトグラフィーカラムから溶出す
る画分中に回収され得る。得られたイソ型ＡＴ−IIIには、実質的にヒスチジン
−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)が含まれない(free)。

【００１６】 更なる態様では、本発明は、実質的に純粋のヒスチジン−リッチグリコプロテ
イン(ＨＲＧＰ)を含む溶液の調製の方法を提供する。この方法は、出発物質が、
ＡＴ−IIIの他に幾らかの量のＨＲＧＰをも含むとき（ＡＴ−IIIを調製する上記
方法を用いるときは通常そうである）、適用される(Koide, T. et al. (1985) J
. Biochem. 98, 1191-1200参照)。当業者は、クロマトグラフィーカラムからＨ
ＲＧＰを溶出するために適当な条件を決定することができる。以下の実施例１で
使用する条件下、ＨＲＧＰは、通常、約３００から約４００ｍＭ、例えば３４０
ｍＭのホスフェート濃度でカラムから溶出する。

【００１７】 本発明の方法は、通常、約６．０から約７．５、好ましくは約６．５から約７
．２、約ｐＨ６．８のようなｐＨで行う。

【００１８】 本発明により産生する抗トロンビン調製物は、医薬組成物および組合せにおけ
る医薬的有効成分として適当である。医薬組成物は、所望により、ヒルジンまた
はヘパリンのような抗凝固薬、プラスミノーゲンアクチベーターまたはヘメンチ
ン(hementin)のような血栓溶解薬などの更なる活性成分を含み得る。本発明によ
り産生された抗トロンビン調製物は、任意の非毒性、有機性酸または無機性酸を
伴う医薬的に許容される塩を形成し得る。

【００１９】 本発明により産生された抗トロンビン調製物は、通常の非毒性の医薬的に許容
される担体、希釈剤、非経口投与に典型的なアジュバントおよびビヒクルを含む
単位用量として投与し得る。本明細書で用いるとき、「医薬的に許容される担体
」なる用語は、活性化合物または患者と好ましくない反応をしない、不活性、非
毒性固体または液体フィルター、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。適当
に、好ましくは液体担体は当分野に既知であり、滅菌水、生理食塩水、水性デキ
ストラン、糖溶液、エタノール、グリコールおよび石油、動物、野菜、または合
成起源のようなもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油および鉱油を含むオイルな
どである。

【００２０】 「非経口」なる用語には、本明細書では、皮下、静脈、動脈および気管内注射
および注入技術を含む。経口投与および局所適用のような他の投与もまた適当で
ある。非経口組成物および組合せは、最も好ましくは、ボラス型でまたは既知手
順の定常量点滴として、いずれかで静脈に投与される。経口投与用の錠剤および
カプセルには、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤(tableting agent)、滑沢剤
、崩壊剤、および湿潤剤のような通常の賦形剤が含まれる。当該錠剤は、当分野
に既知の方法で被覆され得る。

【００２１】 経口液体調製物は、水性または油性上清、溶液、エマルジョン、シロップまた
はエリキシルの型であり得るか、または使用前に水または他の適当なビヒクルで
再構成する乾燥産物として存在し得る。その液体調製物には、懸濁化剤、乳化剤
、非水性ビヒクルおよび保存剤のような通常の添加剤を含み得る。典型的な適用
は、水性または油性懸濁、溶液、エマルジョン、ゼリーまたは好ましくはエマル
ジョン軟膏の型であり得る。本発明の単位用量には、毎日必要な量の本発明のタ
ンパク質であるか、または所望用量の分割量(sub-multiples)を含み得る。所定
患者(ヒトを含む哺乳類)用の、最適の治療的に許容される用量および用量率は、
用いられる特異活性物質の活性化、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与
の時間および経路、クリアランス率のような種々の要因に依存する。処置の目的
、すなわち、治療または予防および処置すべき血栓症疾患、抗血小板または抗凝
固活性の性質。

【００２２】 実験方法 ＡＴ−IIIの生物学的活性(IU/ml)は、ヘパリンおよびＡＴ−III存在中のトロ
ンビンによる色素生産性基質H-D-Phe-Pip-Arg-pNA・2HCl(Chromogenix, Sweden)
の切断をモニターすることにより、ヘパリン補因子活性として測定された。Fran
tzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983)およびvan V
oorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984)。

【００２３】 総タンパク質濃度は、２８０ｎｍ(Ａ_２８０)での吸収測定値により決定した。
ＡＴ−III溶液の濃度(mg/ml)は、6.4 IU/ml係数を用い算出した。ＡＴ−IIIの特
異活性(ＳＡ)は、IU/mlとして算出されるヘパリン補因子活性とＡ_２８０との間
の割合として定義される。

【００２４】 実施例 実施例１：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαおよび
ＡＴ−IIIβの分離 当分野に既知の方法(Miller-Andersson et al. (1974) Thrombosis Research
5, 439-452参照)により調製した、９５％を超える純度を有するヒト抗トロンビ
ンのサンプルを用い、抗トロンビンのαおよびβ型を分析した。

【００２５】 抗トロンビンサンプルを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０１ｍＭ塩化カル
シウム、ｐＨ６．８で平衡化したヒドロキシアパタイト(７５×７．５ｍｍＩＤ
、５μｍ、孔サイズ１０００Å)分析カラムを装着したＨＰＬＣシステムを用い
、クロマトグラフした。抗トロンビン(6.8mg/ml)の注射容量は２５μｌであり、
流速は室温で０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。溶出は、セグメント化勾配の手段に
より行い、最初に平衡緩衝液で定組成洗浄期(isocratic wash period)(０から５
分間)、次いで短勾配(short gradient)で行い１１０ｍＭリン酸ナトリウムとし
、次いで１７分間、定組成を流し、その後、５００ｍＭリン酸ナトリウムまで直
線状勾配(２５から３５分間)とした。検出は、２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定する
ことにより行った。ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβは、保持時間１６および３５
分で、それぞれ溶出した(図１)。既知の方法(Peterson, C.B. & Blackburn, M.N
. (1985) J. Biol. Chem. 260, 610-615参照)により得られた精製ＡＴ−IIIαお
よびＡＴ−IIIβを対照サンプルとして使用し、同じ方法で分析するとき上記と
同じ保持時間とした。ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβ以外のピークはクロマトグ
ラフでは見られなかった。当該ピークは良好なレゾリューションで分解し、その
結果から、ＡＴ−IIIサンプルは、成分領域に基づき、約０．７％のＡＴ−IIIβ
を含むことが示された。精製ヒスチジン−リッチグリコプロテインは、同じシス
テムで分析するとき、ＡＴ−IIIβよりも長い保持時間を供した。

【００２６】 実施例２：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαおよび
ＡＴ−IIIβの精製 １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中のＡＴ−IIIサンプル、実施例１に
記載と同じ定量で４５０ｍｇを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０１ｍＭ塩化
カルシウム、ｐＨ６．８で平衡化したヒドロキシアパタイト、１５μｍ粒経、調
製用カラム(35×2.5cm ID)を装着したクロマトグラフィーシステムを用い、適当
にクロマトグラフする。温度＋４℃から＋８℃で流速３ｍｌ／ｍｉｎを精製に適
用する。溶出は、セグメント化勾配の手段により行い、最初に、４５分間、定組
成をサンプルローディングおよびウォッシングの間に平衡緩衝液で走らせ、次い
で１１０ｍＭリン酸ナトリウムまで直線状勾配(０．５ｈ)とし、その後、定組成
を走らせ(２．６ｈ)、最終的に５００ｍＭリン酸ナトリウムまで直線状勾配(１
．５ｈ)とした。２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによる検出。ＡＴ−IIIα
およびＡＴ−IIIβは、約２および５時間後、それぞれ溶出する。

【００２７】 粒子サイズ１５μｍを有するヒドロキシアパタイトの代わりに、他の型のヒド
ロキシアパタイトは、通常、より大きなスケール、例えば、Macro-Prep(商標)セ
ラミックヒドロキシアパタイト(Bio-Rad；粒子サイズ８０μｍ)での精製に使用
し得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるＡＴ−
IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤でＡＴ−
   IIIβからイソ型ＡＴ−IIIαを分離することを含む、実質的に純粋のイソ型ＡＴ
   −IIIを含む溶液の調製方法。
2. 【請求項２】 次のステップ： (i)ＡＴ−IIIを主に含む溶液を調製すること、 (ii)当該溶液を、カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤と接触させ
   ること、 (iii)実質的に純粋なイソ型ＡＴ−IIIを含むタンパク質画分を溶出および回収す
   ること、 を含む、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離をカラムクロマトグラ
   フィーにより行う、請求項１または２の方法。
4. 【請求項４】 実質的に純粋のＡＴ−IIIαの調製のための請求項１の方法
   。
5. 【請求項５】 ＡＴ−IIIαが、約５０ｍＭから約１５０ｍＭのホスフェー
   ト濃度を有する緩衝液を用いカルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤
   から溶出する、請求項４の方法。
6. 【請求項６】 実質的に純粋のＡＴ−IIIβの調製のための請求項１の方法
   。
7. 【請求項７】 ＡＴ−IIIβが、約１５０ｍＭから約４００ｍＭのホスフェ
   ート濃度を有する緩衝液を用いカルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着
   剤から溶出する、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 当該カルシウムヒドロキシホスフェートベースの吸着剤がヒ
   ドロキシアパタイトである、請求項１の方法。
9. 【請求項９】 ＡＴ−IIIαとＡＴ−IIIβの分離が約６．０から約７．５の
   ｐＨで行われる、請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 ＡＴ−IIIを主に含む当該溶液が、次のステップ： (i)ヒト血漿からCohn Fraction I上清を調製すること、 (ii)当該Cohn Fraction I上清を、ＡＴ−IIIを結合することができるアフィニテ
    ィーゲルと接触させること；および (iii)当該アフィニティーマトリクスに結合するタンパク質画分を溶出および回
    収すること、 を含む方法により調製される、請求項２の方法。
11. 【請求項１１】 当該アフィニティーゲルには、アフィニティーリガンドと
    してヘパリンを含む、請求項１０の方法。
12. 【請求項１２】 得られたイソ型ＡＴ−IIIには、実質的にヒスチジン−リ
    ッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)が含まれない(free)、請求項１の方法。