JPH01196295A - プロウロキナーゼからの発熱性物質除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はプロウロキナーゼ（以下、Ｐｒｏ−ＵＫと略記
する。）から発熱性物質を除去する方法であり、さらに
詳しくは発熱性物質を含むＰｒｏ−ＵＫ溶液を半透膜で
濾過する工程と次いで脱パイロジエン吸着体に接触させ
る工程により、発熱性物質を含まないＰｒｏ−ＵＫ溶液
を得ることを特徴とする蛋白質回収率、迅速性、再現性
、安全性および経済性に優れた発熱性物質の除去方法に
関する。

この方法はＰｒｏ−ＵＫを医薬用即ち注射用の生物学的
製剤として精製するために有用な方法である。

［従来の技術およびその問題点］ Ｐｒｏ−ＵＫは、４１１のアミノ酸よりなる分子量約５
万の蛋白質であり、ある種の蛋白質分解酵素である。機
能としては、人体の血液凝固系に関与し、凝固した血液
の溶解をたすける働きを持つ。用途としては、血栓溶解
剤として血管塞栓性疾患すなわち、血管が詰まることに
よって生ずる心筋梗塞、脳血栓などの治療薬として期待
されている。Ｐｒｏ−ＵＫは、現在既に血栓溶解剤とし
て広く用いられているウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記
する。）の前駆体であり、より血栓特異性が高く、ＵＫ
の欠点である全身性出血の問題を解消できる新しい血栓
溶解剤として期待されている。

ところで、このように注射薬製品からの発熱性物質の除
去の問題は重要である。発熱性物質は低分子発熱性物質
（パイレティクス：　Ｐｙｒｅｔｉｃｓ）とパイロジエ
ン（Ｐｙｒｏｇｅｎ　ｓ高分子発熱性物質）に大別され
、このうちパイロジエンはさらに外因性（Ｅｘｏｇｅｎ
ｌｏｕｓ）のものがあり、この外因性の中に細菌性のエ
ンドトキシン（Ｅｎｄｏｔｏｘｌｎ　：内毒素）、外毒
素（ＥＸＯｔＯＸｌｎ）などがある。特にこのエンドト
キシンは１０ｎｇ／ｋｇの微量でウサギに明確な発熱を
もたらす程強い活性を有する。

一般にパイロジエンといえば細菌性発熱物質を指し、ダ
ラム陰性菌の細胞壁外膜開成成分であるエンドトキシン
は医薬品に混在する確率が高く微量で発熱を引き起こす
ことから特に注目されている。　さらに詳しくは、エン
ドトキシンがグラム陰性桿菌の夾雑構成成分であるリポ
多糖（Ｌｉｐｏ−ｐｏｔｙｓａｃｃｈａｒｉｔｉ卸以後
ＬＰＳと略す。）を主成分とし、発熱性物質の活性本体
がこのＬＰＳを構成する多糖（ＰＳ）及び糖脂質部（Ｌ
ｌｐｌｄ　Ａ　）であることが確認されている（Ｍ、Ｉ
ｎ＋ｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、、８０．５ｅｒＢ　）　、　Ｌ
　Ｐ　Ｓは水溶液中では会合体ミセルをつくる性質があ
る。その分子量はサブユニットとしては１〜２．５万だ
がミセル形成時は５０〜１００万、更にベシクルになる
と数百刃になって安定化されているとされている。ＬＰ
Ｓを失活させるには２５０℃で３０分以上。

２００℃で６０分以上、１８０℃では１２０分以上の加
熱が必要とされている。ＬＰＳのこの様な耐熱性や化学
的安定性のために、ＬＰＳが混入した製剤からの生理的
条件下での不活化や除去は極めて困難である。ダラム陰
性菌を゛使用して製造する遺伝子組替え菌体産生薬さら
には生物学的製剤などには、このＬＰＳを主成分とする
エンドトキシンの混入が問題となってくる。Ｐｒｏ−Ｕ
Ｋは上記のごとく、生体抽出物又は遺伝子組替菌体産生
物であるため、エンドトキシン除去の問題は重要であり
、また生物学的製剤であるため、その生体への投与量、
投与回数などの観点からもエンドトキシンを完全に除去
することが必須となってくる。

しかしながら、このような酵素やさらには抗体を含有す
る溶液や製剤、また血液製剤からエンドトキシンを充分
に除去できる、簡便で安全確実。

再現性の良い方法は未だ確立されておらず、多くの問題
を抱えているのが現状である。

例えば、タンパク質溶液などか、らの発熱性物質除去に
ついて従来、次のような方法が報告されている。

（１）膜濾過による除去（例えば、特開昭５９−１４９
９０１号公報等） （２）吸着体による発熱性物質の吸着９発熱性物質の溶
出分！（例えば、特開昭５０−６９２２０号公報、特開
昭５７−１８３７１２号公報等）（３）吸着体による目
的物質の吸着１発熱性物質の溶出分離（例えば特開昭５
０−６９２２０号公報、特開昭５２−９９２　Ｆ、　６
号公報等）（４）そのほか、界面活性剤を用いる方法（
例えば特開昭６１−９３１１１号公報、米国特許７．４
１２．９８５等） しかしながら、（１）の方法では前記のごとくＬＰＳが
溶液中で種々の分子集合状態（会合体等）をとるので、
溶液組成によっては、低分子量のＬＰＳが膜を通過して
しまい、完全には目的物質を濾別することは出来ない。

低分子物質からの発熱性物質除去例としては、分画分子
量１万の限外濾過膜を用い、注射液などからパイロジエ
ンを除去する方法が知られている［　（Ｇ、Ｋｏｐｐｅ
ｎｓｔｅｉｎｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｐｈａｒｍ、Ｉｎｄ、
、３ｇ、１９．８２７−９３１．１９７６）　］　、　
しかし大大腸由由のエンドトキシン含有溶液を濾過する
場合、その溶液組成（例えばイオン強度等）によっては
、はとんどが膜を透過してしまう。また、溶液組成によ
っては、目的物質の膜への吸着等により回収率が極めて
悪くなる。さらに方法によっては、目的物質が希釈され
ることが多く、後の工程で濃縮操作などが必要になる等
の欠点がある。

（２）の方法では、溶出条件によっては目的物質の吸着
体への非特異的吸着が起こり、その回収率が悪くなった
り、吸着体の吸着容量や選択性によっては十分には発熱
性物質の成骨除去ができなくなることが多い。

（３）の方法では、（２）の方法とは逆に発熱性物質の
吸着体への非特異的吸着が起こり、発熱性物質の除去が
十分にできなくなることが多い。また、目的物質の吸着
体からの分離は被吸着原液より高い電気伝導度ををする
溶液を用いる。すなわち、溶離用の溶液の塩濃度を高め
るなどして行うため、目的物質を含む溶出液が高濃度の
塩も含むことになり、後の工程で脱塩（濃縮）などの必
要があるなどの欠点がある。さらには、この様な溶液組
成の異なるものが必要となったり、目的物質の溶出には
塩の濃度勾配をかける必要があったりして、その操作が
煩雑となることが多い。

（４）の方法では界面活性剤と目的物質とを混合撹拌処
理するため、目的物質の変性や界面活性剤の回収不全に
よる残留などの安全性が問題となる。

このように従来のタンパク質溶液などからの発熱性物質
の除去法には多くの困難が伴い、これらの諸問題点を改
善するための技術の開発が強く要望されているのが現状
である。

本発明は以上の観点からなされたもので、その目的は簡
便、迅速で、回収率、再現性、安全性に優れ、経済的、
効率的であるとともに確実で実用的なＰｒｏ−ＵＫから
の発熱性物質の除去方法を提供するものである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の要旨は発熱性物質を含むＰ　ｒ　ｏ−ＵＫ水溶
液を第１工程として半透膜で濾過し、次いで第２工程と
して脱パイロジエン吸着体に接触させることを特徴とす
るＰｒｏ−ＵＫからの発熱性物質除去方法にあり、本発
明の方法によりＰ「〇−ＵＫから効率良く安全確実に発
熱性物質を除去することを達成したものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

第１工程で用いる半透膜はＰｒｏ−ＵＫの分子量以上で
１０６程度以下の分画分子量を持つものなら特に限定は
されないが、Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｕ　Ｋの分子量が５万程度
なので、回収率などの点から分画分子量約３０万程度の
ポリスチレン系やポリエーテルスルホン系限外濾過膜（
例えば東ソー（株）製画品名ｒＵＦ−３００ＰＳＪ　）
が好ましい。この膜による濾過は除菌、除粒子等、有害
物質の除去操作も兼ねることができる。

ａａ条件は試料の処理量により決定すれば良いが、通常
試料溶液５０〜２００ｄに対して、濾過膜面積は１１．
５〜２７ｃｍが最適であり、濾過圧は２．０〜４．５ｋ
ｇ重／Ｃ−が最適・である。

ＬＰＳの会合状態の変化や膜へのタンパクの付イ５０ス
に関して前記した如く、この場合のＰｒ。

−ＵＫ水溶液の組成はＰｒｏ−ＵＫの回収率や脱エンド
トキシンの効率に微妙に影響する。ここでは、次の第２
工程の脱パイロジエン吸着体への接触時の最適溶液組成
、即ち２０％以下のエタノールを含む１０〜１００ｍｍ
ｏｊ’／ｉのカリウム又はナトリウム（Ｋ−又はＮａ−
）リン酸緩衝液（ｐＨ４，０〜７．５）が望ましい。ま
た、このｃＡ衝液はエタノールを含まないものでも一向
に差し支えないが、エタノールを含む緩衝液を用いれば
第１工程の膜処理を施した後のＰ　ｒ　ｏ−ＵＫの回収
率が良好となるので好ましい。エタノールの含有量が２
０％を越える場合、タンパクの溶解性が低下したり脱パ
イロジエン吸着体に悪影響を及ぼす恐れがある。更に好
ましくは１０％エタノールを含む約２０ｍｍｏＪ／ｊ！
でｐＨ約５．０程度である。

またＰｒｏ−ＵＫは精製途中の部分精製品でも良いが、
本発明の方法ではＰｒｏ−ＵＫ精製の最終工程で脱パイ
ロジェンできるという大きな利点があり、従来の精製工
程では除去できなかった、又は、コンタミしたパイロジ
エンを除去することが可能となることから、従来の精製
の最終工程にこの方法を適用するのが最善である。数％
（Ｗ／　Ｖ　）の蛋白濃度で数千〜数万ｎｇ／−程度の
エンドトキシンを含有する精製Ｐｒｏ−ＵＫ水溶液（例
えば、比活性１４万単位／　ｍｇ以上の大腸菌産生遺伝
子組換体Ｐｒｏ−ＵＫ）は本発明の第１工程の膜処理で
回収率が９０％以上でエンドトキシン濃度が１〜１０程
度に低減され、変性や失活もない（タンパク定量はロー
リ−法（Ｌｏｗｒｙ法）；活性測定はＬ−ピログルタミ
ル−グリシルＬ−アラギニンーｐ−ニトロアニリドを基
質として用いる測定法による）。

第２工程の脱パイロジエン吸着体への接触工程は上記の
溶液組成のまま連続的に行える。この接触はバッチ法又
はカラム法又はその両者の組み合わせでもできる。

バッチ法は試料溶液に脱パイロジエン吸着体を（約１／
１０〜１／１０００容′Ｑ程度）懸濁混合し攪拌後、濾
別や遠心分離などにより、吸着体と試料溶液を分離する
方法である。また、カラム法は例えば試料を溶解させる
溶液で脱パイロジエン吸着体を懸濁し、適当なカラムに
充填し、同溶液で平衡化する事により脱パイロジエン吸
着体カラムを調製し、これに試料溶液を（空間速度：ｓ
■−１〜３程度）流し、その溶出液として脱パイロジエ
ン化された試料溶液を得る方法である。試料溶液中のタ
ンパク量と吸着体量（湿潤品換算）との比は吸着体のリ
ガンド含量やその種類によるが０．４〜０．５が最適で
ある。同じく、試料溶液中のエンドトキシン含量と吸着
体量（湿潤品換算）との比は２×１０〜２Ｘ１０’が最
適である。

本発明で用いる吸着体は、含窒素複素環式化合物を水不
溶性担体に直接又はスペーサーを介して結合させたもの
を用いる。含窒素複素環式化合物は、−殺伐Ｒ−Ａ−Ｘ
で表され、Ｒがイミダゾール骨格、ピラゾール骨格、ピ
リミジン骨格、ピリダジン骨格、ピラジン骨格、プリン
骨格、アクリジン骨格、トリアゾール骨格、オキサジア
ゾール骨格、テトラゾール骨格、インダゾール骨格、ベ
ンゾトリアゾール骨格、ベンゾピリダジン骨格。

ベンゾピリミジン骨格を有する複素環式基であり、Ａが
単結合手、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数２〜
１２のアルケニレン基であり、Ｘが水素原子、アミノ基
、水酸基又はカルボキシル基であるもので、特にヒスチ
ジン、ヒスタミン、ウロカニン酸などが望ましい。水不
溶性担体としては、セルロース、アガロース、架橋デキ
ストランなどの多糖類、アミノアルキル化多糖類、又は
カルボキシアルキル化多糖等が好適にあげられる。更に
スペーサーとしては炭素数１〜１２程度のアルキル鎖の
両端にアミノ基やカルボキシル基や水酸基又はそれらを
組み合わせたものを持つものが挙げられる。

パイロジエン除去効率はバッチ法よりカラム法の方が優
れている。特に、エピクロルヒドリンで活性化したアミ
ノへキシルセファ０−スにヒスチジンを共有結合させる
ことにより調製した固定化ヒスチジン脱パイロジエン吸
着体、を用いたカラム法による結果では、第１工程の膜
処理で回収率が９０％以上でエンドトキシン濃度が１〜
１０ｎｇ／−程度に軽減されたＰ　ｒ　ｏ−ＵＫ試料溶
液をそのままこのカラムに導通したところ、はとんど希
釈されることなく、回収率９５％以上で、エンドトキシ
ン濃度が高感度リムラステストで検出限界（０，０ｉｎ
ｇ／ＩＲ１）以下に低減されたＰｒｏ−ＵＫ試料溶液を
得た。この試料溶液はまた、公定法であるウサギの体温
上昇値で判定する日本薬局方発熱性試験（第８改正日本
薬局方局方第１部第８３項記載の方法によった。）でも
陰性であった。

ところで、リムラステストは米国薬局方［Ｕ、Ｓ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｌａ　ＸＸ、８８８（１９８０）
　］には既に採用されているが、我国でも放射性医薬品
基準一般試験中には採用されている。

このリムラステストとウサギによる発熱試験との相関関
係はｉｎ　ｖｌｔｒｏとｉｎ　ｖｌｖｏでの結果の比較
となり難しいが、Ｌ　Ｐ　Ｓ　（Ｅ、Ｃｏ１１０１１１
：Ｂ４）を用いたウサギによる発熱性試験の検討では日
本薬局方に基づき再試験にかかる体温上昇をもたらすエ
ンドトキシン濃度は約５　ｎｇ／−であった［Ｈ，Ｕｓ
ａ−ｍｉ、Ａｎｎ、Ｒｃｐ、Ｔｏｋｙｏ−Ｍｅｔｒ、Ｒ
ｅｓ、Ｌａｂ、Ｐ、１１．．３３．ｌＯＯ−１０４（１
９８２）　］　、即ち、５ｎｇ／！！ｄｌ濃度は５０ｎ
ｇ／ｋｇ用量に相当し、この濃度で最高体温上昇値が開
法基準値の０．６℃を示した。人の発熱感受性は一般的
にウサギの約３倍であるので、更に高い体温上昇値を示
す可能性があるといわれている［玉熊正悦、「エンドト
キシンショック」、中外医学社（１９７７）　］。　こ
れらのことから判断しても、Ｐｒｏ−ＵＫの人臨床量（
例えば通常、数〜数十ｍｇ、即ち数十〜数百ｎｇ／ｋｇ
）では、前記の方法による発熱性物質除去で十分にその
目的を達成していることが確認される。

以上のようにして得られたＰｒｏ−ＵＫ温溶液一般的に
は低イオン強度、高タンパク量のものとして得られるが
、必要があれば脱塩や濃縮を行い、それに糖類などを適
当量添加するなどして凍結品や凍結乾燥品にすることに
より、長期に安定かつ安全、高純度なＰｒｏ−ＵＫ製剤
にすることが可能である。

上記の一連の発熱性物質除去操作は０〜３０℃程度で行
えるが、必ずしも低温で行う必要はなく、室温で十分行
える。また、使用する器具類の洗浄滅菌も通常の方法で
良く、なんら特殊な処理の必要はない。

また、使用する半透膜の再生はＩＮ程度の水酸化ナトリ
ウムへの浸漬処理など、通常の方法で十分である。脱パ
イロジエン吸着体の再生はカラムに詰めたままでも可能
であり、−例として上記ヒスチジン固定化吸着体などの
場合は吸着体容量の０．２倍量の０．２Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液。

４倍量の０．５％デオキシコール酸ナトリウム水溶液、
２０倍量の０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、４倍量の
パイロジエンフリー水、３０倍量の１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液及び１０倍量のパイロジエンフリー水で順次
再生し、次いで試料を溶解する溶液で平衡化すれば良い
。このようにして、少なくとも数千回程度の反復使用が
可能であり、再現性も良好であった。

［発明の効果］ 以上の説明から明らかなように、本発明によれば、次の
ような効果が得られる。

（１）高濃度（数Ｗ／Ｖ　　％）のＰ　ｒ　ｏ−ＵＫ水
溶液に含有された高濃度（数千〜数万ｎｇ／　ｒｔｄｌ
　）のエンドトキシンを少なくとも０．１ｎｇ／ｒ１１
１以下がら高感度リムラステストの検出限界（０，０１
ｎｇ／ｍｊ）以下のエンドトキシン濃度まで低減でき、
医薬用としては十分にエンドトキシン除去されたＰｒｏ
−ＵＫを得ることができる。

（２）Ｐｒｏ−ＵＫの比活性、純度などの変化もなく、
少なくとも全工程で８５％以上という高回収率で、はと
んど希釈されることなく　Ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ水溶液を得
ることができる。

（３）迅速、簡便に発熱性物質の除去ができる。

試料溶液の組成変更やカラム処理で濃度勾配など煩雑な
操作をする必要がなく、全工程、同一の溶液組成でしか
も室温での連続的処理ができる。

（４）再現性に優れ、安全確実に発熱性物質除去ができ
る。複数回処理によるバラツキはなく、吸着体のリガン
ド等の漏出による試料溶液の汚染がない。

（５）経済的、効率的に発熱性物質除去ができる。

使用する膜や吸着体を低コストで製造でき、膜の処理量
や吸着体のパイロジエン吸着量が大きく、短時間に多量
の試料溶液の処理ができる。またこれらの膜や吸着体は
簡単な再生処理により、少なくとも十〜数十回の反復使
用が可能である。

（６）スケールアップが容易で、大量の試料溶液の発熱
性物質除去ができる。大規模（工業的）大量精製のため
の実用的プロセスとしても採用できる。

（７）完全に近い発熱性物質除去によって、医薬用とし
てのＰｒｏ−ＵＫの安全性を著しく高めることができる
。

［実施例］ 以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 遺伝子組換大腸菌産生のＰｒｏ−ＵＫ（精製品。

比活性約１４万単位／　ｍｇ　：　Ｌ−ピログルタミル
−グリシルし一アラギニンーｐ−ニトロアニリドを基質
として用いる活性測定法、以下も同様：蛋白濃度８　＠
ｇ　／　ｒｒｄｌ　：　Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｙ法、以下も
同様）に含有されるエンドトキシン濃度はリムラステス
ト（「エンドトキシン検出用リムラスＭＳ−シングルテ
ストワコー」和光純薬工業（株）製、商品名。

以下同様）で約６０００　ｎｇ／ｍｉであった。この溶
液を１０％エタノールを含む０．０２Ｍカリウム（Ｋ−
）リン酸緩衝液（ｐＨ５，０）濃度となるように調製し
、その５０ｄを通常の方法でよく洗浄したポリエーテル
スルホン製限外濾過膜（分画分子量約３０万、ｒＵＦ−
３００ＰＳＪ　：東ソー（株）製、商品名）に通し濾過
した。濾過膜面積は２７ｃｊ、！過圧は２．５ｋｇ重／
Ｃ−であり、濾過装置はｒＵＨＰ−４５４（東洋ろ紙（
株）製、商品名）を用いＮ２ガスで加圧して行った。こ
の膜濾過液のエンドトキシン濃度は１〜１０ｎｇ／−と
なり、タンパク定量値から求めた一Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｕ　
Ｋ回収率は９１％であった。次にヒスチジンをリガンド
とし、アミノヘキシルセルロース担体に固定化させた脱
パイロジエン吸着体（粒径６０〜１２０ミクロン、リガ
ンド含量０．０１４〜０．０２０ｍＭ／ｇ［吸着体コ湿
潤品、「パイロセップ」。

ダイセル化学工業■製、商品名）８−（吸着体０．７ｇ
湿重量で１−となる。）を１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶
液に懸濁後、滅菌したカラム（内径ｇｓ＋ｍ、長さ１０
０龍）に充填し、１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液２５０
ｒＲ１，パイロジエンフリー水１００ｄで洗浄した。Ｏ
，０２ＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ５，０）１００ｍｌ！
で平衡化し、このカラムに上記の膜濾過液を５Ｖ−１の
流速で流下させた。

これら一連の操作は全て室温下で行った。この溶出液の
タンパク濃度は６．２ｍｇ／！！ｄｌであり、はとんど
希釈されておらず、Ｐｒｏ−ＵＫの回収率は８８％以上
であった。また高感度リムラステストによるエンドトキ
シン濃度は検出限界（０，０１ｎｇ／ｒｄ）以下であっ
た。

これら一連の脱パイロジエン処理工程において、試料溶
液中のＰ　ｒ　ｏ−ＵＫの比活性は変化しなかった。ま
た、ＳＤＳ電気泳動的方法や高速液体クロマトグラフィ
ー（ｒＧ−３０００ＳＷｊ　、東ソー（株）製、商品名
）などのＰｒｏ−ＵＫ純度分析によっても上記の脱パイ
ロジエン処理前後で変化がないことを確認した。

更に、上記の脱パイロジエン処理したＰｒｏ−Ｕ　Ｋ溶
出液を無菌的に生理食塩水で０．１０゜１００倍にそれ
ぞれ希釈して試験物質とし、日本薬局方発熱性物質試験
（第８改正日本薬局方第−部第８３項記載の方法によっ
た）に従い、検液１０−／ｋｇ　（ウサギ体重）を試験
用量とし、発熱性物質試験を実施したところ、３羽とも
体温上昇値が０．６℃を越えるものはなく、発熱性物質
陰性と判断した。

実施例２ 遺伝子組換大腸菌産生Ｐｒｏ−ＵＫ溶液（精製品、比活
性約１４万単位／　ｍｇ　；タンパク濃度５　ｍｇ／−
）を１５％エタノールを含む８．０４ＭＫ−リン酸緩衝
液（ｐＨ５，０）濃度となるように調製した。この溶液
に含有されるエンドトキシン濃度はリムラステストで約
６０００　ｎｇ／−であった。

これを試料溶液とし、実施例１と同様にして脱パイロジ
エン処理を行った。第１工程での膜濾過液のエンドトキ
シン濃度は１０〜１００　ｎｇ／−で、Ｐｒｏ−ＵＫの
回収率は９０％であった。第２工程での脱パイロジエン
カラムの溶出液のエンドトキシン濃度は０．０１ｎｇ／
ｍｊ！以下で、タンパク濃度は４．３ｍｇ／ｍｊ！であ
り、Ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ回収率は９５％であった。実施例
１と同様のＰｒｏ−ＵＫの比活性測定及びＰｒｏ−ＵＫ
の純度分析の結果、脱パイロジエン処理前後で、何ら変
化がないことを確認した。更に、実施例１と同様の発熱
性物質試験結果も陰性であった。

参考例 実施例１などで用いた、繰り返しの使用によりパイロジ
エン吸着能の低下したカラムは０．２Ｍ水酸化ナトリウ
ム水溶液１６ｍ１，０．５％デオキシコール酸ナトリウ
ム水溶液３２ｄ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１６
０ｍ１．パイロジエンフリー水５０ｍｊ、１．５Ｍ塩化
ナトリウム水溶液２５０ｄ、パイロジエンフリー水１０
０−で順次洗浄して、再生した。その後、実施例１．２
と同様の操作を繰り返した結果、少なくとも１０回以上
の繰り返し使用でも同一の再現性のある結果が得られた
。

比較例１ 実施例１の脱パイロジエン処理工程において、第１工程
の膜濾過工程を行わなかった以外は、実施例１と同様の
処理操作を行った。即ち、実施例１における第２工程の
脱パイロジエン吸着体カラム処理のみを行った結果、得
られた溶出液のエンドトキシン濃度は１０〜１００　ｎ
ｇ／ｍであり、不十分なエンドトキシン除去に終わった
。実施例２の試料溶液についても同様の結果が得られた
。

実施例１と同一の試料溶液を用いて、本発明による発熱
性物質除去処理を行った場合と本発明による発熱性物質
除去処理のうち第１工程の膜濾過処理のみを行った場合
及び第２工程の脱パイロジエン吸着体との接触のみを行
った場合の３通りについて、それぞれ処理の前後で試料
溶液のエンドトキシン濃度を比較した結果を表１に示す
。

表１ 表１から明らかなように膜濾過処理のみまたは脱パイロ
ジエン吸着体カラム処理のみでは、エンドトキシンの除
去は不十分であり、本発明による発熱性物質除去方法を
行った場合には高感度リムラステストの検出限界以下ま
でエンドトキシン濃度を低減することができ、特に医薬
用として有用なＰｒｏ−ＵＫ溶液が得られることが明ら
かである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）発熱性物質を含むプロウロキナーゼ水溶液を半透
   膜で濾過する工程、次いで脱パイロジェン吸着体に接触
   させる工程からなることを特徴とするプロウロキナーゼ
   からの発熱性物質除去方法。