JPS62246593A - 蛋白質の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、蛋白質、特に人間の血漿から、人間の血漿の
凍結蛋白質の残留物からまたは細胞組織の残留物から吸
着される蛋白質をイオン交換ゲル、特にジエチルアミノ
エチル（ＤＥＡＥ）ゲルρ如きアニオン交換ゲルによっ
て分離する方法およびその装置に関する。

表面に担持された基を持ちそして血液の血漿に転化する
ゲルによって沢山の血漿蛋白質を吸着することは公知で
ある。これらのゲルによって蛋白質を表面で保持する力
は、用いる個々のゲルの官能基□即ち、官能基が正であ
ろうが負であろうが（それ故にアニオンを吸着しようが
またはカチオンを吸着しようが）に依存しており、また
担持される基の解離定数に依存しており、更に血液の血
漿とゲルとを混合する間を占有する条件、即ち第一にイ
オン濃度、溶解されるイオンの種類、ｐＬ値および温度
に依存している。

例えばＤＨＡＥ−ゲルの如くアニオン交換効果を官能基
として持つゲルを血液の血漿に添加した時に、血漿蛋白
質が、“プロトロンビン−コンプレックスの各ファクタ
ー”として公知であるゲルによって吸着される。蛋白質
を負荷したゲルは次いで残留血漿から簡単に分離できる
。血漿蛋白質とイオン交換ゲルとの間の結合強度が周囲
の溶液のイオン濃度の増加につれて減少するので、蛋白
質は高いイオン濃度の溶液中でゲルから脱着し得る。ド
イツ特許第２．７１５．８３２号明細書、東独特許第１
４８．２９７号明細書および同第１４１．２６１号明細
書およびヨーロッパ特許第０１０４１．１７３号明細書
は、プロトロンビン−コンプレックスのファクターがＤ
ＥＡＥ−ゲルによって血液血漿から吸着されそしてプロ
トロンビン−コンプレックスの個々の成分に分離される
ことなしに高いイオン濃度の溶液で該ゲルを洗浄するこ
とによって一緒に脱着する方法が開示されている。

プロトロンビン−コンプレックスが種々の蛋白質、例え
ば血液凝固ファクター■、ファクターＶＩＩ、■および
Ｘ並びに血液凝固抑制剤例えば蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ
を含有していることも公知である。プロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分は異なる生物学的作用を示し、特
に互いに全く拮抗する血液凝固ファクターと血液凝固抑
制剤を考える時にそうである。

医薬文献には、プロトロンビン−コンプレックスの一つ
の成分を合成する能力ない患者に、血液の血漿にその成
分が欠けている為に現れる遺伝的病気が開示されている
。凝固ファクターの一つが欠けていることが、血友病を
生ぜしめる。例えばファクター■が欠けていると血友病
Ｂが生じる。一方二つの凝固抑制剤の一つが欠けている
と患者に血栓症を生せしめる。しかしながらこれらの全
く異なる病気の治療は、不足を補充する為にプロトロン
ビン−コンプレックスである同じ血漿誘導体を用いるこ
とより成る。

明らかに、不足した凝固ファクターと血液凝固抑制剤と
の同時投与が、血友病患者の流血傾向を増加させ、一方
血栓症にかかっている患者においては、必要とされる抑
制剤に加えて凝固ファクターを同時に投与することが血
栓症の危険を増加させ得る。

凝固ファクターの欠乏する患者を不足した凝固ファクタ
ーだけを含有する□換言すれば、抑制因子を含まない□
調製剤で治療しそして抑制因子の一つの不足した患者は
如何なるファクターも含まない関係する抑制因子だけを
含有する調製剤で治療するのが明かに有利である。

プロトロンビン−コンプレックスの各成分ヲ本質的に分
離する方法は、例えばＳ、Ｐ、Ｂａｊａｊ等によってザ
・パブリケーション・プレパラテブ・パイコケミスドリ
ー（ｔｈｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｅ−ｐａｒ
ａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ）、１３（３
）　、第１９１〜２１４頁、（１９８３）に開示されて
いる。この方法は以下の方法段階で構成されている： 血漿を硫酸アンモニウムで飽和させた（３３χ）後に、
沈澱する蛋白質を捨てそして上澄み残留物を硫酸アンモ
ニウムで濃厚化して６６〜７０χの飽和状態する。沈澱
する蛋白質を捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリウ
ム塩（Ｂａ（／！またはＢａ５Ｏ１）を添加しそして沈
澱する蛋白質を捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリ
ウム塩での沈澱処理は、硫酸アンモニウムで別々に沈澱
させる前に実施してもよい。次いで、蛋白質を、ＤＥＡ
Ｒ−ゲル−カラムでの吸着処理および溶出用緩衝溶液中
のイオン濃度を徐々に増加させることで徐々に溶出する
ことによる分別脱着処理に委ねる。しかしながらこのゲ
ル−クロマトグラフィー処理の後に、プロトロンビン−
コンプレックスの各成分は完全には分離されないので、
準備されたアクリルアミド電気泳動法で構成される別の
段階が提案されている。

上記の分別法は、生物化学的試験管内試験での為にまた
は抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）を製造する為の動物の免
疫法の為に実験室規模でプロトロンビン−コンプレック
スの各ファクターを製造するのにのみ適している。従来
技術によれば、アクリルアミド−電気泳動法は、例えば
ｓ、ｏｏｏ血漿単位より少ないファクターＩＸの如き少
ない量の蛋白質でしか実施できない、更に、電気泳動と
は別に、この方法の残りの各段階は非常に時間が掛りそ
してこの長たらしい方法の間に蛋白質の酵素的変性を減
少させる為にベンズアミジンのようなプロテアーゼ抑制
因子を用いる必要がある。よく説明されであるように、
これらのプロテアーゼ抑制因子は著しい毒性があるので
、人間の蛋白質調製物中で適用することは不可能である
。更に、沈澱の為にバリウム塩を用いることは、これら
の成分がおまけに毒性を有する為に望ましくない。

〔発明の構成〕

それ故に本発明の対象は、上記の欠点を回避する為に、
イオン交換ゲルによって吸着される蛋白質の各成分、特
にプロトロンビン−コンプレックスの各成分を分離する
改善された方法を提供することである。

この課題および後述によって明らかになる他の課題は、
クロマトグラフィー−カラム中のゲルによって吸着され
た蛋白質を、徐々に変化するイオン濃度および実質的に
一定のｐＨ−値を持つ緩衝溶液で溶出して、ゲルから蛋
白質を徐々に脱着しそして溶出物を提供し、そして溶出
物を別々の蛋白質分別物に分別することによって達成さ
れる。

本発明の別の実施形態によれば、緩衝溶液のイオン濃度
を１００〜４００ｍｖａｌおよび４００〜４０００ｍｖ
ａｌの範囲で連続的に変化させそして一方ｐｌ＋−値を
５〜８の範囲で実質的に一定に維持することによって傾
斜的溶出が達成される。場合によっては、ｐト値を３〜
９の範囲で連続的に変化させ、他方イオン濃度を１００
〜４００ｍｖａｌ　、特に１００〜４００ｍｖａ　ｌの
範囲で一定の水準に実質的に維持してもよい。

本発明者は、アニオン交換ゲル、特に［）ＥＡＩ！−ゲ
ルで実施しそして、所望の傾斜溶出を達成する為には、
溶出剤としてイオン濃度が増加しそしてｐＬ値が一定で
あるかまたはｐＨ−値が増加してそしてイオン濃度が実
質的に一定である緩衝溶液を用いるのが特に有利である
ことを見出した。

本発明の別の実施形態によれば、クロマトグラフィー−
カラム、該クロマトグラフィー−カラムに連結されてお
りそして第一緩衝溶液を含有する最初の貯蔵用容器、上
記クロマトグラフィー−カラムに連結されておりそして
互いに連結された二つの部屋に分けられている第二の貯
蔵用容器で構成されている、イオン交換ゲルによって吸
着された蛋白質を分離する装置である。

上記部屋の一つは第一の緩衝溶液を含有しており、一方
第二の部屋が第一の緩衝溶液と第二の緩衝溶液とを勾配
的に混合した時に、勾配をはっきり示すようにより大き
い溶出力の第二緩衝溶液を含有している。

撹拌機が、第二の緩衝溶液を第一の緩衝溶液中に導入し
た時に、混合する間に第二の貯蔵用容器の一つの部屋の
中に装備しているのが好ましい、クロマトグラフィー用
カラムから搬出される溶出物は、溶出物の紫外線吸着に
依存して適当な制御単位によって監視する。

本発明では、蛋白質の各成分、例えばプロトロンビン−
コンプレックスおよびトランスフェリンは、毒性のプロ
テアーゼ抑制因子または毒性のバリウム塩を用いる必要
なく、大規模に精製できる。それ故に、蛋白質の各成分
は毒性成分を含まず且つＳ、Ｐ、　Ｂａｊａｊによって
開示された小規模の方法で得られる各成分よりも優れて
いる。本発明の方法でえられる生成物は、人間に投与す
るのに適しており、ヨーロッパ薬局法に適合している。

〔実施例〕

以下の実施例によって、プロトロンビン−コンプレック
スの各成分への本発明に従う分離法を説明する。この実
施例は本発明を限定するものではない。

１、イオン交換ゲルによる血漿蛋白質の吸着：イオン交
換ゲル、例えば乾燥状態または水溶液中で膨潤したＤＥ
ＡＲ−ゲル　を血液の血漿または凍結蛋白質の除去後の
血液血漿の如き血液血漿分別物に添加する。ゲルを、所
望の蛋白質成分が該ゲルによって本質的に吸着されるま
で蛋白質溶液と一緒に撹拌する。トランスフェリンおよ
びプロトロンビン−コンプレックスのファクター（ファ
クターＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ１蛋白質Ｃ１蛋白質Ｓ）
が全てこの方法でＤｌｌ！ＡＥ−ゲルによって吸着され
る。

特に、ＤＥＡＥ−ゲル、なかでもＤＩＥＡＨ−セファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ａ５０は凍結蛋白質を含
まない血液血漿に０〜２０℃、特に０°Ｃで１ｊ！の血
漿当たり０．２〜１０ｇ　、特に０．５ｇの量で添加す
る。

ゲルを血漿溶液中で１／４〜１０時間、殊に４時間撹拌
することによって懸濁状態を維持する。その後に、ゲル
を残留血漿から重力によってまたは遠心分離によって沈
澱させそして上澄みの残留血漿を次いで分離することに
よって分離する。

２、ゲルによって吸着された蛋白質のゲル−クロマトグ
ラフィー分離 この方法段階を更に詳細に説明する為に、本発明の装置
の添付図面について説明する。

第１図は本発明の蛋白質コンプレックスの各成分を分離
する為の装置の一実施態様を概略的に図示したものであ
る。

第２図はクロマトグラムをグラフで図示したものである
。

第１図について述べると、このものは本発明に従って蛋
白質をその各成分に分離する装置の一実施態様を概略的
に図示したものである。最初のクロマトグラフィー用カ
ラム（ＧＳＩ）はポンプ（Ｐｌ）および三方弁を経て、
ゲルによって吸着して残す為の分別されるべき蛋白質は
許容するがゲルに対して親和力の低い不所望の洗去する
べき蛋白質は許容しない塩濃度およびｐＬ値の緩衝溶液
（ＰＲＩ）を含有する第一の貯蔵容器（Ｒ１）に連結さ
れている。

適する三方弁ｖ２およびＲ３を経てクロマトグラフィー
−カラム（ＧＳＩ）に連結されているのは、ポンプ（Ｒ
２）を経て貯蔵容器（Ｒ１）に連結されている第二のク
ロマトグラフィー−カラム（ＧＳ２）である。三方弁（
Ｒ４）は分別用コレクター（ＰＲ）を備えたカラム（Ｇ
Ｓ２）に連結されている。更にカラム（ＧＳＩ）は弁（
ｖｌ）を経て、二つの部屋（Ｒ２ａ）および（Ｒ２ｂ）
を持った第二の貯蔵容器（Ｒ２）に連結されている。二
つの部屋は弁（図示してない）を備えたパイプ（ＶＲ）
を経て互いに連絡されている。部屋（Ｒ２ａ）には、貯
蔵容器（Ｒ１）中における緩衝溶液（ＰＲＩ）と同様の
緩衝溶液（ＰＲ２）が入っておりそしてその中に含有さ
れる溶液と混合する為の撹拌装置（Ｍ）を備えている０
部屋（Ｒ２ｂ）は、ゲルから所望の全ての血漿蛋白質を
吸着するのに充分な塩濃度およびＨ゛−イオン濃度を有
する緩衝溶液（ＰＲ２）より大きい溶出力の緩衝溶液（
ＰＲ３）が入っている。

部屋（Ｒ２ａ）と（Ｒ２ｂ）とをパイプ（ＶＲ）を経て
連結することによって、緩衝溶液（ＰＲ３）を導入する
ことによって緩衝溶液（ＰＲ２）のイオン濃度を徐々に
増加させそして実質的にｐＨ−値を一定水準に実質的に
維持することによっであるいはｐＨ−値を徐々に増加さ
せそしてイオン濃度を実質的に一定に維持することによ
って勾配が明らかになる。最初の場合には、カラム（Ｃ
３Ｉ）へ供給する緩衝溶液のイオン濃度を１００〜４０
００ｍｖａ　Ｉ、殊に１００〜４００＋５ｖａｌの範囲
で徐々に変化させそしてｐＨ−値を５〜８の範囲で実質
的に一定に維持する。後者の場合には、ｐＨ−値を３〜
９の範囲で連続的に変化させそしてイオン濃度を１００
〜４００＋＋ｖａｌおよび４００〜４０００ｏｖａｌの
範囲の水準で実質的に一定の水準に維持する。

各カラム（ＧＳＩ）　、（ＧＳ２）の出口に紫外線測定
装置（ＵＶＩ）　、（ＵＶ２）が接続されている。矢印
によって示したように、紫外線測定装置（ＵＶＩ）、（
ＵＶ２）は、例えばカラム（ＧＳＩ）　、（ＧＳ２）の
溶出物中の蛋白質濃度の紫外線吸着性に依存して装置（
Ｋ）を制御する為の信号を送り平衡の終わりを示し且つ
カラム（ＧＳＩ）　、（ＧＳ２）での洗浄段階および溶
出物の分別を指示する。紫外線測定装置（ＵＶＩ）　、
（ＵＶ２）によって与えられる情報に依存して制御装置
（Ｋ）が弁（ｖｌ）、（Ｒ２）、（Ｒ３）、（Ｒ４）、
ポンプ（Ｐｌ）、（Ｒ２）および撹拌機（Ｐｌ）を破線
で示したように作動させる。

本発明の装置は、有利な実施形態においては、ゲルによ
って吸着された蛋白質をコンピュータ制御で分別するこ
とを可能としそして次のような操作を行う： 蛋白質の負荷したゲルをカラム（ＧＳＩ）に供給しそし
て蛋白質未負荷のゲルをカラム（ＧＳ２）に充填する。

弁（ｖｌ）および（Ｒ３）を経て、カラム（ＧＳｌ）　
、（ＧＳ２）で貯蔵容器（Ｒ１）から緩衝溶液・（ＰＲ
ｌ）にて溶出する。カラム（ＧＳＩ）においては、不所
望の蛋白質をゲルから洗去し、一方力ラム（ＧＳ２）で
は緩衝溶液（ＰＲＩ）によって平衡状態にされる。満足
な洗去および個々のカラム（ＧＳＩ）、（ＧＳ２）の平
衡を達成する為には、緩衝溶液容量をカラムの容量の三
倍と計算する。

緩衝溶液（ＰＲＩ）の有効な条件のもとてゲルに対して
全く親和性を有していない蛋白賞金てが洗去されるや否
や、紫外線測定装置（ＵＶＩ）が、洗浄段階を終了した
ことを示す信号を制御装置（Ｋ）に伝達する。同時に制
御装置（Ｋ）が、カラム（ＧＳＩ）を貯蔵容器（Ｒ２）
の部屋（Ｒ２ａ）から緩衝溶液（ＰＲ２）を供給しそし
て得られるカラム（ＧＳｌ）の搬出物を弁（Ｒ３）によ
って貯蔵容器（ＰＲＩ）から隔離されるカラム（ＧＳ２
）に供給するように弁ｍ）、（Ｒ２）　（Ｒ３）を作動
させる。カーフ　ム（ＧＳＩ）と貯蔵容器（Ｒ２）の部
屋（Ｒ２ａ）との解放連結するのと同時に、撹拌機（Ｍ
）が作動しそして緩衝溶液（ＰＲ３）を適当なポンプ（
図示してない）によってパイプライン（ＶＲ）を通して
部屋（Ｒ２ａ）に部屋（Ｒ２ｂ）からポンプ供給し、一
方ポンプ（Ｒ２）のスイッチを切る０次いで、貯蔵容器
（Ｒ２）の連結された部屋（Ｒ２ａ）　、（Ｒ２ｂ）に
よって勾配が限定され、その結果カラム（ＧＳＩ）内の
ゲルに付着する種々の蛋白質がゲルに対する親和性に依
存して溶出される。カラム（ＧＳ２）においては、蛋白
質が、官能基が実質的にないゲルによって短時間の間に
再び吸着される。傾斜を急にすることで生じる脱着は、
クロマトグラフィーの分離のシャープさを著しく増加さ
せる。

紫外線吸着がカラム（ＧＳ２）の溶出物中で増加するや
いなや、溶出物を弁（ｖ４）を経て搬出して分別物コレ
クター（ＰＲ）にいれる０分別物コレクター（ＰＲ）を
一定の容量に従って各分別物を蓄積するかまたは各分別
物を形成する為に（吸着のピークにより）ピーク制御し
てもよい。

二つのカラムを用いる必要がないことに注目するべきで
ある。むしろ本発明の方法は、カラム（ＧＳＩ）の如き
カラム一つでけを持つ装置でも実施した方がよいことも
ある。上記の方法はクロマトグラフィー−カラム中で蛋
白質の負荷したゲルの下に未負荷の平衡状態のゲル下側
層を形成するように変えることもできる。

以下に本発明の方法および装置を、プロトロンビン−コ
ンプレックスのトランスフェリンおよび各ファクターを
口ＥＡＥ−ゲルの充填されたクロマトグラフィーによっ
て分離することに関して例示的に記載する。この例を簡
略図だけで説明しているが、これによって本発明は限定
されるものではない。

カラム（ＧＳＩ）に蛋白質の負荷したＤＥＡＥ−ゲル（
Ｄｔ！ＡＨ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ３０）をカラム（Ｇ
ＳＩ）と同じゲル容量で充填する。このゲルを、Ｒ２０
に０．０２モルの燐酸塩、０．０１モルのクエン塩およ
りｏ、　ｔｓモルの°ＮａＣｌを溶解してなるｐト値６
にＮａ０１１で調整した緩衝溶液（ＰＲＩ”）中で２０
°Ｃで膨潤させる。

カラム（ＧＳＩ）　、（ＧＳ２）を緩衝溶液、特に１１
のカラム容積当たり３１の緩衝溶液で別々に洗浄する。

カラム（ＧＳＩ）　、（ＧＳ２）を次いで連結した後に
、傾斜溶出を部屋（Ｒ２ｂ）から部屋（Ｒ２ａ）に緩衝
溶液を導入することによって開始する。部屋（Ｒ２ｂ）
中の緩衝溶液（ＰＲ３）の容量は、好ましくは部屋（Ｒ
２ａ）中の緩衝溶液（ＰＲ２）の容積に相応する。緩衝
溶液（ＰＲ３）は好ましくは０．０２モルの燐酸塩、０
．０１モルのクエン酸塩および０．５モルのＮａＣｌを
ＨｌＯが溶解されており、２０°ＣでＮａＯＨでｐＨ−
値６に調節されている。

カラム（ＧＳ２）の出口に設置した紫外線測定装置が紫
外線吸着の増加を記録するやいなや、分別物を集める。

好ましくは、貯蔵容器（Ｒ２）の部屋（Ｒ２ａ）　、（
Ｒ２ｂ）中の全容積が２０　ｆ　（４０の分別物）の場
合には、フラクシッン当たり１／２１の溶出容量を集め
る。゛試験用サンプルを分析の為に各留分から取る。各
試験用サンプルを、それらの蛋白質含有量、ファクター
ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘの含有量並びに蛋白質Ｃおよび
蛋白質Ｓの含有量について後記の方法によって試験する
。

今度は、トランスフェリン並びにプロトロンビン−コン
プレックスの各成分の代表的な溶出ダイヤ夛ラムを示し
た第２図について説明する。

若干の隣接する分別物中で蛋白質成分を溶出する場合に
は、これらの分別物を一緒にしそして透析、熱処理、ウ
ィルス不活性化、大量の凍結乾燥、水中への溶解および
塩含有量およびｐｕ−値の調節、分別による滅菌および
容器中での煮沸、最終生成物の凍結乾燥の如き公知の方
法に従って人間に適用するよう処理する。

溶出の順序は最初の生成物の異なった条件および方法パ
ラメータで変えることができる。この方法は、蛋白質Ｃ
および蛋白質Ｓを単離するのに特に有利である。

以下にトランスフェリン、ファクターＩＩ、ＶＩＩ、■
およびＸ、蛋白質Ｓおよび蛋白質Ｃを測定する為の方法
を示す。

Ａ）　トランスフェリン： 人間のトランスフェリンの免疫血清特効薬を用いること
によってラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）の電気的免疫拡散
法により測定する。

Ｂ）ファクター■： 人間のファクターＨの為の免疫血清特効薬を用いること
によってラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）の電気的免疫拡散
法により測定する。ファクターＩＩの不足する血漿を用
いてトロンボプラスチン時間（プロトロンビンがトロン
ビンに転化スる時間）にて官能的に測定する。

Ｃ）ファクター■： ファクター■の不足する血清を用いることによってトロ
ンボプラスチン時間にて官能的に測定する。

Ｄ）ファクター■ ファクターＩＸの為の免疫血清特効薬を用いることによ
ってラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）の電気的免疫拡散法に
より測定する。ファクターＩＸの不足する血清を用いる
ことによって活性化部分的トロンボプラスチン時間にて
官能的に測定する。

Ｅ）ファクターＸ ファクターＸの不足する血清を用いることによって時間
により官能的に測定する。

Ｆ）蛋白質Ｃ： “ＥＬＩＳＡ−プロティンＣ”の名称で市販されている
試験用用具にて酵素免疫学的検査によって測定する。Ｔ
ｈ、　Ｖｕｋｏｖｉｃｈのウィナ−・クリニック・ボッ
ヘンシュリフト（Ｗｉｅｎｅｒ　ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ　
Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ）９７．９．１９８５．４
４５に開示された方法で官能的に測定するかまたはベー
ジング・ジアグノチカ（Ｂｅｈｒｉｍｇ　Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｋａ）から市販されている試験用具を用いて官能
的に測定する。

後者の方法は最終生成物の品質制御の為に極めて有利で
あることが判っている。分別蛋白質Ｃを同定する為に、
凝固促進成分の為の実例的試験方法は以下の通りである
。

溶出サンプルを、遠心分離によって後で除かれる不溶性
トロンビンと一緒に装置し、一方上澄み残渣を標準血漿
と１＋１の比で混合する。この混合物の活性化部分的ト
ロンボプラスチン時間を標準血漿と緩衝溶液との対照用
調製物と比較する。サンプル中の蛋白質Ｃの存在が、対
照用調製物との比較で活性化部分的トロンボプラスチン
時間の延長によって明らかになり、一方サンプル中の凝
固ファクターの存在がトロンボプラスチン時間の短縮を
明らかにする。

Ｇ）蛋白質Ｓ： 蛋白質Ｓの不足するものの活性化部分的トロンボプラス
チン時間へのトロンビン−セファローゼ活性化蛋白質Ｃ
の抑制作用の指数を測定することによって官能的に測定
する。

本発明に従う方法によって分離される蛋白質分別物の適
応： １、分別トランスフェリン トランスフェリンの先天的なまたは後天的な不足症での
適用；鉄分不足の貧血、バクテリヤ感染での投与；悪性
の腫瘍での投与。

２、ファクター■： ファクターＩＩの先天的なまたは後天的な不足症での適
用：傷の治療においての“フィブリン接着剤剤としての
フィブリノーゲンと一緒での投与。

３、ファクター■： ファクター■の先天的なまたは後天的な不足症での適用
：血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。

４、ファクター■ ファクターＩＸの先天的なまたは後天的な不足症での適
用：血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。

５、ファクターＸ ファクターＸの先天的なまたは後天的な不足症での適用
；血友病＾および血友病Ｂでの適用。

６、蛋白質Ｃ： 蛋白質Ｃの先天的なまたは後天的な不足症での適用：抹
消−および中枢血管疾患、静脈疾患での適用：血小板閉
塞形成症での適用：リンパ管内の凝固パティ（ｃｏａｇ
ｕｌｏｐａｔｙ）　：血栓症予防の為の適用：マーフマ
ルＭａｒｋｏｕ■ａｒ）で誘発されたスキン・ネクロー
ゼの予防および治療の為の適用：呼吸窮迫症候群での適
用：蛋白質Ｓ不足症　　゛への適用：化学療法での適用
。

７、分別蛋白質Ｓ： 蛋白質Ｓの先天的なまたは後天的な不足症での適用；蛋
白質Ｃの不足症での適用；　６の所で記した全てでの適
用。

８、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの混合分別物：６の所で記
した全てでの適用。

本発明の、方法により分離された蛋白質分別物の特徴的
な組成： １、分別トランスフェリン： 分別物中に含まれる蛋白質の９０χより多くがトランス
フェリンである。同種凝集素のアンチ−Ａ、アンチ−Ｂ
を追跡できない。Ｉｇのトランスフェリン当たりのファ
クターＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ１蛋白質Ｃおよび蛋白質
Ｓが１０単位より少ない。

２、分別ファクター■： 同種凝集素のアンチ−Ａ、アンチ−８を追跡できない。

ファクター■の１血漿単位当たり０．２血漿単位より少
ないファクターＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ１蛋白質Ｃおよ
び蛋白質Ｓ。

３、分別蛋白質Ｓ： １ｍの溶液光たり５０血漿単位の蛋白質Ｓの濃縮物にお
いて、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚的
に検出できずそして濃度が１０−血漿単位より少ないフ
ァクターＶＩＩ、ＩＩ、ＩＸ、Ｘを含有し、活性化凝集
ファクターが非活性部分的トロンボプラスチンで追跡で
きずそして活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮
が、１ｍｌ当たり４０ＮＩＨ一単位でトロンビン−セフ
ァローゼと一緒に３７℃で２時間温置した後に検出でき
ずそして標準血漿との１＋１の比の混合物中のトロンビ
ン−セファローゼを除きそして該濃縮物が１Ｏｎ＋ｇよ
り少ない蛋白質を含有する。

４、分別蛋白質Ｃ： ｌ＃！１！の溶液光たり５０血漿単位の蛋白質Ｃの濃縮
物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が
視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少ないファ
クターＶＩＩ、ＩＩ、ＩＸ、Ｘが検出でき、活性化部分
的トロンボプラスチン時間の短縮と言うよりもむしろ延
長がｌｌｌ１１の混合物当り＃）４０ＮＩＨ一単位でト
ロンビン−セファローゼと一緒に３７℃で２時間温置し
た後に、検出できそして標準血漿との１＋１部の比の混
合物中のトロンビン−セファローゼを除きそして活性化
凝固ファクターが非活性化部分的トロンボプラスチン時
間で検出できずそして該濃縮物が１０ｍｇより少ない蛋
白質を含有する。

４ａ、分別蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ： ｌａｄの溶液光たり３０〜５０血漿単位の蛋白質Ｃおよ
び蛋白質Ｓの濃縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血
球の同種凝集素が視覚的に検出できずそして濃度が１０
血漿単位より少ないファクターＶＩＩ、ＩＩ、ＩＸ、Ｘ
が検出でき、活性化部分的トロンボプラスチン時間の短
縮と言うよりもむしろ延長がｌｌｌ１の混合物当たり４
０ＮＩＨ一単位でトロンビン−セファローゼと一緒に３
７℃で２時間温置した後に検出できそして標準血漿との
１＋１の比の混合物中のトロンビン−セファローゼを除
きそして活性化凝固ファクターが活性化部分的トロンボ
プラスチン時間で検出できずそして該濃縮物がＩＯＢよ
り少ない蛋白質を含有する。

５、分別ファクター■： ｌｄの溶液光たり５０血漿単位のファクターＩＸの濃縮
物において、血液群＾またはＢの赤血球の同種凝集素が
視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少ない蛋白
質Ｃおよび蛋白質Ｓを含有する濃縮物が非活性化部分的
トロンボプラスチン時間（ヘパリンおよび／またはアン
チトロンビンＩＩＩの添加せず）にて追跡できそして該
濃縮物が１０ｍｇより少ない蛋白質を含有する。

６、分別ファクター■： １Ｊｌｄ！の溶液光たり５０血漿単位のファクターＩＩ
の濃縮物において血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集
素が視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少ない
蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓがその中に含有されている。

７、分別ファクターＸ： ｌｙｄの溶液光たり５０血漿単位のファクターＸの濃縮
物において、血液群＾またはＢの赤血球の同種凝集素お
よび１０血漿単位より少ない蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓが
その中に含まれており、活性化凝固ファクターが非活性
化部分的トロンボプラスチン時間でヘパリンおよび／ま
たはアンチトロンビンＩＩＩの添加なしに検出できそし
て該濃縮物が２０ｍｇより少ない蛋白質を含有する。

それ故に、前述の説明から明らかになることの中の前に
説明した課題が効果的に達成されることは明らかであり
そして、上記の方法を実施した時に生じ得る一定の変更
および組成物も本発明の精神および範囲から逸脱してい
ないので、上記の説明に包含されるあらゆるものが実例
と解釈されるべきであり且つ本発明は該実例に制限され
るものではない。

また、特許請求の範囲において単独で各成分および各化
合物を記したが、常識的に許容されるか＼る成分の適合
性のある如何なる混合物も本発明に包含されると理解さ
れるべきである。

【図面の簡単な説明】

第台図は、本発明の蛋白質コンプレックスの各成分を分
離する為の装置の一実施態様を概略的に図示したもので
ある。 第２図は、トランスフェリンまたはプロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分の代表的な溶出クロマトグラムを
グラフで図示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）−二つのパラメーターによって規定されておりそし
   てその一つが、もう一方がゲルから蛋白質が徐々に脱着
   しそして溶出物を供給するような水準に実質的に一定に
   維持されている間に徐々に変化する、溶出剤の如き緩衝
   溶液でクロマトグラフィー用カラム中のゲルによって吸
   着された蛋白質を徐々に溶出し、上記両方のパラメータ
   ーがイオン濃度とＰＨ−値でありそして−溶出物を別々
   の蛋白質分別物に分別する各段階で構成されていること
   を特徴とする、イオン交換用ゲルによって吸着された蛋
   白質を分離する方法。 ２）分離段階が、溶出物をトランスフェリン、ファクタ
   ーII、ファクターVII、ファクターIX、ファクターＸ、
   蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓより成る群から選択される分別
   物に分別することを包含する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３）徐々に溶出する段階が緩衝溶液のイオン濃度が徐々
   に変化することおよび緩衝溶液のｐＨ−値を実質的に一
   定水準に維持することを包含する特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４）緩衝溶液のイオン濃度を１００〜４００ｍｖａｌお
   よび４００〜４０００ｍｖａｌの範囲で連続的に変化さ
   せそしてｐＨ−値を５〜８の範囲で実質的に一定に維持
   する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５）徐々に溶出する段階がｐＨ−値を徐々に変化させる
   ことおよびイオン濃度を実質的に一定水準に維持するこ
   とを包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）緩衝溶液のｐＨ−値を３〜９の範囲で連続的に変化
   させそしてイオン濃度を１００〜４００ｍｖａｌの範囲
   で実質的に一定の水準に維持する特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７）イオン濃度を１００〜４００ｍｖａｌの範囲で実質
   的に一定の水準に維持しる特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８）イオン交換ゲルがアニオン系交換ゲルである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ９）アニオン系交換ゲルがジエチルアミノエチル（ＤＥ
   ＡＥ）−ゲルである特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０）更に、吸着された蛋白質の負荷したアニオン系交
   換ゲルを最低イオン濃度の別の緩衝溶液と平衡状態にす
   る段階を、徐々に溶出する段階の前に包含する特許請求
   の範囲第９項記載の方法。 １１）更に、吸着された蛋白質の負荷したアニオン系交
   換ゲルを最高ｐＨ−値の別の緩衝溶液との平衡状態にす
   る段階を、徐々に溶出する段階の前に包含する特許請求
   の範囲第９項記載の方法。 １２）徐々に溶出する段階が、１００〜４００ｍｖａｌ
   の範囲のイオン濃度の最初の緩衝溶液を４００〜４，０
   ００ｍｖａｌの範囲のイオン濃度の第二の緩衝溶液に添
   加することによって溶出剤中に徐々に溶出するよう調節
   することを包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３）徐々に溶出する段階が、６〜８のｐＨ−値の最初
   の緩衝溶液を５〜７のｐＨ−値の第二の緩衝溶液に添加
   することによって溶出剤中に徐々に溶出するよう調節す
   ることを包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４）更に、未負荷の平衡化されたゲルにて、徐々に溶
   出する段階から得られる溶出物を精製することを包含す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５）徐々に溶出する段階が蛋白質吸着ゲルの下に未負
   荷の平衡化ゲルの層を形成することを包含する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 １６）更に、溶出物の紫外線吸着を監視する段階を包含
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７）更に、同定するべき蛋白質の為の抗血清特効薬を
   用いることによる免疫学的方法により分別物を同定する
   段階を包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １８）更に、同定するべき蛋白質の為の機能的方法特性
   によって分別物を同定する段階を包含する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 １９）更に、不溶性のトロンビンと一緒に溶出物のサン
   プルを温置し、上澄み残留物から遠心分離によってトロ
   ンビンを除き、１＋１の比で標準血漿と混合しそしてそ
   の混合物の活性化部分的トロンボプラスチン時間を対照
   調製物の一つと比較することによって蛋白質Ｃおよび凝
   固ファクターの存在を同定しそして各ファクターを凝固
   させる段階―この段階で、凝固ファクターの存在が混合
   物の活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮を示す
   のに、該時間の延長を蛋白質Ｃの存在が示す―を包含す
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ２０）対照調製物が標準血漿および緩衝溶液を含有する
   特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１）最初の緩衝物および第二の緩衝物を燐酸塩、クエ
   ン酸塩、ＮａＣｌおよびＮａＯＨより成る群から選択す
   る特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２２）徐々に溶出する段階を、以下の各段階−血漿蛋白
   質を含有する溶液にイオン交換ゲルを添加する段階、 −所望の蛋白質を吸着する為の懸濁液中にゲルを保持す
   る為に溶液中でゲルを撹拌する段階および −吸着した蛋白質を持つゲルを残留血漿から分離する段
   階 によって進める特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２３）ゲルを血漿蛋白質の溶液１ｌ当たり０．２〜１０
   ｇの量で０〜２０℃の範囲の温度で血漿蛋白質の溶液に
   添加する特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４）ゲルを０℃の温度で添加する特許請求の範囲第２
   ３項記載の方法。 ２５）ゲルを血漿蛋白質の溶液１ｌ当たり０．５ｇの量
   で添加する特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６）ゲルを血漿蛋白質の溶液中で１／４〜１０時間撹
   拌する特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２７）ゲルを血漿蛋白質の溶液中で４時間撹拌する特許
   請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８）更に、適当なイオン濃度およびｐＨ−値の緩衝溶
   液を不所望の蛋白質を洗去する為のクロマトグラフィー
   用カラム中に、徐々に溶出する段階の前に導入する段階
   を包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２９）緩衝溶液がクロマトグラフィー用カラムの容積の
   三倍の容量である特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０）イオン交換ゲルによって吸着された蛋白質を分離
   する装置において、 −二つのパラメーターによって規定されておりそしてそ
   の一つが、もう一方がゲルから蛋白質が徐々に脱着され
   そして溶出物を供給するような水準に実質的に一定に維
   持されている間に徐々に変化する溶出剤の如き緩衝溶液
   で、クロマトグラフィー用カラム中のゲルによって吸着
   された蛋白質を徐々に溶出するクロマトグラフィー手段
   ―但し、上記両方のパラメーターはイオン濃度およびＰ
   Ｈ−値である――および −溶出物を別々の蛋白質分別物に分別する手段より成る
   、上記装置。 ３１）クロマトグラフィー手段が少なくとも一つのクロ
   マトグラフィー用カラム、該クロマトグラフィー用カラ
   ムに連結されそして適当な溶出用粉末の最初の緩衝物を
   含有している最初の貯蔵用容器、クロマトグラフィー用
   カラムに連結されそして互いに連結された二つの部屋に
   分けられている第二の貯蔵用容器を包含しており、上記
   の部屋の一方には上記の緩衝溶液が入れられておりそし
   てもう一方の部屋には、第二の緩衝溶液と第一の緩衝溶
   液とを徐々に混合した時に勾配をはっきり示すように、
   最初の緩衝溶液より大きい溶出力の第二の緩衝溶液が入
   っている特許請求の範囲第３０項記載の装置。 ３２）更に、第一の緩衝溶液と第二の緩衝溶液とを充分
   に混合する為に第二の貯蔵容器中に撹拌手段が配置され
   ている特許請求の範囲第３１項記載の装置。 ３３）分別手段が、制御単位および、溶出物の紫外線吸
   着に依存して該制御単位に信号を送るように溶出物を監
   視するべく、クロマトグラフィー用カラムに協力する紫
   外線測定装置を包含している特許請求の範囲第３１項記
   載の装置。 ３４）更に、クロマトグラフィー用カラムを通る流れを
   調整する為の弁およびポンプ、紫外線測定装置によって
   送られる信号に依存して制御単位によって作動される弁
   およびポンプを包含する特許請求の範囲第３３項記載の
   装置。 ３５）更に、第二のクロマトグラフィー用カラムが最初
   のクロマトグラフィー用カラムに後続して連結されそし
   て第一の貯蔵用容器に連結されており、第一のクロマト
   グラフィー用カラムに蛋白質の負荷したゲルを供給しそ
   して第二のクロマトグラフィー用カラムに未負荷のゲル
   を供給する特許請求の範囲第３０項記載の装置。 ３６）精製されたトランスフェリンを含有する製剤調製
   物。 ３７）人間に投与するのに適する状態のトランスフェリ
   ンを含有する製剤調製物。 ３８）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していないトランスフェリンを含有する製剤
   調製物。 ３９）精製されたファクターVIIを含有する製剤調製物
   。 ４０）人間に投与するのに適する状態のファクターVII
   を含有する製剤調製物。 ４１）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していないファクターVIIを含有する製剤調
   製物。 ４２）精製された蛋白質Ｓを含有する製剤調製物。 ４３）人間に投与するのに適する状態の蛋白質Ｓを含有
   する製剤調製物。 ４４）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していない蛋白質Ｓを含有する製剤調製物。 ４５）精製された蛋白質Ｃを含有する製剤調製物。 ４６）人間に投与するのに適する状態の蛋白質Ｃを含有
   する製剤調製物。 ４７）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していない蛋白質Ｃを含有する製剤調製物。 ４８）各凝固ファクターから精製された蛋白質Ｃおよび
   蛋白質Ｓを含有する製剤調製物。 ４９）人間に投与するのに適する状態の蛋白質Ｃおよび
   蛋白質Ｓを含有する製剤調製物。 ５０）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していない蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓを含有す
   る製剤調製物。 ５１）精製されたファクターIXを含有する製剤調製物。 ５２）人間に投与するのに適する状態のファクターIXを
   含有する製剤調製物。 ５３）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していないファクターIXを含有する製剤調製
   物。 ５４）精製されたファクターIIを含有する製剤調製物。 ５５）人間に投与するのに適する状態のファクターIIを
   含有する製剤調製物。 ５６）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していないファクターIIを含有する製剤調製
   物。 ５７）精製されたファクターＸを含有する製剤調製物。 ５８）人間に投与するのに適する状態のファクターＸを
   含有する製剤調製物。 ５９）プロテアーゼ抑制剤およびバリウム塩の如き毒性
   物質が存在していないファクターＸを含有する製剤調製
   物。 ６０）追跡可能なあらゆる同種凝集素のアンチ−Ａ、ア
   ンチ−Ｂを含有していない少なくとも９０％のトランス
   フェリンを含有しそして１ｇのトランスフェリン当たり
   ファクターII、VII、IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ
   を１０血漿単位より少なく含有する蛋白質含有量の特許
   請求の範囲第３６項記載の製剤調製物。 ６１）追跡可能なあらゆる同種凝集素のアンチ−Ａ、ア
   ンチ−Ｂを含有しておらずそして１血漿単位のファクタ
   ーVII当たり０．２血漿単位より少ないファクターII、
   IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓを含有する特許請求の
   範囲第３９項記載の製剤調製物。 ６２）１ｍｌの溶液当たり５０血漿単位の蛋白質Ｓの濃
   縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素
   が視覚的に検出できずそして濃度が１０血漿単位より少
   ないファクターVII、II、IX、Ｘを含有し、各活性化凝
   固ファクターが非活性部分部トロンボプラスチンで追跡
   できずそして活性化部分的トロンボプラスチン時間の短
   縮が１ｍｌ当たり４０ＮＩＨ−単位でトロンビン−セフ
   ァローゼと一緒に３７℃で２時間温置した後に検出でき
   ずそして標準血漿との１＋１の比の混合物中のトロンビ
   ン−セファローゼを除きそして該濃縮物が１０ｍｇより
   少ない蛋白質を含有する特許請求の範囲第４２項記載の
   製剤調製物。 ６３）１ｍｌの溶液当たり５０血漿単位の蛋白質Ｃの濃
   縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素
   が視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少ないフ
   ァクターVII、II、IX、Ｘが検出でき、活性化部分的ト
   ロンボプラスチン時間の短縮と言うよりもむしろ延長が
   １ｍｌの混合物当たり４０ＮＩＨ−単位でトロンビン−
   セファローゼと一緒に３７℃で２時間温置した後に、検
   出できそして標準血漿との１＋１部の比の混合物中のト
   ロンビン−セファローゼを除きそして活性化凝固ファク
   ターが非活性化部分的トロンボプラスチン時間で検出で
   きずそして該濃縮物が１０ｍｇより少ない蛋白質を含有
   する特許請求の範囲第４５項記載の製剤調製物。 ６４）１ｍｌの溶液当たり３０〜５０血漿単位の蛋白質
   Ｃおよび蛋白質Ｓの濃縮物において、血液群ＡまたはＢ
   の赤血球の同種凝集素が視覚的に検出できずそして濃度
   が１０血漿単位より少ないファクターVII、II、IX、Ｘ
   が検出でき、活性化部分的トロンボプラスチン時間の短
   縮と言うよりもむしろ延長が１ｍｌの混合物当たり４０
   ＮＩＨ−単位でトロンビン−セファローゼと一緒に３７
   ℃で２時間温置した後に検出できそして標準血漿との１
   ＋１の比の混合物中のトロンビン−セファローゼを除き
   そして活性化凝固ファクターが活性化部分的トロンボプ
   ラスチン時間で検出できずそして該濃縮物が１０ｍｇよ
   り少ない蛋白質を含有する特許請求の範囲第４７項記載
   の製剤調製物。 ６５）１ｍｌの溶液当たり５０血漿単位のファクターI
   Xの濃縮物において血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝
   集素が視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少な
   い蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓを含有する濃縮物が非活性化
   部分的トロンボプラスチン時間でヘパリンおよび／また
   はアンチトロンビンIIIの添加なしに追跡できそして該
   濃縮物が１０ｍｇより少ない蛋白質を含有する特許請求
   の範囲第４８項記載の製剤調製物。 ６６）１ｍｌの溶液当たり５０血漿単位のファクターI
   Iの濃縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種
   凝集素が視覚的に検出できずそして１０血漿単位より少
   ない蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓがその中に含有されている
   特許請求の範囲第５１項記載の製剤調製物。 ６７）１ｍｌの溶液当たり５０血漿単位のファクターＸ
   の濃縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝
   集素および１０血漿単位より少ない蛋白質Ｃおよび蛋白
   質Ｓがその中に含まれており、活性化凝固ファクターが
   非活性化部分的トロンボプラスチン時間でヘパリンおよ
   び／またはアンチトロンビンIIIの添加なしに検出でき
   そして該濃縮物が２０ｍｇより少ない蛋白質を含有する
   特許請求の範囲第４８項記載の製剤調製物。