JP2511449B2 - 蛋白質の分離方法 - Google Patents
蛋白質の分離方法Info
- Publication number
- JP2511449B2 JP2511449B2 JP62071922A JP7192287A JP2511449B2 JP 2511449 B2 JP2511449 B2 JP 2511449B2 JP 62071922 A JP62071922 A JP 62071922A JP 7192287 A JP7192287 A JP 7192287A JP 2511449 B2 JP2511449 B2 JP 2511449B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- gel
- buffer solution
- factor
- adsorbed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
- Y10S530/831—Cohn fractions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、蛋白質、特に人間の血漿から、人間の血漿
の凍結蛋白質の残留物からまたは細胞組織の残留物から
吸着される蛋白質をイオン交換ゲル、特にジエチルアミ
ノエチル（DEAE）ゲルの如きアニオン交換ゲルによって
分離する方法に関する。
の凍結蛋白質の残留物からまたは細胞組織の残留物から
吸着される蛋白質をイオン交換ゲル、特にジエチルアミ
ノエチル（DEAE）ゲルの如きアニオン交換ゲルによって
分離する方法に関する。
表面に担持された基を持ちそして血液の血漿に転化す
るゲルによって沢山の血漿蛋白質を吸着することは公知
である。これらのゲルによって蛋白質を表面で保持する
力は、用いる個々のゲルの官能基−−即ち、官能基が正
であろうが負であろうが（それ故にアニオンを吸着しよ
うがまたはカチオンを吸着しようが）に依存しており、
また担持される基の解離定数に依存しており、更に血液
の血漿とゲルとを混合する間を占有する条件、即ち第一
にイオン濃度、溶解されるイオンの種類、pH−値および
温度に依存している。
るゲルによって沢山の血漿蛋白質を吸着することは公知
である。これらのゲルによって蛋白質を表面で保持する
力は、用いる個々のゲルの官能基−−即ち、官能基が正
であろうが負であろうが（それ故にアニオンを吸着しよ
うがまたはカチオンを吸着しようが）に依存しており、
また担持される基の解離定数に依存しており、更に血液
の血漿とゲルとを混合する間を占有する条件、即ち第一
にイオン濃度、溶解されるイオンの種類、pH−値および
温度に依存している。
例えばDEAE−ゲルの如くアニオン交換効果を官能基と
して持つゲルを血液の血漿に添加した時に、血漿蛋白質
が、“プロトロンビン−コンプレックスの各ファクタ
ー”として公知であるゲルによって吸着される。蛋白質
を負荷したゲルは次いで残留血漿から簡単に分離でき
る。血漿蛋白質とイオン交換ゲルとの間の結合強度が周
囲の溶液のイオン濃度の増加につれて減少するので、蛋
白質は高いイオン濃度の溶液中でゲルから脱着し得る。
ドイツ特許第2,715,832号明細書、東独特許第148,297号
明細書および同第141,261号明細書およびモヨーロッパ
特許第0,041,173号明細書は、プロトロンビン−コンプ
レックスのファクターがDEAE−ゲルによって血液血漿か
ら吸着されそしてプロトロンビン−コンプレックスの個
々の成分に分離されることなしに高いイオン濃度の溶液
で該ゲルを洗浄することによって一緒に脱着する方法が
開示されている。
して持つゲルを血液の血漿に添加した時に、血漿蛋白質
が、“プロトロンビン−コンプレックスの各ファクタ
ー”として公知であるゲルによって吸着される。蛋白質
を負荷したゲルは次いで残留血漿から簡単に分離でき
る。血漿蛋白質とイオン交換ゲルとの間の結合強度が周
囲の溶液のイオン濃度の増加につれて減少するので、蛋
白質は高いイオン濃度の溶液中でゲルから脱着し得る。
ドイツ特許第2,715,832号明細書、東独特許第148,297号
明細書および同第141,261号明細書およびモヨーロッパ
特許第0,041,173号明細書は、プロトロンビン−コンプ
レックスのファクターがDEAE−ゲルによって血液血漿か
ら吸着されそしてプロトロンビン−コンプレックスの個
々の成分に分離されることなしに高いイオン濃度の溶液
で該ゲルを洗浄することによって一緒に脱着する方法が
開示されている。
プロトロンビン−コンプレックスが種々の蛋白質、例
えば血液凝固ファクターII、ファクターVII、IXおよび
Ｘ並びに血液凝固抑制剤例えば蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ
を含有していることも公知である。プロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分は異なる生物学的作用を示し、特
に互いに全く拮抗する血液凝固ファクターと血液凝固抑
制剤を考える時にそうである。
えば血液凝固ファクターII、ファクターVII、IXおよび
Ｘ並びに血液凝固抑制剤例えば蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ
を含有していることも公知である。プロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分は異なる生物学的作用を示し、特
に互いに全く拮抗する血液凝固ファクターと血液凝固抑
制剤を考える時にそうである。
医薬文献には、プロトロンビン−コンプレックスの一
つの成分を合成する能力ない患者に、血液の血漿にその
成分が欠けている為に現れる遺伝的病気が開示されてい
る。凝固ファクターの一つが欠けていることが、血友病
を生ぜしめる。例えばファクターIXが欠けていると血友
病Ｂが生じる。一方二つの凝固抑制剤の一つが欠けてい
ると患者に血栓症を生ぜしめる。しかしながらこれらの
全く異なる病気の治療は、不足を補充する為にプロトロ
ンビン−コンプレックスである同じ血漿誘導体を用いる
ことより成る。明らかに、不足した凝固ファクターと血
液凝固抑制剤との同時投与が、血友病患者の流血傾向を
増加させ、一方血栓症にかかっている患者においては、
必要とされる抑制剤に加えて凝固ファクターを同時に投
与することが血栓症の危険を増加させ得る。
つの成分を合成する能力ない患者に、血液の血漿にその
成分が欠けている為に現れる遺伝的病気が開示されてい
る。凝固ファクターの一つが欠けていることが、血友病
を生ぜしめる。例えばファクターIXが欠けていると血友
病Ｂが生じる。一方二つの凝固抑制剤の一つが欠けてい
ると患者に血栓症を生ぜしめる。しかしながらこれらの
全く異なる病気の治療は、不足を補充する為にプロトロ
ンビン−コンプレックスである同じ血漿誘導体を用いる
ことより成る。明らかに、不足した凝固ファクターと血
液凝固抑制剤との同時投与が、血友病患者の流血傾向を
増加させ、一方血栓症にかかっている患者においては、
必要とされる抑制剤に加えて凝固ファクターを同時に投
与することが血栓症の危険を増加させ得る。
凝固ファクターの欠乏する患者を不足した凝固ファク
ターだけを含有する−−換言すれば、抑制因子を含まな
い−−調製剤で治療しそして抑制因子の一つの不足した
患者は如何なるファクターも含まない関係する抑制因子
だけを含有する調製剤で治療するのが明かに有利であ
る。
ターだけを含有する−−換言すれば、抑制因子を含まな
い−−調製剤で治療しそして抑制因子の一つの不足した
患者は如何なるファクターも含まない関係する抑制因子
だけを含有する調製剤で治療するのが明かに有利であ
る。
プロトロンビン−コンプレックスの各成分を本質的に
分離する方法は、例えばS.P.Bajaj等によってザ・パブ
リケーション・プレパラテブ・バイコケミストリー（th
e Publication Preparative Biochemistry）、13
（３）、第191〜214頁、（1983）に開示されている。こ
の方法は以下の方法段階で構成されている： 血漿を硫酸アンモニウムで飽和させた（33％）後に、
沈澱する蛋白質を捨てそして上澄み残留物を硫酸アンモ
ニウムで濃厚化して66〜70％の飽和状態する。沈澱する
蛋白質を捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリウム塩
（BaClまたはBaSO4）を添加しそして沈澱する蛋白質を
捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリウム塩での沈澱
処理は、硫酸アンモニウムで別々に沈澱させる前に実施
してもよい。次いで、蛋白質を、DEAE−ゲル−カラムで
の吸着処理および溶出用緩衝溶液中のイオン濃度を徐々
に増加させることで徐々に溶出することによる分別脱着
処理に委ねる。しかしながらこのゲル−クロマトグラフ
ィー処理の後に、プロトロンビン−コンプレックスの各
成分は完全には分離されないので、準備されたアクリル
アミド電気泳動法で構成される別の段階が提案されてい
る。
分離する方法は、例えばS.P.Bajaj等によってザ・パブ
リケーション・プレパラテブ・バイコケミストリー（th
e Publication Preparative Biochemistry）、13
（３）、第191〜214頁、（1983）に開示されている。こ
の方法は以下の方法段階で構成されている： 血漿を硫酸アンモニウムで飽和させた（33％）後に、
沈澱する蛋白質を捨てそして上澄み残留物を硫酸アンモ
ニウムで濃厚化して66〜70％の飽和状態する。沈澱する
蛋白質を捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリウム塩
（BaClまたはBaSO4）を添加しそして沈澱する蛋白質を
捨てそして食塩溶液に再溶解する。バリウム塩での沈澱
処理は、硫酸アンモニウムで別々に沈澱させる前に実施
してもよい。次いで、蛋白質を、DEAE−ゲル−カラムで
の吸着処理および溶出用緩衝溶液中のイオン濃度を徐々
に増加させることで徐々に溶出することによる分別脱着
処理に委ねる。しかしながらこのゲル−クロマトグラフ
ィー処理の後に、プロトロンビン−コンプレックスの各
成分は完全には分離されないので、準備されたアクリル
アミド電気泳動法で構成される別の段階が提案されてい
る。
上記の分別法は、生物化学的試験管内試験での為にま
たは抗血清（antisera）を製造する為の動物の免疫法の
為に実験室規模でプロトロンビン−コンプレックスの各
ファクターを製造するのにのみ適している。従来技術に
よれば、アクリルアミド−電気泳動法は、例えば5,000
血漿単位より少ないファクターIXの如き少ない量の蛋白
質でしか実施できない。更に、電気泳動とは別に、この
方法の残りの各段階は非常に時間が掛りそしてこの長た
らしい方法の間に蛋白質の酵素的変性を減少させる為に
ベンズアミジンのようなプロテアーゼ抑制因子を用いる
必要がある。よく説明されてあるように、これらのプロ
テアーゼ抑制因子は著しい毒性があるので、人間の蛋白
質調製物中で適用することは不可能である。更に、沈澱
の為にバリウム塩を用いることは、これらの成分がおま
けに毒性を有する為に望ましくない。
たは抗血清（antisera）を製造する為の動物の免疫法の
為に実験室規模でプロトロンビン−コンプレックスの各
ファクターを製造するのにのみ適している。従来技術に
よれば、アクリルアミド−電気泳動法は、例えば5,000
血漿単位より少ないファクターIXの如き少ない量の蛋白
質でしか実施できない。更に、電気泳動とは別に、この
方法の残りの各段階は非常に時間が掛りそしてこの長た
らしい方法の間に蛋白質の酵素的変性を減少させる為に
ベンズアミジンのようなプロテアーゼ抑制因子を用いる
必要がある。よく説明されてあるように、これらのプロ
テアーゼ抑制因子は著しい毒性があるので、人間の蛋白
質調製物中で適用することは不可能である。更に、沈澱
の為にバリウム塩を用いることは、これらの成分がおま
けに毒性を有する為に望ましくない。
それ故に本発明の対象は、上記の欠点を回避する為
に、イオン交換ゲルによって吸着される蛋白質の各成
分、特にプロトロンビン−コンプレックスの各成分を分
離する改善された方法を提供することである。
に、イオン交換ゲルによって吸着される蛋白質の各成
分、特にプロトロンビン−コンプレックスの各成分を分
離する改善された方法を提供することである。
この課題および後述によって明らかになる他の課題
は、クロマトグラフィー−カラム中のゲルによって吸着
された蛋白質を、徐々に変化するイオン濃度および実質
的に一定のpH−値を持つ緩衝溶液で溶出して、ゲルから
蛋白質を徐々に脱着しそして溶出物を提供し、そして溶
出物を別々の蛋白質分別物に分別することによって達成
される。
は、クロマトグラフィー−カラム中のゲルによって吸着
された蛋白質を、徐々に変化するイオン濃度および実質
的に一定のpH−値を持つ緩衝溶液で溶出して、ゲルから
蛋白質を徐々に脱着しそして溶出物を提供し、そして溶
出物を別々の蛋白質分別物に分別することによって達成
される。
従って本発明は、イオン交換ゲルにて吸着される蛋白
質を含有する人血漿から、人血漿の凍結蛋白質の残留物
からまたは細胞組織の残留物から蛋白質を分離する方法
において、 − 二つのパタメーターによって規定されている溶出剤
として緩衝溶液を用いてクロマトグラフィー用カラム中
でイオン交換ゲルに吸着された蛋白質を徐々に脱着し、
但しパラメーターの一つは、もう一つが実質的に一定水
準に維持されている間に、ゲルから蛋白質が徐々に脱着
するように徐々に変化させ、そしてこれらのパラメータ
ーがイオン濃度およびpH値であり； − イオン交換ゲルから脱着された直後に蛋白質を蛋白
質不含で且つ平衡化された実質的に同じ種類のイオン交
換ゲルに吸着させそして次に蛋白質が鮮明に分離された
溶出物が得られるように、一つのパラメーターを更に変
えることで緩衝溶液を変えて蛋白質を脱着することによ
って、脱着蛋白質を精製しそして − 溶出物を別々の蛋白質分別物に分別する 各段階を包含することを特徴とする、上記方法に関す
る。
質を含有する人血漿から、人血漿の凍結蛋白質の残留物
からまたは細胞組織の残留物から蛋白質を分離する方法
において、 − 二つのパタメーターによって規定されている溶出剤
として緩衝溶液を用いてクロマトグラフィー用カラム中
でイオン交換ゲルに吸着された蛋白質を徐々に脱着し、
但しパラメーターの一つは、もう一つが実質的に一定水
準に維持されている間に、ゲルから蛋白質が徐々に脱着
するように徐々に変化させ、そしてこれらのパラメータ
ーがイオン濃度およびpH値であり； − イオン交換ゲルから脱着された直後に蛋白質を蛋白
質不含で且つ平衡化された実質的に同じ種類のイオン交
換ゲルに吸着させそして次に蛋白質が鮮明に分離された
溶出物が得られるように、一つのパラメーターを更に変
えることで緩衝溶液を変えて蛋白質を脱着することによ
って、脱着蛋白質を精製しそして − 溶出物を別々の蛋白質分別物に分別する 各段階を包含することを特徴とする、上記方法に関す
る。
本発明の別の実施形態によれば、緩衝溶液のイオン濃
度を100〜400mvalおよび400〜4000mvalの範囲で連続的
に変化させそして一方PH−値を５〜８の範囲で実質的に
一定に維持することによって傾斜的溶出が達成される。
場合によっては、pH−値を３〜９の範囲で連続的に変化
させ、他方イオン濃度を100〜400mval、特に100〜400mv
alの範囲で一定の水準に実質的に維持してもよい。
度を100〜400mvalおよび400〜4000mvalの範囲で連続的
に変化させそして一方PH−値を５〜８の範囲で実質的に
一定に維持することによって傾斜的溶出が達成される。
場合によっては、pH−値を３〜９の範囲で連続的に変化
させ、他方イオン濃度を100〜400mval、特に100〜400mv
alの範囲で一定の水準に実質的に維持してもよい。
本発明者は、アニオン交換ゲル、特にDEAE−ゲルで実
施しそして、所望の傾斜溶出を達成する為には、溶出剤
としてイオン濃度が増加しそしてpH−値が一定であるか
またはpH−値が増加してそしてイオン濃度が実質的に一
定である緩衝溶液を用いるのが特に有利であることを見
出した。
施しそして、所望の傾斜溶出を達成する為には、溶出剤
としてイオン濃度が増加しそしてpH−値が一定であるか
またはpH−値が増加してそしてイオン濃度が実質的に一
定である緩衝溶液を用いるのが特に有利であることを見
出した。
本発明の別の実施形態によれば、クロマトグラフィー
−カラム、該クロマトグラフィー−カラムに連結されて
おりそして第一緩衝溶液を含有する最初の貯蔵用容器、
上記クロマトグラフィー−カラムに連結されておりそし
て互いに連結された二つの部屋に分けられている第二の
貯蔵用容器で構成されている、イオン交換ゲルによって
吸着された蛋白質を分離する装置である。上記部屋の一
つは第一の緩衝溶液を含有しており、一方第二の部屋が
第一の緩衝溶液と第二の緩衝溶液とを勾配的に混合した
時に、勾配をはっきり示すようにより大きい溶出力の第
二緩衝溶液を含有している。
−カラム、該クロマトグラフィー−カラムに連結されて
おりそして第一緩衝溶液を含有する最初の貯蔵用容器、
上記クロマトグラフィー−カラムに連結されておりそし
て互いに連結された二つの部屋に分けられている第二の
貯蔵用容器で構成されている、イオン交換ゲルによって
吸着された蛋白質を分離する装置である。上記部屋の一
つは第一の緩衝溶液を含有しており、一方第二の部屋が
第一の緩衝溶液と第二の緩衝溶液とを勾配的に混合した
時に、勾配をはっきり示すようにより大きい溶出力の第
二緩衝溶液を含有している。
攪拌機が、第二の緩衝溶液を第一の緩衝溶液中に導入
した時に、混合する間に第二の貯蔵用容器の一つの部屋
の中に装備しているのが好ましい。クロマトグラフィー
用カラムから搬出される溶出物は、溶出物の紫外線吸光
度に依存して適当な制御単位によって監視する。
した時に、混合する間に第二の貯蔵用容器の一つの部屋
の中に装備しているのが好ましい。クロマトグラフィー
用カラムから搬出される溶出物は、溶出物の紫外線吸光
度に依存して適当な制御単位によって監視する。
本発明では、蛋白質の各成分、例えばプロトロンビン
−コンプレックスおよびトランスフェリンを、毒性のプ
ロテアーゼ抑制因子または毒性のバリウム塩を用いる必
要なく、大規模に精製できる。それ故に、蛋白質の各成
分は毒性成分を含まず且つS.P.Bajajによって開示され
た小規模の方法で得られる各成分よりも優れている。本
発明の方法でえられる生成物は、人間に投与するのに適
しており、ヨーロッパ薬局法に適合している。
−コンプレックスおよびトランスフェリンを、毒性のプ
ロテアーゼ抑制因子または毒性のバリウム塩を用いる必
要なく、大規模に精製できる。それ故に、蛋白質の各成
分は毒性成分を含まず且つS.P.Bajajによって開示され
た小規模の方法で得られる各成分よりも優れている。本
発明の方法でえられる生成物は、人間に投与するのに適
しており、ヨーロッパ薬局法に適合している。
以下の実施例によって、プロトロンビン−コンプレッ
クスの各成分への本発明に従う分離法を説明する。この
実施例は本発明を限定するものではない。
クスの各成分への本発明に従う分離法を説明する。この
実施例は本発明を限定するものではない。
1.イオン交換ゲルによる血漿蛋白質の吸着： イオン交換ゲル、例えば乾燥状態または水溶液中で膨
潤したDEAE−ゲルを血液の血漿または凍結蛋白質の除去
後の血液血漿の如き血液血漿分別物に添加する。ゲル
を、所望の蛋白質成分が該ゲルによって本質的に吸着さ
れるまで蛋白質溶液と一緒に攪拌する。トランスフェリ
ンおよびプロトロンビン−コンプレックスのファクター
（ファクターII、VII、IX、Ｘ蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ）が
全てこの方法でDEAE−ゲルによって吸着される。
潤したDEAE−ゲルを血液の血漿または凍結蛋白質の除去
後の血液血漿の如き血液血漿分別物に添加する。ゲル
を、所望の蛋白質成分が該ゲルによって本質的に吸着さ
れるまで蛋白質溶液と一緒に攪拌する。トランスフェリ
ンおよびプロトロンビン−コンプレックスのファクター
（ファクターII、VII、IX、Ｘ蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ）が
全てこの方法でDEAE−ゲルによって吸着される。
特に、DEAE−ゲル、なかでもDEAE−セファデックス
（Sephadex）A50は凍結蛋白質を含まない血液血漿に０
〜20℃、特に０℃で１の血漿当たり0.2〜10g、特に0.
5gの量で添加する。ゲルを血漿溶液中で1/4〜10時間、
殊に４時間攪拌することによって懸濁状態を維持する。
その後に、ゲルを残留血漿から重力によってまたは遠心
分離によって沈澱させそして上澄みの残留血漿を次いで
分離することによって分離する。
（Sephadex）A50は凍結蛋白質を含まない血液血漿に０
〜20℃、特に０℃で１の血漿当たり0.2〜10g、特に0.
5gの量で添加する。ゲルを血漿溶液中で1/4〜10時間、
殊に４時間攪拌することによって懸濁状態を維持する。
その後に、ゲルを残留血漿から重力によってまたは遠心
分離によって沈澱させそして上澄みの残留血漿を次いで
分離することによって分離する。
2.ゲルによって吸着された蛋白質のゲル−クロマトグラ
フィー分離 この方法段階を更に詳細に説明する為に、本発明の装
置の添付図面について説明する。
フィー分離 この方法段階を更に詳細に説明する為に、本発明の装
置の添付図面について説明する。
第１図は本発明の蛋白質コンプレックスの各成分を分
離する為の装置の一実施態様を概略的に図示したもので
ある。
離する為の装置の一実施態様を概略的に図示したもので
ある。
第２図はクロマトグラムをグラフで図示したものであ
る。
る。
第１図について述べると、このものは本発明に従って
蛋白質をその各成分に分離する装置の一実施態様を概略
的に図示したものである。最初のクロマトグラフィー用
カラム（GS1）はポンプ（P1）および三方弁を経て、ゲ
ルによって吸着して残す為の分別されるべき蛋白質は許
容するがゲルに対して親和力の低い不所望の洗去するべ
き蛋白質は許容しない塩濃度およびpH−値の緩衝溶液
（PR1）を含有する第一の貯蔵容器（R1）に連結されて
いる。
蛋白質をその各成分に分離する装置の一実施態様を概略
的に図示したものである。最初のクロマトグラフィー用
カラム（GS1）はポンプ（P1）および三方弁を経て、ゲ
ルによって吸着して残す為の分別されるべき蛋白質は許
容するがゲルに対して親和力の低い不所望の洗去するべ
き蛋白質は許容しない塩濃度およびpH−値の緩衝溶液
（PR1）を含有する第一の貯蔵容器（R1）に連結されて
いる。
適する三方弁V2およびV3を経てクロマトグラフィー−
カラム（GS1）に連結されているのは、ポンプ（P2）を
経て貯蔵容器（R1）に連結されている第二のクロマトグ
ラフィー−カラム（GS2）である。三方弁（V4）は分別
用コレクター（FR）を備えたカラム（GS2）に連結され
ている。更にカラム（GS1）は弁（V1）を経て、二つの
部屋（R2a）および（R2b）を持った第二の貯蔵容器（R
2）に連結されている。二つの部屋は弁（図示してな
い）を備えたパイプ（VR）を経て互いに連絡されてい
る。部屋（R2a）には、貯蔵容器（R1）中における緩衝
溶液（PR1）と同様の緩衝溶液（PR2）が入っておりそし
てその中に含有される溶液と混合する為の攪拌装置
（Ｍ）を備えている。部屋（R2b）は、ゲルから所望の
全ての血漿蛋白質を吸着するのに充分な塩濃度およびH+
−イオン濃度を有する緩衝溶液（PR2）より大きい溶出
力の緩衝溶液（PR3）が入っている。
カラム（GS1）に連結されているのは、ポンプ（P2）を
経て貯蔵容器（R1）に連結されている第二のクロマトグ
ラフィー−カラム（GS2）である。三方弁（V4）は分別
用コレクター（FR）を備えたカラム（GS2）に連結され
ている。更にカラム（GS1）は弁（V1）を経て、二つの
部屋（R2a）および（R2b）を持った第二の貯蔵容器（R
2）に連結されている。二つの部屋は弁（図示してな
い）を備えたパイプ（VR）を経て互いに連絡されてい
る。部屋（R2a）には、貯蔵容器（R1）中における緩衝
溶液（PR1）と同様の緩衝溶液（PR2）が入っておりそし
てその中に含有される溶液と混合する為の攪拌装置
（Ｍ）を備えている。部屋（R2b）は、ゲルから所望の
全ての血漿蛋白質を吸着するのに充分な塩濃度およびH+
−イオン濃度を有する緩衝溶液（PR2）より大きい溶出
力の緩衝溶液（PR3）が入っている。
部屋（R2a）と（R2b）とをパイプ（VR）を経て連結す
ることによって、緩衝溶液（PR3）を導入することによ
って緩衝溶液（PR2）のイオン濃度を徐々に増加させそ
して実質的にpH−値を一定水準に実質的に維持すること
によってあるいはpH−値を徐々に増加させそしてイオン
濃度を実質的に一定に維持することによって勾配が明ら
かになる。最初の場合には、カラム（CS1）へ供給する
緩衝溶液のイオン濃度を100〜4000mval、殊に100〜400m
valの範囲で徐々に変化させそしてpH−値を５〜８の範
囲で実質的に一定に維持する。後者の場合には、pH−値
を３〜９の範囲で連続的に変化させそしてイオン濃度を
100〜400mvalおよび400〜4000mvalの範囲の水準で実質
的に一定の水準に維持する。
ることによって、緩衝溶液（PR3）を導入することによ
って緩衝溶液（PR2）のイオン濃度を徐々に増加させそ
して実質的にpH−値を一定水準に実質的に維持すること
によってあるいはpH−値を徐々に増加させそしてイオン
濃度を実質的に一定に維持することによって勾配が明ら
かになる。最初の場合には、カラム（CS1）へ供給する
緩衝溶液のイオン濃度を100〜4000mval、殊に100〜400m
valの範囲で徐々に変化させそしてpH−値を５〜８の範
囲で実質的に一定に維持する。後者の場合には、pH−値
を３〜９の範囲で連続的に変化させそしてイオン濃度を
100〜400mvalおよび400〜4000mvalの範囲の水準で実質
的に一定の水準に維持する。
各カラム（GS1）、（GS2）の出口に紫外線測定装置
（UV1）、（UV2）が接続されている。矢印によって示し
たように、紫外線測定装置（UV1）、（UV2）は、例えば
カラム（GS1）、（GS2）の溶出物中の蛋白質濃度の紫外
線吸光度に依存して装置（Ｋ）を制御する為の信号を送
り平衡の終わりを示し且つカラム（GS1）、（GS2）での
洗浄段階および溶出物の分別を指示する。紫外線測定装
置（UV1）、（UV2）によって与えられる情報に依存して
制御装置（Ｋ）が弁（V1）、（V2）、（V3）、（V4）、
ポンプ（P1）、（P2）および攪拌機（Ｍ）を破線で示し
たように作動させる。
（UV1）、（UV2）が接続されている。矢印によって示し
たように、紫外線測定装置（UV1）、（UV2）は、例えば
カラム（GS1）、（GS2）の溶出物中の蛋白質濃度の紫外
線吸光度に依存して装置（Ｋ）を制御する為の信号を送
り平衡の終わりを示し且つカラム（GS1）、（GS2）での
洗浄段階および溶出物の分別を指示する。紫外線測定装
置（UV1）、（UV2）によって与えられる情報に依存して
制御装置（Ｋ）が弁（V1）、（V2）、（V3）、（V4）、
ポンプ（P1）、（P2）および攪拌機（Ｍ）を破線で示し
たように作動させる。
本発明の装置は、有利な実施形態においては、ゲルに
よって吸着された蛋白質をコンピュータ制御で分別する
ことを可能としそして次のような操作を行う： 蛋白質の負荷したゲルをカラム（GS1）に供給しそし
て蛋白質未負荷のゲルをカラム（GS2）に充填する。弁
（V1）および（V3）を経て、カラム（GS1）、（GS2）で
貯蔵容器（R1）から緩衝溶液（PR1）にて溶出する。カ
ラム（GS1）においては、不所望の蛋白質をゲルから洗
去し、一方カラム（GS2）では緩衝溶液（PR1）によって
平衡状態にされる。満足な洗去および個々のカラム（GS
1）、（GS2）の平衡を達成する為には、緩衝溶液容量を
カラムの容量の三倍と計算する。
よって吸着された蛋白質をコンピュータ制御で分別する
ことを可能としそして次のような操作を行う： 蛋白質の負荷したゲルをカラム（GS1）に供給しそし
て蛋白質未負荷のゲルをカラム（GS2）に充填する。弁
（V1）および（V3）を経て、カラム（GS1）、（GS2）で
貯蔵容器（R1）から緩衝溶液（PR1）にて溶出する。カ
ラム（GS1）においては、不所望の蛋白質をゲルから洗
去し、一方カラム（GS2）では緩衝溶液（PR1）によって
平衡状態にされる。満足な洗去および個々のカラム（GS
1）、（GS2）の平衡を達成する為には、緩衝溶液容量を
カラムの容量の三倍と計算する。
緩衝溶液（PR1）の有効な条件のもとでゲルに対して
全く親和性を有していない蛋白質全てが洗去されるや否
や、紫外線測定装置（UV1）が、洗浄段階を終了したこ
とを示す信号を制御装置（Ｋ）に伝達する。同時に制御
装置（Ｋ）が、カラム（GS1）を貯蔵容器（R2）の部屋
（R2a）から緩衝溶液（PR2）を供給しそして得られるカ
ラム（GS1）の搬出物を弁（V3）によって貯蔵容器（PR
1）から隔離されるカラム（GS2）に供給するように弁
（V1）、（V2）（V3）を作動させる。カラム（GS1）と
貯蔵容器（R2）の部屋（R2a）との解放連結するのと同
時に、攪拌機（Ｍ）が作動しそして緩衝溶液（PR3）を
適当なポンプ（図示してない）によってパイプライン
（VR）を通して部屋（R2a）に部屋（R2b）からポンプ供
給し、一方ポンプ（P2）のスイッチを切る。次いで、貯
蔵容器（R2）の連結された部屋（R2a）、（R2b）によっ
て勾配が限定され、その結果カラム（GS1）内のゲルに
付着する種々の蛋白質がゲルに対する親和性に依存して
溶出される。カラム（GS2）においては、蛋白質が、官
能基が実質的にないゲルによって短時間の間に再び吸着
される。傾斜を急にすることで生じる脱着は、クロマト
グラフィーの分離のシャープさを著しく増加させる。
全く親和性を有していない蛋白質全てが洗去されるや否
や、紫外線測定装置（UV1）が、洗浄段階を終了したこ
とを示す信号を制御装置（Ｋ）に伝達する。同時に制御
装置（Ｋ）が、カラム（GS1）を貯蔵容器（R2）の部屋
（R2a）から緩衝溶液（PR2）を供給しそして得られるカ
ラム（GS1）の搬出物を弁（V3）によって貯蔵容器（PR
1）から隔離されるカラム（GS2）に供給するように弁
（V1）、（V2）（V3）を作動させる。カラム（GS1）と
貯蔵容器（R2）の部屋（R2a）との解放連結するのと同
時に、攪拌機（Ｍ）が作動しそして緩衝溶液（PR3）を
適当なポンプ（図示してない）によってパイプライン
（VR）を通して部屋（R2a）に部屋（R2b）からポンプ供
給し、一方ポンプ（P2）のスイッチを切る。次いで、貯
蔵容器（R2）の連結された部屋（R2a）、（R2b）によっ
て勾配が限定され、その結果カラム（GS1）内のゲルに
付着する種々の蛋白質がゲルに対する親和性に依存して
溶出される。カラム（GS2）においては、蛋白質が、官
能基が実質的にないゲルによって短時間の間に再び吸着
される。傾斜を急にすることで生じる脱着は、クロマト
グラフィーの分離のシャープさを著しく増加させる。
紫外線吸光度がカラム（GS2）の溶出物中で増加する
やいなや、溶出物を弁（V4）を経て搬出して分別物コレ
クター（FR）にいれる。分別物コレクター（FR）を一定
の容量に従って各分別物を蓄積するかまたは各分別物を
形成する為に（吸着のピークにより）ピーク制御しても
よい。
やいなや、溶出物を弁（V4）を経て搬出して分別物コレ
クター（FR）にいれる。分別物コレクター（FR）を一定
の容量に従って各分別物を蓄積するかまたは各分別物を
形成する為に（吸着のピークにより）ピーク制御しても
よい。
二つのカラムを用いる必要がないことに注目するべき
である。むしろ本発明の方法は、カラム（GS1）の如き
カラム一つでけを持つ装置でも実施した方がよいことも
ある。上記の方法はクロマトグラフィー−カラム中で蛋
白質の負荷したゲルの下に未負荷の平衡状態のゲル下側
層を形成するように変えることもできる。
である。むしろ本発明の方法は、カラム（GS1）の如き
カラム一つでけを持つ装置でも実施した方がよいことも
ある。上記の方法はクロマトグラフィー−カラム中で蛋
白質の負荷したゲルの下に未負荷の平衡状態のゲル下側
層を形成するように変えることもできる。
以下に本発明の方法および装置を、プロトロンビン−
コンプレックスのトランスフェリンおよび各ファクター
をDEAE−ゲルの充填されたクロマトグラフィーによって
分離することに関して例示的に記載する。この例を簡略
図だけで説明しているが、これによって本発明は限定さ
れるものではない。
コンプレックスのトランスフェリンおよび各ファクター
をDEAE−ゲルの充填されたクロマトグラフィーによって
分離することに関して例示的に記載する。この例を簡略
図だけで説明しているが、これによって本発明は限定さ
れるものではない。
カラム（GS1）に蛋白質の負荷したDEAE−ゲル（DEAE
−Sephadex A50）をカラム（GS1）と同じゲル容量で充
填する。このゲルを、H2Oに0.02モルの燐酸塩、0.01モ
ルのクエン塩および0.15モルのNaClを溶解してなるpH−
値６にNaOHで調整した緩衝溶液（PR1）中で20℃で膨潤
させる。カラム（GS1）、（GS2）を緩衝溶液、特に１
のカラム容積当たり３の緩衝溶液で別々に洗浄する。
カラム（GS1）、（GS2）を次いで連結した後に、傾斜溶
出を部屋（R2b）から部屋（R2a）に緩衝溶液を導入する
ことによって開始する。部屋（R2b）中の緩衝溶液（PR
3）の容量は、好ましくは部屋（R2a）中の緩衝溶液（PR
2）の容積に相応する。緩衝溶液（PR3）は好ましくは0.
02モルの燐酸塩、0.01モルのクエン酸塩および0.5モル
のNaClをH2Oが溶解されており、20℃でNaOHでpH−値６
に調節されている。
−Sephadex A50）をカラム（GS1）と同じゲル容量で充
填する。このゲルを、H2Oに0.02モルの燐酸塩、0.01モ
ルのクエン塩および0.15モルのNaClを溶解してなるpH−
値６にNaOHで調整した緩衝溶液（PR1）中で20℃で膨潤
させる。カラム（GS1）、（GS2）を緩衝溶液、特に１
のカラム容積当たり３の緩衝溶液で別々に洗浄する。
カラム（GS1）、（GS2）を次いで連結した後に、傾斜溶
出を部屋（R2b）から部屋（R2a）に緩衝溶液を導入する
ことによって開始する。部屋（R2b）中の緩衝溶液（PR
3）の容量は、好ましくは部屋（R2a）中の緩衝溶液（PR
2）の容積に相応する。緩衝溶液（PR3）は好ましくは0.
02モルの燐酸塩、0.01モルのクエン酸塩および0.5モル
のNaClをH2Oが溶解されており、20℃でNaOHでpH−値６
に調節されている。
カラム（GS2）の出口に設置した紫外線測定装置が紫
外線吸光度の増加を記録するやいなや、分別物を集め
る。好ましくは、貯蔵容器（R2）の部屋（R2a）、（R2
b）中の全容積が20（40の分別物）の場合には、フラ
クション当たり1/2の溶出容量を集める。試験用サン
プルを分析の為に各留分から取る。各試験用サンプル
を、それらの蛋白質含有量、ファクターII、VII、IX、
Ｘの含有量並びに蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの含有量につ
いて後記の方法によって試験する。
外線吸光度の増加を記録するやいなや、分別物を集め
る。好ましくは、貯蔵容器（R2）の部屋（R2a）、（R2
b）中の全容積が20（40の分別物）の場合には、フラ
クション当たり1/2の溶出容量を集める。試験用サン
プルを分析の為に各留分から取る。各試験用サンプル
を、それらの蛋白質含有量、ファクターII、VII、IX、
Ｘの含有量並びに蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの含有量につ
いて後記の方法によって試験する。
今度は、トランスフェリン並びにプロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分の代表的な溶出ダイヤグラムを示
した第２図について説明する。若干の隣接する分別物中
で蛋白質成分を溶出する場合には、これらの分別物を一
緒にしそして透析、熱処理、ウイルス不活性化、大量の
凍結乾燥、水中への溶解および塩含有量およびpH−値の
調節、分別による滅菌および容器中での煮沸、最終生成
物の凍結乾燥の如き公知の方法に従って人間に適用する
よう処理する。
ンプレックスの各成分の代表的な溶出ダイヤグラムを示
した第２図について説明する。若干の隣接する分別物中
で蛋白質成分を溶出する場合には、これらの分別物を一
緒にしそして透析、熱処理、ウイルス不活性化、大量の
凍結乾燥、水中への溶解および塩含有量およびpH−値の
調節、分別による滅菌および容器中での煮沸、最終生成
物の凍結乾燥の如き公知の方法に従って人間に適用する
よう処理する。
溶出の順序は最初の生成物の異なった条件および方法
パラメータで変えることができる。この方法は、蛋白質
Ｃおよび蛋白質Ｓを単離するのに特に有利である。
パラメータで変えることができる。この方法は、蛋白質
Ｃおよび蛋白質Ｓを単離するのに特に有利である。
以下にトランスフェリン、ファクターII、VII、IXお
よびＸ、蛋白質Ｓおよび蛋白質Ｃを測定する為の方法を
示す。
よびＸ、蛋白質Ｓおよび蛋白質Ｃを測定する為の方法を
示す。
Ａ）トランスフェリン： 人間のトランスフェリンの免疫血清特効薬を用いるこ
とによってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法に
より測定する。
とによってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法に
より測定する。
Ｂ）ファクターII: 人間のファクターIIの為の免疫血清特効薬を用いるこ
とによってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法に
より測定する。ファクターIIの不足する血漿を用いてト
ロンボプラスチン時間（プロトロンビンがトロンビンに
転化する時間）にて官能的に測定する。
とによってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法に
より測定する。ファクターIIの不足する血漿を用いてト
ロンボプラスチン時間（プロトロンビンがトロンビンに
転化する時間）にて官能的に測定する。
Ｃ）ファクターVII: ファクターVIIの不足する血清を用いることによって
トロンボプラスチン時間にて官能的に測定する。
トロンボプラスチン時間にて官能的に測定する。
Ｄ）ファクターIX ファクターIXの為の免疫血清特効薬を用いることによ
ってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法により測
定する。ファクターIXの不足する血清を用いることによ
って活性化部分的トロンボプラスチン時間にて官能的に
測定する。
ってラウレル（Laurell）の電気的免疫拡散法により測
定する。ファクターIXの不足する血清を用いることによ
って活性化部分的トロンボプラスチン時間にて官能的に
測定する。
Ｅ）ファクターＸ ファクターＸの不足する血清を用いることによって時
間により官能的に測定する。
間により官能的に測定する。
Ｆ）蛋白質C: “ELISA−プロテインC"の名称で市販されている試験
用用具にて酵素免疫学的検査によって測定する。Th.Vuk
ovichのウイナー・クリニッシ・ボッヘンシュリフト（W
iener klinische Wochenschrift）97、９、1985、445に
開示された方法で官能的に測定するかまたはベーリング
・ジアグノチカ（Behring Diagnostika）から市販され
ている試験用具を用いて官能的に測定する。後者の方法
は最終生成物の品質制御の為に極めて有利であることが
判っている。分別蛋白質Ｃを同定する為に、凝固促進成
分の為の実例的試験方法は以下の通りである。
用用具にて酵素免疫学的検査によって測定する。Th.Vuk
ovichのウイナー・クリニッシ・ボッヘンシュリフト（W
iener klinische Wochenschrift）97、９、1985、445に
開示された方法で官能的に測定するかまたはベーリング
・ジアグノチカ（Behring Diagnostika）から市販され
ている試験用具を用いて官能的に測定する。後者の方法
は最終生成物の品質制御の為に極めて有利であることが
判っている。分別蛋白質Ｃを同定する為に、凝固促進成
分の為の実例的試験方法は以下の通りである。
溶出サンプルを、遠心分離によって後で除かれる不溶
性トロンビンと一緒に温置し、一方上澄み残渣を標準血
漿と１＋１の比で混合する。この混合物の活性化部分的
トロンボプラスチン時間を標準血漿と緩衝溶液との対照
用調製物と比較する。サンプル中の蛋白質Ｃの存在が、
対照用調製物との比較で活性化部分的トロンボプラスチ
ン時間の延長によって明らかになり、一方サンプル中の
凝固ファクターの存在がトロンボプラスチン時間の短縮
を明らかにする。
性トロンビンと一緒に温置し、一方上澄み残渣を標準血
漿と１＋１の比で混合する。この混合物の活性化部分的
トロンボプラスチン時間を標準血漿と緩衝溶液との対照
用調製物と比較する。サンプル中の蛋白質Ｃの存在が、
対照用調製物との比較で活性化部分的トロンボプラスチ
ン時間の延長によって明らかになり、一方サンプル中の
凝固ファクターの存在がトロンボプラスチン時間の短縮
を明らかにする。
Ｇ）蛋白質S: 蛋白質Ｓの不足するものの活性化部分的トロンボプラ
スチン時間へのトロンビン−セファローゼ活性化蛋白質
Ｃの抑制作用の指数を測定することによって官能的に測
定する。
スチン時間へのトロンビン−セファローゼ活性化蛋白質
Ｃの抑制作用の指数を測定することによって官能的に測
定する。
本発明に従う方法によって分離される蛋白質分別物の
適応： 1.分別トランスフェリン トランスフェリンの先天的なまたは後天的な不足症で
の適用；鉄分不足の貧血、バクテリヤ感染での投与；悪
性の腫瘍での投与． 2.ファクターII: ファクターIIの先天的なまたは後天的な不足症での適
用；傷の治療においての“フィブリン接着剤剤としての
フィブリノーゲンと一緒での投与。
適応： 1.分別トランスフェリン トランスフェリンの先天的なまたは後天的な不足症で
の適用；鉄分不足の貧血、バクテリヤ感染での投与；悪
性の腫瘍での投与． 2.ファクターII: ファクターIIの先天的なまたは後天的な不足症での適
用；傷の治療においての“フィブリン接着剤剤としての
フィブリノーゲンと一緒での投与。
3.ファクターVII: ファクターVIIの先天的なまたは後天的な不足症での
適用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
適用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
4.ファクターIX ファクターIXの先天的なまたは後天的な不足症での適
用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
5.ファクターＸ ファクターＸの先天的なまたは後天的な不足症での適
用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
用；血友病Ａおよび血友病Ｂでの適用。
6.蛋白質C: 蛋白質Ｃの先天的なまたは後天的な不足症での適用；
抹消−および中枢血管疾患、静脈疾患での適用；血小板
閉塞形成症での適用；リンパ管内の凝固パティ（coaglo
paty）；血栓症予防の為の適用；マークマルMarkouma
r）で誘発されたスキン・ネクローゼの予防および治療
の為の適用；呼吸窮迫症候群での適用；蛋白質Ｓ不足症
への適用；化学療法での適用。
抹消−および中枢血管疾患、静脈疾患での適用；血小板
閉塞形成症での適用；リンパ管内の凝固パティ（coaglo
paty）；血栓症予防の為の適用；マークマルMarkouma
r）で誘発されたスキン・ネクローゼの予防および治療
の為の適用；呼吸窮迫症候群での適用；蛋白質Ｓ不足症
への適用；化学療法での適用。
7.分別蛋白質S: 蛋白質Ｓの先天的なまたは後天的な不足症での適用；
蛋白質Ｃの不足症での適用;6の所で記した全てでの適
用。
蛋白質Ｃの不足症での適用;6の所で記した全てでの適
用。
8.蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの混合分別物： ６の所で記した全てでの適用。
本発明の方法により分離された蛋白質分別物の特徴的
な組成： 1.分別トランスフェリン： 分別物中に含まれる蛋白質の90％より多くがトランス
フェリンである。同種凝集素のアンチ−Ａ、アンチ−Ｂ
を追跡できない。1gのトランスフェリン当たりのファク
ターII、VII、IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓが10単
位より少ない。
な組成： 1.分別トランスフェリン： 分別物中に含まれる蛋白質の90％より多くがトランス
フェリンである。同種凝集素のアンチ−Ａ、アンチ−Ｂ
を追跡できない。1gのトランスフェリン当たりのファク
ターII、VII、IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓが10単
位より少ない。
2.分別ファクターVII: 同種凝集素のアンチ−Ａ、アンチ−Ｂを追跡できな
い。ファクターVIIの１血漿単位当たり0.2血漿単位より
少ないファクターII、VII、IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋
白質Ｓ。
い。ファクターVIIの１血漿単位当たり0.2血漿単位より
少ないファクターII、VII、IX、Ｘ、蛋白質Ｃおよび蛋
白質Ｓ。
3.分別蛋白質S: 1mlの溶液当たり50血漿単位の蛋白質Ｓの濃縮物にお
いて、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚的
に検出できずそして濃度が10血漿単位より少ないファク
ターVII、II、IX、Ｘを含有し、活性化凝集ファクター
が非活性部分的トロンボプラスチンで追跡できずそして
活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮が、1ml当
たり40NIH−単位でトロンビン−セファローゼと一緒に3
7℃で２時間温置した後に検出できずそして標準血漿と
の１＋１の比の混合物中のトロンビン−セファローゼを
除きそし該濃縮物が10mgより少ない蛋白質を含有する。
いて、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚的
に検出できずそして濃度が10血漿単位より少ないファク
ターVII、II、IX、Ｘを含有し、活性化凝集ファクター
が非活性部分的トロンボプラスチンで追跡できずそして
活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮が、1ml当
たり40NIH−単位でトロンビン−セファローゼと一緒に3
7℃で２時間温置した後に検出できずそして標準血漿と
の１＋１の比の混合物中のトロンビン−セファローゼを
除きそし該濃縮物が10mgより少ない蛋白質を含有する。
4.分別蛋白質C: 1mlの溶液当たり50血漿単位の蛋白質Ｃの濃縮物にお
いて、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚的
に検出できずそして10血漿単位より少ないファクターVI
I、II、IX、Ｘが検出でき、活性化部分的トロンボプラ
スチン時間の短縮と言うよりもむしろ延長が1mlの混合
物当たり40NIH−単位でトロンビン−セァローゼと一緒
に37℃で２時間温置した後に、検出できそして標準血漿
との１＋１部の比の混合物中のトロンビン−セファロー
ゼを除きそして活性化凝固ファクターが非活性化部分的
トロンボプラスチン時間で検出できずそして該濃縮物が
10mgより少ない蛋白質を含有する。
いて、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚的
に検出できずそして10血漿単位より少ないファクターVI
I、II、IX、Ｘが検出でき、活性化部分的トロンボプラ
スチン時間の短縮と言うよりもむしろ延長が1mlの混合
物当たり40NIH−単位でトロンビン−セァローゼと一緒
に37℃で２時間温置した後に、検出できそして標準血漿
との１＋１部の比の混合物中のトロンビン−セファロー
ゼを除きそして活性化凝固ファクターが非活性化部分的
トロンボプラスチン時間で検出できずそして該濃縮物が
10mgより少ない蛋白質を含有する。
4a.分別蛋白質Ｃおよび蛋白質S: 1mlの溶液当たり30〜50血漿単位の蛋白質Ｃおよび蛋
白質Ｓの濃縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の
同種凝集素が視覚的に検出できずそして濃度が10血漿単
位より少ないファクターVII、II、IX、Ｘが検出でき、
活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮と言うより
もむしろ延長が1mlの混合物当たり40NIH−単位でトロン
ビン−セファローゼと一緒に37℃で２時間温置した後に
検出できそして標準血漿との１＋１の比の混合物中のト
ロンビン−セファローゼを除きそして活性化凝固ファク
ターが活性化部分的トロンボプラスチン時間で検出でき
ずそして該濃縮物が10mgより少ない蛋白質を含有する。
白質Ｓの濃縮物において、血液群ＡまたはＢの赤血球の
同種凝集素が視覚的に検出できずそして濃度が10血漿単
位より少ないファクターVII、II、IX、Ｘが検出でき、
活性化部分的トロンボプラスチン時間の短縮と言うより
もむしろ延長が1mlの混合物当たり40NIH−単位でトロン
ビン−セファローゼと一緒に37℃で２時間温置した後に
検出できそして標準血漿との１＋１の比の混合物中のト
ロンビン−セファローゼを除きそして活性化凝固ファク
ターが活性化部分的トロンボプラスチン時間で検出でき
ずそして該濃縮物が10mgより少ない蛋白質を含有する。
5.分別ファクターIX: 1mlの溶液当たり50血漿単位のファクターIXの濃縮物
において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視
覚的に検出できずそして10血漿単位より少ない蛋白質Ｃ
および蛋白質Ｓを含有する濃縮物が非活性化部分的トロ
ンボプラスチン時間（ヘパリンおよび／またはアンチト
ロンビンIIIの添加せず）にて追跡できそして該濃縮物
が10mgより少ない蛋白質を含有する。
において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視
覚的に検出できずそして10血漿単位より少ない蛋白質Ｃ
および蛋白質Ｓを含有する濃縮物が非活性化部分的トロ
ンボプラスチン時間（ヘパリンおよび／またはアンチト
ロンビンIIIの添加せず）にて追跡できそして該濃縮物
が10mgより少ない蛋白質を含有する。
6.分別ファクターII: 1mlの溶液当たり50血漿単位のファクターIIの濃縮物
において血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚
的に検出できずそして10血漿単位より少ない蛋白質Ｃお
よび蛋白質Ｓがその中に含有されている。
において血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素が視覚
的に検出できずそして10血漿単位より少ない蛋白質Ｃお
よび蛋白質Ｓがその中に含有されている。
7.分別ファクターX: 1mlの溶液当たり50血漿単位のファクターＸの濃縮物
において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素およ
び10血漿単位より少ない蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓがその
中に含まれており、活性化凝固ファクターが非活性化部
分的トロンボプラスチン時間でヘパリンおよび／または
アンチトロンビンIIIの添加なしに検出できそして該濃
縮物が20mgより少ない蛋白質を含有する。
において、血液群ＡまたはＢの赤血球の同種凝集素およ
び10血漿単位より少ない蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓがその
中に含まれており、活性化凝固ファクターが非活性化部
分的トロンボプラスチン時間でヘパリンおよび／または
アンチトロンビンIIIの添加なしに検出できそして該濃
縮物が20mgより少ない蛋白質を含有する。
それ故に、前述の説明から明らかになることの中の前
に説明した課題が効果的に達成されることは明らかであ
りそして、上記の方法を実施した時に生じ得る一定の変
更および組成物も本発明の精神および範囲から逸脱して
いないので、上記の説明に包含されるあらゆるものが実
例と解釈されるべきであり且つ本発明は該実例に制限さ
れるものではない。
に説明した課題が効果的に達成されることは明らかであ
りそして、上記の方法を実施した時に生じ得る一定の変
更および組成物も本発明の精神および範囲から逸脱して
いないので、上記の説明に包含されるあらゆるものが実
例と解釈されるべきであり且つ本発明は該実例に制限さ
れるものではない。
また、特許請求の範囲において単独で各成分および各
化合物を記したが、常識的に許容されるかゝる成分の適
合性のある如何なる混合物も本発明に包含されると理解
されるべきである。
化合物を記したが、常識的に許容されるかゝる成分の適
合性のある如何なる混合物も本発明に包含されると理解
されるべきである。
第１図は、本発明の蛋白質コンプレックスの各成分を分
離する為の装置の一実施態様を概略的に図示したもので
ある。 第２図は、トランスフェリンまたはプロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分の代表的な溶出クロマトグラムを
グラフで図示したものである。
離する為の装置の一実施態様を概略的に図示したもので
ある。 第２図は、トランスフェリンまたはプロトロンビン−コ
ンプレックスの各成分の代表的な溶出クロマトグラムを
グラフで図示したものである。
Claims (12)
- 【請求項１】イオン交換ゲルにて吸着される蛋白質を含
有する人血漿から、人血漿の凍結蛋白質の残留物からま
たは細胞組織の残留物から蛋白質を分離する方法におい
て、 − 二つのパタメーターによって規定されている溶出剤
として緩衝溶液を用いてクロマトグラフィー用カラム中
でイオン交換ゲルに吸着された蛋白質を徐々に脱着し、
但しパラメーターの一つは、もう一つが実質的に一定水
準に維持されている間に、ゲルから蛋白質が徐々に脱着
するように徐々に変化させ、そしてこれらのパラメータ
ーがイオン濃度およびpH値であり； − イオン交換ゲルから脱着された直後に蛋白質を蛋白
質不含で且つ平衡化された実質的に同じ種類のイオン交
換ゲルに吸着させそして次に蛋白質が鮮明に分離された
溶出物が得られるように、一つのパラメーターを更に変
えることで緩衝溶液を変えて蛋白質を脱着することによ
って、脱着蛋白質を精製しそして − 溶出物を別々の蛋白質分別物に分別する 各段階を包含することを特徴とする、上記方法。 - 【請求項２】溶出物をトランスフェリン、ファクターI
I、ファクターVII、ファクターIX、ファクターＸ、蛋白
質Ｃおよび蛋白質Ｓより成る群から選択された分別物に
分別する分離段階を含む特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】緩衝溶液のイオン濃度を100〜400mvalと40
0〜4000mvalの範囲内で連続的に変化させそしてpH値を
５〜８の範囲で実質的に一定の水準に維持する特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】緩衝溶液のpH値を３〜９の範囲で連続的に
変化させそしてイオン濃度を100〜400mvalの範囲内の実
質的に一定の水準に維持する、特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項５】イオン交換ゲルがアニオン系交換ゲルであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】吸着された蛋白質の付いたアニオン交換ゲ
ルを最も低いイオン濃度の別の緩衝溶液とで平衡化させ
る段階が上記の徐々の溶出段階の前にある、特許請求の
範囲第１項、２項、３項および５項の何れか一つに記載
の方法。 - 【請求項７】吸着された蛋白質の負荷したアニオン交換
ゲルを最も高いpH値の別の緩衝溶液で平衡化させる段階
が上記の徐々の溶出段階の前にある、特許請求の範囲第
１項、２項、４項および５項の何れか一つに記載の方
法。 - 【請求項８】徐々に溶出する段階が、100〜400mvalの範
囲内のイオン濃度の最初の緩衝溶液を400〜4000mvalの
範囲のイオン濃度の第二の緩衝溶液に添加することによ
って溶出剤中に徐々に溶出するように調節することを包
含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項９】徐々に溶出する段階が、６〜８のpHの最初
の緩衝溶液を５〜７のpH値の第二の緩衝溶液に添加する
ことによって溶出剤中に徐々に溶出するように調節する
ことを包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】徐々に溶出する段階が、蛋白質不含の平
衡化ゲルの層を蛋白質負荷ゲルの下に形成することを含
む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１１】徐々に溶出する段階から得られる溶出物
を、最初のクロマトグラフ−カラムに引き続いて連結さ
れそして蛋白質不含の平衡化ゲルを含有する第二のクロ
マトグラフ−カラムで精製する、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項１２】徐々に溶出する段階が、以下の各段階 − 血漿蛋白質を含有する溶液にイオン交換ゲルを添加
する段階 − 所望の蛋白質を吸着する為の懸濁状態にゲルを維持
する為に溶液中でゲルを撹拌する段階および −吸着した蛋白質を持つゲルを残留血漿から分離する段
階 によって勧める特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT827/86 | 1986-03-27 | ||
| AT0082786A AT399095B (de) | 1986-03-27 | 1986-03-27 | Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62246593A JPS62246593A (ja) | 1987-10-27 |
| JP2511449B2 true JP2511449B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=3500677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62071922A Expired - Lifetime JP2511449B2 (ja) | 1986-03-27 | 1987-03-27 | 蛋白質の分離方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5112949A (ja) |
| EP (1) | EP0239565B1 (ja) |
| JP (1) | JP2511449B2 (ja) |
| AT (2) | AT399095B (ja) |
| AU (1) | AU596159B2 (ja) |
| CA (1) | CA1327674C (ja) |
| DE (1) | DE3751389T2 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664913A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-12 | Xoma Corporation | Method for treating plasma for transfusion |
| US4810391A (en) * | 1987-11-06 | 1989-03-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Separation of hemoglobin A2 from hemoglobin mixture |
| EP0365858B1 (en) * | 1988-10-26 | 1994-11-30 | American Cyanamid Company | Process for reducing the aggregate content of growth hormone-like materials |
| US5110913A (en) * | 1990-05-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Antibody purification method |
| IT1262899B (it) * | 1992-03-27 | 1996-07-22 | Sclavo Spa | Processo per l'isolamento di fattore ix, fattore x e fattore ii altamente purificati dal complesso protrombinico o dal plasma umano |
| EP0585504A1 (en) * | 1992-09-04 | 1994-03-09 | Pentapharm A.G. | Phospholipid dependant prothrombin activator and its use in lupus anticoagulant testing |
| DK114392D0 (da) * | 1992-09-17 | 1992-09-17 | Kem En Tec As | Isolering af biomolekyler |
| US6159468A (en) | 1997-04-28 | 2000-12-12 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
| AU769144B2 (en) * | 1997-04-28 | 2004-01-15 | Eli Lilly And Company | Improved methods for processing activated protein C |
| US6630137B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
| AT408613B (de) * | 1998-06-17 | 2002-01-25 | Immuno Ag | Pharmazeutisches faktor vii-präparat |
| AU770634B2 (en) * | 1998-06-23 | 2004-02-26 | Shanbrom Technologies, Llc | Method and apparatus for the production of purified plasma proteins |
| US7204981B2 (en) * | 2000-03-28 | 2007-04-17 | Eli Lilly And Company | Methods of treating diseases with activated protein C |
| US7087578B2 (en) | 2000-05-24 | 2006-08-08 | Eli Lilly And Company | Formulations and methods for treating hypercoagulable states |
| EP1485121A4 (en) * | 2002-03-08 | 2007-11-07 | Lilly Co Eli | ACTIVE C PROTEIN FORMULATIONS |
| WO2005040787A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-05-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Chromatography system, method and software for the separation of biomolecules |
| US20060057275A1 (en) * | 2004-09-16 | 2006-03-16 | Shaowen Wu | Process for the preparation of glycinin-rich and beta-conglycinin-rich protein fractions |
| US9446329B2 (en) * | 2008-04-21 | 2016-09-20 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Preparation of liquid mixtures |
| AU2010298776A1 (en) * | 2009-09-25 | 2012-03-15 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method and system for preparation of liquid mixtures |
| EP3186355A4 (en) * | 2014-07-31 | 2018-03-21 | Govind Rao | Microscale bioprocessing system and method for protein manufacturing from human blood |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE392038B (sv) * | 1971-09-08 | 1977-03-14 | Kabi Ab | Forfarande for isolering av antitrombin ur blod eller blodprodukter |
| CS162953B1 (ja) * | 1972-05-10 | 1975-07-31 | ||
| AT336182B (de) * | 1972-12-13 | 1977-04-25 | Cutter Lab | Verfahren zur herstellung eines prothrombinkomplexes |
| FR2210396A1 (en) * | 1972-12-19 | 1974-07-12 | Cutter Lab | Blood coagulation complex - by extraction of plasma with sephadex |
| ATE15489T1 (de) * | 1980-05-27 | 1985-09-15 | Miles Lab | Die blutkoagulation aktivierendes produkt und verfahren zu dessen herstellung. |
| US4447416A (en) * | 1982-04-28 | 1984-05-08 | American National Red Cross | Plasma protein concentrates of reduced thrombogenicity and their use in clinical replacement therapy |
| FR2543448A1 (fr) * | 1983-04-01 | 1984-10-05 | Rhone Poulenc Spec Chim | Procede de fractionnement du plasma |
| GB8327860D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Monoclonal antiprotein c antibody |
| GB8403473D0 (en) * | 1984-02-09 | 1984-03-14 | Special Trustees For St Thomas | Purification of factor viii |
| US4721572A (en) * | 1985-07-12 | 1988-01-26 | Miles Laboratories, Inc. | Purfication of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices |
| US4770781A (en) * | 1986-03-03 | 1988-09-13 | Merck & Co., Inc. | Purification of human interleukin-1 species |
-
1986
- 1986-03-27 AT AT0082786A patent/AT399095B/de not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-03-17 US US07/026,868 patent/US5112949A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-26 AT AT87890061T patent/ATE124703T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-26 DE DE3751389T patent/DE3751389T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-26 CA CA000533089A patent/CA1327674C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-26 AU AU70672/87A patent/AU596159B2/en not_active Ceased
- 1987-03-26 EP EP87890061A patent/EP0239565B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-27 JP JP62071922A patent/JP2511449B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5112949A (en) | 1992-05-12 |
| CA1327674C (en) | 1994-03-08 |
| EP0239565A3 (en) | 1989-07-26 |
| JPS62246593A (ja) | 1987-10-27 |
| EP0239565A2 (en) | 1987-09-30 |
| DE3751389T2 (de) | 1996-03-21 |
| EP0239565B1 (en) | 1995-07-05 |
| AU596159B2 (en) | 1990-04-26 |
| AT399095B (de) | 1995-03-27 |
| AU7067287A (en) | 1987-10-01 |
| ATA82786A (de) | 1989-09-15 |
| DE3751389D1 (de) | 1995-08-10 |
| ATE124703T1 (de) | 1995-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2511449B2 (ja) | 蛋白質の分離方法 | |
| Briginshaw et al. | Identification of two distinct heparin cofactors in human plasma: Separation and partial purification | |
| Seegers et al. | Further studies on the purification of thrombin | |
| US3842061A (en) | Method for isolation of antithrombin from animal tissue materials by adsorption on sulfated carbohydrate gel | |
| Yin et al. | Rabbit plasma inhibitor of the activated species of blood coagulation factor X: purification and some properties | |
| CA2024667C (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii-von willebrand factor complex from total plasma | |
| JPH05227962A (ja) | ウイルス安全性精製ヒトトロンビン | |
| Gentry et al. | Specific coagulation factor adsorption to insoluble heparin | |
| NO167627B (no) | Fremgangsmaate for rensing av faktor viii:c. | |
| Uszynski et al. | Separation and characterization of two fibrinolytic inhibitors from human placenta | |
| Bezeaud et al. | Prothrombin Madrid: a new familial abnormality of prothrombin | |
| CA2213577C (en) | A process for the preparation of factor ix from biological sources | |
| CN107406840A (zh) | 用于纯化和定量凝血酶及其降解多肽的方法 | |
| CN103328000A (zh) | 用于从含有凝血因子的溶液中减少和/或除去FXI和FXIa的方法 | |
| JP2573467B2 (ja) | 第ｉｘ因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 | |
| Prydz | Studtes on Proconvertin (Factor VII) II. Purification | |
| Prydz | Studies on Proconvertin: I. Gel Filtration | |
| Hatton et al. | Fate of thrombin and thrombin-antithrombin-III complex adsorbed to a heparinized biomaterial: analysis of the enzyme-inhibitor complexes displaced by plasma | |
| US5047503A (en) | Thrombin-binding substance and process for its preparation | |
| CA1170183A (en) | Blood coagulation promoting product | |
| Aoki et al. | Distinction of serum inhibitor of activator-induced clot lysis from α1-antitrypsin | |
| Dempfle et al. | Purification of human plasma fibrinogen by chromatography on protamine-agarose | |
| Van Creveld et al. | The separation of AHF from fibrinogen | |
| Moroi et al. | Isolation of platelet glycocalicin by affinity chromatography on thrombin-sepharose | |
| Demin et al. | Synergistic effects in the processes of protein multicomponent sorption |