JPS6023320A - 血漿の分画方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は血漿蛋白のタロマドグラフィーによる分画方法
に関する。詳しくは、本発明はイオン交換体を使用し高
純度のアルブミンを得る血漿の分画方法に閃する。

発明の背景 血漿の主要成分であるアルブミンと免疫グロブリンを分
離するために使用される工業的規模の最も普及している
方法は、アルコール水溶液を使用して蛋白を選択的に沈
澱することを原理とするコーン（Ｃｏｈｎ）の方法であ
る。沈澱による方法は選択性が完全ではなく蛋白が部分
的に変性するので、操作に長時間を要し、人手と資本の
面で高価となり、無菌かつ非発熱性の製品を得ることは
と（に困難である。

イオン交換材料の導入とともに、固定床カラムを使用し
た連続法により蛋白の混合物から個々の蛋白を分離する
ための新しい技術が提案されている０これらの方法はよ
り経済的であり、純度のより高い蛋白をより高い収量で
得ることを可能にする。しかしながら、バイオ産業にお
けるそれらの方法の大規模な開発は一定の不都合がある
ためまだ制限されている。

多糖類イオン交換体と接触させて血漿からアルブミンを
単離する方法が払国特許出願第２３，２７２，５２６号
明細書、米国特許第４．２２８．１５４号明細膏および
同第４，１３６，０９４号明細書に記載されている。こ
れらの方法は不純物とくにリボ蛋白、場合によってはγ
−グロブリンの大部分を除去するための複雑な予備処理
を含んでいたり、９８％を超える純度を得るために分子
篩によるアルブミンの最終的精製を必要としたりする。

これらの補完的処理は工業化が困難であり不経済である
。また生産性も低く、絶えず増大する世界的な蛋白の需
要により必要性の高い血漿の大量処理には適していない
。

多糖類とは逆に無機担体は優れた物理化学的性質を持ち
高い１過量を可能にするが、吸着部位が非特異的であり
、ｐＨと使用可能なイオン強度に応じて、蛋白我輩の損
失を招くことがあり得る。

無機のイオン交換担体を使用したり目マドグラフィーに
よる蛋白の分離方法はとくに仏画特許第２．５２１，９
５２号、同第２．５５９．６５４号および同第２．４６
４９６７号明細書に記載されているＯ上記のイオン交換
体が関与していると、仙漿の分画の場合、治療用途に要
求される純度の程度としては収率が不十分になることが
あり、分画すべき血漿の如何によらず高純度のアルブミ
ンを得ることができない。

発明の目的 本発明の主要な目的は、最初に血漿から夾雑物を除去す
る以外は補完的処理をすることなく、大量の血漿を処理
し、高収率で高純度の蛋白を単離することのできる方法
を提供することである。

さらに詳しくは、本発明の目的は、血漿からその由来に
かかわらず治療用途のアルブミンを大規模に抽出する方
法を提供することである。

本発明の説明 最も一般的にいえば、本発明の方法は陰イオンおよび陽
イオンイオン交換体を使用して血漿を分画することから
成り、血漿の溶液を、イオン交換体もしくは非イオン交
換体製の少なくとも一種の部分的に疎水性の支持体とイ
オン交換体製の少なくとも一種の親水性支持体とに接触
させることを特徴としている。

部分的に疎水性の支持体は、親木基を有するとともに、
親油基を有する溶質と複合体を形成し得る疎水基を有す
る支持体を意味する。これらの支持体は一般的に疎水性
の重合体すなわち炭素数６以上の直鎖もしくは分枝吠の
飽和または不飽和のアルキル基あるいは飽和または不飽
和の環状基を有する重合体から成る。これに対して、親
水性支持体は疎水基をもたない支持体であり、表面の部
位がもっばら親水性である。

さらに詳しくいえば、本発明の特徴は、部分的に脱塩し
た血漿の水溶液を順次少なくとも一種の陰イオン交換体
と少なくとも一種の陽イオン交換体に接触させ、これら
のイオン交換体としてイオン交換能が２ｍ、・ｑ／１未
満であり、粒径４μｍ〜５ｓｗ＋、孔径５００　Ｎ２，
５００人、比表面積５〜１５０冑富／ｌの多孔性無機質
支持体を、少なくとも一方の交換体用にアミノ基もしく
は第四アンモニウム塩基を含有または担持する網状化重
合体の薄膜を１５　Ｔｎ９／ｍ”未満の厚さに被覆した
もの、および他方のイオン交換体用にカルボン酸基を担
持する網状化ポリビニルラクタムの薄膜を１５１ｎ９／
ｍ２未満の厚さに被覆したものを使用することにある。

上記イオン交換体の基体となる無機質支持体はアルミナ
とシリカが代表的な例である。使用する交換体の支持体
は、上記の限定の範囲内であれば、同じ性質のものでも
異なる性質のものでも使用でき、また同じ特性のもので
も異なる特性のものでも使用できる。

使用する無機質支持体は、孔径６００〜１，５００λ、
比表面積２０〜５０ｍ”／９および粒径５０μｍ〜１ｎ
のものが好ましい。

陰イオン交換樹脂は下記の官能基を含有または担持する
網状重合体から形成される。すなわち、次式の第一、第
二もしくは第三アミン基または第四アンモニウム塩基ニ
ー冊８．−臘、−Ｎ（Ｒ）Ｑ。

−Ｎ（＋１（Ｒ）８Ｘ０（式中、Ｒは、同一または相異
なって、炭素数１〜４のアルキル基もしくはヒドロキジ
アルキル基を表わし、Ｘは、例えば塩化物、硫酸塩、硝
酸塩、燐酸塩、クエン酸塩のような無機もしくは有機陰
イオンを表わす。

第三アミン基、第四アンモニウム塩基は、支持体の全表
面を被覆しイオン交換体を形成している網状重合体の鎖
の一部となっているか、あるいはこの重合体に固定され
ており、イオン交一体の交換能は２　ｍｅｑ／、ｐ以下
、好ましくはＯ，１５〜１．２ｍｅｑ／ｇ、さらに好ま
しくは０１５〜０．７０　ｍｅｑ／、ｐである。

支持体の表面を被覆する網状重合体はそれ自体公知の製
品であり、触媒としてのポリアミンを使用すると網状化
するエポキシ化合物；ポリアミンとの重縮合により網状
化するホルムアルデヒド；重合開始剤または紫外線の存
在下でモノアルキレングリコールもしくはポリアルキレ
ングリコールのジアクリル酸エステルまたはジメタクリ
ル酸エステル、ジビニルベンゼン、ビニルトリアルコキ
シシラン、ビニルトリハロゲノシラン、ビス−メチレン
アクリルアミドのような多官能単量体と反応して網状化
するビニルピリジン、スチレンおよびそれらの誘導体な
どのビニル単量体のような単量体から得られる。

網状重合体が分子鎖中に官能基をもたない場合には重合
体を修飾する必要がある。これは特にスチレンとその誘
導体、アクリル酸アルキルとメタクリル酸アルキル、な
らびにアクリロニトリルをベースとする網状重合体の場
合である。重合体のこの修飾はあらゆる公知方法により
行われる。

支持体上のこれらの陰イオン交換樹脂とその製造法は仏
国特許公開公報第２．３２１．９３２号および同第２．
４６４．９６７号に記載されているので参照することが
できる。

陽イオン交換体に関しては、多孔性無機質支持体に官能
基−０００Ｈを担持する網状ポリビニルラクタム薄膜を
被覆する。

支持体を被覆するビニルラクタム共重合体はそれ自体公
知の製品であり、式中の単量体δ＝　ＯＨ，（Ｉ） 番 （式中、ＲはＨまたは低級アルキル基を表わし、Ｘは２
〜５の整数を表わす。）の単量体と式（ＩＤＢ・１ １　（Ｉｆ） Ｅｏ　Ｏ＝　０−　Ｒｓ＋ （式中、Ｒ１はＨまたはＯＨ，を表わし、Ｒ２は０ｌ−
Ｃ８゜の直鎖もしくは分校状の二価のアルキレン基、フ
ェニレン基、シクロアルキレン基、＋ａｎ、）ｎ−ｏ−
−ｆＯＨけ「、→Ｃ肘片ＣＯ任ＯＨ鱈「、子０ｌ−Ｔ、
甘Ｃ０〇−（−ＯＨＱす、（ＯＨＱ）。−ｓｏ、→（Ｉ
Ｈ，−袖−１…■９号ＮＲ，−＋０■、尤、または（Ｏ
Ｒ，キ００−　ＮＲ，→ＯＬ［、九　（ここにｓ　Ｒ４
は■もしくは０□−Ｃ１のアルキル基を表わし、ｎおよ
びｍは０〜１２の整数を表わす０）を介して不飽和炭素
原子に結合し得る一０００Ｈ基を表わす。）の不飽和カ
ルボン酸単量体との共重合により得られる。

式（１）の単量体の例としてはλ−ビニルピロリドン、
Ｎ−ビニルカプロラクタム、Ｎ−ビニル−β−グロピオ
ノラクタム、α−メチルビニルグロピオノラクタムなど
が挙げられる。Ｎ−ビニルピロリドンを使用するのが好
ましい。

式（ＩＤのカルボン酸の例としてはアクリル酸、メタク
リル酸、４−ペンテン酸、ビニルベンゼンカルボン酸、
６−アクリルアミドヘキサン酸などが挙げられる。

これらの単量体は当業界において公知の多官能性網状化
剤、例えばジエチレングリコールもしくはジブタン−１
，４−ジオールのジアクリル酸エステルまたはジメタク
リル酸エステルのようなポリオールのジアクリル酸エス
テル、およびトリアリルイソシアヌレートのようなトリ
アジンのビニルもしくはアリル誘導体などを使用して網
状化できる。網状化剤としては次式 ％式％ （式中、各Ｘは、同一または相異なって、低級アルコキ
シ、アセトキシもしくはフェノキシまたはハロゲン原子
の加水分解性残基を表わす。）のシラン型単量体を使用
することもできる。使用し易いシラン誘導体の例はビニ
ルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビ
ニルトリアセトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、
ビニルトリス（β−メトキシエトキシ）シランなどであ
る。

好ましくは、無機質支持体の共重合体による被覆は支持
体の存在下で単量体を現場重合することにより達成され
る。ビニルラクタム、網状化剤およびビニルカルボン酸
、場合によってさらに重合開始剤を溶媒に溶解し、得ら
れた溶液を支持体に含浸させてから溶媒を蒸発させ、単
量体を加熱や紫外線照射のようなそれ自体公知の任意の
方法により網状化する。溶媒としては、最終的に蒸発さ
せるのが容易になるように沸点ができるだけ低い単量体
の溶媒製品がすべて使用できる。例えば、塩化メチレン
、クロロフロロメタン（フルゲン）、エチルエーテル、
アセトン、酢酸エチルなどが使用できる。

一般に、単量体の使用量は多孔性支持体の表面に１〜１
５ダ／ｍ２、好ましくは１〜６■／ｍ　２の薄膜が得ら
れるように選ばれる。単量体の割合により重合体薄膜上
に割当てられる官能基の量が決定される。支持体の表面
に割当てられた官能基の量カｏ、　０５〜２　ｒｎｅｑ
／ｇ支持体となるような量のビニルカルボン酸を使用す
るのが好ましい。網状化剤の量は単量体の総重量に対し
て１〜６０重量大の範囲で変えられる。

さらに検討の結果、血漿からの蛋白の分離および非常に
高純度のアルブミンの収得が別の支持体を使用したクロ
マトグラフィーにより、イオン交換体もしくは非イオン
交換体製の少なくとも一種の部分的に疎水性の支持体と
イオン交換体製の少なくとも一種の親水性支持体を順次
使用する条件下で達成し得ることが見出された。

この場合は、一般的には、支持体は無機質でも有機質で
もよく、天然物でも合成物でもよい。大大規模生産のた
めには、もちろん無機酸化物をベースとする支持体が好
ましい。

親水性支持体はイオン交換基を有する重合体マトリック
スまたは親水性重合体薄膜を被覆した無機酸化物で構成
できる。親水性天然物支持体の例は、網状化デキストラ
ン、アガロース、網状化アガロース、セルロース、網状
化セルロースのような多糖類をペースとする重合体マト
リックスである。

公知の合成親水性重合体はアクリルアミドとその親水性
誘導体のような単量体の１合により得られる。

親水性支持体の別の群は表面を天然もしくは合成親水性
重合体で被覆した多孔性無機酸化物に代表される。多孔
性無機酸化物はシリカ、アルミナ、マグネシア、酸化チ
タンまたはそれらの天然または合成誘導体たとえばガラ
ス、ケイ酸塩、ゼオライト、カオリンなどでもよい。無
機質支持体は粒径が４μｍ　〜５１１１１　、好ましく
は５０μｍ〜ＩＭＩＬ１孔径が２５０〜ａ、ｏｏｏＸ、
好ましくは６００〜１．５００Ｘ、比表面積が５〜１５
０が７ｇ、好ましくは２０〜５ｏｍ”７ｇである。

支持体の表面を被覆する重合体は上記のような天然の多
糖類重合体でもよく、それらは網状化剤の存在下でビニ
ル単量体の重合により得られるそれ自体公知の水不溶性
親水性重合体でもよい。これらの親水性重合体の代表例
は、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシルプロピル、ヒ
ドロキシエトキシエチルのアクリル酸エステルもしくは
メタクリル酸エステルの単独重合体または共重合体のよ
うなヒドロキシアルキルもしくはヒドロキシ（低級アル
コキシ）アルキルのアクリル酸エステルまたはメタクリ
ル酸エステルの重合体；例支ば酢酸ビニルの単独重合体
または共重合体の部分加水分解物のようなカルボン酸ビ
ニルエステル重合体の部分加水分解物；アクリルアミド
重合体；Ｎ−ビニルラクタムの単独重合体および共重合
体のようなヘテロ環ビニル化合物の重合体などである。

多糖類重合体で被覆した無機酸化物は仏画特許第２゜３
１９、３９９号明細書に記載されている。

同様に、部分的に疎水性の支持体は天然もしくは合成重
合体マ）　ＩＪラックスらびに部分的に疎水性の重合体
の薄膜で被覆した上記のような無機酸化物で構成するこ
ともできる。多糖類重合体は炭素数３以上の直鎖もしく
は分枝状アルキル基またはアルケニル基；フェニル、ト
リル、キシリルのようなアリール基またはアルキルアリ
ール基；シクロヘキシルのようなシクロアルキル基また
はシクロアルケニル基のような基の不動化により部分的
に疎水性にすることができる。合成重合体はスチレンと
その誘導体のような芳香族ビニル単量体を単独でまたは
芳香族ビニル単量体同志および／または例えば（Ｏｓｅ
ｓ）アルキルのアクリル酸エステルもしくはメタクリル
酸エステル、アクリロニトリル、ブタジェンのような共
重合性単量体と混合して懸濁重合することにより得られ
、モノアルキレングリコールもしくはポリアルキレング
リコールのジアクリル酸エステルまたはジメタクリル酸
エステル、ジビニルベンゼン、ビニルトリアルコキシシ
ラン、ビニルトリハロゲノシラン、ビス−メチレンアク
リルアミドのような多官能性単量体を重合開始剤または
紫外線の存在下で使用することにより網状化できる。

本発明の方法において使用するのが好ましい疎水性支持
体は少なくとも部分的に疎水性の重合体薄膜で被覆した
無機酸化物（親水性支持体に対して上記のように定義さ
れたよりなもの）から成る。

被覆に使用する重合体は例えば長鎖の脂肪族アミンのよ
うな疎水基を不動化した多糖類重合体（この型の支持体
は仏画特許第２．４０３．０９８号明細書または米国特
許第４．３０８．２５４号明細書に記載の方法により調
製できる。）、あるいは触媒としてポリアミンを使用す
ると網状化するエポキシ化合物；ポリアミンとの重縮合
により網状化するホルムアルデヒド；重合開始剤または
紫外線の存在下でモノアルキレングリコールもしくはポ
リアルキレングリコールのジアクリル酸エステルまたは
ジメタクリル酸エステル、ジビニルベンゼン、ビニルト
リアルコキシシラン、ビニルトリハロゲノシラン、ビス
−メチレンアクリルアミドのような多官能単量体と反応
して網状化するビニルピリジン、スチレンおよびその誘
導体などのビニル単量体のような単量体を出発原料とし
て得られる合成重合体であってもよい。

イオン交換基は親水性もしくは疎水性重合体上に化学修
飾により固定するか、あるいは酸型もしくは塩基型のイ
オン化し得るかまたは化学反応により最終的に修飾され
てイオン交換基を導入し易い官能基を担持するビニル単
量体を使用して単独重合または共重合により重合体分子
鎖中に導入することもできる。

共１合性単量体の例としては次式の化合物が挙げられる
。

１ Ｈ，０＝Ｏ−Ｒ。

（式中、Ｒ１はＨまたはＯＨ，を表わし、ＲＱはフェニ
ル基もしくはナフチル基のようなアリール基；−〇謝、
−０ＯＮＩ（Ｑ、−ｏｎ、ｏＨ，−０００Ｒａ　（ここ
に、Ｒ３ような反応性官能基Ｙ；または０１　（ｈｏの
直鎖もしくは分校状の二価のアルキレン基、フェニレン
基、フクロアルキレン基、−（−ＯＨ，ｉｏ−＋（］］
Ｈ，−３−ｙ１−％Ｏｆ１ｇ４００＋０Ｈｓｋ、賢（Ｈ
，−鈷−ＣＯＯ→Ｃ■ｓ−輻−−→ＯＨ，−３ｙ　８０
　＄１−千０■−百、−印圧ｄ「皿４→Ｈ２ヤ、−■Ｈ
，キ００　ＮＲａ句Ｈへ璽（ここにＲ４はＨまたは０、
−０８アルキル基を表わし、ｎおよびｍはＯ〜１２の整
数を表わす。）を介して不飽和炭素原子に結合された前
記と同じ意味をもつ官能基Ｙを表わす。

共重合性単量体の例としては（メタ）アクリル酸、４−
ペンテン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、ビニルベンゼ
ンカルボン酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ア
クリロニトリル、メタクリロニトリル、アリルアルコー
ル、アリルアミン、１．２−ジメチル−４−ペンテニル
アミン、２，３−エポキシプロピルのアクリル酸エステ
ルおよびメタクリル酸エステル；Ｎ−メチロールアクリ
ルアミド、６−アクリルアミドヘキサン酸、スチレンな
どが挙げられる。官能共重合体を得るための反応性ビニ
ル単量体の選択は用途によってのみ制限され、その選択
は官能基によって行なわれる。例えば陽イオン基または
陰イオン基を担持する単量体を選び支持体をそのままイ
オン交換樹脂とじて使用できる。

それ自体イオン交換基をもたない単量体の場合は任意の
公知技術に従い化学反応によりその化学反応が共重合体
の安定性に適合する範囲で最終的にこれを修飾すること
が可能である。

任意の従来技術に従い共重合体に存在する反応性基Ｙを
最終的に修飾して新しい官能基Ｙ′を得ることも可能で
ある。この修飾は、例えば、第一アミンを第三アミンも
しくは第四アンモニウム塩に転換してイオン交換支持体
を得るか、あるいは場合によってアルキル化により第四
アンモニウム塩に転換することのあるジアミンの一〇〇
ｏｎ基の反応により陽イオン交換体を陰イオン交換体に
転換することによって行なうことができる。

天然もしくは合成重合体による無機質支持体の被覆は吹
付けまたは含浸のような任意の公知の方法により得られ
る。被覆する重合体が合成重合体のときは支持体を上記
の一種以上の単量体と場合によって重合開始剤を溶媒に
溶解した溶液で含浸し、次いでこの溶媒を蒸発させ、公
知の方法に従い単量体を網状化することにより得るのが
好適である。溶媒としては単量体と重合開始剤の溶媒で
あればどんな製品でも使用できるが、最終的蒸発を容易
にするためにできるだけ低い沸点のものが好ましい。こ
のような溶媒の例としては塩化メチレン、エチルエーテ
ル、ベンゼン、アセトン、酢酸エチル、クロロフロロメ
タン（フルゲン）などが挙げられる。

一般に、単量体または重合体の使用量は、支持体の表面
に１〜１５η／が、好ましくは１〜６■、／ｍ”の厚さ
の重合体の薄膜が得られるように選ばれる。

支持体の表面に割当てられる官能基の量は０．０１〜２
　ｍｅｑ／ｇ支持体が好適である。支持体をもっばらイ
オン交換体として使用するときは、その量は好ましくは
０．０５〜２　ｍｅｑ／ｇ支持体である。

陰イオン交換基はジエチルアミノエチル基や次式 ％式％（１ （式中、Ｒは、同一または相異なって、アルキル基また
はヒドロキシアルキル基を表わし、Ｘは、例えば塩化物
、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢
酸塩、蟻酸塩などのような無機もしくは有機陰イオンを
表わす。）で表わされる第四アミノアルキル基のような
芳香族アミノ基または脂肪族アミノ基により構成するこ
とができる。

陽イオン交換基はスルホン酸塩基、硫酸塩基、ホスホノ
基、カルボキシ基もしくはフェノール性水酸基、好まし
くはカルボキシメチル基またはスルホアルキル基である
。

商業的に入手し易い親水性イオン交換支持体としてはセ
ファデックスおよびセファロースという商品名でファル
マシア・ファイン・ケミカルス社かも発売されている公
知の化合物、特にＤＥＡＥセファデックス（ジエチルア
ミノエチルデキストラン）、ＱＡＥセファデックス（第
四アンモニウム塩化ジエチルアミノエチルデキストラン
）、ＤＦｉＡＥセファロース（ジエチルアミノエチルア
ガロース）、０Ｍセファデックス（カルボキシメチルデ
キストラン）、ＳＰセファデックス（スルホプロピルデ
キストラン）、ＯＭ七ファμｍス（カルボキシメチルア
ガロース）ならびにＤＥＡＥ　）リスアクリルＭおよび
ＣＭトリスアクリルＭという商品名でシミーク・ボワン
テット・ジラール社から発売されている公知化合物が挙
げられる。

部分的に疎水性の支持体としては、網状化アガロースを
ベースとするフェニルセファロース０Ｌ−４Ｂ、オクチ
ルセファロース０Ｌ−４Ｂ　（ファルマシア・ファイン
・ケミカルス社）という商品名で知られる製品、第四ア
ンモニウム基を担持するビニルトルエンをベースとする
重合体で被覆したシリカでアルスフエロシルＱ　ＭＡ　
（ロース・ツーラン研究所）という商品名で知られる製
品を挙げることができる。

本発明で使用する血漿は動物由来のもの、特に牛血漿、
またはヒト血漿でもよいａ血漿は血液のデカンテーショ
ンまたは遠心分離、あるいはグラスマフエレーゼのモジ
ュール上での限外ｐ過により得られる。新鮮なもしくは
解凍した全血漿、もしくは低温沈澱の上清、のみならず
他の分離法により得られた分画を使用することができる
。

イオン交換体を使用して分画する血漿は前処理をして塩
類を少なくとも一部除去し、好ましくは、不安定な蛋白
複合体を構成する真正グロブリンを除去する。これらの
前処理はポリエチレングリコールのような清澄化もしく
は沈澱助剤または粉末状燃焼シリカのような吸着剤を使
用する必要がないが、もちろんそのような前処理を施し
た血漿溶液にも本発明の方法は適用できる。

脱塩と田およびイオン強度条件の調整は特に隔膜ｐ過ま
たは透過クロマトグラフィーにより行なうことができる
。さらに詳しくいうと、脱塩は、例えば網状化ポリビニ
ルラクタムのような親水性重合体の薄膜で被覆した孔を
もつ多孔性無機質支持体上での透過クロマトグラフィー
により達成することができる。この操作に使用する無機
質支持体は孔径が４０〜３００＾、比表面積が１００〜
８００が７ｇおよび粒径が４μμ〜５朋であるのが有利
である。

被覆は支持体上に重合体を単に吸着させることによって
得られるが、好ましい使用態様としては被覆は前記の化
合物から選ばれた多官能網状化剤の存在下、陽イオン交
換樹脂の調製のための前記の方法で例えばＮ−ビニルピ
ロリドンのようなＮ−ビニルラクタムの溶液を使用して
現場重合することにより実現される。網状化剤と１〜て
は無機質支持体とポリビニルラクタムとの間に安定な結
合を形成し得るシラン誘導体を使用するのが好ましい。

単量体の１は支持体の表面に１〜１５■／？７１２、好
ましくは１〜６ｉｎ９／ｍ２の厚さの重合体の薄膜が得
られるように選ばれ、網状化剤の量は単量体のｉ重量に
対して１〜５０重量％の範囲内で変えられる。

低イオン強度では田５近傍で血漿からそれに含まれてい
る真正グロブリンを除去することができ、次いで遠心分
離し、清澄化した血漿溶液を分離する。

本発明の方法に従えば、血漿溶液は少な（とも一種の部
分的に疎水性の支持体と少なくとも一種の親水性支持体
とに接触させられる。部分的に疎水性の支持体は必ずし
もイオン交換基を含有している必要はないが、少なくと
も一種の陰イオン交換支持体と少なくとも一種の陽イオ
ン交換支持体を使用する必要がある。陰イオン交換体を
陽イオン交換体に先行させるのが有利である。

本発明の好適な実施態様においては、収率な増加させよ
り純度の高いアルブミンを得るために、部分的に疎水性
の支持体として陰イオン交換体を使用し、親水性支持体
として陽イオン交換体を使用する。

最も好適な実施態様においては一方が親水性であっても
よく他方が部分的に疎水性である二つの陰イオン交換体
と親水性の陽イオン交換体とを組み合わせて分離を行な
う。後者の二つの支持体に通す順序はどちらが先でもよ
い。

イオン強度を調整し、好ましくは清澄化した血漿の分画
は一種以上の陰イオン交換体と陽イオン交換体とを順次
使用し田とイオン強度をアルブミンであれ他の蛋白もし
くは不純物であれ選択的に固着されるように調整するこ
とによって行なわれる。

例えば、血漿の溶液を予め平衡化した部分的に疎水性の
陰イオン交換支持体と接触させ主としてアルブミンとα
−グロブリンがＦ４（５以上で固着されるようにするこ
とができる。田が４．４〜４．８で適当なイオン強度の
緩衝液を使用して溶離することによりアルブミンに富み
、残余α−およびβ−グロブリンを含む溶液が得られる
。例えば…４．７の０．０２５Ｍ酢酸塩緩衝液を使用す
ることができる。ｐＨ５，０以上に調整した溶離液を次
いで予め同じ田の緩衝液で平衡化した陽イオン交換体と
接触させると、この陽イオン交換体上にアルブミン以外
の蛋白のほとんど全部が保持される。

他の使用例では、血漿溶液を親水性陰イオン交換体、部
分的に疎水性の支持体、好ましくは陰イオン交換体、次
いで親水性陽イオン交換体を順次に接触させる。血漿溶
液の田とイオン強度を上記のように調整して最初の親水
性陰イオン交換体上にアルブミンと若干のα−およびβ
−グロブリンが保持されるようにする。溶離後、アルブ
ミンを含む溶液を部分的に疎水性の支持体と接触させる
とそれに種々の不純物が保持される。これらの不純物の
うちリボ蛋白は田４．５〜６．０１好ましくは）Ｈ４，
７〜５．２で０．０２５〜０．０６Ｍ＋７）酢酸塩緩ｅ
液を使用して固着することができる。アルブミンを含む
溶離液を上記の条件下で陽イオン交換体で最終的に精製
する。

陰イオン交換支持体を横断する免疫グロブリンは溶液の
田とイオン強度を変えて別のイオン交換支持体と接触さ
せることにより精製することができる。

無機酸化物をベースとする支持体を使用する好適な実施
態様においては陰イオン交換体の量は血漿１１当り２５
０〜２０００ゴにしてもよく、陽イオン交換体の量は血
漿１ノ当り２００〜１０００ａにしてよい。血漿溶液と
各交換体との接触時間は約１５分以上である。

本発明の方法によれば最初の血漿に含まれている蛋白全
体を評価することができるとともに、電気泳動法により
５０ｇ／ｌの濃度で測定した純度が９９％以上１００％
にも達し得るアルブミンを溶液で得ることができる。ゲ
ルｐ過分析によりアルブミンの重合体は存在しないこと
が示されている。

アルブミン溶液の純度は免疫沈降技術により評価するこ
とができる。特に、ゲロースを使用した二重免疫拡散技
術に従いリポ蛋白α１およびβの不存在を示すことがで
きる。場合によって検出できる痕跡量のα１アンチトリ
プシンとハプトグロビンはアルブミンの品質にとって不
都合ではない。

このアルブミン溶液は例えば限外ｐ過のような任意の公
知方法により濃縮し、次いで調整および安定化して法定
の加熱処理を６０℃で１０時間行なってアルブミン溶液
を注射可能にする。イオン交換体に保持されているアル
ブミン以外の蛋白は再生溶液を使用して溶離することか
できる。流出溶液と再生溶液に含まれる蛋白混合物はク
ロマトグラフィー技術により最終的にそれぞれの蛋白に
分離することができる。

血漿の処理は一連のカラムを使用してタンク内で不連続
的、半連続的または連続的に行なうことができる。連続
的処理は工業的実施にとくに適している。カラムで連続
的に行なう方法により殺菌塵の高い条件下で製品の収率
と純度を向上させることができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが
、これらの実施例は例示であり本発明はこれらに限定さ
れない。

実施例１ ムー排除りロマトグラフィー用支持体の調製（ＧＰＯ）
粒径４０〜１００μｍ、比表面積４００　ｍ２／９、平
均孔径８０Ｘおよび気孔容積１　ｍｌ／ｉのシリカ２０
０ｇを減圧下１５０℃で５時間乾燥する。

得られた乾燥シリカをフルゲン１１　（ｃｏｔ８ｐ　）
５００ｍｇ１　Ｎ−ビニルピロリド７１５０ｍｌ、ビニ
ルトリエトキシシラン３Ｑｄおよび過酸化ジラウロイル
１ｇを含む均質溶液中に導入する。フルゲン１１を周囲
温度で蒸発させ、次いで含浸シリカを８０℃で１７時間
加熱して網状化させる。

次いでこのシリカを８００　ｍｌの流水中に懸濁し、５
時間沸騰させる。ｐ過後シリカを流水およびアセトンで
順次洗浄し、次いで真空下４０℃で乾燥させる。分析の
結果、被覆シリカに対して１２重量製の炭素量が得られ
た。

Ｂ−支持体上の陰イオン交換体の調製 粒径１００〜３００μｍ、比表面積２５ｍ”／７、平均
孔径１，２５０！、気孔容積１ｍｌ／９のシリカを官能
基−Ｎ”　−（ＯＨ，）ａ　Ｃ，＋−＋をもつビニルト
ルエンの網状化により得られ下肥の特性を示す共重合体
で３、６　ｍｌ／ｎ２の厚さに被覆して支持体上にイオ
ン交換体を調製する。

炭素量　６，１％ 窒素ｉ　０．４２％ イオン交換能　０．３０　ｍｅｑ／ｇ 粒径１００〜３００μｍ、比表面積２５が７ｇ、平均孔
径１，２ｓｏ、Ｌおよび気孔容積１ｘｌ／ｇのシリカ１
００ｇを減圧下１５０℃で５時間乾燥する。

得られた乾燥シリカを、Ｎ−ビニルピロリドン５０ゴ、
アクリル酸２１、ビニルトリエトキシシラン１５ｉｉｊ
および過酸化ジラウロイルを２５０ｍ１のフルゲン１１
に均質化した溶液中に導入する。

周囲温度で溶媒を蒸発させた後、含がシリカを８０℃で
１６時間加熱して網状化させる。

次いでこのシリカを４ＱＱｉｄの流水中に懸濁し５時間
沸騰させる。濾過後シリカを流水およびアセトンで順次
洗浄し、次いで真空下４０”Ｃで乾燥させる。

このようにして得られた微量の陽イオン交換体を結合し
たシリカは下記の特性を示す。

％０　６．０５ ％Ｈ１，０９ ％Ｎ　Ｏ，３ イオン交換能：　０．２０　ｍｅｑ／＃固定重合体量！
３．２　■／ｍ” 血漿の前処理 直径２．６ｆｆｉの力２ムに上記支持偉人を装入し圧縮
状態に保つ。

このカラムに０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶１１１
［２０Ｑｍ、プラスマ７エレーゼのモジュールからの新
鮮血漿６０１１１７および新たに０．０２５　Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝溶液１００ｄを順次３０晩の流速で注入す
る。全蛋白を使用緩衝溶液の固有抵抗に近い固有抵抗を
有する溶液６５ｄ中に集める。

６％酢酸溶液を徐々に加えることによりこの蛋白溶液の
田を５．１に調整する。沈澱した真正グロブリンを遠心
分離する。

このようにして得られた蛋白溶液は下記の特性を示す。

固有抵抗＝　５２０Ωｃｍ２／ｃｍ 全蛋白？　４３．８７７７１ 組成：　アルブミン　６６８％ α−グロブリン　９．２％ β−グロブリン　６．６％ γ−グロブリン　１７．４％ 血漿溶液の分画 直径１．６ｃＩＩＬのカラムＩに上記陰イオン交換体Ｂ
２５ｐを装入し圧縮状態に保つ。このカラムを田５．１
の０．０２５Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝溶液で平衡化す
る。

直径１ｃｒＩＬのカラム■に上記陰イオン交換体ＢＩＯ
９を装入し圧縮状態に保つ。このカラムをＦ４（４，７
の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。

直径１ｃＩＩＬのカラム■に上記陽イオン交換体０５ｙ
を装入し圧縮状態に保つ。このカラムを田５．５の０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。

カラムＩに前処理した血漿溶液５６ｍｚを一定流速７０
鴫４で、川５．１の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶
液１００ゴ、次いでＦ４（４，７の０．０２５Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝溶液を順次注入する。

カラムＩから溶離した溶液１８５ｄを回収したところ、
全蛋白量は８．８１／ｌであり下記の組成を示した。

アルブミン　９３％ α−グロブリン　１．６％ β−グロブリン　３％ ｒ−グロブリン　２．４％ このカラムのアルブミン抽出収率は８９．２％である。

カラム■の溶離液１３０ｄを一定流速４０　ｒｎｌＡｌ
でカラム■に注入する。次いでカラム■にＦ！（４，７
の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液１１０ａｕを注
入する。これらの流出液と洗浄液を混合して全蛋白量４
．２９／］の下記組成をもつ溶液を得る。

アルブミン　９６．５％ α−グロブリン　０．８％ β−グロブリン　２．７％ カラム■のアルブミン抽出収率は９１．４％である。

カラム■で集めた溶液を塩化ナトリウムの添加により田
５．５および固有抵抗１８０Ωｃａｔ”／−に調整する
。この溶液９４ｍをカラム■に流速４０ＩＩＬｔ４　で
注入する。このカラムをＦ４″１５．５の０．１　Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝溶液２６ｍで洗浄する。流出液と洗浄
液を混合して全蛋白量が３．　ＯＥｌ／ｌの下記組成を
もつ溶液を得る。

アルブミン　９９．５％ α−グロブリン　０．５％ カラム■のアルブミン抽出収率は９４％である。

分画全体のアルブミン抽出収率は７６．６％である。

カラムＩとカラム■は田４．０の１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝溶液で再生できるが、カラム■は０．５ＮＨＯ７溶液
で再生できる。

カラムＩＯｐ液（すなわち流出液）はγ−グロブリン７
５％、β−グロブリン２５％および痕跡量のα−グロブ
リンを含有している。このｐ液をカラムＩと同じカラム
■に田を５．８およびイオン強度をＱ、０５０Ｍに調整
してから注入すると、γ−グロブリンの純度が１００％
近い溶液が回収される。γ−グロブリンの全体の抽出収
率は８０％である。

実施例２ プラズマフエレーゼのモジュール由来の一４０℃で貯蔵
された血漿１００１を＋４℃で徐々に解凍し遠心してフ
ァクター■を含有する沈澱を除去する。得られた血漿で
ある「低温型沈降物の上清」を隔膜ｐ過により…７．４
の０．００５Ｍ酢酸塩緩衝溶液に対して透析する。６％
酢酸により田５，１に溶液を酸性化し次いで遠心して真
正グロブリンを除去した後、得られた蛋白溶液は下記の
特性をもつ。

固有抵抗：　１．０６６ΩｃＩＬ２／ｃＩｎ全蛋白量７
　３９．４９／ｌ 組成：アルブミン　６７．３％ α−グロブリン　９．１％ β−グロブリン　７．２％ γ−グロブリン　１６．３％ 血漿の分画 前記の蛋白溶液５８１を流速７０ＪＩ＋４／ｈで実施例
１に記載のカラムＩに注入する。このカラム■は陰イオ
ン交換体Ｂを含有し田５．１の０．０２５　Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝溶液で予め平衡化しである。

このカラムを同じ緩衝溶液１００Ｊで洗浄し、次いで…
４．５の０．０２５　Ｍ酢酸塩緩衝溶液で溶離する。

このようにして集めた溶離液の全蛋白量は１０，１１／
ｌであり下記の組成をもつ。

アルブミン　９５．０％ α−グロブリン　１．８％ β−グロブリン　３．２％ γ−グロブリン　０％ このカラムのアルブミン抽出収率は７８％である。

溶離液５ｏＩｎｌを一定流速４０　ｒｎｌＡで、陽イオ
ン交換体０を含有し）４（５，５の０．１Ｍ酢酸塩緩衝
溶液で予め平衡化した実施例１のカラム■と同じ第２の
カラムに注入する。このカラムを同じ緩衝溶液１５１１
１）で洗浄する。流出液と洗浄液を混合して全蛋白量が
７．２７１１／ｌで下記組成をもつ溶液を得る。

アルブミン　９９．０％ α−グロブリン　１．０％ このカラムのアルブミン抽出収量は９７，５％であり、
この分画法により得られたアルブミンの全体の抽出収率
は７６％である。

実施例３ 遠心により得た牛血漿１００就を隔膜−過により田７．
４の０．００５Ｍ酢酸塩緩衝溶液に対して透析する。

前記実施例１および２と同様にして真正グロブリンを除
去して得られた蛋白溶液は全蛋白量が３９、１１／ｌで
あり下記の組成をもつ。

アルブミン　６６１％ α−グロブリン　８６０％ β−グロブリン　１０．０％ γ−グロブリン　１５．９％ この蛋白溶液５８ＩＩ！７！を流速７０ｒＩＬｌ／／ｌ
ｌで、陰イオン交換体Ｂを含有し田５．１の０．０２５
Ｍ酢酸塩緩衝溶液で予め平衡化した実施例１に記載のカ
ラム■に注入する。このカラムを前記実施例と同様に処
理する。集められた溶離液（１６７ｙ）は蛋白７、５　
ｆＩ／ｌを含有し、蛋白の組成は下記の通りである。

アルブミン　９５．３％ α−グロブリン　１．６％ β−グロブリン　３．１％ γ−グロブリン　０％ 次いで、この溶離液６７ＩＩＬｔを流速４０ｍ／ｈで、
陽イオン交換体０を含有し田５．５の０．ＩＭ酢酸塩緩
衝溶液で予め平衡化した実施例１に記載のカラム■と同
じ第２のカラムに注入する。このカラムを同じ緩衝溶液
２３１ｎｌで洗浄する。

流出液と洗浄液を混合すると、全蛋白量が５．１１１／
ｌであり下記組成の溶液が得られる。

アルブミン　９９．１％ α−グロブリン　０．９％ この分画法により得られるアルブミンの収率は７５．６
％である。

実施例４ 血漿溶液の調製 血漿２５０νを３７℃で解凍し、濃ＨＧＩ７で…５．２
に調整し、…５２の０．０１Ｍ９Ａ酸塩緩衝溶液６０４
に対して透析する。

遠心して全蛋白量が３５．５　ｆｊ／ｌであり下記組成
をもつ血漿溶液２９３ｄを得る。

アルブミン　５６．５％ α−グロブリン　１２．９％ β−グロブリン　９．５％ γ−グロブリン　２１．１％ 分画 下記のものを直列に設備する。

一実施例１に記載の部分的に疎水性の陰イオン交換支持
体Ｂを１５ｇ含有するカラム■（直径１、６　ｃｌＩＬ
） 一上記と同じ陰イオン交換体Ｂを５ｇ含有するカラム■
（直径１　ｃｍ　） 一粒径１００〜３００μｍ、比表面積３２７Ｂ、”　／
　／ｉ　。

平均孔径１，１５０！および気孔容積１．２１ｎｌ／７
７のシリカをＮ−ビニルピロリドン−アクリル酸共重合
で５ＴｔＴ９／１ｒＬ２の厚さに被覆して成る陽イオン
交換支持体りを５ｇ含有するカラム■（直径１、　ｃｍ
、　）。

この支持体は単量体の割合を変えた以外は陽イオン交換
体Ｃ用の実施例１に記載の方法により調製する。陽イオ
ン交換支持体りの特性は下記の通りである。

炭素量　８．４６％ 窒素量　１．２９％ イオン交換能　０．１９　ｍｅｑ／、９前記のように調
製した血漿溶液３５Ｉ！Ｌｌを流速６０　ｒＩＬｌ／ｈ
で、ｐｉ−１５，２の０．０２５　Ｍ酢酸塩緩衝溶液で
予め平衡化したカラムＩに注入する。このカラムを平衡
化に使用した緩衝溶液６５ｄで洗浄した後、同じ流速（
６０ＴＪＬｔ／ｈ　）で田４．７の０．０２５Ｍ酢酸塩
緩衝溶液を注入する。溶離溶液１６０ＩＩ＋７（蛋白濃
度３．７２１／ｌ　）はアルブミン９２．５％、α−グ
ロブリン３％ならびにβ−およびγ−グロブリン４．５
％を含有している。溶離溶液の一部（１３８１１１７）
を流速４０　ｍｌＡで、Ｎ（４，７の０．０２５Ｍ酢酸
塩緩衝溶液で予め平衡化したカラムＨに注入する。

このカラムを同じ緩衝溶液２２属で洗浄する。

流出液と洗浄液を混合すると、蛋白濃度は３．０６９／
ｌでアルブミン９３．６％、α−グロブリン２５％およ
びβ−グロブリン３．５％を含有している。

前記混合溶液の一部（１４Ｑｍ）をＮａＯＨの添加によ
り田５．５および１ＭＮａＯ７の添加により固有抵抗２
７０Ωｃｒｎ”　／ｃｉｉに調整し、次いで流速２９ｍ
／！４で、田５．５のＱ、０５　Ｍ酢酸塩緩衝溶液で予
め平衡化したカラム■に注入する。このカラムを同じ緩
衝溶液２５ｍ１で洗浄する。

流出液と洗浄液の濃縮混合液を電気泳動にかけたところ
アルブミンに不純物の混入はみられなかった（アルブミ
ン１００％）。

出発血漿溶液に含まれるアルブミンに対する全収率は７
１％である。

カラ、ＡＩ、■および■は０．ＩＮＩ（Ｏ７溶液、蒸留
水および緩衝溶液によりそれぞれ再生される。

実施例５ 下記ＡおよびＢを調製する。

Ａ−多孔性無機質支持体に担持した親水性陰イオン交換
体−［陰イオン交換体Ｅ　ｊ 粒径１００〜２００μ、比表面積３０　ｍ　２／、ｉｉ
’　ｓ平均孔径１，２５０！、気孔容積ｉ　ｍ１７ｇの
多孔性シリカ（スフエロシルＸ０ＢＯ１５）１００＆を
水酸化ナトリウムの添加により…１１．５に調整した７
、５％ＤＥＡＥデキストラン水溶液２００ゴに添加する
。

このペーストを回転乾燥室内で８０℃の温度で１５時間
乾燥する。得られた粉末を、１，４−ブタンジオール−
ジグリシジルエーテルの０．１５％エチルエーテル溶液
に添加し、エーテルを窒素気流中周囲温度で蒸発除去す
る。次いで８０℃で１５時間加熱して網状化する。使用
前にこの支持体を０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液１０容、
０、ＩＮＨＯ／溶液１０容およびエチルアルコール溶液
１０容で洗浄し、次いで乾燥し使用時まで貯蔵する。

このようにして、　ＤＥＡＥデキストラン１３％を含有
し０．２　ｒｎｅｔＪｇのＯｌイオンを固定する能力を
もつ粉末１１５．！ｉ’を得る。

Ｂ−多孔性無機質支持体上に担持した部分的に疎水性の
陰イオン交換体−「陰イオン交換体！」このイオン交換
体の調製に使用する支持体は前記Ａと同様に調製される
が、最終的にＤｌｊＡ　１６デキストランを５，７％し
か含有していない。

支持体１００ｇを、１０９／ｌのＭａｉｌを含有する０
、０５Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎａｌ０４）　水
溶液５００１１１１で周囲温度で２時間酸化する。１０
９／ｌ　ＮａＣ７溶液、次いでエチルアルコールで洗浄
した後、生成物を窒素気流中４０℃で乾燥する。

酸化支持体１００Ｉをヘキサデシルアミンの６％エチル
アルコール溶液１００ゴに添加し、周囲温度て゛４８時
間放置する。

このようにして形成されたイミン結合のアミン結合への
還元は水素化ホウ素す）　ＩＪウムＮａＥＨ，を添加し
て５０％の水の存在下０．２　Ｍの濃度にすることによ
り行なわれる。アルコールで洗浄した後０．１ＮＨＯノ
で洗浄をくり返し、洗浄支持体を乾燥して使用時まで貯
蔵する。

血漿の前処理 クエン酸ナトリウムで予備洗浄したヒト血漿２００ｄを
１６％エタノール水溶液２００１に０℃で添加する。生
じた沈澱を遠心で除去する。上清を＋４℃で（ＮＨＯ７
で）酸性にし田５．２５にする。２時間後、生じた沈澱
を遠心により除去し、上清を限外−過セル内で隔膜−過
し、７１４（５，２５の０．０１Ｍ燐酸塩緩衝溶液で平
衡化できるようにする。真正グロブリンの沈澱を新たに
遠心により除去し、得られた上清を多孔度０．２μのメ
ンプランでｐ遇する。その固有抵抗は１，２００ΩＣＩ
ＩＬ２／ｃＩＩＬである。

一直径２．５　ｃｍのカラムＩに陰イオン交換体Ｅ５０
ｇ（１０５ｄ）を充填する。このカラムを…５．２５の
０．０１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。

一直径２．５ｃＩｒＬのカラム■に陰イオン交換体Ｆ３
０、！ｉ’　（６３ｄ）を充填する。このカラムを区１
５の０．０５４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する
。

一直径２．５　ｃｍのカラム■に実施例４に記載された
陽イオン交換体Ｄ６０ｇ（１２６Ｉ１１７りを充填する
。このカラムを…５．５の０．０５４Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝溶液で平衡化する。

上記の前処理法に従って得られた血漿２００　ｍｌに相
当する清澄化した溶液をカラムＩに流速４００屹りで注
入する。このカラムを…５．２５の０．０１Ｍ燐酸塩緩
衝溶液２００ａで洗浄し、次いで固着したアルブミンを
田４．７の０．０２５Ｍ酢酸塩緩衝溶液５００１１Ｌｌ
で溶離する。溶離液を集めたところ４００ｄの体積であ
った。

このようにして得られた溶離液をＮ　ＮａＯＨの添加に
より田５に調整し次いでＮａｐｌを添加して固有抵抗を
２７０ΩｃｒＩＬ２／ｃｒＩＬにする。この溶液をカラ
ム■に流速１００鴫で注入する。

この条件下ではアルブミンの大半は固着されずｆ液とと
もにカラムを通過する。カラムをＦ４（５００，０５４
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液１２０ＩＩＬｌで洗浄する。

アルブミンを含有する混合物をＮａＯＨの添加により田
５．５に調整し、カラム■に流速２００　ｉＪ／ｈで注
入する。このカラムを…５，５の０．０５４Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝溶液２００ｄで洗浄する。流出液を混合し、
アミコンＰＭＩＯメンプランで限外ｐ過して濃縮し濃度
を５０〜２００１／ｌにする。

５０９／ｌにおけるアルブミン溶液の純度を局方記載の
条件下で酢酸セルロースを使用（−た電気泳動および免
疫電気泳動により計画する。これらの純度は１００％で
あった。種々の血漿蛋白の特異抗血清に対するゲロース
を使用した二重免疫拡散分析により蛋白不純物、特にα
−およびβ−リポ蛋白、が存在しないことが証明された
。Ｎ製アルブミンの最終濃度が１３０１／ｌであるとき
は、電気泳動では見えない痕跡量のα１抗トリプシンと
ハプトグロビンが対応する抗血清に対する二重免疫拡散
により検出することができる。

これらの痕跡量の不純物が存在することは正常であり、
最終的に得られるアルブミン溶液の安定性または動物も
しくはヒトに静脈内投与するときの良好な寛容に対して
影響を与えない。

アルブミンの収率と純度に関する結果は表Ｉに示す。

三つのカラム全体を田４の０．１　Ｍ酢酸塩溶液または
２０　ｇ／ｌ　ＮａＯ！溶液で洗浄することができ、こ
れにより保持されているアルブミンを回収し次のサイク
ルのときにまたは独立の処理においてこれを再使用する
ことができる。

次いてこれらのカラムは０．１　Ｎ　Ｈｏｔと６０％エ
タノールで順次洗浄することにより再生する。場合によ
って、これらのカラムは混法（ホルモール２％）で定期
的に消毒することができる。

実施例に の実施例では親水性陰イオン交換支持体、疎水性陰イオ
ン交換支持体および親水性陽イオン交換支持体を使用す
る。

下記のカラムを直列に配置する。

一実施例５に記載された陰イオン交換支持体１４ｙを含
有するカラムＩ（直径１．６　ｃｍ　）。このカラムを
Ｆ４（５−２の０．０１Ｍ燐酸塩緩衝溶液で平衡化する
。

一陰イオン交換体Ｂを含有する実施例４のカラム■と同
じカラム■。

一陽イオン交換体りを含有する実施例４のカラム■と同
じカラム■。

同じ血漿溶液５１ｄから出発し実施例と同様にしてかつ
カラムＩの溶離用およびカラム■およびカラム■の洗浄
用の緩衝溶液を使用して操作する。

カラムＩ、■および■の流駕はそれぞれ６０ｍ１４．２
０Ｉｎｌ／ｂおよび２（ＩＡ／ｈで！、、る。

５０ｇ／ｌに濃縮した最終溶液の電気泳動分析によりア
ルブミンに不純物の混入はないことが示された。１３０
　ｇ／ｌに濃縮した溶液の二重免疫拡散のコントロール
は蛋白不純物が全く存在しないことを示している。

アルブミンの％とカラムの収率は表■に測定結果な示す
。

実施例７ カラム■とカラム■の順序を入れ換えた以外は実施例６
と同様に操作する。

カラムＩから出た溶離液をＮａ、ＯＨでｌ：ｆ１５．５
にかつｌ　Ｍ　Ｍａｉｌで固有抵抗２７０ΩｃＩＩＬ２
／ｃＩＩＬに調整しカラムＨに注入する。

カラム■から来る溶液（流出液十洗浄液）をＩＮ　Ｉｉ
Ｏ／で…４．７に調整してカラム■に注入する。

カラム■、■および■の流速はそれぞれ６ＱＩＬｌ／ｈ
　、２０　ｍｌ／ｂおよび２０　ｍｌ／ｂである。

１３０９／ｌに濃縮した最終溶液の電気泳動および免疫
拡散分析によりアルブミンに不純物の混入はないことが
示された。

シアルブミンと収率の結果は表１に示した。

実施例８ カラム■を非イオン交換体の部分的に疎水性の支持体を
含有する新しいカラム■で置き換えた以外は実施例６と
同様に操作する。この支持体は粒径１００〜３００μｍ
、比表面積２　ｓ　ｍ２／Ｉ　ｓ平均孔径１．２５０　
！および気孔容積１鴫４のシリカを網状化したビニルト
ルエン−ビニルトリエトキシシラン共重合体で３．３■
／ｍ２の厚さに被覆した炭素量が７．３のシリカから成
る。

カラム■を９５％エタノール５ＱＩ１１１．次いで川４
．７の０．０２５Ｍ酢酸塩緩衝溶液５ＱｍＪで平衡化す
る。

カラムＩ、ＩＩおよび■の流速はそれぞれ６（ＩＪ／ｈ
　、２０　ｉｕ／ｈおよび２０ゴ／ｈである。

カラム■の流出液はアルブミン９９．３％およびα−グ
ロブリン０７％を含有している。

結果は表Ｉに示す。

実施例９ カラム■を同じ大きさおよび使用条件の０Ｍセファロー
ス０Ｌ−６Ｂ　（ファルマシア・ファイン・ケミカルス
社、スウェーデン国つプサラ市）のカラムで置き換えた
以外は実施例５と同じ条件で操作する。結果は表Ｉに示
す。

実施例１０ カラム■を同じ大きさおよび使用条件のＣＭ　）リスア
クリル−Ｍ（試薬ＩＢＦ　、ボワンテットージラール社
、フランス国とルネープ・う・ガレンヌ）のカラムで置
き換えた以外は実施例６と同じ条件下で操作する。

結果を表■に示す。

実施例１１ カラムＩを同じ大きさおよび使用条件のＤΣＡＩＭセフ
ァロース０Ｌ６Ｂ（ファルマシア・ファイン・ケミカル
ス社、スウェーデン国つプサラ市）のカラムで置き換え
た以外は実施例９と同じ条件下で操作する。

結果を表Ｉに示す。

実施例１２ カラム■を同じ大きさおよび使用条件のＤＥＡ］ｉｉト
リスアクリルＭ（試薬ＩＢＦ、ボワンテット・ジラール
社、フランス国ビルネープ・う・ガレンヌ）のカラムで
置き換えた以外は実施例１０と同じ条件下で操作する。

結果を表Ｉに示す。

実施例１３ 一直径２．５０のカラム■に実施例５に記載の陰イオン
交換体１０１００Ｆ（２１０を充填する。

このカラムをｒＨｓ、２５の０．０２５　Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝溶液で平衡化させる。

一直径２．５　ｃｔｎのカラム■にヘキサデシルアミン
を結合したセファロース０Ｌ４Ｂ６３ＩＩＬｌを充填し
、…５の０．０５４Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化する。

ヘキサデシルアミンの結合は臭化シアン法により下記の
手順に従って行われる。

すなわち、セファロースＯＬ４Ｂ１００１ｍ／を脱イオ
ン水で順次３回デカンテーションを行すうことにより洗
浄し、水２０ＯＮを追加する。

ソーダ（ＮａＯＨ）を連続的に添加することにより田を
１１に保ち、ＢｒＣＮ９．！ｉ＋を添加する。反応を約
１５分間継続する。田がそれ以上増加しなくなったら支
持体を０．１　Ｍ重炭酸塩で洗浄し次いで９５％エチル
アルコールで洗浄する。

アルコール２００ｊ１７にヘキサデシルアミン２０ｇを
溶解した溶液を支持体に４０℃で加え、１５時間反応さ
せる。

最後に、支持体を数置０．１１ＪＩ（Ｏ７溶液および９
５％アルコール溶液で順次洗浄し、次いで前記のように
平衡化した。

一直径２．５　ｃｍのカラム■に実施例４に記載の陽イ
オン交換体Ｄ　６０，９（１２６ＩＩＬｌ）を充填する
。

このカラムを）！（５，５の０．０５４Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝溶液で平衡化する。

低温型沈降物の上溝２００ｍを０℃で１６％エタノール
水溶液２００ｄに添加する。生じた沈澱を遠心により除
去する。上溝を＋４℃でＣＮｍｏｔにより）酸性にして
ｐＨ５，２５にする。２時間後、生じた沈澱を遠心によ
り除去し、上清を限外ｒ過セル内で隔膜ｒ過しテｌ’４
（５，２５）０．０２５　Ｍ酢酸塩緩衝溶液で平衡化す
る。真正グロブリンの沈澱を遠心により新たに除去し、
得られた上清を多孔度０．２μのメンプランでｐ遇する
。その固有抵抗は６３００ｃｍ２／ｃｍである。この溶
液をカラムＩに流速４００帳で注入する。このカラムを
ｐＨ５，２５の０．０２５Ｍ酢酸塩緩衝溶液２００　ｍ
ｌで洗浄し、次いで固着されたアルブミンをｐＨ４，７
の０．０２５Ｍ酢酸塩緩衝溶液４００ゴで溶離する。溶
離液を集めたところ、その体積は３５０ｄであった。

このようにして得られた溶離液を１ＪａＯＨの添加によ
り田５に調整し、次いでＭａｉｌを添加して固有抵抗２
７０ΩｃＩＩＬ２／ｃＩｎにする。この溶液をカラム■
に流速１００帳で注入する。

このカラムにより無視できない量のアルブミンが固着さ
れたが、前記の諸実施例のカラム■で使用した支持体に
比べて収率が２０〜３０％減少している。カラムを通過
した溶液はアルブミンと若干のα−およびβ−グロブリ
ンを含有している。

このカラムをＦ４］５の０．０５４Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝溶液１２０ａで洗浄する。アルブミンを含有する混合
物をＮａＯＨの添加により田５．５に調整し、カラム■
に流速２００幌で注入する。このカラムを田５．５の０
．０５４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液２００ｍＡ！で洗浄
する。流出液を混合し、アミコンＰＭＩＯメンプランで
限外ｐ過することにより濃縮して濃度を５ｏｆｔ／ｌに
する。

この溶液の純度は、局方記載の条件下で酢酸セルロース
を使用して電気泳動で評価したところ９９．１％であっ
て、従って現行の基準に照らして満足なものと考えられ
る。種々の血漿蛋白の特異抗血清に対するゲロースを使
用した二重免疫拡散分析により次の不純物ニドランスフ
ェリン、α１抗トリプシン、α２マクログロブリンおよ
びハプトグロビン、の存在を検出することができる。

五つのカラムは各サイクル毎に前記実施例と同様にして
再生および消毒することができる。

この精製方法の全収率は５５％にとどまった。

結果を表Ｉに示す。

実施例１４（比較例） 疎水性セファロースのカラム■の代わりに親水性の陰イ
オン交換体Ｅのカラムを同じ使用条件で使用した以外は
実施例１３と同じ条件下で操作する。得られた結果（表
■参照）は、前記の諸実施例の結果とは異なる。アルブ
ミンの最終純度は９９％未満である。とくにその存在が
アルブミンの最終溶液の安定性とくに６０’Ｃに加熱し
たときの安定性を損なうα１−リポ蛋白の統一的存在が
検出された。

この実施例は非常に高純度のアルブミンを得るために部
分的に疎水性の支持体でト遇する工程を包含する必要性
を示している。

フランス国６９７１０リョン・リュ ・プールジュラ１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）血漿の溶液を、イオン交換体もしくは非イオン交
   換体製の少なくとも一種の部分的に疎水性の支持体とイ
   オン交換体製の少なくとも一種の親水性支持体とに接触
   させることを特徴とする陰イオンおよび陽イオン交換体
   を使用して血漿を分画する方法。 （２）該少なくとも一種の親水性支持体が陽イオン交換
   体であることを特徴とする特＊ｍ求の範囲第１項記載の
   方法。 （３）該部分的に疎水性の支持体が陰イオン交換体であ
   り、該親水性支持体が陽イオン交換体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法０ （４）該血漿の溶液を一方が親水性であってもよく、他
   方が部分的に疎水性である二つの陰イオン交換支持体と
   、親水性陽イオン交換支持体とに接触させることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）該親水性陰イオン交換体が該部分的に疎水性の陰
   イオン交換体に先行していることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 （６）該支持体が天然多糖類重合体マトリックス、合成
   重合体マトリックス、多糖類重合体で被覆した無機酸化
   物および網状化合成重合体の薄膜で被覆した無機酸化物
   から成る群より独立に選ばれたことを特徴とする特許請
   求の範囲第１〜５項のいずれか一つに記載の方法。 （７）該部分的に疎水性の支持体が疎水基を固定するこ
   とにより修飾した多糖類重合体、合成重合体吸着剤、疎
   水基を固定することにより修飾した多糖′Ｉ！４１合体
   で被覆した無機酸化物、および疎水性の網状化重合体の
   薄膜で被覆した無Ｍ酸化物から成る群より選ばれたこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１〜６項のいずれか一つ
   に記載の方法。 （８）該親水性支持体が多糖類重合体、水不溶性親水性
   合成重合体、多糖類重合体で被覆した無ｉ＃＆化物およ
   び親水性網状化重合体の薄膜で被覆した無ＩｊｓＦ４１
   化物から成る群より選ばれたことを特徴とする特Ｆ！Ｆ
   １ｉｉｌ求の範囲第１〜６項のいずれか一つに記載の方
   法。 （９）該多孔性無機酸化物は粒径か４μｍ〜５ｍ、孔径
   が２５０〜へ０００におよび比表面積が５〜１５０　ｍ
   ”７１１であることを特徴とする特ＦＦ精求の範囲第６
   〜８項のいずれか一つに記載の方法。 ０［１該無機酸仕切は粒径が５０μｍ〜１■、孔径が６
   ００〜１．ｓｏｏ人および比表面積が２０〜５０１１　
   ／ｍ！であることを特徴とする特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 Ｑｌ）　イオン交挨能が２　ｍ、ｅ　ｑ　／　１未満の
   イオン交候体トシテ粒ｉ４＃ｔ＊〜ｓ＊ｗ、孔径５００
   　Ｎ２．５０　Ｏｆ。 比表面積５〜１５０ｍ”／７７の多孔性無機質支持体を
   、少なくとも一方のイオン交換体用にアミノ基もしくは
   第四アンモニウム塩基を含有または担持する網状化重合
   体の薄膜を１５ダ／ｍ”の厚さに被覆したもの、および
   他方のイオン交換体用にカルボン酸基を担持する網状化
   ポリビニルラクタムの薄膜を１５ＪＩｖ／ｍ”の厚さに
   被覆したものを使用したことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の少なくとも一種の陰イオン交換体と少な
   くとも一種の陽イオン交換体とに接触させることにより
   血漿を分画する方法。 α２　該血漿の溶液をさらに、好ましくは最初に、同じ
   特性の多孔性無機質支持体をアミ７基または第四アンモ
   ニウム塩基を担持する多糖類重合体で被覆したものと接
   触させることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載
   の方法。 α漕　該陽イオン交換支持体の表面を被覆するポリビニ
   ルラクタムが多官能網状化剤の存在下でビニルラクタム
   と不飽和カルボン酸を共重合させることにより得られた
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 （１４）　ＭビニルラクタムがＮ−ビニルビルリドンで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の方
   法。 α四　該カルボン酸がアクリル酸であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１５項記載の方法。 Ｈ該網状化剤が式ＣＨ，＝　ＣＨＢ　ｉＸ、のシラン誘
   導体であることを特徴とする特許請求の範囲第１５〜１
   ５項のいずれか一つに記載の方法６同　該陰イオン交換
   支持体の表面を被覆する疎水性網状化重合体が芳香族ビ
   ニル単置体から得られることを特徴とする特許請求の範
   囲第１１項記載の方法。 Ｈ該陰イオン交換体の使用量が血漿１を当り２５０〜２
   ．０口Ｏａｊであり、該陽イオン交換体の使用量が血漿
   １を当り２００〜１，０ＯＯＩＩＬ７！であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１〜１７項のいずれか一つに
   記載の方法。 （Ｉｎ　直列のカラムを使用して連続的に実施すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１〜１Ｂ項のいずれか一
   つに記載の方法。