DK164741B - Fremgangsmaade til chromatografisk fraktionering af plasmaproteiner, samt albumin med hoej renhed opnaaet ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 164741B

i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til chromatografisk fraktionering af plasmaproteiner. Opfindelsen angår især en fremgangsmåde til fraktionering af plasma ved hjælp af ionbyttere til opnåelse af albu-5 min med høj renhed samt albumin med høj renhed ved denne f remgangsmåde.

Den i industriel målestok mest udbredte metode til separering af plasmas hovedbestanddele, albumin og immun-globuliner, er Cohn's metode, hvis princip er baseret 10 på den selektive udfældning af proteiner ved hjælp af vandige alkoholiske opløsninger. Fremgangsmåderne til udfældning er ikke fuldstændig selektive, og de virker delvis denaturerende; de medfører langvarige behandlinger, som er kostbare med hensyn til arbejdskraft og 15 investeringer, og de medfører, at opnåelsen af sterile og apyrogene produkter er særligt vanskelig.

Man har i forbindelse med introduktionen af ionbytter-materialer foreslået fremgangsmåder til separering af proteiner fra deres blandinger gennem kontinuerte frem-20 gangsmåder over søjler indeholdende fast leje. Disse fremgangsmåder er mere økonomiske og muliggør, at man med bedre udbytter opnår proteiner med meget stor renhed. Udviklingen heraf inden for den biologiske industri i stor målestok er imidlertid stadig begrænset af visse 25 ulemper.

Fremgangsmåder til isolering af albumin fra blodplasma ved kontakt med polysaccharid-ionbyttere er blevet omtalt i fransk patentskrift nr. 2 327 256, USA patentskrift nr. 4 228 154 og USA patentskrift nr. 4 136 094.

30 Disse fremgangsmåder indebærer komplicerede forudgående behandlinger til fjernelse af den største del af urenhederne, især lipoproteiner, og i visse tilfælde X-globuli-ner, og/eller de nødvendiggør en senere rensning af albuminet ved passage gennem en molekylærsigte til opnåel- 2

DK 164741 B

se af en renhedsgrad højere end 98%. Disse yderligere behandlinger lader sig kun vanskeligt gennemføre i industriel målestok, og de er lidet økonomiske. Produktiviteten er lav og lader sig ikke tilpasse behandlingen 5 af et betydeligt volumen af plasma for hvilket behovet er bestemt af verdens efterspørgsel efter proteiner, som uden ophør er voksende.

Uorganiske bærematerialer har i modsætning til polysac-charider fremragende fysisk-mekaniske egenskaber, som 10 muliggør meget høje filtreringshastigheder; men de ud viser ikke-specifikke adsorptions-steder, som kan forårsage et tab i udbyttet af proteiner som funktion af pH og af den anvendte ionstyrke.

Fremgangsmåder til separering af proteiner ved chroma-15 tografi over ionbyttere med uorganisk bæremateriale er især blevet omtalt i fransk patentskrift nr. 2 321 932, fransk patentskrift nr. 2 359 634 og fransk patentskrift nr. 2 464 967. Den beskrevne gruppe af ionbyttere kan, når det drejer sig om fraktionering af plasma, føre 20 til utilstrækkelige udbytter for de renhedsgrader, som kræves ved terapeutiske anvendelser, og gør det ikke muligt at opnå albumin med høj renhed uafhængig af det plasma, der skal fraktioneres.

Fra U5 patentskrift nr. 4 025 500 kendes en fremgangs-25 måde til fraktionering af plasmaproteiner til opnåelse af fraktioner af renset albumin, hvor plasmaproteinerne bringes i kontakt med en blok-copolymer, bestående af ethylenoxid og propylenglycol. Denne fremgangsmåde er dog ikke optimal, hvad angår effektiviteten og end-30 videre er den ikke egnet til isolering af albumin i stor skala.

Hovedformålet med den foreliggende opfindelse er at 3

DK 164741 B

tilvejebringe en fremgangsmåde, som gør det muligt at behandle store rumfang plasma og at isolere proteiner med høj renhed og med et godt udbytte uden yderligere behandling bortset fra den i begyndelsen gennemførte 5 klaring af plasmaet.

Det er særligt formål åt tilvejebringe en fremgangsmåde til ekstraktion i stor målestok af albumin til terapeutisk anvendelse ud fra plasma uafhængigt af dette plasmas oprindelse.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i sin mest almene form deri, at man fraktionerer plasmaet ved hjælp af anioniske og kationiske ionbyttere, og fremgangsmåden er ejendommelig derved, at en opløsning af plasma bringes i kontakt med mindst et delvis hydrofobt bærema-15 teriale, som kan være ionbyttende eller ikke-ionbyttende, og med mindst et ionbyttende hydrofilt bæremateriale, idet der som bæremateriale anvendes matricer af naturlige polysaccharid-polymere, matricer af syntetiske polymere, uorganiske oxider beklædt med en polysaccharid-polymer 20 og uorganiske oxider beklædt med en film af tværbundet syntetisk polymer.

Man forstår ved begrebet delvis hydrofobt bæremateriale et bæremateriale, som er i besiddelse af hydrofile og hydrofobe grupper, som er i stand til at danne komplek-25 ser med opløste bestanddele, som er bærere af lipofile grupper. De består i almindelighed af en polymer, som er hydrofob eller bærer af tilgængelige alkylkæder med et antal carbonatomer lig med eller større end 3, som kan være ligekædede eller forgrenede, mættede eller 30 umættede, eller af mættede eller af umættede cycliske kerner. Et hydrofilt bæremateriale er omvendt et bæremateriale, som ikke besidder hydrofobe grupper, idet overfladestederne udelukkende er hydrofile.

4

DK 164741 B

t'n særlig ud førelses form for opfindelsen er ejendommelig ved, at en delvis afsaltet plasmaopløsning bringes i kontakt successivt med mindst én anionbytter, og derpå med en kationbytter, idet disse ionbyttere, hvis ionbyt-5 ningskapacitet er mindre end 2 mækv/g, består af et porøst uorganisk bæremateriale, der har en partikelstørrelse på 4 p - 5 mm, en porediameter på 50 - 250 nm 2 og en specifik overflade på 5 - 150 m /g beklædt i en mængde mindre end 15 mg/m med en tværbundet polymerfilm, 10 som indeholder eller som er bærer af aminogrupper eller kvaternære ammoniumsalte for mindst én af ionbytterne, samt med en tværbunden polyvinyllactam-film, som er bærer af carboxylsyregrupper, for den anden ionbytter.

I denne særlige udførelsesform for opfindelsen er de 15 uorganiske bærematerialer, der tjener som basis for ionbytterne, repræsenteret ved aluminiumoxiderne og siliciumoxiderne. De her anvendte ionbytter-bæremateria-ler kan være af samme art eller af forskellig art, og de kan besidde de samme karakteristika eller forskelli-20 ge karakteristika på den betingelse, at de forbliver inden for de ovenfor anførte grænseværdier.

Det anvendte uorganiske bæremateriale har fortrinsvis en porediameter på 60 - 150 nm, en specifik overflade o 2 o på 20 - 50 m /g og en partikelstørrelse på 50 ^um -25 1 mm.

Anionbytterharpikserne er dannet af en tværbunden polymer indeholdende eller bærende funktionelle grupper: primære, sekundære eller tertiære amingrupper, kvaternære ammoniumsalte med de almene formler: -Nl·^, -NHR, 30 -N(R)2, (R), hvori R, som kan være identisk eller forskellig, repræsenterer en C^-C^alkylgruppe eller hydroxyalkylgruppe, og X repræsenterer en uorganisk eller organisk anion, såsom f.eks. chlorid, sulfat, 5

DK 164741 B

nitrat, phosphat eller citrat.

De tertiære amingrupper eller kvaternære ammoniumsaltgrupper udgør en del af kæden i den tværbundne polymere, eller de er fikseret til den tværbundne polymere, som 5 beklæder hele overfladen af bærematerialet, og som fører til ionbyttere, hvis ionbytterkapacitet er mindre end eller lig med 2 mækv/g, fortrinsvis på mellem 0,15 og 1,2 mækv/g, især foretrukket mellem 0,15 og 0,70 kækv/g.

De tværbundne polymere, som beklæder bærematerialets 10 overflade, er i sig selv velkendte produkter, som er opnået ud fra monomere, såsom epoxidholdige forbindelser, som tværbindes med polyaminer som katalysatorer; formaldehyd, som tværbindes ved polykondensation med polyaminer; vinyliske monomere: vinylpyridin, styren og deri-15 vater deraf, som tværbindes med polyfunktionelle mono mere, såsom diacrylater eller dimethacrylater af monoeller poly-alkylenglycoler, divinylbenzen, vinyltrialkoxy-silaner, vinyltrihalogenosilaner, bis-methylenacrylamid, i nærvær af en initiator eller af UV-stråler.

20 I det tilfælde, hvor den tværbundne polymere ikke har funktionelle grupper i sin kæde, er det nødvendigt at modificere den. Dette er især tilfældet ved tværbundne polymere baseret på styren og derivater deraf, acryla-ter og alkylmethacrylater samt acrylonitril. Denne modi-25 fikation af den polymere kan gennemføres ved en hvil ken som helst kendt fremgangsmåde.

Sådanne anionbyttende harpikser på bæremateriale og fremgangsmåder til fremstilling deraf er beskrevet i fransk offentliggørelsesskrift nr. 2 321 932 og 2 464 967, 30 hvortil der henvises.

Når det drejer sig om kationbyttere, er det porøse uorga- 6

DK 164741 B

niske bæremateriale beklædt med en tværbunden polyvinyl-lactam film, som er bærer af funktionelle COOH-grupper.

De vinyllactam-copolymere, som beklæder bærematerialet, er i sig selv velkendte produkter. De opnås ved copoly- 5 merisation åf monomere med formlen:

R

C - ch2 (I)

1-(CH0) -CO

I_ hvori R betegner H eller en lavere alkylgruppe, og x er et helt tal på mellem 2 og 5, sammen med en umættet carboxylsyre-monomer med formlen: h a« H2C - hvori R^ er H eller CH^, og R^ er en COOH-gruppe, som 10 kan være bundet til det umættede carbonatom ved hjælp af en ligekædet eller forgrenet, divalent C^-C^alky-lengruppe, phenylen, cycloalkylen, “(CH2)n-0-(CH2)m-, -(CH2)n-C0-(CH2)m-, -(CH2)n-C00-(CH2)m-, (CH.) so7-(ch7) -, -CCH7) -nr.-(ch7) Z n- 2 2 m Zn 4 2m 15 (CH0) -C0-NR, -(CH0) -, hvor.*i R. betegner H eller C.-C,- 2n 42m 4 3 15 alkyl, og n, m er hele tal fra 0 - 12.

Eksempler på monomere med formlen (I) er N-vinylpyrro-lidon, N-vinylcaprolactam, N-vinyl-P-propiolactam, og a-methylvinylpropiolactam. Man anvender fortrinsvist 20 N-vinyIpyrrolidon.

Man kan som eksempler på carboxylsyre med formlen (II) nævne acrylsyre, methacrylsyre, 4-pentensyre, vinylben-zencarboxylsyre og 6-acetylamidohexansyre.

Disse monomere kan tværbindes ved hjælp af velkendte 7

DK 164741 B

polyfunktionelle tværbindingsmidler, såsom f.eks. polyol-diacrylater, såsom diacrylatet eller dimethacrylatet af diethylenglycol eller 1,4-butandiol, og vinyl- eller allyl-derivater af triazin, såsom triallylisocyanurat.

5 Man kan som tværbindingsmiddel også anvende monomere af silantypen med formlen Cl·^ = CH-S1-X2 (III), hvori hver af X, som kan være identiske eller forskellige, betegner en hydrolyserbar lavere alkoxygruppe, eller acetoxy eller phenoxy eller et halogenatom. Eksempler 10 på anvendelige silan-derivater, er vinyltrimethoxysilan, vinyltriethoxysilan, vinyltriacetoxysilan, vinyltrichlor-silan og vinyl-tris-(β-methoxyethoxy)silan.

Beklædningen af det uorganiske bæremateriale med co-polymeren gennemføres fortrinsvis ved polymerisation 15 in situ af monomerene i nærvær af bærematerialet. Man opløser i et opløsningsmiddel vinyllactamen, tværbindingsmidlet og vinylcarboxylsyren, eventuelt initiator, og opløsningen imprægneres på bærematerialet, hvorpå opløsningsmidlet afdampes, og de monomere tværbindes 20 ved hvilken som helst kendt fremgangsmåde, såsom varme eller UV-bestråling. Man kan som opløsningsmiddel anvende et hvilket som helst produkt, der opløser monomerene, og hvis kogepunkt er så lavt som muligt for at fremme den efterfølgende afdampning. Som eksempler kan 25 nævnes methylenchlorid, chlorfluormethaner (Flugener), ethylether, acetone og ethylacetat.

Den mængde monomer, der skal tages i brug, vælges i almindelighed således, at man på bærematerialets pore- overflade opnår en polymerfilm på mellem 1 og 15 mg/m, 2 30 fortrinsvis mellem 1 og 6 mg/m . Forholdet af monomere ne bestemmer mængden af funktionelle grupper fordelt over polymerfilmen. Man anvender fortrinsvis vinylcarb-oxylsyre i en sådan mængde, at mængden af funktionelle grupper fordelt på bærematerialets overflade er på mel 8

DK 164741 B

lem 0,05 og 2 mækv/g af bærematerialet. Mængden af tvær-bindingsmiddel kan variere mellem 1 og 60 vægt-?i i forhold til den samlede vægt af monomerene.

Det har nu vist sig, at man kan opnå en separation af 5 plasmaproteiner under opnåelse af albumin med meget høj renhed ved chromatografi over andre bærematerialet under forudsætning af, at man successivt anvender mindst ét delvis hydrofobt bæremateriale, som eventuelt kan være ionbyttende, og mindst ét ionbyttende hydrofilt 10 bæremateriale.

Bærematerialet er organisk eller uorganisk, syntetisk eller naturligt. På grund af produktiviteten i stor målestok foretrækker man dog at anvende bærematerialer baseret på uorganiske oxider.

15 De hydrofile bærematerialer, som består af matricer af polymere eller uorganiske oxider beklædt med en hydrofil polymerfilm, som er bærer af ionbyttergrupper. Eksempler på hydrofile naturlige bærematerialer er polymer-matricer baseret på polysaccharider, såsom tværbun-20 det dextran, agarose, tværbundet agarose, cellulose og tværbundet cellulose.

Kendte syntetiske hydrofile bærestoffer kan f.eks. være opnået ved polymerisation af monomere, såsom acrylamid og de hydrofile derivater deraf.

25 En anden gruppe af hydrofile bærematerialer er repræ senteret ved porøse uorganiske oxider, hvis overflade er beklædt med en syntetisk eller naturlig hydrofil polymer. Det porøse uorganiske oxid kan være siliciumoxid, aluminiumoxid, magnesiumoxid, et titanoxid eller 30 syntetiske eller naturlige derivater deraf, såsom glas- arter, silicater, zeolitter, kaolin etc. Det uorganis- 9

DK 164741 B

ke bæremateriale har en partikelstørrelse på 4 /jm -5 mm, fortrinsvis 50 /Jm til 1 mm, en porediameter på 25 - 300 nm, fortrinsvis 60 - 150 nm, og en specifik overflade på 5 - 150 m /g, fortrinsvis 20 - 50 m /g.

5 Den polymere, som beklæder bærematerialets overflade, kan være en polysaccharidisk naturlig polymer som ovenfor beskrevet, den kan være en i sig selv velkendt vand-uopløselig hydrofil polymer, som er opnået ved polymerisation af vinyliske monomere i nærvær af et tværbin-10 dingsmiddel. Repræsentative eksempler på disse hydro file polymere omfatter polymere af hydroxyalkyl- eller hydroxy C-lavere alkoxy)alkylacrylater og -methacrylater, såsom homopolymere og copolymere 2-hydroxyethy 1-, hy-droxypropyl- eller hydroxyethoxyethylacrylat eller -meth-15 acrylat, delvis hydrolyserede polymere af en carboxyl- syrevinylester, som f.eks. delvis hydrolyserede homo-og copolymere af vinylacetat} acrylamidpolymere} polymere af heterocycliske vinyl-forbindelser, såsom homo-og copolymere af N-vinyllactamer etc. De uorganiske 20 oxider beklædt med polysaccharid-polymere er beskrevet i fransk patentskrift nr. 2 319 399.

De delvis hydrofobe bærematerialer som ligeledes består af syntetiske eller naturlige polymer-matricer eller af uorganiske oxider som ovenfor defineret, som er be-25 klædt med en delvis hydrofob polymerfilm. De polysac- charidiske polymere kan være gjort delvis hydrofobe ved immobilisering af grupper, såsom alkyl eller alke-nylcarbonhydridgrupper, som kan være ligekædede eller forgrenede og med et antal carbonatomer lig med eller 30 større end 3} aryl- eller alkylarylgrupper, såsom phe nyl, tolyl, xylyl; cycloalkylgrupper eller cycloalke-nylgrupper, såsom cyclohexyl. De syntetiske polymere kan være opnået ved suspensionspolymerisation af vinylaromatiske monomere, såsom styren og derivater deraf, 10

DK 164741 B

som anvendes alene eller i indbyrdes blanding og/eller sammen med mindst én copolymeriserbar monomer, såsom f.eks. acrylater og methacrylater af C-^-C^alkyl, acrylo-nitril, butadien, og tværbundet ved hjælp af polyfunk-5 tionelle monomere, såsom diacrylater eller dimethacry- later af mono- eller polyalkylenglycoler, divinylben-zen, vinyltrialkoxysilaner, vinyltrihalogenosilaner, bis-methylenacrylamid, i nærvær af en initiator eller UV-stråler.

10 Det hydrofobe bæremateriale, som man fortrinsvis anvender ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, består af et uorganisk oxid (som ovenfor defineret i forbindelse med det hydrofile bæremateriale), som er beklædt med en polymerfilm, som i det mindste partielt er hydrofob.

15 Polymeren der anvendes ved beklædningen kan være en poly- saccharidisk polymer på hvilken man har immobiliseret hydrofobe grupper, f.eks. langkædede alifatiske aminer (denne type bæremateriale kan være fremstillet efter den fremgangsmåde, som er omtalt i fransk patentskrift 20 nr. A 2 403 098 eller USA patentskrift nr. A 4 308 254), eller det kan være en syntetisk polymer opnået ud fra monomere, såsom epoxygruppeholdige forbindelser, som tværbindes med polyaminer som katalysatorer; formaldehyd, som tværbindes ved polykondensation med polyaminer; 25 vinyliske monomere: vinylpyridin, styren og derivater deraf, som tværbindes med polyfunktionelle monomere, såsom diacrylater eller dimethacrylater af mono- eller polyalkylenglycoler, divinylbenzen, divinyltrialkoxy-silaner, vinyltrihalogenosilaner, bis-methylenacrylamid, 30 i nærvær af en initiator eller af UV-stråler.

Ionbyttergrupperne kan være fikseret på den hydrofile eller hydrofobe polymer ved kemisk modifikation, eller de kan være indført i den polymere kæde ved polymerisation eller copolymerisation ved hjælp af vinyliske monomere, 11

DK 164741 B

som er bærere af ioniserbare funktionelle grupper af syretypen eller af basisk type, eller som efterhånden kan modificeres ved kemisk reaktion til indføring af ionbyttergrupperne. De copolymeriserbare monomere, som 5 man kan tage i brug, er forbindelser med formlen: ?» H2C =C“R2 hvori Rj er H eller CH^, og R2 betegner: - en arylgruppe, såsom phenyl eller naphthenyl, - en reaktionsdygtig funktionel gruppe Y, såsom -C*N, -C0NH2, -CH20H, -C00R3 hvori R? er H eller C^-C^alkyl 10 eller CH2-CH-.CH2, -OH, -NH2, halogen, -SOjH, -P0(0H)2,

V

- eller en funktionel gruppe Y med den ovenfor anførte betydning forbundet til det umættede carbonatom ved hjælp af en lineær eller forgrenet C^-C^gdivalent 15 alkylengruppe, phenylen, cycloalkylen, -(CH2)n-0-(CH2)m-, -(CH2)n-C0-(CH2)m, -(CH2)n-C00-CH2)m-, -(CH2)n-S02-(CH2)m-, -(CH2)n-NV(CH2>n,-> -(CH2)n-C0-NR4-(CH2)m-, hvori R^ er H eller C^-C^alkyl, og n og m er et helt 20 tal fra 0-12.

Man kan som copolymeriserbare monomere nævne (meth)-acrylsyre, 4-pentensyre, vinylbenzensulfonsyre, vinyl-benzencarboxylsyre , acrylamid og methacrylamid, acrylo-nitril og methacrylonitril, allylalkohol, allylamin, 25 1,2-dimethy1-4-pentenylamin, 2,3-epoxypropylacrylat og -methacrylat, n-methylolacrylamid, 6-acrylamidohexan-syre og styren.

Valget af den reaktionsdygtige vinylmonomer til opnåelse af den funtionelle copolymer er alene begrænset af 30 den anvendelse, der skal gøres af den funktionelle grup- 12

DK 164741 B

pe. Man kan f.eks. vælge en monomer, der er bærer af en kationisk gruppe eller af en anionisk gruppe og direkte anvende bærematerialet som ionbytterharpiks.

Dersom monomeren ikke selv indbefatter ionbyttergrup-5 per er det muligt til sidst at modificere den ved kemisk omsætning på i og for sig kendt måde i den udstrækning, hvor en sådan reaktion er forligelig med copolymerens stabilitet.

Det er ligeledes muligt til sidst at modificere den 10 reaktionsdygtige gruppe Y, som findes i copolymeren, på i og for sig kendt måde til opnåelse af en ny funktionel gruppe Y'. Denne modifikation kan f.eks. bestå i, at man omdanner en primær amin til en tertiær amin eller et kvaternært amminoumsalt for at fremstille et 15 anionbytterbæremateriale, eller i at man omdanner en kationbytter til en anionbytter ved reaktion over en COOH-gruppe med en diamin, som man til sidst omdanner til kvaternær ammoniumforbindelse ved alkylering.

Beklædningen af det uorganiske bæremateriale med den 20 syntetiske eller naturlige polymer gennemføres ved en hvilken som helst kendt metode, såsom forstøvning eller imprægnering. Når den til beklædningen anvendte polymer er en syntetisk polymer, gennemfører man fortrinsvis beklædning ved imprægnering af bærematerialet med en 25 opløsning af den eller de ovenfor nævnte monomere og eventuelt en initiator i et opløsningsmiddel, som derpå afdampes, hvorpå monomerene tværbindes ved kendte fremgangsmåder. Man kan som opløsningsmiddel anvende alle produkter, der fungerer som opløsningsmiddel over for 30 monomerene og initiatoren, og hvis kogepunkt er så lavt som muligt for at fremme den senere afdampning. Sådanne omfatter f.eks. methylenchlorid, ethylether, benzen, acetone, ethylacetat og chlorfluormethanerne (Flugener).

13

DK 164741 B

Den mængde monomer eller monomere eller polymer, der tages i arbejde, vælges 1 almindelighed således, at man på bærematerialets oerflade opnår en polymerfilm på mellem 1 og 15 mg/m , fortrinsvis mellem 1 og 6 mg/m .

5 Mængden af funktionelle grupper, som er fordelt på bære- materialets overfalde, er bedst på mellem 0,01 og 2 mækv/g bæremateriale. Når bærematerialerne udelukkende anvendes som ionbyttere, er denne mængde fortrinsvis på mellem 0,05 og 2 mækv/g bæremateriale.

10 Anionbytter-grupperne kan bestå af aminoaromatiske grupper eller aminoalifatiske grupper, såsom fortrinsvis diethylaminoethylgruppen eller kvaternære aminoalkylgrup-per med formlen -N^+^-(, hvori R, som kan være identisk eller forskellig, betegner en alkylgruppe eller 15 hydroxyalkylgruppe, og X betegner en organisk eller uorganisk anion, såsom f.eks. chlorid, sulfat, nitrat, phosphat, citrat, borat, acetat eller formiat.

Kationbytter-grupperne kan være følgende grupper: sul-fonat, sulfat, phosphono, carboxyl eller phenolisk hydr-20 oxyl, fortrinsvis carboxymethylgrupper eller sulfoal-kylgrupper.

Man kan blandt de ionbyttende hydrofile bærematerialer, som er kommercielt tilgængelige, nævne forbindelserne, som forhandles under betegnelserne "Sephadex" og "Sepha-25 rose" og som forhandles af firmaet Pharmacia Fine Chemi cals AB, især DEAE Sephadex (diethylaminoethyldextran), QAE Sephadex (kvaterniseret diethylaminoethyldextran), DEAE Sepharose (diethylaminoethylagarose, CM Sephadex (carboxymethyldextran), SP Sephadex (sulfopropyldextran), 30 CM Sepharose (carboxymethylagarose), såvel som de forbindelser, der er kendt under betegnelserne DEAE Tris-acryl M og CM, Trisacryl M, som forhandles af firmaet Chimique Pointet-Girard.

DK 164741B

14

Man kan blandt de delvis hydrofobe bærematerialer nævne de produkter, som kendes under betegnelserne "Phenyl-Sep-harose" CL-4B, "Octyl-Sepharose" CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals AB), som er baseret på tværbundet agarose; 5 "Spherosil" Q MA (Rhone-Poulenc Recherches), som er et siliciumoxid beklædt med en polymer baseret på vinyltoluen, som er bærer af kvaternære ammoniumgrupper.

Det plasma, som kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være af animalsk oprindelse, især 10 plasma fra kvæg, eller af human oprindelse. Det kan være opnået ved dekantering eller centrifugering af blod eller ved ultrafiltrering over plasmaferese-moduler.

Man kan anvende hel plasma i frisk tilstand eller optøet tilstand eller en cryosupernatant eller fraktioner 15 opnået ved andre separationsmetoder.

Det plasma, som man fraktionerer ved hjælp af ionbyttere, behandles forinden for at befri det i det mindste delvis for salte, og med fordel for euglobuliner, som udgør et ustabilt proteinkomplex. Disse forudgående 20 behandlinger nødvendiggør ikke anvendelse af klaringseller fældningsadditiver, såsom polyethylenglycoler, eller adsorptionsmidler, såsom pulverformige silicium-oxider fra forbrændingsprocesser. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er dog naturligvis også anvendelig på 25 plasmaopløsninger, som har undergået sådanne behandlinger .

Man kan især opnå afsaltningen og indreguleringen af pH- og ionstyrke-forholdene ved diafiltrering eller ved permeationschromatografi. Ued en særlig udførelses-30 form for fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres afsaltningen ved permeationschromatografi over et porøst uorganisk bæremateriale, hvis porer er beklædt med en hydrofil polymerfilm, såsom f.eks. en tværbun- 15

DK 164741 B

det polyvinyllactam. Det ved denne behandling anvendte uorganiske bæremateriale har med fordel en porediameter på 4 - 30 nm, en specifik overflade på 100 til 800 m /g og en partikelstørrelse på 4 jum til 5 mm.

5 Man kan opnå beklædningen ved simpel adsorption af po lymeren på bærematerialet; men ved en foretrukken udførelsesform gennemfører man beklædningen ved polymerisation in situ med en opløsning af N-vinyllactam, f.eks. N-vinyIpyrrolidon, i nærvær af et polyfunktionelt tvær-10 bindingsmiddel valgt blandt de ovenfor beskrevne for bindelser og på den måde, som er beskrevet for fremstillingen af kationbytterharpikser. Man foretrækker blandt tværbindingsmidlerne at anvende et silan-derivat, som gør det muligt at danne en stabil binding imellem 15 det uorganiske bæremateriale og polyvinyllactamen. Mæng den af monomerene vælges således, at man på overfladen af bærematerialet opnår en polymer film på mellem 1 2 2 og 15 mg/m , fortrinsvis mellem 1 og 6 mg/m , idet mængden af tværbindingsmiddel kan variere mellem 1 og 50 20 vægt-% i forhold til den samlede vægt af monomerene.

Plasmaet kan ved lav ionstyrke befries for de euglo-buliner, som det indeholder, ved en pH-værdi i nærheden af 5, med påfølgende centrifugering og separering af den klarede plasmaopløsning.

25 Plasmaopløsningen bringes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som nævnt i kontakt med mindst ét delvis hydrofobt bæremateriale og mindst et hydrofilt bæremateriale. Det delvis hydrofobe bæremateriale indeholder ikke nødvendigvis ionbyttergrupper; men det er nødven-30 digt at anvende mindst ét anionbyttende bæremateriale og mindst et kationbyttende bæremateriale. Anionbytte-ren befinder sig med fordel forud for kat ionbytteren.

16

DK 164741 B

Ved en foretrukken udførelsesform er til opnåelse af et bedre udbytte og af et albumin med meget høj renhed det delvis hydrofobe bæremateriale anionbyttende, og det hydrofile bæremateriale er kationbyttende.

5 Ved den mest foretrukne udførelsesform gennemfører man separationen, idet man kombinerer to anionbyttere, hvoraf den ene kan være hydrofil, og den anden er delvis hydrofob, med en hydrofil kationbytter. Rækkefølgen for gennemstrømningen gennem disse to sidstnævnte bære-10 materialer er ligegyldig.

Fraktionering af det plasma, som er reguleret med hensyn til ionstyrke, og som fortrinsvis er blevet klaret, foregår successivt med den eller de anvendte anionbyt-tere og med kationbytteren, idet man indregulerer pH 15 og ionstyrken på en sådan måde, at man selektivt fikse- rer albuminet eller de andre proteiner eller urenheder.

Plasmaopløsningen kan f.eks. blive bragt i kontakt med det delvis hydrofobe anionbytter-bæremateriale, som forinden er blevet bragt i ligevægtstilstand for hoved-20 sagelig at fiksere albumin og a-globulinerne ved en

pH-værdi lig med eller større end 5. Ved eluering med en pH-pufferopløsning på mellem 4,4 og 4,8 og med en passende valgt ionstyrke opnår man en opløsning, der er rig på albumin, og som indeholder restindhold af 25 a- og β-globuliner. Man kan som eksempel anvende pH

4,7 og en 0,025 M acetatpuffer. Den således eluerede opløsning, som indreguleres til pH større end eller lig med 5,0, bringes derpå i kontakt med kationbytte-ren, som forinden er blevet bragt i ligevægt med en 30 puffer med identisk pH, og på hvilken der tilbagehol des næsten den totale mængde af de proteiner, som er forskellige fra albumin.

17

DK 164741 B

Ved et andet eksempel på gennemførelsen af fremgangsmåden bringer man plasmaopløsningen i kontakt successivt med en hydrofil anionbytter, et delvis hydrofobt bæremateriale, som fortrinsvis er anionbyttende, og derpå med 5 en hydrofil kationbytter. pH-værdien og ionstyrken for opløsningen indreguleres på den ovenfor angivne måde til tilbageholdelse af albumin og visse a- og β-glo-buliner på den første hydrofile anionbytter. Efter elu-ering bringes opløsningen indeholdende albumin i kontakt 10 med det delvis hydrofobe bæremateriale, på hvilket for skellige urenheder, deriblandt lipoproteinerne, kan blive fikseret ved en pH på 4,5 - 6,0, fortrinsvis 4,7 -5,2, med en acetatpuffer med styrken 0,025 - 0,06 M.

Den eluerede opløsning indeholdende albumin renses til 15 sidst over kationbytteren under samme betingelser som angivet ovenfor.

De immunglobuliner, som trænger igennem anionbytterbæ-rematerialet, kan renses ved at blive bragt i kontakt med et andet ionbytterbæremateriale, idet man varierer 20 pH og ionstyrken for opløsningen.

I det foretrukne tilfælde, hvor man anvender bærematerialer baseret på uorganiske oxider, kan mængderne af anionbytter være på mellem 250 og 2000 ml pr. liter plasma, og mængderne af kationbytter kan være på mel-25 lem 200 og 1000 ml. Kontakttiden for opløsningen med hver af ionbytterne er større end ca. 15 minutter.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at udnytte næsten den totale mængde af proteiner indeholdt i det som udgangsmateriale anvendte plasma og at opnå 30 en albumin i opløsning, hvis renhed bestemt ved elek- troforese med en koncentration på 50 g/liter er større end eller lig med 99%, idet den kan nå op på næsten 100¾. Analyse ved gelfiltrering viser fraværet af poly- 18

DK 164741 B

mere af albumin. Albuminopløsningens renhed kan bedømmes ved immunopræcipitations-teknik. Man kan især ved anvendelse af dobbelt immunodiffusions-teknik på gelose påvise den manglende tilstedeværelse af al- og β — 1i — 5 poproteiner. De spormængder af αΐ-antitrypsin og hapto globin, der eventuelt lader sig påvise, bevirker ikke nogen ulempe for albuminens kvalitet. Denne albuminopløsning kan opkoncentreres ved en hvilken som helst kendt fremgangsmåde, f.eks. ved ultrafiltrering, hvor-10 på den kan reguleres og stabiliseres for at kunne blive underkastet den lovmæssigt krævede opvarmning på 10 timer ved 60 °C med henblik på at gøre den egnet til injektionsbrug. Andre proteiner end albumin, som tilbageholdtes af ionbytterne, kan elueres ved hjælp 15 af en regenerationsopløsning. De proteiner i blanding, som indeholdes i de udstrømmende opløsninger og regenerationsopløsningerne, kan til sidst adskilles fra hverandre ved chromatografisk teknik.

Behandlingen af plasma kan gennemføres i beholdere på 20 diskontinuert måde, på semikontinuert måde eller kontinuert med serier af søjler, idet denne sidste mulighed er særlig egnet til industriel udførelse. Man kan ved den kontinuerte fremgangsmåde i søjler opnå en bedre produktivitet, et bedre udbytte og en meget højere ren-25 hed af slutproduktet under særdeles favorable sterili- tetsbetingelser.

De efterfølgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

19

DK 164741 B

EKSEMPEL 1 Man fremstiller: A - Et bæremateriale til tilbaqeholdelses-chromatoqrafi (GPC) 5 Man tørrer ved 150 °C under reduceret tryk i 5 timer 200 g siliciumoxid med en partikelstørrelse på 40 -100 yum, en specifik overflade på 400 m /g og en middel-porediameter på 8 nm. Det således opnåede tørre siliciumoxid indføres i en homogen opløsning indeholdende 10 500 ml flugen 11 (CCl^F), 160 ml N-vinylpyrrolidon, 30 ml vinyltriethoxysilan og 1 g dilaurylperoxid. Flugen 11 afdampes ved omgivelsernes temperatur, hvorpå det imprægnerede siliciumoxid opvarmes til 80 °C i 17 timer til opnåelse af tværbindingen. Siliciumoxidet 15 bringes derpå i suspension i 800 ml ionbyttet vand og opvarmes til kogning i 5 timer. Efter filtrering vaskes siliciumoxidet med ionbyttet vand og med acetone, hvorpå det tørres under vakuum ved 40 °C. Analyse viser et carbonindhold på 12 vægt-% i forhold til det 20 med overtræk forsynet siliciumoxid.

B - En anionbytter på bæremateriale, som består af siliciumoxid med en partikelstørrelse på 100 - 300 ,um, .2 en specifik overflade på 25 m /g, en middelporediame- ter på 125 nm, og et porevolumen på 1 m/g, som er ble- 2 25 vet overtrukket med 3,6 mg/m af en copolymer opnået ved tværbinding af vinyltoluen, som er bærer af de funktionelle grupper -N-(CH^)^CL^~^, og som udviser følgende karakteristika:

Carbonindhold 6,1 % 30 Nitrogenindhold 0,42%

Ionisk kapacitet 0,30 mækv/g.

20

DK 164741 B

C - En kationbytter på bæremateriale

Man tørrer ved reduceret tryk og 150 °C igennem 5 timer 100 g siliciumoxid med en partikelstørrelse på 100 - 2 300 ^um, en specifik overflade på 25 m /g, en middel-5 porediameter på 125 nm og et porevolumen på 1 ml/g.

Det således opnåede tørre siliciumoxid indføres i en opløsning af 250 ml flugen 11, hvori man har homgeni-seret 50 ml N-vinylpyrrolidon, 2 ml acrylsyre, 15 ml vinyltriethoxysilan og 0,50 g dilaurylperoxid. Efter 10 at man har afdampet opløsningsmidlet ved omgivelser nes temperatur, opvarmes det imprægnerede siliciumoxid til 80 °C i 16 timer til opnåelse af tværbindingen.

Siliciumoxidet bringes derpå i suspension i 400 ml ionbyttet vand og opvarmes til kogning i 5 timer. Efter 15 filtrering vaskes siliciumoxidet med ionbyttet vand, derpå med acetone, hvorpå det tørres under vakuum ved 40 °C.

Det således opnåede svagt kationbyttende, podede siliciumoxid udviser følgende karakteristika: 20 % C 6,05 % H 1,09 % N 0,3

Ionisk kapacitet: 0,20 mækv/g 2 Mængde af fikseret polymer: 3,2 mg/m .

25 Forbehandling af plasma

Man anbringer 100 g af det under punkt A beskrevne bære-materiale i en søjle med diameteren 2,6 cm og fastholder det i sammentrykket tilstand.

21

DK 164741 B

Man tilsætter successivt til denne kolonne i en mængde 30 ml/time 200 ml natriumacetatpuffer med styrken 0,025 M, 60 ml frisk plasma stammende fra et plasmaferesemodul og derpå atter 100 ml 0,025 M acetatpuffer. Den samle-5 de mængde proteiner opsamles i 65 ml opløsning, hvis elektriske modstand er i nærheden af den tilsvarende værdi for den anvendte puffer.

Proteinopløsningens pH reguleres til 5,1 ved langsom tilsætning af 6% eddikesyreopløsning. De udfældede euglo-10 buliner frasepareres ved centrifugering.

Den således opnåede proteinopløsning udviser følgende karakteristika: t 2 elektrisk modstand: 520.Q.cm /cm

Total proteinmængde: 43,8 g/liter med følgende sammen-15 sætning:

Albumin 66,8Si a-globuliner 9,2¾ β-globuliner 6,6¾ J^globuliner 17,4¾.

20 Fraktionering af plasmaopløsninqen

Man anbringer i en søjle I med diameteren 1,6 cm 25 g af anionbytteren B, og denne anionbytter holdes sammentrykket. Søjlen bringes i ligevægt med 0,025 M natriumacetatpuffer ved pH: 5,1.

25 I en søjle II med diameteren 1 cm anbringer man og fast holder i sammentrykket tilstand 10 g af anionbytteren B. Denne søjle bringes i ligevægt med en 0,025 M natri-umacetatpuffer ved pH: 4,7.

I en søjle III med diameteren 1 cm anbringer man og 22

DK 164741 B

holder sammentrykket 5 g af kationbytteren C. Denne søjle bringes i ligevægt med en 0,1 M natriumacetat-puffer ved pH: 5,5.

Man indsprøjter successivt i søjlen I 58 ml af den for-5 behandlede plasmaopløsning i en konstant mængde på 70 ml/time, 100 ml 0,025 M natriumacetatpufferopløsning ved pH 5,1 og derpå en 0,025 M acetatopufferopløsning ved pH: 4,7.

Der indvindes 185 ml af en opløsning, der betegnes som 10 eluatet, fra søjle I, og eluatets samlede proteinind hold er 8,8 g/1 med følgende sammensætning:

Albumin 93 ¾ a-globuliner 1,6¾ β-globuliner 3 ¾ 15 /^globuliner 2,4¾.

Ekstraktionsudbyttet af albumin fra denne søjle er på 89,2¾.

130 ml af eluatet fra søjle I indsprøjtes i en konstant mængde på 40 ml/time i søjlen II. Derpå indsprøjtes 20 i søjlen II 110 ml 0,025 M acetatpuffer ved pH: 4,7.

Udstrømningsopløsningen og vaskeopløsningen blandes til dannelse af en opløsning, hvis samlede proteinindhold er på 4,2 g/1 med følgende sammensætning:

Albumin 96,5¾ 25 a-globulin 0,8¾ β-globulin 2,7¾.

Ekstraktionsudbyttet af albumin fra søjlen II er på 91,4¾.

23

DK 164741 B

Den fra søjlen II opsamlede opløsning reguleres til pH: 5,5 og til en elektrisk modstand på 180jT3Lcm /cm ved tilsætning af natriumchlorid. 94 ml af denne opløsning indsprøjtes i søjlen III med en hastighed på 5 40 ml/time. Søjlen vaskes med 26 ml 0,1 M acetatpuffer ved pH: 5,5. Udløbsopløsningen og vaskeopløsningen blandes til dannelse af en opløsning, hvis samlede indhold af proteiner er på 3,0 g/1, og hvis sammensætning er som følger: 10 Albumin 99,5% a-globulin 0,5%.

Ekstraktionsudbyttet af albumin fra denne søjle III er på 94%.

Ekstraktionsudbyttet for albumin opnået ved samtlige 15 fraktioneringsbehandlinger er på 76,6%.

Søjlerne I og II kan regenereres med en 1 M natriumacetatpuffer ved pH: 4,0, medens søjlen III kan regenereres med en 0,5 N HCl-opløsning.

Filtratet (eller udløbsopløsningen) fra søjlen I inde-20 holder 75% JÉglobuliner og 25% β-globuliner sammen med spormængder af a-globuliner. Dette filtrat indsprøjtes i en søjle IV, som er identisk med søjlen I, efter ind-regulering til pH på 5,8 og en ionstyrke på 0,050 M.

Man opsamler en opløsning, hvis renhed med hensyn til 25 V^globuliner er tæt på 100%. Totaludbyttet af ekstrak tionen af y^globuliner på 80%.

EKSEMPEL 2

Man optør langsomt ved +4 °C 100 ml plasma, som har været oplagret ved -40 °C, og som stammer fra et plasma- 24

DK 164741 B

feresemodul, og der centrifugeres til fjernelse af bundfaldet indeholdende den såkaldte faktor VIII. Det således opnåede plasma "cryosupernatanten" dialyseres ved diafiltrering over for en 0,005 M acetatpuffer ved pH 5 7,4. Efter at man har gjort opløsningen sur til pH 5,1 ved hjælp af 6¾ eddikesyre og påfølgende centrifugering til fjernelse af euglobulinerne udviser den således opnåede proteinopløsning følgende karakteristika: 2

Elektrisk modstand: 1066Λ cm /cm 10 Totalproteinindhold: 39,4 g/liter med sammensætningen:

Albumin 67,3¾ α-globuliner 9,1¾ β-globuliner 7,2¾ y^globuliner 16,3¾.

15 Fraktionering af plasma 58 ml af den ovenfor beskrevne proteinopløsning indsprøjtes i en mængde på 70 ml/time på den i eksempel 1 beskrevne søjle I, som indeholder anionbytteren B, og som forinden er bragt i ligevægt med en 0,025 M na-20 triumacetatpuffer ved pH 5,1.

Søjlen vaskes med 100 ml af den samme pufferopløsning, hvorpå der elueres med en 0,025 M acetatpufferopløsning ved pH 4,5. Det således opsamlede eluat (125 ml), hvis samlede proteinindhold er på 10,1 g/1, udviser følgende 25 sammensætning:

Albumin 95,0¾ α-globuliner 1,8¾ β-globuliner 3,2¾ V^globuliner 0 %.

25

DK 164741 B

Ekstraktionsudbyttet af albumin for denne søjle er på 78%.

Man indsprøjter 50 ml af eluatet i en konstant mængde på 40 ml/time på en anden søjle, som er identisk med 5 søjlen III fra eksempel 1 indeholdende kationbytteren C, og som forinden er bragt i ligevægt med en 0,1 M acetatpuffer ved pH 5,5. Søjlen vaskes med 15 ml af den samme puffer. Udstrømningsopløsningen og vaskeopløsningen sammenblandes til dannelse af en opløsning, 10 hvis samlede proteinindhold er 7,27 g/1 med følgende sammensætning:

Albumin 99,0% a-globuliner 1,0%.

Udbyttet af albumin fra denne søjle er på 97,5%. Det 15 samlede ekstraktionsudbytte af albumin opnået ved frak tioneringsbehandlingen er på 76%.

EKSEMPEL 3

Man dialyserer 100 ml okse-plasma, der er opnået ved centrifugering, ved diafiltrering over for en 0,005 20 M acetatpuffer ved pH: 7,4.

Proteinopløsningen, der er opnået efter fjernelse af euglobulinerne, således som det er beskrevet i forudgå- 2 ende eksempler, har en elektrisk modstand på 1164.Q.cm /cm og et samlet indhold af proteiner på 39,1 g/1 med følgen-25 de sammensætning:

Albumin 66,1% a-globuliner 8,0% β-globuliner 10,0% /'"-globul iner 15,9%.

26

DK 164741 B

58 ml af proteinopløsningen indsprøjtes i en mængde på 70 ml/time på dne i eksempel 1 beskrevne søjle I indeholdende anionbytteren B, og som er bragt i ligevægt med en 0,025 M acetatpuffer ved pH 5,1. Søjlen 5 behandles analogt med forudgående eksempel. Det opsam- lede eluat (167 ml) indeholder 7,5 g/1 proteiner, hvis sammensætning er som følger:

Albumin 95,3¾ a-globuliner 1,6¾ 10 β-gluboliner 3,1¾

Jf^globuliner 0 %.

GI ml af eluatet indsprøjtes derpå i en mængde på 40 ml/time på en anden søjle, som er identisk med den i eksempel 1 beskrevne søjle III indeholdende kationbyt-15 teren, og som er bragt i ligevægt med en 0,1 M acetat puffer ved pH 5,5. Søjlen vaskes med 23 ml af den samme puffer.

Elueringsopløsningen og vaskeopløsningen blandes. Man opnår en opløsning, hvis samlede proteinindhold er 5,1 20 g/1 med følgende sammensætning:

Albumin 99,1¾ a-globuliner 0,9¾.

Det ved fraktioneringsbehandlingen opnåede udbytte af albumin er på 75,6¾.

25 EKSEMPEL 4

Fremstilling af plasmaopløsninq

Man optør ved 37 °C 250 ml plasma, pH reguleres til 5,2 med koncentreret HC1, og man dialyserer imod 60 27

DK 164741 B

1 0,01 M phosphatpuffer ved pH = 5,2.

Man opnår efter centrifugering 293 ml af en plasmaopløsning med en samlet proteinkoncentration på 35,5 g/1 med følgende sammensætning: 5 Albumin 56,5¾ α-globuliner 12,9¾ β-globuliner 9,5¾ ϊ^-globul iner 21,1¾.

F raktionerinq 10 Man placerer i serie: - en søjle I (0 = 1,6 cm) indeholdende 15 g af det i eksempel 1 beskrevne delvis hydrofobe anionbytter-bæremateriale B, - en søjle II (0 = 1 cm) indeholdende 5 g af den samme 15 anionbytter B, - en søjle III (0=1 cm) indeholdende 5 g af et kation-bytterbæremateriale D, som består af et siliciumoxid med en kornstørrelse på 100 - 300 ,um, en specifik overflade på 32 m /g, en middelporediameter på 115 20 nm og et porevolumen på 1,2 ml/g, som er beklædt med 2 5 mg/m af en copolymer N-vinylpyrrolidon-acrylsyre.

Dette bæremateriale er fremstillet analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde for kationbytte-ren C, idet man har modificeret de indbyrdes forhold 25 mellem de monomere. Det udviser følgende karakteri stika: - carbonindhold 8,46¾ - nitrogenindhold 1,29% - ionisk kapacitet 0,19 mækv/g.

28

DK 164741 B

Man indsprøjter 35 ml af den ovenfor fremstillede plasmaopløsning i en mængde på 60 ml/time i søjlen I, som forinden er bragt i ligevægt med en 0,025 M acetatpuffer ved pH = 5,2. Efter at have vasket søjlen med 65 5 ml af den til ligevægtsindstillingen brugte pufferop løsning, indsprøjter man den samme mængde (60 ml/time) af en 0,025 M acetatpuffer ved pH 4,7. Den eluerede opløsning på 160 ml (proteinkoncentration 3,72 g/1) har en analyse på 92,5% albumin, 3% a-globuliner og 10 4,5% β + ^globuliner. En aliquot fraktion af den elue rede opløsning (138 ml) indsprøjtes i en mængde på 40 ml/time på søjlen II, som forinden er blevet bragt i ligevægt med 0,025 M acetatpuffer ved pH 4,7. Søjlen vaskes med 22 ml af den samme pufferopløsning. Blandin-15 gen af de udstrømmende opløsninger og vaskeopløsninger ne, hvis proteinkoncentration er på 3,06 g/1, giver ved analyse 93,6% albumin, 2,5% a-globuliner og 3,5% β-globuliner.

En aliquotfraktion (140 ml) af den ovenfor nævnte blan- 20 ding af opløsninger indreguleres til pH 5,5 ved tilsæt- 2 ning af NaOH og til en elektrisk modstand på 270.O. cm /cm ved tilsætning af 1 M NaCl, hvorpå den indsprøjtes i en mængde på 20 ml/time i søjlen III, som forinden er bragt i ligevægt med en 0,05 M acetatpuffer ved pH 5,5.

25 Søjlen vaskes med 25 ml af den samme pufferopløsning.

Elektroforeseanalyse på den opkoncentrerede blanding af udløbsopløsningerne og af vaskeopløsninger viser fravær af urenheder i albuminen (albumin 100%).

Det samlede udbytte er på 71% i forhold til den albu-30 min, som var indeholdt i den som udgangsvæske anvendte plasmaopløsning.

Søjlerne I, II og III regenereres ved vask med henholds- 29

DK 164741 B

vis en 0,1 N HCl-opløsning, med destilleret vand og med pufferopløsning.

EKSEMPEL 5

Man fremstiller: 5 A - en hydrofil anionbytter på et porøst uorganisk bæ remateriale og betegnet som "anionbytter E".

Man sætter 100 g porøs siliciumoxid ("Spherosil" XOB

015) med partikelstørrelsen 100 - 200 ,um, specifik 2

overflade 30 m /g, middelporediamter 125 nm og porevo-10 lumen 1 ml/g til 200 ml af en vandig opløsning af DEAE

Dextran med koncentrationen 7,5% og indreguleret til pH 11,5 ved tilsætning af natriumhydroxid.

Den derved opnåede pasta tørres i en pladeovn ved 80 °C igennem 15 timer. Det opnåede pulver sættes til 300 15 ml af en 0,15% opløsning af 1,4-butandiol-diglycidyl- ether i ethylether. Etheren afdampes under en nitrogen-strøm ved omgivelsernes temperatur. Tværbindingsreaktionen gennemføres derpå ved opvarmning til 80 °C i 15 timer.

20 Dette bæremateriale vaskes derpå, før det anvendes, med følgende opløsninger: 10 rumfang 0,1 N NaOH, 10 rumfang 0,1 N HC1 og 10 rumfang ethylalkohol, hvorpå det tørres for at kunne oplagres før anvendelsen. Man opnår 115 g af et pulver indeholdende 13% DEAE. Dextran, 25 og som er i stand til at fiksere 0,2 mækv Cl-ioner pr. g.

B - En delvis hydrofob anionbytter på et porøst uorganisk bæremateriale og betegnet "anionbytter F".

Det bæremateriale, der tjener til fremstillingen af 30

DK 164741 B

denne anionbytter, præpareres analogt med det ovenfor under A beskrevne, idet det dog kun indeholder 5,7¾ DEAE Dextran i slutproduktet.

100 g bæremateriale oxideres med 500 ml af en 0,05 M 5 vandig opløsning af natriummetaperiodat NalO^ indehol dende 10 g/1 naCl igennem 2 timer ved omgivelsernes temperatur. Efter vask med en NaCl-opløsning indeholdende 10 g/1 og derpå med ethylalkohol tørrers det således fremstillede produkt i en nitrogenstrøm ved 40 °C.

10 100 g af det oxiderede bæremateriale sættes til 100 ml 6¾ opløsning af hexadecylamin i ethylalkohol, og man lader henstå ved omgivelsernes temperatur i 48 timer. Reduktionen af den således dannede imin-binding til en amino-binding gennemføres ved tilsætning af na-15 triumborhydrid til opnåelse af en koncentration af 0,2 M i nærvær af 50¾ vand. Efter vask med alkohol og derpå gentagne gange med 0,1 N HC1 tørres det vaskede bæremateriale for at kunne oplagres før anvendelsen.

Forbehandling af plasma 20 Man sætter 200 ml humant plasma, som forinden er vasket over natriumcitrat, til 200 ml af en vandig 16¾ ethanol-opløsning ved 0 °C. Det således dannede bundfald fjernes ved centrifugering. Supernatanten gøres sur (med 1 N HC1) ved pH 5,25 og ved +4 °C. Efter 2 timers forløb fjernes 25 det dannede bundfald ved centrifugering, og supernatan ten diafiltreres i en ultrafiltreringscelle for at være i ligevægt med en 0,01 M phosphatpuffer ved pH 5,25.

Bundfaldet af euglobuliner fjernes påny ved centrifugering, og den således opnåede supernatant filtreres igen- 30 nem en membran med en porøsitet på 0,2 ,um. Den elektri- 2 ske modstand er på 1200.Qcm /cm.

31

DK 164741 B

Fraktionering af plasmaopløsninqen - en søjle I med diameteren 2,5 cm fyldes med 50 g (105 ml) af anionbytteren E. Søjlen bringes i ligevægt med en 0,01 M natriumphosphatpuffer ved pH 5,25.

5 - En søjle II med diameteren 2,5 cm fyldes med 30 g (63 ml) af anionbytteren F. Søjlen bringes i ligevægt med en 0,054 M natriumacetatpuffer ved pH 5.

- En søjle III med diameteren 2,5 cm fyldes med 60 g (126 ml) af den i eksempel 4 beskrevne kationbytter 10 D. Søjlen bringes i ligevægt med en 0,054 M natrium acetatpuffer ved pH 5,5.

Den klarede opløsning svarende til 200 ml plasma, som er opnået ved den ovenfor beskrevne forbehandling, indsprøjtes i søjlen I med en hastighed på 400 ml/time.

15 Søjlen skylles med 200 ml 0,01 phosphatpuffer ved pH

5,25, hvorpå det fikserede albumin elueres med 500 ml 0,025 M acetatpuffer ved pH 4,7. Eluatet opsamles, og dets volumen er 400 ml.

Det således opnåede eluat indreguleres til pH 5 ved 20 tilsætning et 1 N NaOH, hvorpå der tilsættes NaCl til 2 opnåelse af en elektrisk modstand på 270jQ.cm /cm. Denne opløsning indsprøjtes på søjlen II med en hastighed på 100 ml pr. time. Størstedelen af albuminen bliver ikke fikseret under disse betingelser og strømmer 25 igennem søjlen sammen med filtratet. Søjlen skylles med 120 ml 0,054 M natriumacetat ved pH 5.

Blandingen indeholdende albumin indreguleres til pH

5,5 ved tilsætning af NaOH og indsprøjtes på søjlen III med en hastighed på 200 ml/time. Søjlen skylles 30 med 200 ml 0,054 M natriumacetatpuffer ved pH 5,5. De udstrømmende opløsninger sammenblandes og opkoncentre-res ved ultrafiltrering over en membran "Amicon" PM

32

DK 164741 B

10 til opnåelse af en koncentration på 50 - 200 g/1.

Renheden af albuminopløsningen med 50 g/1 bedømmes ved elektroforese og ved immun elektroforese over celluloseacetat i overensstemmelse med de i Pharmacopeen an-5 givne betingelser. Den viser sig at være 100¾. Analyse ved dobbelt immunodiffusion på gelose over for specifikke antisera for de forskellige plasma-produkter gør det muligt at bekræfte fraværet af protein-urenheder, især af a- og (3-lipoproteiner. Når slutkoncentrationen 10 af det rensede albumin er 130 g/1, kan man detektere spormængder af αΐ-antitrypsin og af haptoglobin, der ikke viser sig ved elektroforese, under anvendelse af dobbelt immunodiffusion over for de tilsvarende antisera.

15 Tilstedeværelsen af disse spormængder af urenheder er normal og uden konsekvens for stabiliteten af den endelige albuminopløsning, eller for den gode tolerance ved intravenøs indgift i dyr eller til mennesker.

De opnåede resultater med hensyn til udbytte og ren-20 hed af albumin er samlet i efterfølgende tabel I.

Det samlede system af tre søjler kan vaskes med en 0,1 M acetatopløsning ved pH 4 eller med NaCl med koncentrationen 20 g/1, hvorved man kan genvinde den tilbageholdte albumin for at recirkulere den under en ef-25 terfølgende cyklus eller ved en uafhængig behandling.

Søjlerne regenereres derpå ved successiv vaskning med 0,1 N HC1 og med 60¾ ethanol. De kan eventuelt periodisk steriliseres ad fugtig vej (2¾ formalin).

EKSEMPEL 6 30 I dette eksempel anvender man et hydrofilt anionbyt- 33

DK 164741 B

terbæremateriale, et hydrofobt anionbytter-bæremate-riale og et hydrofilt kationbytter-bæremateriale.

Man placerer i serie: - en søjle 10= 1,6 cm) indeholdende 14 g af det i 5 eksempel 5 beskrevne anionbytter-bæremateriale E.

Søjlen bringes i ligevægt med en 0,01 M phosphatpuf-fer ved pH = 5,2, - en søjle II identisk med søjle II fra eksempel 4 og indeholdende anionbytteren B, 10 - en søjle III identisk med søjle III i eksempel 4 og indeholdende kationbytteren D.

Man går frem analogt med eksempel 4 ud fra 61 ml af den samme plasmaopløsning, og idet man anvender de samme pufferopløsninger til eluering af søjle I og til 15 vask af søjlerne II og III.

De indsprøjtede mængder i søjlerne I, II og III er henholdsvis 60 ml/time, 20 ml/time og 20 ml/time.

Analyse ved elektroforese af slut-opløsningen, med en koncentration på 50 g/1, viser fravær af urenheder, 20 som forurener albuminen. Kontrol af opløsningen koncen treret til 130 g/1 ved dobbeltimmunodiffusion viser fravær af en hvilken som helst proteinisk urenhed.

%-Indholdet af albumin og udbytterne fra søjlerne er anført i efterfølgende tabel I.

25 EKSEMPEL 7

Man går frem analogt med eksempel 6, idet man dog bytter om på rækkefølgen af søjlerne II og III.

34

DK 164741 B

Eluatet, som kommer fra søjle I, reguleres til pH = 2 5,5 med NaOH og til en elektrisk modstand på 270 cm /cm med 1 M NaCl, hvorpå det indsprøjtes i søjlen II.

Opløsningen (udstrømningsvæske + vaskevæske), der kom-5 mer fra søjle II, reguleres til pH = 4,7 med 1 N HC1, hvorpå det indsprøjtes i søjle III.

De indsprøjtede mængder er henholdsvis 60 ml/time, 20 ml/time og 20 ml/time.

Analyse ved elektroforese og ved immunodiffusion af 10 den endelige opløsning koncentreret til 130 g/1 viser fraværet af urenheder, som forurener albumin.

De opnåede resultater med hensyn til % albumin og udbytte er anført i efterfølgende tabel I.

EKSEMPEL 8 15 Man går frem analogt med eksempel 6, idet dog søjlen II erstattes med en ny søjle II, som indeholder et delvis hydrophobt bæremateriale, der ikke er ionbyttende. Dette bæremateriale består af et siliciumoxid med en kornstørrelse på 100 - 300 ,um, en specifik overfla- 20 de på 25 m /g, en middelporediameter på 125 nm og et • 2 porevolumen på 1 ml/g, som er beklædt med 3,3 mg/m af et tværbundet vinyltoluen-vinyltriethoxysilan-poly-mermateriale der har et carbonindhold på 7,3¾.

Søjlen II bringes i ligevægt med 50 ml 95¾ ethanol og 25 derpå med 50 ml 0,025 M acetatpufferopløsning ved pH

4,7.

De indsprøjtede mængder i søjlerne I, II og III er henholdsvis 60 ml/time, 20 ml/time og 20 ml/time.

35

DK 164741 B

Den fra søjle III udstrømmende opløsning indeholder \/ed analyse 99,3% albumin og 0,7% a-globuliner.

De opnåede resultater er vist i tabel I.

EKSEMPEL 9 5 Man går frem under de samme reaktionsbetingelser som i eksempel 5, idet man dog erstatter søjlen III med en søjle af "CM Sepharose" CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, i Uppsala-Sverige) af samme størrelse og under de samme anvendelsesbetingelser. De derved opnåede re-10 sultater er anført i tabel I.

EKSEMPEL 10

Man går frem under de samme reaktionsbetingelser som i eksempel 6, idet man dog erstatter søjlen III med en søjle af "CM Trisacryl-M" (Reactifs IBF, Société 15 Pointet-Girard i Villeneuve la Garenne, Frankrig) med samme størrelse og under de samme anvendelsesbetingelser.

De derved opnåede resultater er anført i tabel I.

EKSEMPEL 11

Man går frem under de samme operationsbetingelser som 20 i eksempel 9, idet man dog erstatter søjlen I med en søjle af "DEAE Sepharose" CL 6B (Pharmacia Fine Chemicals i Uppsala i Sverige) med samme størrelse og under de samme anvendelsesbetingelser.

De opnåede resultater er anført i tabel I.

25 EKSEMPEL 12

Man går frem under de samme betingelser som i eksempel

DK 164741 B

3 6 10, idet man dog erstatter søjle I med en søjle af "DEAE Trisacryl M" (Reactifs IBF, Société Pointet-Girard i Villeneuve la Garenne, Frankrig) af samme størrelse og under de samme anvendelsesbetingelser.

5 Resultaterne er anført i tabel I.

EKSEMPEL 13 - Man fylder en søjle I med diameteren 2,5 cm med 100 g (210 ml) af den i eksempel 5 beskrevne anionbytter E. Søjlen bringes i ligevægt med en 0,025 M natrium- 10 acetatpuffer ved pH 5,25.

- Man fylder en søjle II med diameteren 2,5 cm med 63 ml "Sepharose" CL 4B, som er podet med hexadecylamin, og som er bragt i ligevægt med 0,054 M natriumacetat ved pH 5. Podningen med hexadecylamin gennemføres 15 ved cyanogenbromid-metoden i overensstemmelse med følgende fremgangsmåde:

Man vasker 100 ml "Sepharose" CL 4B med demineraliseret vand ved 3 på hinanden følgende dekanteringer, hvorpå man sætter det til 200 ml vand. Idet man hol- 20 der pH på værdien 11 ved kontinuert tilsætning af natriumhydroxid (NaOH), tilsætter man 9 g BrCN. Reaktionen varer ca. 15 minutter. Når pH ikke ændrer sig yderligere, vaskes bærestoffet med 0,1 M hydrogencar-bonatopløsning og derpå med 95¾ ethylalkohol.

25 Man sætter ved 40 °C til bærestoffet 20 g hexadecyl amin opløst i 200 ml alkohol, og reaktionen forløber igennem 15 timer.

Til sidst vaskes bærematerialet flere gange successivt med opløsninger af 0,1 N HC1 og 95¾ alkohol, 30 hvorpå der bringes i ligevægt som tidligere anført.

37

DK 164741 B

- Man fylder en søjle III med diameteren 2,5 cm med 60 g (126 ml) af den i eksempel 4 beskrevne kation-bytter D. Søjlen bringes i ligevægt med 0,054 M natriumacetatpuffer ved pH 5,5.

5 Forbehandling af humant plasma

Man sætter 200 ml cryosupernatant til 200 ml af en vandig 16,¾ ethanolisk opløsning ved 0 °C. Det derved dannede bundfald fjernes ved centrifugering. Supernatan-ten gøres sur (med 1 N HC1) til pH 5,25 ved +4 °C. Ef-10 ter 2 timers forløb fjernes det således dannede bund fald ved centrifugering, og supernatanten diafiltreres i en ultrafiltreringscelle, hvorved det bliver bragt i ligevægt med en 0,025 M acetatpuffer med pH 5,25.

Bundfaldet af euglobuliner fjernes på ny ved centrifu-15 gering, og den således opnåede supernatant filtreres igennem en membran med porøsiteten 0,2 ,um. Dets elek- 2

triske modstand udgør 630,/icm /cm. Opløsningen sprøjtes ind på kolonnen I i en mængde på 400 ml/h. Kolonnen skylles med 200 ml 0,025 acetatpuffer med pH 5,25, hvor-20 på det fikserede albumin elueres med 400 ml 0,025 M

acetatpuffer ved pH 4,7. Eluatet opsamles, og dets rumfang er 350 ml.

Det således opnåede eluat reguleres til pH ved tilsætning af NaOH, hvorpå der tilsættes NaCl for at opnå 2 25 en elektrisk modstand på 270 Λοπι /cm. Opløsningen sprøjtes i kolonne II i en mængde på 100 ml/h.

En ikke-negligerbar mængde albumin fikseres af søjlen, hvorved udbyttet formindskes med 20 - 30¾ i forhold til de bærestoffer, som anvendes i søjle nr. II i de 30 foregående eksempler. Den opløsning, som strømmer igen nem søjlen, indeholder albumin og nogle a- og β-globu-liner. Søjlen skylles med 120 ml 0,054 M natriumacetat- 38

DK 164741 B

puffer med pH 5. Blandingen indeholdende albumin reguleres til pH 5,5 ved tilsætning af NaOH og indsprøjtes i søjlen III i en mængde på 200 ml/h. Søjlen skylles med 200 ml 0,054 M natriumacetatpuffer med pH 5,5. De 5 udstrømmende opløsninger sammenblandes og opkoncentre- res ved ultrafiltrering over en membran af typen "Amicon" PM 10 til opnåelse af en koncentration på 50 g/1.

Opløsningens renhed, således som den bedømmes ved elek-troforese over celluloseacetat under de i pharmacopeen 10 angivne betingelser er 99,1%, og den kan således betrag tes som værende tilfredsstillende efter de for tiden i kraft værende normer. Analyse ved dobbelt immunodiffusion over gelatine over for specifikke antisera over for forskellige plasma-proteiner gør det muligt at fast-15 lægge tilstedeværelsen af følgende urenheder: transferi- ne, αΐ-antitrypsin, B2-makroglobulin, haptoglobin.

De tre søjler kan regenereres og steriliseres mellem hver cyklus som omtalt i de forudgående eksempler.

Det samlede udbytte af denne rensningsfremgangsmåde 20 er kun på 55!i.

De opnåede resultater er vist i tabel I.

EKSEMPEL 14 (sammenliqninqseksempel)

Man går frem under de samme reaktionsbetingelser som i eksempel 15, idet man dog erstatter søjlen II af hy-25 drofobt "Sepharose" med en hydrofil søjle af anionbyt-ter af typen E, under de samme anvendelsesbetingelser.

De opnåede resultater (se tabel I) er forskellige fra de i de foregående eksempler opnåede resultater. Renheden af det til sidst opnåede albumin er mindre end 99%.

30 Man finder den systematiske tilstedeværelse af al-lipo- 39

DK 164741 B

protein, hvis tilstedeværelse skader stabiliteten af den endelige albuminopløsning, især under opvarmning ved 60 °C.

Dette eksempel viser nødvendigheden af at inkludere 5 et filtreringstrin over et delvis hydrofobt bærestof til opnåelse af en albumin med meget høj renhed.

40

DK 164741 B

-J

- -h—i’-icor^vncs* c^coinc7\ ^ r>»fv»r^r>.or^r^\or^.inr^ o i— HH I—i t—1

δ* O

0 Λ c »—j n co co -H r—J Gi Cl Ol E a

D LO

JO

I—i · * ·· *· ·· *» l| II l| Μ I. II «· ·· ·« II ·· ·· · . II II ·· ·« l| II ·· II II

CO

tl_ I—I

CO i—i

t-O CO

o a i 4-> r-i O CM * -u ·Ό CT1 Øl Cl

>i Q

-O LO

Ό a ......................................................

1—1

CD

Ή ^ r-j ** B CO C\ Cl HH £ ^ ^ ^ _J ............................................................

UJ

CD h-i «£ H-i

Η- l-H

Λ f-* 0 p-) 03 03 »H * ·* CO OOOOC^OOO OC^r^ 0 0- Q 0000cr\00000\c* I I 1 «-i h*H ·"-( r—{ «-Η »—i »-H »—<

O

U- o ......................................................

u

4J

03 H-i *“H I—!

^ ^ VOLOCMVOO\iAeDCMLOfv'CO

ω·—I covOOvOMi'VOOvO'JO'NfsJ· ““ -i-J'O OiOiCiCiOiCinciCiOlOi L_ s

C LJ CO

•H c: L— D ....................................................

_Q

i—1 ..

< t-H

c_, ø inr^r^r^i^co ltj O cnj cnj

0 ^ ·***·» Λ ^ *\ *\ *t A

JJ .- CMCOCOCOCOCM-^CMfO'S-Sj· i q Cl Cl Cl Ci Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl

UJ CD

^ MJ-LOvCr'-.CGCriO—ICMCO-C- “ —t .—I ·—1 *—< —( LU *

Claims (18)

1. Fremgangsmåde til chromatografisk fraktionering af plasmaproteiner ved hjælp af anioniske og kationi-ske ionbyttere, kendetegnet ved, at man bringer en plasmaopløsning i kontakt med mindst ét del- 5 vis hydrofobt bæremateriale, som eventuelt kan være ionbyttende, og med mindst ét hydrofilt, ionbyttende bæremateriale, idet der som bæremateriale anvendes matricer af naturlige polysaccharid-polymere, matricer af syntetiske polymere, uorganiske oxider beklædt med 10 en polysaccharidpolymer og uorganiske oxider beklædt med en film af tværbundet syntetisk polymer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mindst ét hydrofilt bæremateriale er kation- byttende.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det delvis hydrofobe bæremateriale er anionbyt-tende, og at det hydrofile bæremateriale er kationbyt-tende.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at man bringer plasmaopløsningen i kontakt med 2 anionbyttende bærematerialer, hvoraf det ene kan være hydrofilt, og det andet er delvis hydrofobt, samt med et hydrofilt, kationbyttende bæremateriale.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet 25 ved, at den hydrofile anionbytter befinder sig før den delvis hydrofobe anionbytter.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det anvendte delvis hy- DK 164741 B drofobe bæremateriale er valgt blandt polysaccharid-polymere modificeret ved fiksering af en hydrofob gruppe, syntetiske polymer-adsorbanter, uorganiske oxider beklædt med en polysaccharid-polymer modificeret ved 5 fiksering af en hydrofob gruppe og uorganiske oxider beklædt med en film af hydrofob tværbundet polymer.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det anvendte hydrofile bæremateriale er valgt blandt polysaccharid-polymere, 10 vanduopløselige hydrofile syntetiske polymere, uorga niske oxider beklædt med en polysaccharid-polymer og uorganiske oxider beklædt med en film af hydrofil tvær-bundet polymer.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, 15 kendetegnet ved, at det anvendte porøse uor ganiske oxid udviser en partikelstørrelse på 4 ^um - 5 mm, en porediameter på 25 - 300 nm og en specifik 2 overflade på 5 - 150 m /g.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet 20 ved, at det uorganiske oxid har en partikelstørrelse på 50 /um - 1 mm, en porediameter på 60 - 150 nm og o 2 en specifik overflade på 20 - 50 m /g. 1 Fremgangsmåde til plasmafraktionering ifølge krav 1 ved kontakt med mindst én anionbytter og en kation- 25 bytter, kendetegnet ved, at der anvendes ionbyttere, hvis ionbytningskapacitet er mindre end 2 mækv/g, og som består af et porøst uorganisk bæremateriale med partikelstørrelse 4 ,um - 5 mm, porediame- 2 ter 50 - 250 nm og specifik overflade 5 - 150 m /g be- 2 30 klædt med en film i en mængde mindre end 15 mg/m af hydrofob tværbundet polymer indeholdende eller bærende aminogrupper eller kvaternære ammoniumgrupper for mindst DK 164741 B én af ionbytternes vedkommende og med en tværbundet polyvinyllactamfilm bærende carboxylsyregrupper for den anden ionbytters vedkommende.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendeteg-5 net ved, at plasmaopløsningen yderligere, og for trinsvis i et begyndelsestrin, bringes i kontakt med et porøst uorganisk bæremateriale med de samme karakteristika og beklædt med en polysaccharid-polymer bærende amingrupper eller kvaternære ammoniumsalte.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendeteg net ved, at den polyvinyllactam, som beklæder kation-bytter-bærematerialets overflade, er opnået ved copoly-merisation af en vinyllactam og en umættet carboxylsyre i nærvær af et polyfunktionelt tværbindingsmiddel.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendeteg net ved, at vinyllactamen er N-vinylpyrrolidon.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at carboxylsyren er acrylsyre.

15. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 12 - 14, 20 kendetegnet ved, at tværbindingsmidlet er et silan-derivat med formlen Ch^CH-SiX^, hvori X, som kan være ens eller forskellige, betegner en hydrolyserbar lavere alkoxygruppe eller acetoxy, phenoxy eller halogen.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendeteg net ved, at den hydrofobe, tværbundne polymer, som beklæder anionbytter-bærematerialets overflade, er opnået ud fra en vinylaromatisk monomer.

17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 - 16, DK 164741 B kendetegnet ved, at de anvendte mængder an-ionbyttere udgør 250 - 2000 ml pr. liter plasma, og at de anvendte mængder kationbyttere udgør 200 - 1000 ml pr. liter plasma.

18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 - 17, kendetegnet ved, at den gennemføres kontinuert under anvendelse af serier af søjler.

19. Albumin med renhed større end 99?ό bestemt ved elek-troforese, kendetegnet ved, at den er opnået 10 ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 - 18.