NO166230B

NO166230B - Fremgangsmaate for fraksjonering av plasmaproteiner i en opploesning av plasma ved hjelp av ionebyttere.

Info

Publication number: NO166230B
Application number: NO841266A
Authority: NO
Inventors: Adrien Dromard; Michel Exertier; Claude Rollin; Jean-Lois Tayot; Michel Tardy
Original assignee: Rhone Poulenc Rech; Merieux Inst
Priority date: 1983-04-01
Filing date: 1984-03-30
Publication date: 1991-03-11
Also published as: DK164741B; ES8501635A1; JPH0520439B2; IE57598B1; AU2626484A; JPS6023320A; EP0121468A2; ES531132A0; IE840802L; MX7676E; ATE32304T1; US4675384A; IN160634B; DK174484D0; FR2543448A1; EP0121468A3; DK164741C; ZA842204B; AR242115A1; CA1203478A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fraksjonering av plasmaproteiner i en oppløsning av plasma ved hjelp av ionebyttere av anionisk og kationisk type, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at en plasmaoppløsning bringes i kontakt med minst en delvis hydrofob bærer som eventuelt har ionebytterkarakter, og minst en hydrofil ionebytterbærer, idet det som bærer anvendes naturlige polysakkarid-polymermatrikser, syntetiske polymermatrikser, uorganiske oksyder belagt med en polysakkarid-polymer eller uorganiske oksyder belagt med en film av fornettet syntetisk polymer;

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Oppfinnelsen vedrører spesielt fraksjonering av plasma ved hjelp av ionebyttere for oppnåelse av albumin med høy renhet.

Den mest anvendte metode for separering av de bestanddeler som utgjør plasma, nemlig albumin og immunoglobuliner i industrielle målestokk, er metoden til Cohn hvor prinsippet er basert på selektiv utfelling av proteiner ved hjelp av vandig-alkoholiske løsninger. Utfellingsmetoden er ikke fullstendig selektiv og virker delvis denaturerende. Den medfører langvarige og kostbare manipulasjoner med hensyn til utførelse og investering og gjør oppnåelsen av sterile og ikke-pyrogene produkter spesielt vanskelig.

Med innføring av ionebyttermaterialer er det foreslått nye metoder for separering av proteiner fra deres blandinger

i form av kontinuerlige metoder i kolonner med stasjonære lag. Disse metoder er mer økonomiske og tillater oppnåelse av proteiner med meget stor renhet med gode utbytter. Deres anvendelse innen den biologiske industri i stor målestokk er imidlertid begrenset av visse ulemper.

Metoder for isolering av albumin fra blodplasma ved kontakt med polysakkarid-ionebyttere er beskrevet i FR-A 2.327.256, US-A 4.228.154 og US-A 4-136.094. Disse metoder medfører forutgående komplekse behandlinger for å fjerne hoveddelen av forurensninger, spesielt lipoproteiner og i visse tilfeller

■y-globuliner og/eller nødvendigjør en etterfølgende rensing av albuminet ved molekyl-siktbehandling for oppnåelse av en renhetsgrad på over 98 %. Disse etterbehandlinger er vanskelig å utføre i industrien og lite økonomiske. Produktivi-teten er lav og passer ikke for behandling av et stort plasmavolum hvor behovet bærer preg av at den globale etter-spørsel etter proteiner stadig øker.

De uorganiske bærere har i motsetning til polysakkaridene utmerkede fysikalsk-mekaniske egenskaper som tillater meget høy filtreringshastighet, men de frembyr ikke-spesifikke adsorpsjonsseter og kan som funksjon av pH og den anvendbare ionestyrke medføre et tap i utbyttet av proteiner.

Metoder for separering av proteiner ved hjelp av kromatografering på uorganiske ionebytter-bærere er særlig beskrevet i patentskrifter FR-A 2.321.932, FR-A 2.359.634 og FR-A 2.4 64.9 67. Anvendelsen av de beskrevne ionebyttere kan i tilfellet med plasmafraksjonering føre til utilstrekkelige utbytter for de renhetsgrader som foreskrives av terapeutiske anvendelser og tillater ikke oppnåelse av albumin med høy renhet uansett hvilket plasma som fraksjoneres.

Det vesentlige formål for den foreliggende oppfinnelse er

å tilveiebringe en metode som tillater behandling av store plasmavolum og uten annen behandling enn den initiale klaring av plasmaet og å isolere proteiner med høy renhet med et godt utbytte.

Et spesielt formål er å tilveiebringe en ekstraksjonsmetode i stor skala for albumin for terapeutisk anvendelse fra plasma uansett dettes opprinnelse.

Ved oppfinnelsen bringes således en oppløsning av plasma i kontakt med minst en delvis hydrofob bærer med eventuell ionebytterkarakter og minst en hydrofil ionebytterbærer, hvor det som bærer anvendes de nærmere angitte polymertyper.

Med delvis hydrofob bærer forstås en bærer med hydrofile

og hydrofobe grupper som kan danne komplekser med oppløste bestanddeler som bærer lipofile grupper. De utgjøres generelt av en hydrofob polymer eller bærere av tilgjengelige alkyl-kjeder for et antall karbonatomer lik eller over 3 av enten lineær eller forgrenet type og av mettet eller umettet karak-ter, eller mettede eller umettede cykliske kjerner. En hydrofil bærer er derimot en bærer som ikke har hydrofobe grupper idet overflatesetene utelukkende er hydrofile. Disse bærere er mer spesifikt definert i det følgende.

Ved et spesielt trekk ved oppfinnelsen er fremgangsmåten karakterisert ved at en delvis avsaltet plasmaoppløsning bringes i kontakt med i rekkefølge minst en anionbytter, deretter en kationbytter idet ionebytterne har en ionebytterkapasitet på opptil 2 mekv/g og utgjøres av en porøs uorganisk bærer med en kornstørrelse fra 4 um til 5 mm, en porediameter på 500 til 2.500 A, en spesifikk overflate fra 5 til 150 m27g og som er belagt med en mengde opptil 15 mg/m<2 >av en hydrofob fornettet polymerfilm som inneholder eller bærer amingrupper eller kvaternære ammoniumsalter for minst en av ionebytterne, og en film av fornettet polyvinyllaktam som bærer karboksylsyregrupper for den annen ionebytter.

Ved dette spesielle aspekt for oppfinnelsen representeres de uorganiske bærere som tjener som base for ionebytterne av aluminiumoksyder og silisiumoksyder. Ionebytterbærerne som anvendes kan være av samme eller av forskjellig natur og ha samme egenskaper eller forskjellige egenskaper på betingelse av at disse ligger innenfor de ovenfor angitte grenser.

Den uorganiske bærer som anvendes har foretrukket en porediameter fra 600 til 1500 A, en spesifikk overflate på 20 til 50 m<2>/g og en kornstørrelse fra 50 um til 1 mm. Anion-bytterharpiksene utgjøres av en fornettet polymer som inneholder eller bærer funksjonelle grupper: primære, sekun-dære eller tertiære aminer, kvaternære ammoniumsalter med generelle formler: -NH2, -NHR, -N(R)2. -N(<+>)(R)3X(<->), hvori R som er like eller forskjellige representerer alkyl eller hydroksyalkyl med 1 til 4 karbonatomer og X et uorganisk eller organisk anion som f.eks. klorid, sulfat, nitrat, fosfat, citrat.

De tertiære amingrupper henholdsvis kvaternære ammoniumsalter utgjør deler av den fornettede polymerkjede eller er knyttet til den fornettede polymer som dekker hele overflaten av bæreren og gir ionebytterne med ionebytterkapasitet opptil 2 mekv/g og foretrukket mellom 0,15 og 1.2 mekv/g og helt spesielt mellom 0,15 og 0,70 mekv/g.

De fornettede polymerer som dekker overflaten av bærerne

er i og for seg kjente produkter oppnådd fra monomerer som f.eks. epoksy-forbindelser som fornettes med polyaminer som katalysatorer; formaldehyd som fornetter ved polykondensering med polyaminer; vinylmonomerer som vinylpyrridin, styren og derivater som fornetter med polyfunksjonelle monomerer som diakrylater eller dimetakrylater av monoeller poly-alkylenglykoler, divinylbenzen, vinyltrialkoksysilaner, vinyltrihalogensilaner, bismetylenakrylamid, i nærvær av en initiator eller ultrafioletter stråler.

Når den fornettede polymer ikke i kjeden inneholder funksjonelle grupper er det nødvendig å modifisere den og dette er særlig tilfellet med fornettede polymerer på basis av styren og derivater, alkyl-akrylater og alkyl-metakrylater og akrylnitril. Denne modifisering av polymeren gjennomføres ved hjelp av kjente metoder.

Disse anionbytterharpikser på bærere og deres fremstill-ingsmetoder er beskrevet i de franske patentpublikasjoner FR-A 2.321.932 og FR-A 2.464.967 som det refereres til her. Under omrøring av kationbytterne belegges den porøse uorganiske bærer med en film av fornettet polyvinyllaktam som bærer funksjonelle grupper -COOH.

De kopolymerer av vinyllaktam som dekker bæreren er i og for seg kjente produkter og oppnås ved kopolymerisering av monomerer med formel: hvori R er H eller lavere alkyl og x er et helt tall mellom 2 og 5, med en umettet monomer karboksylsyre med formel:

hvori Ri er H eller CH3 og R2 er en gruppe -COOH som kan være knyttet til det umettede karbonatom over et toverdig lineært eller forgrenet alkylenradikal Ci-C3Q-fenylen, cykloalkylen, ~ (CH2.) n-0- (CH2)m-, - (CH2) n-C0- (CH2)m- , - (CH2) n-C00- (CH2)m- , (C<H>2)nS02-(CH2)m-, -(CH2)n-NR4-(CH2)m-, (CH2)n-C0-NR4(CH2)m -

hvori R4 er H eller C1-C3 alkyl og n, m er et helt tall fra 0 til 12.

Eksempler på monomerer med formel (I) er N-vinylpyrrolidon, N-vinylkaprolaktam, N-vinyl-p-propiolaktam, a-metylvinyl-propiolaktam. Man anver foretrukket N-vinylpyrrolidon.

Som eksempler på karboksylsyre med formel (II) nevnes akrylsyre, metakrylsyre, 4-pentensyre, vinylbenzenkarboksylsyre, 6-akrylamidoheksansyre.

Disse monomerer kan fornettes ved hjelp av polyfunksjonelle fornettningsmidler som er kjent innen dette område av teknikken, f.eks. polyol-diakrylater som diakrylatet eller dimetakrylatet av dietylenglykol eller dibutandiol 1-4 og vinyl- eller alyl-derivater av triazin som triallylisocyanu-rat. Som fornettningsmidler kan også anvendes monomerer av silantypen med formel CH2 = CH-Si X3 (III) hvori hver X, som er like eller forskjellige, representerer et hydrolyserbart lavere alkoksyradikal, acetoksy eller fenoksy eller et halogen. Eksempler på tilgjengelige silanderivater er vinyltri-metoksysilan, vinyltrietoksysilan, vinyltriacetoksysilan, vinyltriklorsilan, vinyl tris-(p-metoksyetoksy)-silan.

Foretrukket utføres belegningen av den uorganiske bærer

med kopolymer ved polymerisering in situ av monomerene i nærvær av bæreren. Vinyllaktamet, fornetningsmidlet og vinylkarboksylsyren, eventuelt en initiator, bringes i oppløsning i et løsningsmiddel, oppløsningen impregneres over bæreren hvoretter løsningsmidlet avdampes og monomeren fornettes ved hjelp av i og for seg kjente metoder som oppvarming eller ultrafiolett bestråling. Som løsningsmiddel anvendes alle løsningsmiddelprodukter for monomerer hvor kokepunktet er så lavt som mulig for å begunstige den endelige avdamping og disse er f.eks. metylenklorid, klorfluormetaner (flugener), etyleter, aceton, etylacetat.

Generelt velges mengden av monomer som anvendes slik at man på overflaten av porene av bæreren oppnår en polymerfilm på mellom 1 og 15 mg/m<2>, foretrukket mellom 1 og 6 mg/m<2>. Monomerforholdet bestemmer mengden av funksjonelle grupper fordelt på polymerfilmen. Foretrukket anvendes vinylkarbok-sylsyre i mengder slik at mengden av funksjonelle grupper fordelt på overflaten av bæreren er mellom 0,05 og 2 mekv/g bærer. Mengden av fornettningsmiddel kan variere mellom 1 og 60 vekt% i forhold til total vekt av monomer.

Ved forsøk er det funnet at separering av plasmaproteiner

og oppnåelse av albumin med meget høy renhet kan oppnås

ved kromatografering på andre bærere på betingelse av at man i rekkefølge anvender minst en delvis hydrofob som eventuelt har ionebytterkarakter og minst en hydrofob bærer med ionebytterkarakter.

Innenfor dette generelle aspekt for oppfinnelsen kan bæreren være organisk eller uorganisk og av naturlig eller syntetisk opprinnelse. For fremstilling i stor målestokk foretrekkes imidlertid bærere på basis av uorganiske oksyder.

De hydrofile bærere kan utgjøres av polymere grunnmasser eller uorganiske oksyder belagt med en hydrofil polymerfilm som bærer ionebyttergrupper. Eksempler på naturlige hydrofile bærere er polymere grunnmasser på basis av polysakkarider som fornettet dekstran, agarose, fornettet agarose, cellulose, fornettet cellulose.

Kjente syntetiske hydrofile bærere kan oppnås ved polymerisering av monomerer som akrylamid og hydrofile derivater.

En annen gruppe av hydrofile bærere representeres av porøse uorganiske oksyder hvor overflaten er belagt med en naturlig eller syntetisk hydrofil polymer. Det porøse uorganiske oksyd kan være silisiumoksyd, aluminiumoksyd, magnesiumoksyd, titanoksyd eller deres naturlige eller syntetiske derivater som glass, silikater, zeolitter, kaolin, etc. Den uorganiske bærer har en kornstørrelse fra 4 um til 5 mm, foretrukket 50 um til 1 mm, en porediameter fra 250 til 3000 A, foretrukket 600 til 1500 A, en spesifikk overflate på 5 til 150 m<2>/g, foretrukket 20 til 50 m<2>/g.

Polymeren som dekker overflaten av bæreren kan være en naturlig polysakkarid-polymer som beskrevet i det foregående, den kan være en hydrofil polymer uoppløselig i vann og av i og for seg kjent type, oppnådd ved polymerisering av vinylmonomerer i nærvær av et fornetningsmiddel. De representative eksempler på disse hydrofile polymerer omfatter polymerer av akrylater og metakrylater av hydroksyalkyl eller hydroksy lavere alkoksyalkyl som f.eks. homopolymerene og kopolymerene av akrylat eller metakrylat av 2-hydroksyetyl, hydroksy-propyl, hydroksyetoksyetyl; delvis hydrolyserte polymerer av vinylester av karboksylsyre som f.eks. delvis hydrolyserte homo- og kopolymerer av vinylacetat; akrylamidpolymerer; polymerer av heterocykliske vinylforbindelser som homo- og kopolymerer av N-vinylaktamer etc. De uorganiske oksyder belagt med polysakkaridpolymer er beskrevet i FR-A 2.319.399.

De delvis hydrofobe bærere kan likeledes utgjøres av grunnmasser av naturlige eller syntetiske polymerer eller uorganiske oksyder som definert i det foregående belagt med en film av delvis hydrofob polymer. Polysakkaridpolymerene kan gjøres delvis hydrofobe ved immobilisering av grupper som f.eks. lineære eller forgrenede alkyleller alkenyl-hydro-karboner med et antall karbonatomer på minst 3; aryl- eller alkylaryl-radikaler som fenyl, tolyl, xylyl; cykloalkyl-eller cykloakenyl-radikaler som cykloheksyl. De syntetiske polymerer kan oppnås ved polymerisering i suspensjon av vinylaromatiske monomerer som styren og derivater anvendt alene eller i blanding med hverandre og/eller med minst en kopolymeriserbar monomer som f.eks. alkyl (C1-C5), akrylater og -metakrylater, akrylnitril, butadien, og fornettet ved hjelp polyfunksjonelle monomerer som f.eks. diakrylater eller dimetakrylater av mono- eller poly-alkylenglykoler, divinylbenzen, vinyltrialkoksysilaner, vinyltrihalogensilaner, bismetylenakrylamid, i nærvær av en initiator eller ultrafiolett bestråling.

Den hydrofobe bærer som foretrukket anvendes ved oppfinnelsen utgjøres av et uorganisk oksyd (som definert i det foregående for den hydrofile bærer) belagt med en i det minste delvis hydrofob polymer. Belegg-polymeren kan være en polysakkarid-polymer hvorpå det er immobilisert hydrofobe grupper, f.eks. alifaktiske aminer med lang kjede (denne type bærer fremstilles ved metoden beskrevet i FR-A 2.403.098 eller US-A 4.308.254) eller en syntetisk polymer oppnådd fra monomerer lysatorer; formaldehyd som fornetter ved polykondensering med polyaminer; vinylmonomerer i form av vinylpyridin, styren og derivater som fornettes med polyfunksjonelle monomerer som diakrylater eller dimetakrylater, av mono- eller poly-alkylenglykoler, divenylbenzen, vinyltrialkoksysilaner, vinyltrihalogensilaner, bismetylenakrylamid, i nærvær av en initiator eller ultrafiolettbestråling.

Ionebyttergruppene kan fikseres til den hydrofile eller hydrofobe polymer ved kjemisk modifisering eller være innført i polymerkjeden ved polymerisering eller kopolymerisering ved hjelp av vinylmonomerer som bærer ioniserbare funksjonelle grupper av sur eller basisk type eller som kan modifiseres etterpå ved kjemisk reaksjon for innføring av ionebytter-radikaler. De kopolymeriserbare monomerer som kan anvendes er forbindelser med formel:

hvori Ri er H eller CH3 og R2 representerer:

et arylradikal som fenyl eller naftenyl

en reaktiv funksjonell gruppe Y som -C-N, -CONH2,

-CH2OH, -COOR3 hvori R3 er H eller C^-Cs eller

-0H,

- NH2, -halogen, -S03H, -PO(OH)2, eller

- en funksjonell gruppe Y med den foregående betydning knyttet til et umettet karbonatom over et lineært eller forgrenet C1-C30, <t>overdig alkylenradikal, fenylen, cykloalkylen, -(CH2)n -0-(CH2)m-, -(CH2)n - CO-(CH2)m-, -(CH2)n-COO(CH2)m-, -(CH2)n-S02-(CH2)m-,

-(C<H>2)n-NR4-(C<H>2)m-, -(CH62> n-C0-NR4

~(CH2)m

hvori R4 er H eller C1-C3 alkyl og n og m er hele tall fra 0 til 12.

Som kopolymeriserbar monomer kan nevnes (met)-akrylsyre, 4-pentensyre, vinylbenzensulfonsyre, vinylbenzenkarboksylsyre, akrylamid og metakrylamid, akrylnitril og metakrylnitril, allylalkohol, allylamin, 1,2-dimetyl-4-pentenylamin, 2,3-epoksypropylakrylat og metakrylat, nmetylolakrylamid, 6-akrylamidoheksansyre, styren.

Valget av reaktiv vinylmonomer for oppnåelse av funksjonell kopolymer er bare begrenset ved anvendelsen som bestemmer den funksjonelle gruppe. Man kan f.eks. velge en monomer som bærer en kationisk gruppe eller en anionisk gruppe og direkte anvende bæreren som ionebytterharpiks.

Hvis monomeren ikke selv bærer ionebyttergrupper er det mulig til slutt å modifisere den ved kjemisk reaksjon ved hjelp av hvilken som helst kjent teknikk på betingelse av at denne reaksjon er for likelig med stabiliteten av kopolymeren.

Det er likeledes mulig til slutt å modifisere den reaktive gruppe Y til stede i kopolymeren ved hjelp av hvilken som helst klassisk teknikk for oppnåelse av en ny funksjonell gruppe Y' . Denne modifisering kan f.eks. bestå i å omdanne et primært amin til tertiært amin eller eller til kvaternært ammoniumsalt for oppnåelse av en anionbytterbærer, eller å omdanne en kationbytter til anionbytter ved reaksjon mellom en gruppe COOH og et diamin som deretter eventuelt omdannes til kvaternært ammonium ved alkylering.

Belegningen av den uorganiske bærer med den naturlige eller syntetiske polymer kan oppnås ved hjelp av en hvilken som

helst kjent metode som pulverisering eller impregnering.

Når beleggpolymeren er en syntetisk polymer oppnås belegget foretrukket ved impregnering av bæreren med en opplesning av den eller de overnevnte monomerer og eventuelt initiatoren i et løsningsmiddel som deretter avdampes og monomerene fornettes ved hjelp av kjente metoder. Som løsningsmiddel anvendes alle produkter som er løsningsmidler for monomerene og initiatoren hvor kokepunktet foretrukket er så lavt som mulig for å begunstige den endelige avdamping. Disse er f.eks. metylenklorid, etyleter, benzen, aceton, etylacetat og klorfluormetaner ("Flugen").

Generelt velges mengden av monomerer eller polymerer som anvendes slik at det på overflaten av bæreren oppnås en polymerfilm mellom 1 og 15 mg/m<2> og foretrukket mellom 1 og 6 mg/m<2>.

Mengden av funksjonelle grupper fordelt på overflaten av bæreren er fordelaktig mellom 0,01 og 2 mekv/g bærer. Når bærerne utelukkende anvendes som ionebyttere er denne mengde foretrukket mellom 0,0 5 og 2 mekv/g bærer.

Anion-byttergruppene kan utgjøres av aminoaromatiske eller aminoalifatiske grupper som foretrukket dietylaminoetyl-gruppen eller kvaternære aminoalkylgrupper med formel N<+> -

(R)3 X-, hvori R som er like eller forskjellige representerer en alkylgruppe eller hydroksyalkylgruppe og X representerer et uorganisk eller organisk aion som f.eks. klorid, sulfat, nitrat, fosfat, citrat, borat, acetat, formiat.

Kationbyttergruppene kan være sulfonat-, sulfat-, fosfono-, karboksyl- eller fenolhydroksy-grupper, foretrukket karbok-symetylgrupper eller sulfoalkylgrupper.

Blant de hydrofile ionebytterbærere som kan fås i handelen kan nevnes forbindelser som er kjent under betegnelsene "SEPHADEX" og "SEPHAROSE", spesielt DEAE "Sephadex" (dietyl-aminoetyldekstran)'QAE "Sephadex" (kvaternisert dietylamino-etyldekstran) DEAE "Sepharose" (dietylaminoetylagarose) ,

CM "Sephadex" (karboksymetyldekstran), SP "Sephadex"

(sulfopropyldekstran), CM "Sepharose" (karboksymetylagarose såvel som forbindelser kjent under betegnelsene DEAE "Trisacryl M" og CM "Trisacryl M".

Blant de delvis hydrofobe bærere kan nevnes produkter kjent under betegnelsene "PHENYL-SEPHAROSE" CL-4B, "OCTYL-SEPHARO-SE" CL-4B på basis av fornettet agarose, videre "SPHEROSIL" Q MA som er et silisumoksyd belagt med en polymer på basis av vinyltoluen som bærer kvaternære ammoniumgrupper.

Det plasma som fraksjoneres ved hjelp av ionebytterne be-handles på forhånd for i det minste delvis å fjerne saltene og fordelaktig auglobulinene som utgjør et ustabilt proteink-ompleks. Disse forbehandlinger nødvendiggjør ikke anvendelse av tilsetningsmidler for klaring eller utfelling som f.eks. polyetylenglykol eller adsorpsjonsmidler som forbrennings-silisiumoksydpulver. Selvfølgelig er oppfinnelsen også anvendelig for plasmatiske oppløsninger som har vært underkastet slike behandlinger.

Avsaltingen og innstillingen av betingelsene for pH og ionestyrke kan særlig oppnås ved diafiltrering eller permeasjonskromatografering. Ved et spesielt aspekt av oppfinnelsen

gjennomføres avsaltingen ved permeasjonskromatografering over en porøs uorganisk bærer hvor porene er belagt med en film av hydrofil polymer som f.eks. et fornettet polyvinyllaktan. Den uorganiske bærer som anvendes for denne operasjon har fordelaktig en porediameter fra 40 til 300 A, en spesifikk overflate fra 100 til 800 m<2>/g og en kornstørrelse fra 4 um til 5 mm.

Belegget kan oppnås ved enkel adsorpsjon av polymeren på en bærer, men ved en foretrukket utførelsesform tilveiebringes belegget ved polymerisering in situ med en oppløsning av N-vinyllaktam, f.eks. N-vinylpyrrolidon, i nærvær av et polyfunksjonelt fornetningsmiddel valgt blant de tidligere om-talte forbindelser og på den måte som er beskrevet for frem-stillingen av kation-bytterharpiksen. Blant fornetnings-midlene anvendes foretrukket et silanderivat som tillater dannelse av en stabil binding mellom den uorganiske bærer og polyvinyllaktamet. Mengden av monomerer velges slik at det på overflaten av bæreren oppnås en polymerfilm av 1 til 15 mg/m<2>, foretrukket mellom 1 og 6 mg/m<2> idet mengden av fornetningsmiddel kan variere mellom 1 og 50 vekt% i forhold til den totale vekt av monomerene.

Ved svak ionestyrke kan euglobulin-innholdet fjernes fra plasmaet ved en pH omtrent 5, med etterfølgende sentrifugering og separering av oppløsningen av klaret plasma.

Ved. oppfinnelsen bringes plasmaoppløsningen i kontakt med minst en delvis hydrofob bærer og minst en hydrofil bærer. Den delvis hydrofobe bærer inneholder ikke nødvendigvis ionebyttergrupper men det er nødvendig å anvende minst en anionbytter-bærer og minst en kationbytterbærer. Fordelaktig kommer anionbytteren foran kationbytteren.

Ved en foretrukket utførelsesform for oppnåelse av et godt utbytte og et albumin med meget høy renhet er den delvis hydrofobe bærer en anionbytter og den hydrofile bærer er en kationbytter.

Ved en mer foretrukket utførelsesform gjennomføres separer-ingen ved at man forbinder to anionbyttere hvor av den ene kan være hydrofil og den annen være delvis hydrofob, med en hydrofil kationbytter. Rekkefølgen for passeringen gjennom de to sistnevnte bærere er likegyldig.

Fraksjoneringen av plasmaet innstilt med hensyn til ionestyrke og foretrukket klaret, foregår i rekkefølge med anionbytteren eller anionbytterne og med kationbytteren ved regu-lering av pH og ionestyrken slik at man enten selektivt fikserer albuminet eller de andre proteiner eller forurensninger .

F.eks. kan plasmaoppløsningen bringes i kontakt med den delvis hydrofobe anionbytter-bærer på forhånd ekvilibrert for fiksering av ført og fremst albuminet og alfa-globulinene ved en pH på minst 5. Ved eluering ved hjelp av en bufferoppløsning ved pH mellom 4,4 og 4,8 og passende valgt ionestyrke oppnås en oppløsning rik på albumin inneholdende de resterende alfa- og beta-globuliner. Som eksempel kan anvendes en pH på 4,7 og acetatbuffer 0,025 M. Den eluerte oppløsning, innstilt til en pH på mer enn 5,0 bringes deretter i kontakt med kationbytteren som på forhånd er ekvilibrert med en buffer med identisk pH og hvorpå er tilbakeholdt nesten hele mengden av andre proteiner enn albuminet.

Ved et annet utførelseseksempel bringes plasmaoppløsningen

i rekkefølge i kontakt med en hydrofil anionbytter, en delvis hydrofob bærer, foretrukket anionbytter og deretter en hydrofil kationbytter. pH og ionestyrken av oppløsningen reguleres som angitt tidligere for tilbakeholdelse av albuminet og

visse alfa- og beta-globuliner på den første hydrofile anionbytter. Etter eluering bringes oppløsningen inneholdende albuminet i kontakt med den delvis hydrofobe bærer hvorpå forskjellige forurensninger som lipoproteinene kan fikseres ved en pH fra 4,5 til 6,0 og foretrukket 4,7 til 5,2 med en acetatbuffer 0,025 til 0,06 M. Den eluerte oppløsning inneholdende albuminet renses til slutt på kationbytteren under betingelser som angitt tidligere.

Immunoglobulinene som passerer anionebytter-bæreren kan renses ved å bringes i kontakt med en annen ionebytterbærer ved å variere pH og ionestyrke i oppløsningen.

Ved et foretrukket tilfelle anvendes bærere på basis av uorganiske oksyder idet mengdene av anionbyttere kan være mellom 250 og 2000 ml for en liter plasma og mengden av kationbytter kan være mellom 200 og 1000 ml. Kontakttiden for oppløsningen med hver av ionebytterne er minst omtrent 15 minutter.

Oppfinnelsen tillater foredling av samtlige proteiner som inneholdes i det initiale plasma og oppnåelse av et albumin i oppløsning hvor renheten, bestemt ved elektroforese ved en konsentrasjon på 50 g/liter er minst 99% og kan gå opp i 100%. Analyse ved gelfiltrering viser fraværet av polymerer av albumin. Renheten av albuminoppløsningen kan bedømmes ved hjelp av immuno-precipiteringsteknikk. Spesielt ved teknikken med dobbelt immunodiffusjon på gelose kan man vise fraværet av lipoproteiner alfa 1 og beta. Spor av alfa 1 antitrypsin og haptoglobin som eventuelt kan påvises er uten ulemper for kvatliteten av albuminet. Denne albuminopp-løsning kan konsentreres ved hjelp av kjente metoder, f.eks. ved ultrafiltrering og deretter innstilles og stabiliseres for å bli underkastet en foreskrevet oppvarming i 10 timer ved 60°C for å bli injiserbar. De andre proteiner enn albuminet som er tilbakeholdt av ionebytterne kan elueres ved hjelp av en regenereringsoppløsning. Proteinene i blandingen inneholdt i utstrømnings-oppløsningen og regenereringsopp-løsningen kan endelig separeres det ene fra det annet ved hjelp av kromatografiske metoder.

Behandlingen av plasma kan gjennomføres posjonsvis og diskon-tinuerlig, halvkontinuerlig eller kontinuerlig med en serie av kolonner idet den siste mulighet er spesielt tilpasset for industrielle gjennomføringer. Den kontinuerlige prosess i kolonner tillater oppnåelse av en god produktivitet, et godt utbytte og en høyere renhet av produktene under meget gunstige sterilitetsbetingelser.

I det følgende illustreres oppfinnelsen ved hjelp av eksempler.

EKSEMPEL 1

Man fremstiller:

A - en bærer for eksklusionskromatografering ( GPC)

200 g silisiumoksyd med en kornstørrelse fra 40 til 100 um en spesifikk overflate på 400 m<2>/g, en midlere porediameter på 80 A og et porevolum på 1 ml/g tørkes ved 150°C under redusert trykk i 5 timer.

Det oppnådde tørkede silisiumoksyd innføres i en homogen oppløsning inneholdende 500 ml "Flugen 11" (CCI3 F) 160 ml N-vinylpyrrolidon, 30 ml vinyltrietoksysilan og 1 g dilaurylperoksyd. Flugen 11 avdampes ved vanlig temperatur og deretter oppvarmes det impregnerte silisiumoksyd ved 80°C i 17 timer for oppnåelse av fornetning.

Silisiumoksydet bringes deretter i suspensjon i 800 ml av-ionisert vann og holdes ved koking i 5 timer. Etter filtrering vaskes silisiumoksydet med av-ionisert vann, med aceton og tørkes deretter under vakuum ved 40°C. Analysen gir et karboninnhold på 12 vekt% i forhold til det belagte silisiumoksyd .

B - en anionbytter på bærer som utgjøres av et silisiumoksyd med en kornstørrelse fra 100 til 300 mikrometer, en spesifikk overflate på 25 m<2>/g, en midlere porediameter på 1250 Å, et porevolum på 1 ml/g, belagt med 3,6 mg/m<2> av kopolymer oppnådd ved fornetning av vinyltoluen og som bærer funksjonelle grupper N<+> (CH3)3 Cl<-> og med følgende egenskaper :

C - en kationbytter på bærer

100 g silisiumoksyd med kornstørrelse 100 til 300 mikrometer, en spesifikk overflate på 25 m<2>/g, en midlere pore-

diameter på 1250 A og et porevolum på 1 ml/g tørkes ved 150°C under redusert trykk i 5 timer.

Det oppnådde tørkede silisiumoksyd innføres i en oppløsning av 250 ml flugen 11 hvori det er homogenisert 50 ml N-vinylpyrrolidon, 2 ml akrylsyre, 15 ml vinyltrietoksysilan og 0,50 g dilaurylperoksyd. Etter avdamping av løsnings-midlet ved vanlig temperatur oppvarmes det impregnerte silisiumoksyd ved 80°C i 16 timer for oppnåelse av fornet-ningen.

Silisiumoksydet bringes deretter til suspensjon i 400 ml av-ionisert vann og holdes ved kokepunktet i 5 timer. Etter filtrering vaskes silisiumoksydet med av-ionisert vann, med aceton og tørkes deretter under vakuum ved 4 0°C.

Det svake kodede kationbytter-silisiumoksyd oppnådd på denne måte har følgende egenskaper: % C 6,05

% H 1,09

% N 0,3

Ionekapasitet: 0,20 mekv/g.

Mengde fiksert polymer: 3,2 mg/m<2>.

Forhåndsbehandlina av plasma.

I en kolonne med 2,6 cm diameter anbringes 100 g av bærer

A og holdes under trykk.

På denne kolonne innføres i rekkefølge i en takt av

30 ml/time, 200 ml natriumacetatbuffer 0,025 m, 60 ml friskt plasma fra en plasmaferesemodul og på nytt 100 ml acetatbuffer 0,025 M. Den totale mengde proteiner samles i 65 ml oppløsning hvor motstanden tilsvarer den anvendte buffer.

pH i proteinoppløsningen innstilles til 5,1 ved forsiktig tilsetning av en 6% eddiksyreoppløsning. De utfelte euglobuliner separeres ved sentrifugering.

Den således oppnådde proteinoppløsning har følgende egenskaper :

Motstand: 520 Q cmVcm

Totale proteiner: 4 3,8 g/liter med følgende sammensetning :

Fraksjonering av den plasmatiske oppløsning

I en kolonne I med diameter 1,6 cm anbringes 25 g anionbytter B og holdes under trykk. Kolonnen ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,025 M ved pH 5,1.

I en kolonne II ed diameter 1 cm anbringes 10 g anionbytter B og holdes under trykk. Denne kolonne ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,025 M ved pH 4,7.

I en kolonne III med diameter 1 cm anbringes 5 g kationbytter C og holdes under trykk. Denne kolonne ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,1 m ved pH 5,5.

I kolonnen I innføres i rekkefølge 58 ml av den forhånds-behandlende plasmatiske oppløsning med konstant tilfør-selstakt 70 ml/time, 100 ml natriumacetat-bufferoppløsning 0,025 M ved pH 5,1 og deretter en acetatbufferoppløsning 0,025 M ved pH 4,7.

Man gjenvinner 185 ml av en eluatoppløsning fra kolonne I hvor det totale proteininnhold er 8,8 g/l og med følgende sammensetning:

Ekstraksjonsutbyttet av albumin fra denne kolonne er 89,2 %.

130 ml eluat fra kolonne I innføres i en konstant takt på

40 ml/time i kolonne II. 110 ml acetatbuffer 0,025 M ved pH 4,7 injiseres deretter i kolonne II. Utstrømningsopp-løsningene og vaskeløsningene blandes til å gi en oppløsning med totalt proteininnhold 4,2 g/l med følgende sammensetning:

Ekstraksjonsutbyttet av albumin fra kolonne II er 91,4 %.

Oppløsningen samlet fra kolonne II innstilles til pH 5,5 og motstand 180 Q cm<2>/cm ved tilsetning av natriumklorid. 94 ml av denne oppløsning innføres i kolonne III i en takt på 40 ml/time. Kolonnen vaskes med 25 ml acetatbuffer 0,1 M ved pH 5,5. Utstrømningsoppløsningene og vaskeløsningene blandes for å gi en oppløsning hvor det totale proteininnhold er 3,0 g/l og med følgende sammensetning:

Ekstraksjonsutbyttet av albumin i denne kolonne III er 94%.

Ekstraksjonsutbyttet av albumin oppnådd ved hele fraksjoneringen er 76,6%.

Kolonnen I og II kan regenereres ved hjelp av en natrium-acetatbuf fer 1 M ved pH 4,0 mens kolonne III kan regenereres med en 0,5 M HCl-oppløsning.

Filtratet (eller utstrømningsoppløsningen) fra kolonnen I inneholdende 7 5% av gamma-globulinene og 25% av betaglobulin-ene med spor av alfa-globuliner innføres på kolonne IV, identisk med kolonne I, etter innstilling til pH 5,8 og en ionestyrke på 0,050 M. Man oppnår en oppløsning hvor renheten av gamma-globuliner er omtrent 100%. Den totale ekstraksjonsutbytte av gamma-globuliner er 80%.

EKSEMPEL 2

100 ml plasm lagret ved -40°C fra en plasmaferesemodul tines sakte ved +4°C og sentrifugeres for å fjerne bunnfallet inneholdende faktor VIII. Plasmaet oppnådd som supernatant

fra fryseutfellingen dialalyseres ved hjelp av diafiltrering mot en acetatbuffer 0,005 M ved pH 7,4. Etter surgjøring av oppløsningen til pH 5,1 ved hjelp av 6% eddiksyre og sentrifugering for å fjerne euglobulinene har den oppnådde protein-oppløsning følgende egenskaper:

Motstand: 1,066 cm<2>/cm

Totale proteiner: 39,4 g/liter med sammensetning:

Fraksjonering av plasma

58 ml av den ovennevnte proteinoppløsning injiseres i en takt på 70 ml/time på kolonnen I beskrevet i eksempel 1, inneholdende anionbytter B og som på forhånd er ekvilibrert med en natriumacetatbuffer 0,025 M ved pH 5,1.

Kolonnen vaskes med 10 0 ml av den samme bufferoppløsning og elueres deretter med en acetat-bufferoppløsning 0,025 M ved pH 4,5.

Det derved samlede eluat (125 ml) har totalt proteininnhold på 10,1 g/l med følgende sammensetning:

Ekstraksjonsutbyttet av albumin fra denne kolonne er 7 8%.

50 ml eluat injiseres i konstant takt på 40 ml/time på en annen kolonne identisk med kolonnen III i eksempel 1 inneholdende kationbytter C og som på forhånd er ekvilibrert med en acetatbuffer 0,1 M ved pH 5,5. Kolonnen vaskes med 15 ml av den samme buffer. Utstrømningsoppløsningene og vaske-løsningene blandes til å gi en oppløsning med totalt proteininnhold 7,27 g/l med følgende sammensetning:

Utbyttet av albumin fra denne kolonne er 97,5%, det totale ekstraksjonsutbytte av albumin oppnådd ved fraksjoneringsmetoden er 7 6%.

EKSEMPEL 3

100 ml bovint plasma oppnådd ved sentrifugering dialyseres ved diafiltrering mot en acetatbuffer 0,005 M ved pH 7,4.

Den oppnådde proteinoppløsning har etter fjernelse av euglobulinene, som beskrevet i de foregående eksempler en motstand på 1,64 cm<2>/cm og et totalt proteininnhold på 93,1 g/l med følgende sammensetning:

58 ml av denne proteinoppløsning injiseres i en takt på

7 0 ml/timer på kolonnen I beskrevet i eksempel 1 inneholdende anionbytter B og ekvilibrert med en acetatbuffer 0,025 M ved pH 5,1. Kolonnen behandles som i det foregående eksempel. Det samlede eluat (167 ml) inneholder 7,5 g/l proteiner har følgende sammensetning: 67 ml eluat injiseres deretter i en takt på 40 ml/time på en annen kolonne identisk med kolonnen III beskrevet i eksempel I og som inneholder kationbytter og som er ekvilibrert med en acetatbuffer 0,1 M ved pH 5,5. Kolonnen vaskes med 23 ml av den samme buffer.

Elueringsløsningene og vaskeløsningene blandes og man oppnår en oppløsning med totalt proteininnhold 5,1 g/l og med føl-gende sammensetning:

Utbyttet av albumin oppnådd ved fraksjoneringsmetoden er 75,6%.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av olasmatisk oppløsning

250 ml plasma tines ved 37°C, innstilles til pH = 5,2 med konsentrert HC1 og dialyseres mot 60 ml fosfatbuffer 0,01 M ved pH = 5,2.

Etter sentrifugermg oppnås 29 3 ml av en plasmatisk opp-løning ved en total proteinkonsentrasjon på 3 5,5 g/l med følgende sammensetning:

Fraksjonering

Man etablerer i serie:

en kolonne I (diameter = 1,6 cm) inneholdende 15 g del vis hydrofob anionbytter-bærer B beskrevet i eksempel 1 en kolonne II (diameter = 1 cm) inneholdende 5 g av den

samme anionbytter B,

en kolonne III (diameter = 1 cm) inneholdende 5 g kationbytterbærer som utgjøres av et silisiumoksyd med kornstørrelse fra 100 til 300 um, en spesifikk overflate på 32 m<2>/g, en midlere porediameter på 1150 A og et porevolum på 1,2 ml/g, belagt med 5 mg/m<2> av en kopolymer av N-vinylpyrrolidon-akrylsyre. Denne bærer er fremstilt på samme måte som beskrevet i eksempel 1 for kationbytteren C under modifisering av monomer-mengden. Den har følgende egenskaper:

35 ml plasmatisk oppløsning fremstilt i det foregående injiseres i en takt på 60 ml/time på kolonnen I som på forhånd ekvilibrert med en acetatbuffer 0,025 M ved pH = 5,2. Etter å ha vasket kolonnen 65 ml av ekvilibreringsbufferoppløs-ningen injiseres i samme takt (60 ml/time) en acetatbuffer 0,025 M med pH 4,7. Den eluerte oppløsning 160 ml (proteinkonsentrasjon 3,72 g/l) inneholder 92,5% albumin. 3% alfa-globuliner og 4,5% beta + gamma-globuliner. En delfraksjon (138 ml) av den eluerte oppløsning injiseres i takt på 4 0 ml/timer på kolonnen II som er på forhånd er ekvilibrert med acetatbufferen 0,025 M med pH 4,7. Kolonnen vaskes med 22 ml av den samme bufferløsning. Blandingen av utstrøm-ningsoppløsningene og vaskeløsningene med proteinkonsentrasjon 3,06 g/liter inneholder 93,6% en albumin, 2,5% alfa-globuliner og 3,5% beta-globuliner.

En delfraksjon (140 ml) av de foregående oppløsninger innstilles til pH 5,5 ved tilsetning av NaOH og med en motstand på 270 Q cm<2>/cm ved tilsetning av NaCl IM og deretter injiseres i en takt på 20 ml/time på kolonnen III som på forhånd er ekvilibrert med en acetatbuffer 0,05 M med pH 5,5. Kolonnen vaskes med 25 ml av den samme bufferløsning.

Elektroforesen gjennomført med den oppkonsentrerte blanding av utstrømningsoppløsninger og vaskeløsninger viser fravær av uenigheter som forurenser albumin (albumin 100%).

Det totlae utbytte er 71% i forhold til albuminet inneholdt

i den plasmatiske utgangsløsning.

Kolonnen I, II og III regenereres med vasking med en opp-løsning HC1 0,1 N, destillert vann henholdsvis bufferløsning.

EKSEMPEL 5

Man fremstiller:

A - en hydrofil anionbytter på porøs uorganisk bærer benevnt "anionbytter E".

100 g porøst silisiumoksyd ("SPHEROSIL XOB 015) med korn-størrelse 100-200 u, spesifikk overflate 30 m<2>/g, midlere porediameter 1250 Å, porevolum 1 ml/g tilsettes 200 ml av en vandig oppløsning av 7,5% DEAE Dextran innstilt til pH 11,5 ved tilsetning av natriumhydroksyd.

Pastan tørkes i platetørkeskap ved 80°C i 15 timer. Det oppnådde pulver tilsettes 300 ml av en 0,15% oppløsning av 1-4 butan diol-diglycidyleter i etyleter. Eteren avdampes under en strøm av nitrogen ved vanlig temperatur. Fornet-ningsreaksjonen gjennomføres deretter ved oppvarming ved 80°C i 15 timer.

Før anvendelsen vaskes denne bærer med følgende oppløsning: 10 volum NaOH 0,1 N, 10 volum HC1 0,1 N og 10 volum etylalkohol og tørkes deretter for lagring før anvendelsen.

Man oppnår 115 g pulver inneholdende 13% DEAE Dextran

og som kan binde 0,2 mekv Cl-ioner pr. gram.

B - en delvis hyrofob anionbytter på porøst uorganisk bærer, benevnt "anionbytter F". Utgangsbæreren fremstilles som A i det foregående, men inneholder bare 5,7% DEAE Dextran til slutt.

100 g bærer oksyderes med 500 ml av en vandig oppløsning av 0,05 M natriummeta-periodat NaIC>4 inneholdende 10 g/l NaCl, i 2 timer ved vanlig temperatur. Etter vaskinger med en oppløsning av 10 g/l NaCl og deretter etylalkohol tørkes produktet under nitrogehstrøm ved 40°C.

100 g oksydert bærer tilsettes 100 ml av en 6% oppløsning av heksadecylamin i etylalkohol og hensettes ved vanlig temperatur i 48 timer.

Reduksjonen av iminbindingen dannet derved til aminbinding gjennomføres ved tilsetning av natriumborhydrid NaBH4 for oppnåelse av en konsentrasjon på 0,2 M i nærvær av 50% vann. Etter vaskinger med alkohol og gjentatte ganger med 0,1 NHC1 tørkes den vaskede bærer for lagring før anvendelse.

Forbehandling av plasma

200 ml humant plasma forhåndsvaskes med natriumcitrat tilsettes 200 ml av en vandig 16% etanoloppløsning ved 0°C. Det dannede bunnfall fjernes ved sentrifugering. Supernatanten surgjøres (med NHC1) ved pH 5,25 ved 4°C. Etter to timer fjernes det dannede bunnfall ved sentrifugering og

supernatanten diafiltreres i en ultrafiltreringscelle for ekvilibrering med en fosfatbuffer 0,01 M pH 5,25. Bunnfallet av euglobuliner fjernes på nytt ved sentrifugering og den oppnådde supernatant filtreres gjennom membran med porøsitet 0,2 pm. Motstanden er 1200 fi cm<2>/cm.

Fraksjonering av plasmatisk oppløsning

En kolonne I med diameter 2,5 cm ifylles 50 g (105 ml)

av anionbytter E. Kolonnen ekvilibreres med en natrium-fosfatbuffer 0,01 M ved pH 5,25.

En kolonne II med diameter 2,5 cm ifylles 30 g (63 ml)

anionbytter F. Kolonnen ekvilibreres med en natrium-acetatbuf fer 0,054 M ved pH 5.

En kolonne III med diameter 2,5 cm ifylles 60 g (126

ml) kationbytter D beskrevet i eksempel 4. Kolonnen ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,054 M ved pH 5,5.

Den klarede oppløsning tilsvarende 200 ml plasma, oppnådd i henhold til den tidligere beskrevne forbehandling, innføres i kolonne I i en takt på 400 ml/time. Kolonnen overhelles med 200 ml fosfatbuffer 0,01 m ved pH 5,25, hvoretter det fikserte albumin elueres med 500 ml acetatbuffer 0,025 M

pH 4,7. Eluatet samles med volum 400 ml.

Det derved oppnådde eluat innstilles til pH ved tilsetning av NaOH N og tilsettes deretter NaCl for å oppnå en motstand på 270 Q. cm<2>/cm. Denne oppløsning innføres på kolonne II i en takt på 100 ml pr. time. Hoveddelen av albuminet fikseres ikke under disse betingelser og passerer gjennom kolonnen sammen med filtratet. Kolonnen overhelles med 120 ml natriumacetat 0,054 M pH 5.

Blandingen inneholdende albuminet innstilles til pH 5,5 ved tilsetning av NaOH og innføres på kolonnen III i en takt på 200 ml/time. Kolonnen overhelles 200 ml natriumacetatbuffer 0,054 M pH 5,5. Utstrømningsoppløsningene blandes og konsentreres ved ultrafiltrering over en membran "AMICON" PM 10 for oppnåelse av en konsentrasjon på 50 til 200 g/l. Renheten av albuminoppløsningen med 5 0 g/l bedømmes ved elektroforese og immunoelektroforese på celluloseacetat under betingelsene i samsvar med farmakopea. Den er 100%. Analysen ved dobbelt immunodiffusjon på gelose overfor spesifikke antiserum for diverse plasmatiske proteiner tillater påvisning av fravær av proteinforurensninger og spesielt alfa- og beta-lipoproteiner. Når den endelige konsentrasjon av det rensede albumin er 130 g/l kan spor av alfa 1 antitrypsin og haptoglobin som ikke kommer tilsyne ved elektroforese detekteres ved dobbelt immunodiffusjon overfor tilsvarende antiserum.

Nærværet av disse spor av forurensninger er vanlig og uten følger for stabiliteten av den endelige albuminoppløsning, eller for dens gode toleranse ved intravenøs tilførsel i dyr eller mennesker.

Resultatene vedrørende utbyttet og renheten av albumineter anført i tabell I.

Alle de tre kolonner kan vaskes med en acetatoppløsning

0,1 M pH 4 eller NaCl 20 g/l for å gjenvinne det tilbake-holdte albumin for resirkulasjon i den etterfølgende syklus eller i en egen behandling.

Kolonnene regenereres deretter ved påfølgende vaskinger

med HCl 0,01 N og etanol 60%. De kan eventuelt steriliseres periodisk med vandig formolløsning 2%.

EKSEMPEL 6

I dette eksempel anvendes en hydrofil anionbytter-bærer,

en hydrofob anionbytter-bærer og en hydrofil kationbytter-bærer.

Man anordner i serie:

en kolonne I (diameter = 1,6 cm) inneholdende 14 g anionbytter-bærer E beskrevet i eksempel 5. Kolonnen

ekvilibreres med en fosfatbuffer 0,01 M ved pH 5,2

en kolonne II identisk med kolonne II i eksempel 4

inneholdende anionbytter B

en kolonne III identisk med kolonne III i eksempel 4

inneholdende kationbytter D.

Man går frem som i eksempel 4 fra 61 ml av den samme plasmatiske oppløsning og under anvendelse av de samme bufferopp-løsninger for eluering av kolonnen I og vasking av kolonnene II og III.

Strømningstakten i kolonnene I, II og III er henholdsvis

60 ml/time, 20 ml/time og 20 ml/time.

Analysen ved elektroforese av den endelige oppløsning, konsentrert til 50 g/l, viser fraværet av urenheter som forurenser albuminet. Kontroll ved dobbelt immunodiffusjon av den konsentrerte oppløsning til 130 g/l viser fraværet av enhver proteinforurensning.

Prosentinnhold av albumin og utbytter fra kolonnene er opp-ført i tabell I.

EKSEMPEL 7

Man går frem som i eksempel 6 men med omvendt rekkefølge for kolonnene II og III.

Eluatet fra kolonne I innstilles til pH = 5,5 med NaOH

og til en motstand på 270 Cl cm<2>/cm med NaCl 1 M for injeksjon i kolonne II.

Oppløsningen (utstrømning + vaskeløsning) fra kolonne II innstilles til pH = 4,7 med HC1 1 N for innføring i kolonne

III.

Strømningstaktene er 60 ml/time, 20 ml/time og 20ml/time

i de respektive kolonner.

Analyse ved elektroforese i immunodiffusjon av den endelige oppløsning, konsentrert til 130 g/l viser fravær av urenheter som forurenser albuminet.

Resultatene, prosent av albumin og utbytte, er oppført

i tabell I.

EKSEMPEL 8

Man går frem som i eksempel 6 men kolonne II erstattes med en ny kolonne II inneholdende en delvis hydrofob bærer uten ionebytterkarakter. Denne bærer utgjøres av et silisiumoksyd med en kornstørrelse fra 100 til 300 Q. um, en spesifikk overflate på 25 m<2>/g, en midlere porediameter på 1250 Å og et porevolum på 1 ml/g belagt med 3,3 mg/m<2> av en fornettet vinyltoluen-vinyltrietoksysilan-polymer og med et karboninnhold på 7,3%.

Kolonnen II ekvilibreres med 50 ml 95% etanol og deretter med 50 ml av en acetat-bufferløsning 0,025 M ved pH 4,7.

Strømningstakten i kolonnen I, II og III er henholdsvis

60 ml/time, 20 ml/time og 20 ml/time.

Utstrømningsoppløsningen fra kolonnen III inneholder 99,3% albumin og 0,7% alfa-globuliner.

Resultatene er oppført i tabell I.

EKSEMPEL 9

Man arbeider under de samme betingelser som i eksempel 5 men erstatter kolonnen III med en kolonne med CM "SEPHAROSE" CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, UppsalaSverige) med samme tverrmål og under de samme arbeidsbetingelser. Resultatene fremgår av tabell I.

EKSEMPEL 10

Man går frem med de samme betingelser som i eksempel 6 men erstatter kolonnen III med en kolonne av CM "Trisacryl-M"

(Réactifs IBF, Société POINTET-GIRARD å Villeneuve la Garenne, Frankrike) med samme diameter og med de samme arbeidsbetingelser.

Resultatene fremgår av tabell I.

EKSEMPEL 11

Man går frem under de samme betingelser som i eksempel

9 men erstatter kolonne I med en kolonne av DEAE "Sepharose" CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala Sverige) med samme diameter og under de samme anvendelsesbetingelser.

Resultatene fremgår av tabell I.

EKSEMPEL 12

Man arbeider under de samme betingelser som i eksempel 10 men erstatter kolonne I med en kolonne av DEAE "Trisacryl M" (Réactifs IBF, Société POINTET-GIRARD å Villeneuve La Garenne, Frankrike) med samme diameter og de samme arbeidsbetingelser .

Resultatene fremgår av tabell I.

EKSEMPEL 13

En kolonne I med diameter 2,5 cm ifylles 100 g (210 ml)

ionebytter E beskrevet i eksempel 5. Kolonnen ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,025 M pH 5,25.

En kolonne II med diameter 2,5 cm ifylles 63 ml "SEPHAROSE" CL 4B podet med heksadecylamin og ekvilibrert med natriumacetat 0,054 M pH 5. Podningen av heksadecylaminet gjennomføres ved hjelp av bromcyan-metoden i henhold til følgende: 100 ml "SEPHAROSE" CL 4B vaskes med av-ionisert vann ved hjelp av 3 etterfølgende avhellinger og tilsettes 200 ml vann. pH holdes ved 11 ved kontinuerlig tilsetning av natriumhydroksyd (NaOH), og 9 g BrCN tilsettes. Reaksjonen varer omtrent 15 minutter. Når pH ikke lenger forandres renses bæreren med 0,1 M bikarbonat og deretter med 9 5% etylalkohol. 20 g heksadecylamin oppløst i 200 ml alkohol tilsettes bæreren ved 40°C og reaksjonen foregår i 15 timer.

Til slutt vaskes bæreren flere ganger etter hverandre med oppløsninger av HC1 0,1 N og 9 5% alkohol og ekvilibreres deretter som angitt.

En kolonne III med diameter 2,5 cm ifylles 60 g (126 ml)

kationbytter D beskrevet i eksempel 4. Kolonnen ekvilibreres med en natriumacetatbuffer 0,054 M pH 5,5.

Forbehandling av humant plasma

200 ml supernatant fra fryse-utfellingen tilsettes 200 ml av en vandig etanoloppløsning 16% ved 0°C. Det dannede bunnfall fjernes ved sentrifugering. Supernatanten surgjøres (med HC1 N) til pH 5,25 ved + 4°C. Etter 2 timer fjernes det dannede bunnfall ved sentrifugering og supernatanten diafiltreres i en ultrafiltreringscelle for ekvilibrering med en acetatbuffer 0,025 M pH 5,25. Euglobulin-bunnfallet fjernes på nytt ved sentrifugering og den oppnådde supernatant filtreres gjennom membran med porøsitet 0,2 um. Motstandene 600 cm<2>/cm. Oppløsningen innføres i kolonne I i en takt på 400 ml/time. Kolonnen renses med 200 ml acetatbuffer 0,025 M pH 5,25 og deretter elueres ved fikserte albumin med 400 ml acetatbuffer 0,025 M pH 4,7. Eluatet samles med volum 350 ml.

Det derved oppnådde eluat innstilles til pH 5 ved tilsetning NaOH og tilsettes NaCl for å oppnå en motstand på 27 0 Q cm<2>/cm. Oppløsningen injiseres på kolonne II i en takt på 100 ml/time.

En ikke uvesentelig albuminmengde fikseres i kolonnen og nedsetter utbyttet med 20 til 30% i forhold til bærere anvendt i kolonne II i de foregående eksempler. Oppløs-ningen som passerer gjennom kolonnen inneholder albumin og noe alfa- og beta-globuliner. Kolonnen renses med 120 mi natriumacetat 0,054 M pH 5. Blandingen inneholdende albumin innstilles til pH 5,5 ved tilsetning av NaOH og injiseres på kolonne III i en takt på 200 ml/time. Kolonnen fylles med 200 ml natriumacetatbuffer 0,054 M pH 5,5. De utstrømmende løs-ninger blandes og konsentreres ved ultrafiltrering på en membran "AMICON" PM 10 for oppnåelse av konsentrasjon på

50 g/l.

Renheten av oppløsning, bedømt ved elektroforese på celluloseacetat under betingelsene i farmakopea er 99,1% og kan da betraktes som tilfredsstillende etter gjeldende normer. Analyse ved dobbelt immunodiffusjon på gelose overfor spesifikke antiserum for diverse plasmatiske proteiner tillater detektsjon av nærvær av følgende urenheter: transferin, alfa 1, antitrypsin, alfa 2 makroglobulin, haptoglobulin.

De tre kolonner kan regenereres og steriliseres mellom hver cyklus som i de foregående eksempler.

De totale utbytte ved denne renseprosess er bare 55%. Resultatene fremgår av tabell I.

EKSEMPEL 14 ( sammenlikning)

Man arbeider under de samme betingelser som i eksempel 13 men erstatter kolonnen II med hydrofob "SEPHAROSE" med en kolonne med hydrofil anionbytter E, under de samme arbeidsbetingelser. De oppnådde resultater (se tabell I)

er forskjellige fra resultatene ved de foregående eksempler. Renheten av det endelige albumin er lavere enn 99%. Man detekterer spesielt det systematiske nærvær av alfa 1 lipoprotein som påvirker stabiliteten av den endelige albuminoppløsning særlig ved oppvarming til 60°C.

Dette eksempel viser nødvendigheten av å inkludere et filt-reringstrinn på en delvis hydrofob bærer for oppnåelse av en albumin ved meget høy renhet.

Claims

1. Fremgangsmåte for fraksjonering av plasmaproteiner i en oppløsning av plasma ved hjelp av ionebyttere av anionisk og kationisk type, karakterisert ved at en plasmaoppløsning bringes i kontakt med minst en delvis hydrofob bærer som eventuelt har ionebytterkarakter, og minst en hydrofil ionebytterbærer, idet det som bærer anvendes naturlige polysakkarid-polymermatrikser, syntetiske polymermatrikser, uorganiske oksyder belagt med en polysakkaridpolymer eller uorganiske oksyder belagt med en film av fornettet syntetisk polymer.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som hydrofil ionebytterbærer anvendes minst en kationbytter.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som delvis hydrofob bærer anvendes minst en anionbytter og at det som hydrofil bærer anvendes minst en kationbytter.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at plasmaløsningen bringes i kontakt med to anionbytter-bærere hvorav den ene kan være hydrofil og den annen er delvis hydrofob, og med en hydrofil kationbytter-bærer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den hydrofile anionbytter er anordnet foran den delvis hydrofobe anionbytter.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 5, karakterisert ved at det som delvis hydrofob bærer anvendes polysakkarid-polymerer modifisert ved fiksering av et hydrofobt radikal, syntetiske polymere absorpsjonsmidler, uorganiske oksyder belagt med en polysakkaridpolymer modifisert ved fiksering av et hydrofobt radikal eller uorganiske oksyder belagt med en film av hydrofob fornettet polymer.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 5, karakterisert ved at det som hydrofil bærer anvendes polysakkarid-polymerer, hydrofile syntetiske polymerer som er uoppløselige i vann, uorganiske oksyder belagt med en polysakkarid-polymer eller uorganiske oksyder belagt med en film av hydrofil fornettet polymer.

8. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 5-7, karakterisert ved at det anvendes et porøst uorganisk oksyd med en kornstørrelse fra 4 um til 5 mm, en porediameter på 250 til 3000 A og en spesifikk overflate fra 5 til 150 m<2>/g, foretrukket med en kornstørrelse fra 50 um til 1 mm, en porediameter fra 600 til 1500 Å og en spesifikk overflate fra 20 til 50 g/m<2>.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 hvor det anvendes minst en anionbytter og minst en kationbytter, karakterisert ved at ionebyttere med ionebytterkapasitet på under 2 mekv/g og utgjøres av en porøs uorganisk bærer med kornstørrelse 4 um til 5 mm, en porediameter fra 500 til 2500 A, og en spesifikk overflate fra 5 til 150 m<2>/g og som er belagt med opptil 15 mg/m<2> av en hydrofob fornettet polymerfilm som inneholder eller bærer amingrupper eller kvaternære ammoniumsaltgrupper for minst en av ionebytterne og belagt med en film av fornettet polyvinyllaktam med karboksylsyregrupper som minst en annen ionebytter.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at plasmaløsningen, foretrukket til å begynne med, bringes i kontakt med en porøs uorganisk bærer med de nevnte egenskaper belagt med en polysakkaridpolymer som bærer amingrupper eller kvaternære ammoniumsalt-grupper.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at det anvendes en kationbytterbærer som på overflaten er påført et polyvinyllaktam oppnådd ved kopolymerisering av vinyllaktam, særlig N-vinylpyrrolidon, og en umettet karboksylsyre, særlig akrylsyre, i nærvær av et polyfunksjonelt fornetningsmiddel.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, karakterisert ved at det som fornetningsmiddel anvendes et silanderivat med formel CH2=CH - SiX3-

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at det anvendes en anionbytterbærer som på overflaten er påført en fornettet polymer oppnådd fra en vinylaromatisk monomer.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-13, karakterisert ved at det anvendes anionbyttere i en mengde mellom 250 og 2000 pr. liter plasma og kationbyttere i en mengde mellom 200 og 1000 ml pr. liter plasma.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-14, karakterisert ved at den gjennomføres kontinuerlig i en serie av kolonner.