MX2011000666A - Metodo para preparar inhibidor de alfa-1 proteinasa. - Google Patents

Abstract

La purificación del inhibidor de a-1 proteinasa (a-1 PI) a partir de soluciones que comprenden a-1 Pl se logra utilizando cromatografía por interacción hidrófoba (HIC); en algunas modalidades, la purificación de a-1 IP se lleva a cabo mediante precipitación de las proteínas contaminantes de una solución inicial que comprende a-1 IP, tal como plasma de humano, seguido por cromatografía en resina de intercambio aniónico antes de HIC; la mayor purificación se puede lograr mediante una cromatografía de intercambio catiónico opcional subsecuente a la cromatografía de intercambio aniónico, pero antes de HIC; algunas modalidades de la invención también incluyen la eliminación del virus y/o inactivación por métodos tales como nanofiltración y tal como el contacto con un detergente no iónico; los métodos de la presente invención resultan en un mayor rendimiento, pureza y eliminación de patógenos a partir de las fracciones de plasma en comparación con los métodos conocidos.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR INHIBIDOR DE ALFA-1 PROTEINASA REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama prioridad a la Solicitud Provisional de los E.U.A. No. 61/081 ,907, presentada el 18 de julio de 2008 que se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporciona un método para purificar inhibidor de alfa-1 proteinasa (a-1 Pl) utilizando cromatografía incluyendo la cromatografía por interacción hidrófoba (HIC). En este método, una solución que comprende a-1 Pl se sometió a cromatografía por interacción hidrófoba (HIC). La HIC puede ser precedida y/o seguida por uno o más de otros pasos de purificación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN a-1 Pl es una glucoproteína con un peso molecular de aproximadamente 55,000 Daltones. La proteína es una cadena polipeptídica única a la que varias unidades de oligosacáridos se unen covalentemente. a-1 Pl actúa como un inhibidor de las proteinasas endógenas, tales como la tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática, colagenasa de la piel, renina, uroquinasa y proteinasas de los linfocitos polimorfonucleares. a-1 Pl actualmente se utiliza terapéuticamente para tratar personas que tienen una deficiencia de origen genético de a-1 Pl. En dicha condición, a-1 Pl se administra para inhibir a la elastasa de linfocitos en los pulmones. La elastasa de los linfocitos descompone las proteínas extrañas en los pulmones. Cuando a-1 Pl no está presente en cantidades suficientes para regular la actividad de la elastasa, la elastasa descompone el tejido pulmonar. Con el tiempo, este desequilibrio produce daño crónico en el tejido pulmonar y enfisema, a-1 Pl ha sido utilizado con éxito para tratar esta forma de enfisema.

La demanda de a-1 Pl típicamente supera el suministro disponible, a-1 IP para uso terapéutico actualmente se purifica de plasma de humano. Esta fuente de la proteína es limitada, lo que contribuye al bajo suministro. Con el fin de maximizar el suministro disponible de a-1 Pl, un proceso para purificar a-1 Pl a partir de plasma de humano debe tener el mayor rendimiento posible. La pureza de a-1 Pl aislado de plasma de humano también es fundamental, debido a que las trazas de impurezas pueden estimular la respuesta inmune en los pacientes que están recibiendo a1 Pl. Finalmente, el proceso de purificación de a-1 Pl a partir de plasma de humano utilizando las técnicas actuales requiere una gran cantidad de tiempo, para la separación de a-1 PI a partir de otras proteínas, virus, etc. Todos estos factores (es decir, los bajos rendimientos, largos tiempos de producción y baja pureza), contribuye al suministro inadecuado de a-1 Pl.

Es necesario un método eficaz a escala industrial para la purificación de a-1 Pl que mejore el rendimiento y la pureza de a-1 Pl.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona un método de purificación del inhibidor de alfa-1 proteinasa en una solución acuosa que comprende inhibidor de alfa-1 proteinasa y otras proteínas. El método comprende: a) ajustar el pH, fuerza iónica y la concentración de proteína de la solución acuosa de manera que el inhibidor de alfa-1 proteinasa activo no se une a una resina de intercambio iónico, pero otras proteínas en la solución se unen; b) pasar la solución a través de la resina de intercambio iónico y recolectar un flujo a través que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y c) poner en contacto el flujo a través del paso b) con un adsorberte hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de purificación del inhibidor de alfa-1 proteinasa a partir de una solución acuosa que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, el método comprendiendo: a) eliminar una porción de las proteínas contaminantes a partir de la solución acuosa mediante precipitación con el fin de obtener una solución purificada que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa; b) pasar la solución purificada a través de una resina de intercambio aniónico de manera que el inhibidor de alfa-1 proteinasa se une a la resina de intercambio aniónico; c) eluir el inhibidor de alfa-1 proteinasa a partir de la resina de intercambio aniónico para obtener una solución eluída que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa; d) pasar la solución eluída a través de una resina de intercambio catiónico; e) recolectar un flujo a través a partir de la resina de intercambio catiónico que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y f) poner en contacto la solución eluída del paso c) o el flujo a través del paso e) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

En algunos aspectos, la presente invención proporciona un método de purificación del inhibidor de alfa-1 proteinasa en una solución acuosa que comprende inhibidor de alfa-1 proteinasa y otras proteínas, el método comprendiendo: a) ajustar el pH, fuerza iónica y la concentración de proteína de la solución acuosa; b) pasar la solución a través de una resina de intercambio iónico y recolectar un flujo a través que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y c) poner en contacto el flujo a través del paso b) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

En otros aspectos, la presente invención proporciona inhibidor de alfa-1 proteinasa purificada y/o composiciones que comprenden inhibidor de alfa-1 proteinasa, en donde el inhibidor de alfa-1 proteinasa se purifica utilizando los métodos descritos por la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "absorbente", tal como se usa en la presente invención, se refiere a por lo menos una molécula fijada en un soporte sólido, o por lo menos a una molécula que es, en sí, un sólido que se utiliza para realizar la cromatografía, tal como la cromatografía por interacción hidrófoba. En el contexto de la cromatografía por interacción hidrófoba, el adsorbente es un grupo funcional hidrófobo.

"Cromatografía" es la separación de las moléculas químicamente distintas en una mezcla entre sí mediante el contacto de la mezcla con un adsorbente, en donde una clase de moléculas se une de forma reversible o se adsorbe en el adsorbente. Las moléculas que son por lo menos fuertemente adsorbidas o retenidas por el adsorbente se liberan del adsorbente en condiciones en las que aquellas más fuertemente adsorbida o retenida no lo son.

Cualquiera o todos los pasos cromatográficos de la presente invención se pueden llevar a cabo por una variedad de técnicas mecánicas (también referidas como métodos o procedimientos). La cromatografía se puede llevar a cabo, por ejemplo, en una columna. La columna se puede hacer funcionar con o sin presión y de arriba a abajo o de abajo hacia arriba. La dirección del flujo de fluido en la columna se puede invertir durante el proceso de cromatografía. La cromatografía también se puede llevar a cabo utilizando un proceso por lote en el que los medios sólidos se separan del líquido utilizado para cargar, lavar y eluír la muestra mediante cualquier método adecuado, incluyendo la gravedad, centrifugación o filtración. La cromatografía también se puede realizar al poner en contacto la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moléculas de la muestra con más fuerza que otras.

Así, aunque las vahas modalidades de la presente invención se pueden describir en el contexto de la cromatografía que se lleva a cabo en una columna, por ejemplo, se entiende, sin embargo, que el uso de una columna no es más que una de las varias modalidades de cromatografía que se pueden utilizar, y la ilustración de la presente invención, utilizando una columna no limita la aplicación de la presente invención a la cromatografía en columna, puesto que aquellos expertos en la técnica fácilmente pueden aplicar las enseñanzas a otras modalidades también, tales como aquellas que utilizan un proceso por lote o filtro.

"Cromatografía por interacción hidrófoba (HIC)" es cromatografía que utiliza las interacciones hidrófobas reversibles específicas de las biomoléculas en una solución acuosa salina como una base para la separación de proteína.

El término "contaminante", como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier molécula extraña o censurable, en particular, una macromolécula biológica tal como un ADN, un ARN, o una proteína, que no sea la proteína blanco a ser purificada que está presente en una muestra de una proteína blanco a ser purificada. Los contaminantes incluyen, por ejemplo, proteínas no deseadas en un fluido biológico, proteínas de la célula hospedera de las células utilizadas para expresar la proteína blanco a ser purificada, proteínas que son parte de un absorbente usado en un paso de cromatografía por afinidad que puede filtrarse dentro de una muestra durante el paso previo a la cromatografía por afinidad, y variantes mal plegadas, dímeros o agregados de la proteína blanco mismo.

La presente invención proporciona un método novedoso para la preparación de a-1 Pl, en donde el método incluye un paso de purificación ortogonal que incluye la cromatografía por interacción hidrófoba (HIC) para proporcionar un rendimiento general sorprendentemente alto y una pureza del producto a-1 Pl.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de purificación de inhibidor de alfa-1 proteinasa en una solución acuosa que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa y otras proteínas, el método comprendiendo: a) ajustar el pH, fuerza iónica y concentración de proteína de la solución acuosa; b) pasar la solución a través de una resina de intercambio iónico y recolectar un flujo a través que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y c) poner en contacto el flujo a través del paso b) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de purificación de a-1 IP en una solución acuosa que comprende a-1 IP y otras proteínas. El método comprendiendo: a) ajustar el pH, fuerza iónica y concentración de proteína de la solución acuosa de manera que a-1 IP activo no se una a una resina de intercambio iónico, sino que se una a otras proteínas en la solución; b) pasar la solución a través de la resina de intercambio iónico y recolectar una solución de un flujo a través que contiene a-1 IP; y c) poner en contacto la solución del flujo a través del paso b) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC. En una modalidad, la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio iónico fuerte.

En una modalidad, los pasos a) y b) se proporcionan para la purificación de a-1 IP a partir de soluciones acuosas que contienen proteína mediante cromatografía de flujo a través en los medios para cromatografía de intercambio catiónico en condiciones de pH, fuerza iónica y concentración de proteína suficientes para asegurar que a-1 IP activo no se una a los medios (o resina de intercambio iónico), mientras que otras proteínas, incluyendo a-1 IP inactivo (o desnaturalizado) se unen a los medios (o resina de intercambio iónico). La influencia del pH, fuerza iónica, y concentración de proteína sobre la unión de a-1 IP a una resina de intercambio catiónico se establecen en las Patentes de E.U.A. No. 5,610,285, la descripción total de la cual se incorpora como referencia en la presente invención. Además, la cromatografía de intercambio iónico se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,462,180, la descripción total de la cual se incorpora como referencia en la presente invención.

En modalidades preferidas, el método incluye los siguientes pasos: (1 ) la solución de proteína se dializó o diafiltró hasta una fuerza iónica de aproximadamente 0.1 a 10 mmho/cm, (2) el pH de la solución se ajusta a aproximadamente <6.0; (3) la solución de proteína se ajusta a aproximadamente < 10 mg proteína/mL, (4) la solución se pasa a través de una resina para cromatografía de intercambio catiónico, y (5) la fracción del flujo a través (por ejemplo, la solución del flujo a través del paso (b) anteriormente mencionado) de la cromatografía se recolectó como a-1 IP purificado.

El procedimiento es lo suficientemente versátil de manera que la cromatografía catiónica funcionará en cualquier número de materias primas, que van desde Fracción Cohn del Efluente II + III, Fracción Cohn de la pasta IV-1 (una materia prima actualmente preferida) y a-1 IP purificado, y aún así producir un producto sustancialmente purificado.

Como una opción para la producción a gran escala de productos farmacéuticos, una variedad de pasos adicionales, incluyendo la inactivación viral se puede agregar al rendimiento optimizado, mejora en la seguridad viral, y aseguramiento del cumplimiento normativo. Estos pasos pueden incluir, pero no se limitan a: (1) Cromatografía inicial en una resina de intercambio iónico débil (DEAE); (2) Cromatografía inicial en una resina de intercambio aniónico fuerte (QAE); (3) Inactivación viral utilizando ya sea calor seco o pasteurización en la solución; (4) Exclusión de viral por filtración para eliminar los posibles contaminantes virales; (5) Tratamiento químico tal como el tratamiento de detergente solvente para la inactivación viral, y (6) Pasos de precipitación para purificar parcialmente la materia prima antes de la cromatografía.

En una modalidad, el método comprende además la realización de los pasos a) y b) más de una vez, en donde un paso de inactivación viral se lleva a cabo en la solución antes de un paso final a).

HIC En general, HIC es un método para separar proteínas basado en la fuerza de sus interacciones hidrófobas relativas con un adsorbente hidrófobo. La hidrofobicidad se define generalmente como la repulsión entre un compuesto no polar y un medio ambiente polar, típicamente las soluciones acuosas. Las "interacciones" hidrófobas son esencialmente la tendencia de un medio ambiente polar para excluir los compuestos no-polares (es decir, hidrófobos) del medio ambiente polar y la fuerza de agregación de los componentes hidrófobos entre sí. En consecuencia, la purificación de a-1 IP que incluye HIC se puede basar en las propiedades específicas de los a-1 IP en relación con la falta de interacción hidrófoba con un adsorbente hidrófobo.

De conformidad con la presente invención, HIC se puede emplear utilizando un "protocolo de flujo a través", en donde el contaminante(s), pero no a-1 IP, en una solución se puede obligar a unirse de manera adsorbente o se puede agregar con grupos funcionales hidrófobos (el adsorbente) fijos a un soporte sólido.

A. Protocolo de Flujo a través En una modalidad, la solución de flujo a través de la resina de intercambio iónico que contiene a-1 IP se puede poner en contacto con el adsorbente hidrófobo bajo una condición suficiente para afectar la unión de los contaminantes (o tantos contaminantes como sea posible) al adsorbente, mientras que un inhibidor de la a-1 proteinasa (y tan pocos contaminantes como sea posible) no se une y fluye a través de una fracción de flujo a través de HIC. En una modalidad, la solución es una solución eluída a partir de una resina de intercambio aniónico, en donde la solución eluída comprende a-1 IP. En otra modalidad, la solución es una solución de flujo a través por intercambio catiónico, en donde la solución a través del flujo de intercambio catiónico comprende a-1 IP.

En general, HIC se lleva a cabo al cargar una solución que contiene a-1 IP sobre la columna de HIC en una solución acuosa que comprende un regulador de pH y/o una sal. Los reguladores de pH adecuados incluyen, pero no se limitan a citrato, succinato, fosfato, MES, ADA, BIS-TRIS Propano, PIPES, ACES, imidazol, ácido dietilmalónico, MOPS, MOPSO, TES, regulador de pH con TRIS tales como Tris-HCI, HEPES, HEPPS, TRICINA, amida glicina, BICINA, glicilglicina, acetato y reguladores de pH de borato. Las sales aceptables pueden incluir, pero no se limitan a cloruro de sodio, cloruro de amonio, cloruro de potasio, acetato de sodio, acetato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, tiocianato de amonio, citrato de sodio, fosfato de sodio y sales de potasio, magnesio y calcio de los mismos, y combinaciones de estas sales.

En una modalidad, las sales incluyen, pero no se limitan a, citrato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de amonio, sulfato de sodio y fosfato de sodio. Los intervalos aceptables de concentraciones de sal utilizados pueden estar en el intervalo de 0 a aproximadamente 2M de citrato de sodio, 0 a aproximadamente 4M de cloruro de sodio, 0 a aproximadamente 3M de sulfato de amonio, 0 a aproximadamente 1M de sulfato de sodio y 0 a aproximadamente 2M de fosfato de sodio. Otros reguladores de pH y sales también se pueden utilizar.

Después de la carga, el adsorbente se puede lavar con más de la misma solución de carga (sin proteína) para hacer que cualquier inhibidor de a-1 proteinasa que no está unido al adsorbente fluya a través del adsorbente (una búsqueda).

El inhibidor de a-1 proteinasa se recolecta entonces en la fracción del flujo a través de HIC y de la búsqueda. Las condiciones para la unión de los contaminantes, pero no del inhibidor de a-1 proteinasa, se pueden optimizar por aquellos expertos en la técnica, sin llevar a cabo experimentación indebida. Las concentraciones de sal discutidas en la presente invención son ejemplares, y otras sales y concentraciones de sal se pueden utilizar al variar uno o más parámetros incluyendo, por ejemplo, pH, velocidades de flujo, y temperaturas como se sabe en la técnica.

Debido a que el pH puede afectar directamente la carga (es decir, las propiedades hidrófobas de una proteína en solución) el ajuste del pH puede afectar la cantidad de sal necesaria en el regulador de pH. El pH bajo el cual se lleva a cabo HIC puede variar. Por ejemplo, el intervalo de pH puede estar entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 8.0, o, alternativamente, entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 7.5. Sin embargo, puede ser posible un intervalo más amplio.

B. Los medios HIC Preferiblemente, un medio HIC comprende un soporte y el adsorbente fijado en el soporte. El soporte HIC puede comprender una matriz de resina preparada mediante cualquier método adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica. En general, el soporte puede ser de cualquier material que sea compatible con las separaciones de proteína. Además, el soporte ha sido o puede ser modificado por la unión covaiente al grupo hidrófobo funcional proporcionando así un medio HIC (soporte y absorbente fijado en el soporte).

En una modalidad, el grupo funcional hidrófobo es un alquilo (por ejemplo, uno de C2 a C6 (o de C8 hasta Ci0). En otra modalidad, el grupo funcional hidrófobo es un grupo funcional aromático cíclico, policíclico, o heterocíclico, tal como, por ejemplo, un grupo fenilo. Un experto en la técnica sabe que la hidrofobicídad se puede ajusfar mediante el aumento del grado de sustitución o densidad del grupo funcional en el soporte. En algunas modalidades, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo, e ¡soamilo.

Los soportes adecuados pueden ser de cualquier material actualmente disponible o desarrollado más tarde que tiene las características necesarias para practicar el método reclamado, y se pueden basar en cualesquiera polímeros sintéticos, orgánicos o naturales. Por ejemplo, las sustancias de soporte comúnmente utilizadas incluyen materiales orgánicos tales como celulosa, poliestireno, agarosa, sefarosa, polimetacrilato de poliacrilamida, dextrano y almidón, y materiales inorgánicos, tales como carbón de leña, sílice (perlas de vidrio o arena) y materiales cerámicos. Los soportes sólidos adecuados se describen, por ejemplo, en Zaborsky "Immobilized Enzymes" CRC Press, 1973, Cuadro IV en las páginas 28-46, que se incorpora en la presente invención como referencia para la enseñanza de un soporte sólido.

En una modalidad, el medio HIC comprende lecho promedio con un tamaño de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 mieras, las densidades del grupo funcional de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 micromoles por mi de gel, y los lechos que contienen 4-6% de agarosa reticulada. Además, los medios HIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, columnas a base de resina TSK-GEL Éter-5PW, Fenil-5PW, y Butil-NPR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

En algunas modalidades, puede ser necesario activar el soporte de manera que reaccionará con el grupo funcional hidrófobo formando así los medios HIC. Por lo tanto, debe entenderse que si la materia prima para el soporte, por ejemplo agarosa, no es en sí susceptible a la reacción con un grupo funcional particular, ésta se puede condicionar o activar de modo que será susceptible a este tipo de reacciones.

Antes del equilibrio y de la cromatografía, los medios HIC (el soporte y absorbente fijos al soporte) se pueden pre-equilibrar en una solución elegida, por ejemplo, una solución de sal y/o de regulador de pH. El pre-equilibrio puede tener la función de desplazamiento de una solución utilizada para la regeneración y/o almacenamiento del medio HIC. Un experto en la técnica se dará cuenta que la composición de la solución para pre-equilibrio depende de la composición de la solución de almacenamiento y de la solución que se utilizará para la cromatografía subsecuente. Por lo tanto, las soluciones adecuadas para pre-equilibrio pueden incluir el mismo regulador de pH o sal utilizada para llevar a cabo la HIC. Opcionalmente, la solución para pre-equilibrio puede incluir el regulador de pH o sal a una concentración más alta que se utiliza para realizar HIC.

Antes de que se aplique una solución que comprende un inhibidor de a-proteinasa a los medios HIC, los medios HIC se pueden equilibrar en el regulador de pH o sal que se utilizará para disolver o suspender el inhibidor de proteinasa a-1. En algunas modalidades, el equilibrio puede tener lugar en una solución que comprende citrato de sodio entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 milimolar y sulfato de amonio entre aproximadamente 500 y aproximadamente 1000 milimolar. El equilibrio puede tener lugar a pH entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 8.6, preferiblemente a pH entre 6.5 y 7.5. En una modalidad, la solución de equilibrio comprende un regulador de pH de citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 10 milimolar, concentración de sulfato de amonio de aproximadamente 850 milimolar y a un pH de aproximadamente 7.0.

Opcionalmente, el medio HIC (por ejemplo, la columna HIC) puede ser regenerado. Por ejemplo, después de la purificación HIC de a-1 , cualesquiera contaminantes que pueden permanecer unidos al adsorbente se puede liberar mediante la eliminación del medio HIC utilizando una solución que comprende el regulador de pH o sal utilizada para la cromatografía, pero a una menor fuerza iónica para liberar las proteínas contaminantes. Luego, la columna se puede regenerar utilizando una solución que tendrá el efecto de liberar la mayoría o todas las proteínas del medio de cromatografía y reducir o eliminar cualquier contaminación microbiana que puede estar presente en el medio de cromatografía. En una modalidad, dicha solución puede comprender hidróxido de sodio. También se pueden utilizar otros reactivos. Posteriormente, la columna se puede enjuagar y almacenar en una solución que puede desalentar el crecimiento microbiano. Dicha solución puede comprender hidróxido de sodio, pero otros reactivos también pueden ser apropiados.

El inhibidor de a-1 proteinasa, así como las proteínas contaminantes que pueden estar presentes en una solución que comprende a-1 Pl, pueden ser monitoreados por cualquier método apropiado. Preferiblemente, la técnica debe ser lo suficientemente sensible como para detectar los contaminantes en el intervalo de entre aproximadamente 2 partes por millón (ppm) (calculado como nanogramos por miligramo de la proteína a ser purificada) y 500 ppm. Por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA), un método bien conocido en la técnica, se puede utilizar para detectar la contaminación.

En una modalidad, la contaminación de una solución que comprende a-1 Pl por contaminantes de proteína se puede reducir después de HIC, preferiblemente por lo menos aproximadamente dos veces, de manera ilustrativa, por lo menos aproximadamente tres veces, por lo menos aproximadamente cinco veces, por lo menos aproximadamente diez veces, por lo menos aproximadamente veinte veces, por lo menos aproximadamente treinta veces, por lo menos aproximadamente cuarenta veces, por lo menos aproximadamente cincuenta veces, por lo menos aproximadamente sesenta veces, por lo menos aproximadamente setenta veces, por lo menos aproximadamente 80 veces, por lo menos aproximadamente 90 veces, y por lo menos aproximadamente 100 veces.

En otra modalidad, la contaminación de una solución que comprende a-1 Pl por otros contaminantes de proteína después de HIC no es mayor de aproximadamente 10,000 ppm, preferiblemente no mayor de aproximadamente 2500 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 400 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 360 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 320 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 280 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 240 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 200 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 160 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 140 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 120 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 100 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 80 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 60 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 40 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 30 PPm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 20 ppm, más preferiblemente no mayor de aproximadamente 10 PPm, y más preferiblemente no mayor de aproximadamente 5 ppm. Dicha contaminación puede tener un intervalo a partir de niveles no detectables hasta aproximadamente 10 ppm o de aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 10,000 ppm.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de purificación de a-1 Pl a partir de una solución acuosa que contiene a -1 Pl, en donde el método comprende: (a) eliminar una porción de las proteínas contaminantes a partir de la solución acuosa mediante precipitación con el objeto de obtener una solución purificada que contiene a-1 Pl; (b) pasar la solución purificada a través de una resina de intercambio aniónico de manera que a-1 Pl se une a la resina de intercambio aniónico; (c) eluir a-1 Pl a partir de la resina de intercambio aniónico para obtener una solución eluída que contiene a-1 Pl; (d) pasar la solución eluída a través de una resina de intercambio catiónico; (e) recolectar una solución de flujo a través a partir de la resina de intercambio catiónico que contiene a-1 Pl, y (f) poner en contacto la solución de flujo a través del paso e) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

En una modalidad, los pasos a)-f) anteriormente mencionados se llevan a cabo en la secuencia mencionada. HIC es como se describió anteriormente.

En una modalidad, la solución acuosa que contiene a-1 Pl es la Fracción Cohn IV-I, en donde una porción de las proteínas contaminantes a partir de la Fracción Cohn IV-I se elimina mediante precipitación con el objeto de obtener una solución purificada que contiene a-1 Pl. Por ejemplo, la purificación de a-1 Pl puede comenzar con la Fracción IV-1 pasta, como se obtiene a través del procedimiento de fraccionamiento Cohn-Oncley para plasma de humano. Véase, por ejemplo, E. J. Cohn, et al., J. Amer. Chem. Soc, 68, 459 (1946); E. J. Cohn, Patente de E.U.A. No. 2,390,074; y Oncley, et al., J. Amer. Chem. Soc, 71 , 541 (1949), las descripciones completas de los cuales se incorporan como referencia en la presente invención. El proceso Cohn-Oncley implica una serie de pasos de precipitación en etanol frío durante los cuales las proteínas específicas se separan de conformidad con el punto isoeléctrico mediante el ajuste del pH, fuerza iónica, concentración de proteína, temperatura y concentración del etanol. La Fracción IV-1 pasta obtenida por este procedimiento se disuelve en una solución de regulador de pH y se calienta para activar el a-1 Pl. Un paso de purificación inicial incluye la precipitación de las proteínas contaminantes y los lípidos a partir de la Fracción IV-1 disuelta. El a-1 Pl se precipitó entonces a través de la solución de la Fracción IV-1 disuelta, y el a-1 Pl crudo se pasó a través de una resina de intercambio aniónico para eliminar las proteínas contaminantes. La inactivación viral se llevó a cabo mediante la pasteurización por 10 horas a 60°C en una solución de sacarosa. Después de la pasteurización, el a-1 Pl se diafiltró, se conjugó en NaCI/Na3PO4l se esterilizó por filtrado y se liofilizó. La Fracción IV-1 es típicamente una pasta que se puede disolver en regulador de pH con Tris a un pH de aproximadamente 9.25 a aproximadamente 9.5 a aproximadamente 40°C. Una sal, tal como cloruro de sodio (NaCI) también se puede agregar a la solución.

Otras fracciones, tales como la Fracción Cohn II + III, por ejemplo, también se puede utilizar como materia prima. En esta fracción a-1 IP ya está disuelto en una solución acuosa. En una modalidad, el método incluye la eliminación de por lo menos una porción de proteínas contaminantes de a partir de una solución inicial que contiene a-1 Pl. Dichas proteínas contaminantes pueden incluir fibrinógeno y albúmina, por ejemplo. La porción de proteínas contaminantes preferiblemente se elimina mediante la precipitación con un polialquilenglicol, tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG), por ejemplo. Otros alcoholes que son conocidos por aquellos expertos en la técnica que tienen propiedades similares también se pueden utilizar. El PEG, el polialquilenglicol preferido para el uso en los métodos de la invención, tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 10,000, y preferiblemente tiene un peso molecular de entre aproximadamente 3,000 y aproximadamente 4,000. El PEG agregado a la solución es por lo menos de aproximadamente 2% en peso por volumen de la mezcla formada, preferiblemente es de aproximadamente 3% al 15%, y más preferiblemente es de 11.5%. El pH de la solución también se puede ajustar para precipitar las proteínas contaminantes. El pH típicamente se ajusta a entre 5.0 y aproximadamente 6.0. El pH de la solución se ajusta mediante la adición de un ácido, tal como ácido acético. El precipitado se puede separar entonces a partir de la solución mediante filtración, centrifugación, o cualesquiera otros métodos convencionales conocidos en la técnica, para obtener un filtrado que contiene a-1 Pl.

En una modalidad, el paso de eliminación a) comprende los pasos de: (i) precipitar la porción de las proteínas contaminantes a partir de la solución acuosa, y (ii) separar la porción precipitada de las proteínas contaminantes de la solución acuosa, obteniendo así la solución purificada que contiene a-1 Pl. En otra modalidad, el paso de precipitación comprende los pasos de: (i) añadir un polialquilenglicol a la solución acuosa, y (ii) ajustar el pH de la solución acuosa de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0. En algunas modalidades, el polialquilenglicol es polietilenglicol. La conductividad del filtrado se ajusta entonces antes de pasar el filtrado a través de una resina de intercambio aniónico. El equilibrio entre una resina de intercambio iónico y una solución de proteína está influenciado por la fuerza iónica de la solución (véase, por ejemplo, Yamamato, et al. Biotechnol. Bioeng., 25: 1373-91 (1983)). La conductividad del filtrado se ajusta entonces de manera que el a-1 Pl en el filtrado se unirá a una resina de intercambio aniónico. Esta conductividad típicamente está entre aproximadamente 2.0 mS y 6.0 mS cuando se mide a 25°C, pero pueden ser necesarios otros intervalos de conductividad para unir el a-1 Pl a una resina de intercambio aniónico. La conductividad preferiblemente se ajusta mediante la dilución del filtrado, y no por filtración en gel, diafiltración, u otros métodos de extracción de sal. El filtrado preferiblemente se diluye con agua, que puede contener fosfato de sodio (Na3P04), u otros reguladores de pH capaces de proporcionar un pH de aproximadamente 6-7.

En una modalidad, el método comprende además el paso de ajusfar el pH de la solución purificada a entre aproximadamente 6.25 y aproximadamente 7.25 antes de pasar la solución purificada a través de la resina de intercambio aniónico.

Después de la dilución del filtrado, la solución se puede aplicar directamente a una resina de intercambio aniónico. A diferencia de los métodos conocidos, el filtrado no se somete a precipitación adicional con PEG o diafiltración antes de la separación cromatográfica. El filtrado diluido se pasa a través de una resina de intercambio aniónico, que preferiblemente es una resina de aminoetilo cuaternario (QAE). Aunque se prefiere la cromatografía QAE, otras resinas de intercambio aniónico, tales como trimetilamino etano (????) y dietil aminoetilo (DEAE), se pueden utilizar en los métodos de la invención. El a-1 Pl se une a la resina de intercambio aniónico. En una modalidad preferida, la resina de intercambio aniónico se lava con una solución de regulador de pH, tal como regulador de pH de Na3P04, para eliminar otra porción de proteínas contaminantes. Por ejemplo, cuando la fuente de a-1 Pl es plasma o una fracción del mismo, las proteínas que normalmente se eliminan son albúmina y transferrina. Durante el lavado con regulador de pH, a-1 Pl sigue unido a la resina de intercambio aniónico. Después del lavado con regulador de pH, el a-1 Pl se eluye a partir de la resina de intercambio aniónico. La ceruloplasmina sigue unida a la columna, tanto durante el lavado como durante la elución.

En una modalidad, el método comprende además el paso de, antes del paso de elución e), lavar la resina de intercambio aniónico con una solución de regulador de pH para eliminar una porción de las proteínas contaminantes a partir de la resina de intercambio aniónico de manera que a-1 Pl sigue unido a la resina de intercambio aniónico. En una modalidad, la solución eluída de la resina de intercambio aniónico se pasa a través de la resina de intercambio catiónico para obtener el flujo a través de la resina de intercambio catiónico que comprende el a-1 Pl. El pH, conductividad y concentración de proteína de la solución eluída a partir de la resina de intercambio catiónico se ajustan, como se describió anteriormente.

En otras modalidades, el método comprende además el paso de eliminar los virus a partir de la solución acuosa. La inactivación viral y/o eliminación viral también desempeña una parte en la purificación de a-1 Pl a partir de soluciones acuosas, tal como el plasma, por ejemplo. Los procesos conocidos para la purificación de a-1 Pl utilizan un tratamiento de calor seco para la inactivación de los virus. Sin embargo, este tratamiento puede desnaturalizar la proteína a-1 Pl, lo que reduce el rendimiento y/o la pureza del a-1 Pl. Los métodos de la invención desactivan y eliminan los virus sin este paso de tratamiento con calor, incrementando así tanto el rendimiento como la pureza del a-1 Pl obtenido.

La precipitación anteriormente descrita de las proteínas contaminantes con 11.5% de PEG también sirve como uno de los pasos de eliminación del virus. La precipitación con 11.5% de PEG elimina tanto los virus con cubierta como los virus sin cubierta de la fracción de plasma sanguíneo. Esta precipitación elimina, con un > 4 unidades logarítmicas de eliminación, por lo menos cuatro virus, incluyendo VIH-1 , BVDV, PRV y Reovirus Tipo 3. En comparación, el proceso con calor seco de los métodos conocidos solamente resulta en= 4 unidades logarítmicas de eliminación de tres de estos virus, el Reovirus Tipo 3 solamente se elimina a 1 unidad logarítmica de eliminación. Además, el paso de precipitación con 11.5% de PEG ha demostrado que resulta en > 4 unidades logarítmicas de eliminación de las encefalopatías espongiformes transmisibles (es decir, los priones TSE) a partir de la fracción de plasma sanguíneo. (Véase la Patente de E.U.A. No. 6,437,102 titulada Método de Separación de Priones a partir del Material Biológico).

Opcionalmente, otra desactivación viral se logra mediante la adición de un detergente no iónico. Preferiblemente, este paso se realiza antes de pasar la solución a través de la resina de intercambio aniónico. Los detergentes no iónicos para el uso en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, Tweens, tales como Tween 20 y Tween 80. Tween 20 es el detergente no iónico preferido para uso en los métodos de la invención. Tween 20 también se puede añadir de aproximadamente 0.33% a aproximadamente 10% en peso por volumen de la mezcla resultante. Tween 20 preferiblemente se añade en el intervalo de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 2.0% y se añade más preferible al 1.0%. Opcionalmente, un solvente tal como tri-N-butil-fosfato (TNBP) en un intervalo de 0.01 % a aproximadamente 0.5% se puede agregar junto con el Tween 20 para aumentar la eficacia de la inactivación del virus. El tratamiento con detergente con 1% de Tween 20 (Tween 20 más TNBP) reduce los virus con cubierta por >4 unidades logarítmicas de eliminación.

En una modalidad, el paso de inactivación viral comprende los pasos de: (a) añadir un detergente a la solución purificada para obtener una mezcla de detergente y solución purificada, y (b) ajustar el pH de la mezcla de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5. Otra modalidad de la invención opcionalmente incluye la eliminación del virus. Tanto los virus con cubierta como los virus sin cubierta, se pueden eliminar mediante filtración, preferiblemente mediante nanofiltración, o cualesquiera otros métodos de filtración conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, la solución obtenida a partir de la resina de intercambio iónico, que incluye a-1 Pl, se somete a nanofiltración. La nanofiltración reduce tanto a los virus con cubierta como a los virus sin cubierta por >4 unidades logarítmicas de eliminación. En una modalidad, el método comprende además el paso de eliminar los virus de la solución acuosa. En otra modalidad, el paso de eliminación viral comprende filtrar la solución acuosa mediante nanofiltración. Por lo tanto, los métodos de la presente invención, preferiblemente incluyen dos pasos >4 unidades logarítmicas de eliminación para la eliminación de virus con cubierta y virus sin cubierta.

La práctica de la invención se entenderá con más detalle a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan en la presente invención con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 En una modalidad, la materia prima es la Fracción Cohn IV-1 pasta que se obtiene mediante la técnica de fraccionamiento de Cohn-Oncley, bien conocida por aquellos expertos en la técnica. La preparación de una solución acuosa a partir de la Fracción IV-1 pasta se describe a continuación.

La pasta IV-1 pasta se disuelve en 24 volúmenes de regulador de pH con Tris (la pasta IV-1 peso en veces de kg 24) entre 20 y 8°C. La solución se mezcla por aproximadamente 4.5 horas, mientras se mantiene la temperatura entre 2" y 8°C. Después de la mezcla, el pH de la solución se ajusta a entre 9.25 y 9.5 utilizando 1.0 M de NaOH, que se agrega a una velocidad de 1.25 l/min. Esta solución se mezcla entonces por 1 hora y el pH se reajusta, si es necesario. La solución se calienta entonces de 39°C a 41 °C por aproximadamente 60 a aproximadamente 90 minutos para disolver la Fracción IV-1 pasta en la solución de regulador de pH.

EJEMPLO 2 La Fracción IV-1 , al igual que otras fracciones de plasma, contiene diversas proteínas, tales como las lipoproteínas, inmunoglobulinas, globulina, metaproteína, etc. Estas proteínas se deben separar a partir del a-1 Pl, pero algunas también se unirán a una resina de intercambio iónico y por lo tanto, interfieren con la purificación de a-1 Pl. Por lo tanto, antes de añadir la solución a una resina de intercambio aniónico, preferiblemente se elimina una porción de estas proteínas contaminantes en primer lugar. Este ejemplo describe un paso de purificación en el proceso para la eliminación de las proteínas contaminantes.

La Fracción Cohn IV-1 disuelta en la solución de regulador de pH con Tris, como se describió anteriormente, se enfría de nuevo a entre 2°C y 8°C. A esta solución enfriada se le añade NaCI a 0.11 M. A esta solución se le añade 11.5% de PEG PM 3350 (Carbowax™, Union Carbide, Danbury, Connecticut, peso de la suspensión en veces de kg 0.115). El pH de la solución se ajusta entonces entre 5.10 y 5.35 con 1.0 M de ácido acético glacial. Se formó un precipitado de proteínas contaminantes y virus, incluyendo las proteínas del prióñ. La solución se centrifugó entonces para eliminar el precipitado seguido por la filtración a profundidad, tal como un Cuno CP50 o SP90 (Cuno, Meriden, Connecticut). Otros filtros a profundidad se pueden utilizar para este paso. La pasta obtenida por la centrifugación y el filtrado se desechó. El filtrado contiene el a-1 Pl en PEG. Alternativamente, el precipitado se puede remover mediante filtración sola con o sin la adición de ayuda para el filtro, tal como el 2.5% de Hyflo Supercel™ (Celite Corporation, Lompoc, California).

EJEMPLO 3 En una modalidad preferida, el filtrado obtenido a partir de la precipitación con PEG descrita en el Ejemplo 2 anteriormente mencionado se sometió a inactivación viral en un detergente no iónico, o una combinación de detergente disolvente y no iónico. El pH del filtrado a partir del Ejemplo 2 anteriormente mencionado se ajustó de 7.0 a 7.2 con 1.0 M de NaOH. A esta solución se le añadió Tween 20 al 1% (PEG filtrado peso en veces de kg 10.1 g/kg) o Tween 20 al 0.5% y TNBP al 0.03% (PEG filtrado peso en veces de kg 5.1 g/kg y 0.01 g/kg, respectivamente). El pH se ajustó de 6.9 a 7.1 con 1.0 M de NaOH. Esta solución se mantuvo a entre 20°C y 30°C por 60-10 horas. Este tratamiento reduce los virus recubiertos en la solución que contiene a-1 Pl por >4 unidades logarítmicas de eliminación.

EJEMPLO 4 La solución que contiene a-1 Pl tanto en PEG como en Tween 20 se pasa entonces a través de una resina de intercambio aniónico para purificar adicionalmente el a-1 Pl y separarlo del PEG y del Tween 20. Antes de la adición de la solución a la resina de intercambio aniónico, se ajustó la conductividad de la solución de manera que el a-1 Pl se unirá a la resina de intercambio aniónico. La solución resultante a partir del Ejemplo 3 anteriormente mencionado se diluyó con agua para inyección (WFI - por sus siglas en inglés) hasta que la conductividad de la solución se redujo a un valor de entre aproximadamente 2.0 mS y aproximadamente 6.0 mS a 25°C. Se puede incluir 1 % de Tween 20 adicional en la WFI para prolongar el tiempo de contacto de la solución con el detergente. La WFI puede contener Na3 PO (20 mM) a un pH de 6.5.

Una columna de flujo rápido de Q Sepharose™ (Amersham- Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se preparó y se equilibró con una solución 20 mM de Na3P04 a pH 6.5. La solución de a-1 Pl en Tween 20 y PEG entonces se añadió entonces a la columna a una concentración de 8-12 mg de a-1 Pl por mililitro de resina. La velocidad de flujo de la columna es de 125 cm/hr. El a-1 Pl se une a la columna, que luego se lavó con la solución de 20 mM de Na3P04 a pH 6.5. El regulador de pH Na3P04 elimina además las proteínas contaminantes, tales como albúmina, transferrina, por ejemplo, a partir de la columna. Un regulador de pH de elución de 0.025 M de Na3PO4/0.1 M de NaCI a pH 6.95-7.05 se pasa a través de la columna para eliminar el a-1 Pl. El eluido, que contiene el a-1 Pl se recolecta. La ceruloplasmina permanece unida a la columna hasta la eliminación del NaCI.

Por lo tanto, el paso de purificación logra cuatro objetivos: 1) separación del a-1 Pl a partir del PEG, 2) separación del a-1 Pl a partir del Tween 20; 3) purificación del a-1 Pl; y 4) prolongación del tiempo de contacto de los virus en la solución con el Tween 20.

EJEMPLO 5 En una modalidad preferida de la invención, la solución acuosa que contiene a-1 Pl se sometió a un paso de purificación adicional después de la cromatografía en Q Sepharose™ descrita en el Ejemplo 4 anteriormente mencionado. La purificación adicional se llevó a cabo mediante cromatografía catiónica.

Una columna Macro Prep High S™ (BioRad Laboratories, Hercules, California) se preparó y se equilibró con un regulador de pH con 20 mM de Na3P04/5 mM de NaCI a pH 5.45 a 5.54 hasta que el efluente de la columna tuvo de manera consistente un pH < 5.60. Antes de añadir el eluido que contenía a-1 Pl obtenido a partir del método del Ejemplo 4 anteriormente mencionado a la columna catiónica, éste se puede concentrar mediante ultrafiltración y diafiltración. El NasPC en seco y el NaCI se añadieron entonces al concentrado resultante hasta una concentración final de 20 mM de Na3PO4 y 5 mM de NaCI. El pH de la solución resultante se ajustó entonces a aproximadamente 5.50 con 1.0 M de ácido acético glacial. Esta solución se aplicó entonces a la columna a una proporción de 5 mg de contaminantes (por ejemplo, albúmina e IgA) por mililitro de resina. El a-1 Pl no se une a la resina, mientras que los contaminantes se unen a la resina. El a-1 Pl se persiguió a través de la columna con 20 mM de Na3P04/5 mM de regulador de pH con NaCI a pH 5.45 a 5.54 para obtener una solución que contenía a-1 Pl.

EJEMPLO 6 A fin de eliminar la contaminación de virus, preferiblemente se incluyó un paso de filtración en los métodos de la invención. A la solución que contenía a-1 Pl obtenido en el procedimiento del Ejemplo 5 anteriormente mencionado se le añadió NaCI a 0.75 M y el pH se ajustó a 7.0 con NaOH. La solución se concentró en una membrana Viresolve 70™ (Millipore, Bedford, Mass.) utilizando la diafiltración diferencial con 0.75 M de NaCI hasta que el volumen se redujo a 5%-20% de su volumen original. El a-1 Pl se lavó a través de la membrana Viresolve 70™ con 3-5 volúmenes de diafiltración de 0.75 M de NaCI.

Después de la filtración, la solución resultante que contenía a-1 Pl purificado se concentró mediante ultrafiltración y diafiltración. Después de la diafiltración, la solución se concentró, y el a-1 Pl concentrado se formuló a aproximadamente 55 mg de a-1 Pl por mililitro de 20 mM de Na3P04 y 100 mM de NaCI a pH 7.0. Otros filtros para virus tal como el filtro para virus Asahi Planova puede reemplazar el filtro Viresolve.

EJEMPLO 7 La solución acuosa que contenía a-1 Pl se pudo someter a un paso de purificación adicional después de la filtración del virus descrita en el Ejemplo 6 anteriormente mencionada. La purificación adicional se llevó a cabo mediante cromatografía HIC.

Una GE columna con medio GE Healthcare Octyl Sepharose 4FF se preparó mediante equilibrio con un regulador de pH de 10 mM de citrato de sodio, 850 mM de sulfato de amonio a pH 7.0. La solución acuosa que contenía a-1 Pl se ajustó mediante la adición de 850 mM de sulfato de amonio y se ajustó el pH 7.0. La solución se aplicó entonces a la columna con Octyl Sepharose y cualquier proteína no unida se eliminó de la columna con el regulador de pH para equilibrio. El flujo a través recolectado y el lavado contenían el a-1 Pl purificado.

La solución acuosa que contenía a-1 Pl ultrafiltrado se filtró luego y se diafiltró para eliminar las sales y se preparó para la formulación final. La solución formulada se filtró por esterilización. La solución resultante se liofilizó utilizando métodos conocidos en la técnica.

EJEMPLO 8 CUADRO 1 Pureza de alfa-1 a partir de lotes piloto pre-clínicos (1) Como se describió por Betty, et al., JBC, 255: 3931-3934, 1980, desarrollado y validado para esta matriz (2) Ensayo de Proteína Biuret Estándar, desarrollado y validado para esta matriz (3) (Alfa-1 mg/ml)/(Proteína total mg/ml) (4) HPLC Estándar por Exclusión de Tamaño, desarrollado y validado para esta matriz La invención se puede incorporar a otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales del mismo. Los ejemplos anteriores se incluyen a modo de ilustración solamente. En consecuencia, el alcance de la invención está limitado solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Un método de purificación del inhibidor de alfa-1 proteinasa en una solución acuosa que comprende inhibidor de alfa-1 proteinasa y otras proteínas, el método comprendiendo: a) ajustar el pH, fuerza iónica y concentración de proteína de la solución acuosa de manera que el inhibidor de alfa-1 proteinasa activo no se une a una resina de intercambio iónico, pero se une a otras proteínas en la solución; b) pasar la solución a través de la resina de intercambio iónico y recolectar un flujo a través que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y c) poner en contacto el flujo a través del paso b) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el adsorbente hidrófobo es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo, e isoamilo.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el contacto se produce bajo una condición adecuada para afectar la unión de al menos una porción de cualesquiera contaminantes remanentes al adsorbente, en donde el inhibidor de la alfa-1 proteinasa no se une y fluye a través de una fracción de flujo a través de HIC.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la condición comprende una concentración de sal de 10 mM de citrato de sodio y 850 mM de sulfato de amonio.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el contacto se produce bajo una condición adecuada para afectar la unión de al menos una porción de cualesquiera contaminantes remanentes al adsorbente, en donde el inhibidor de alfa-1 proteinasa no se une y fluye a través como una fracción de flujo a través de HIC.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la solución acuosa es Fracción Cohn IV-1.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los pasos a) y b) se llevan a cabo más de una vez y un paso de inactivación viral se realiza en la solución antes del paso final a).

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el paso de inactivación viral comprende calentar el inhibidor de alfa-1 proteinasa a más de o igual a aproximadamente 60°C por más de o igual a aproximadamente 10 horas.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el paso de inactivación viral comprende añadir uno o más agentes químicos.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el paso de inactivación viral comprende añadir fosfato de tri-n-butilo y un detergente a la solución.

11. - Un método de purificación del inhibidor de alfa-1 proteinasa a partir de una solución acuosa que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, el método comprendiendo: a) eliminar una porción de proteínas contaminantes a partir de la solución acuosa mediante precipitación con el fin de obtener una solución purificada que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa; b) pasar la solución purificada a través de una resina de intercambio aniónico de manera que el inhibidor de alfa-1 proteinasa se une a la resina de intercambio aniónico; c) eluir el inhibidor de alfa-1 proteinasa de la resina de intercambio aniónico para obtener una solución eluída que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa; d) pasar la solución eluída a través de una resina de intercambio catiónico; e) recolectar un flujo a través de la resina de intercambio catiónico que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y f) poner en contacto la solución eluída del paso c) o el flujo a través del paso e) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la solución acuosa que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa es la Fracción Cohn IV-I.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el adsorbente hidrófobo es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo, e isoamilo.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque cuando se produce el contacto bajo una condición adecuada para afectar la unión de al menos una porción de cualesquiera contaminantes remanentes al adsorbente, en donde el inhibidor de alfa-1 proteinasa no se une y fluye a través como una fracción de flujo a través de HIC.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el paso de eliminación comprende los pasos de: (i) precipitar la porción de proteínas contaminantes a partir de la solución acuosa, y (ii) separar la porción precipitada de las proteínas contaminantes de la solución acuosa, obteniendo así la solución purificada que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el paso de precipitación comprende los pasos de: (1) añadir un polialquilenglicol a la solución acuosa, y (2) ajustar el pH de la solución acuosa de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polialquilenglicol es polietilenglicol.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de, antes del paso de elución, lavar la resina de intercambio amónico con una solución de regulador de pH para eliminar una porción de proteínas contaminantes de la resina de intercambio aniónico de manera que el inhibidor de alfa-1 proteinasa permanece unido a la resina de intercambio aniónico.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un paso de inactivación viral.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el paso de inactivación viral comprende los pasos de: (a) añadir un detergente a la solución purificada para obtener una mezcla de detergente y solución purificada, y (b) ajustar el pH de la mezcla de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5.

21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el detergente es un detergente no iónico.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el detergente no iónico es Tween 20.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de eliminar los virus de la solución acuosa.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el paso de eliminación viral comprende filtrar la solución acuosa mediante nanofiltración.

25. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un paso de dilución antes de pasar la solución purificada a través de la resina de intercambio aniónico.

26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el paso de dilución comprende diluir la solución purificada de manera que la solución purificada tiene una conductividad de entre aproximadamente 2.0 mS y aproximadamente 6.0 mS.

27. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el paso de dilución comprende diluir con agua.

28. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el agua comprende fosfato de sodio.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de ajustar un pH de la solución purificada a entre aproximadamente 6.25 y aproximadamente 7.25 antes de pasar la solución purificada a través de la resina de intercambio aniónico.

30. - Un método para purificar el inhibidor de alfa-1 proteinasa en una solución acuosa que comprende inhibidor de alfa-1 proteinasa y otras proteínas, el método comprendiendo: a) ajustar el pH, fuerza iónica y concentración de proteína de la solución acuosa; b) pasar la solución a través de una resina de intercambio iónico y recolectar un flujo a través que contiene inhibidor de alfa-1 proteinasa, y c) poner en contacto el flujo a través del paso b) con un adsorbente hidrófobo de por lo menos un medio HIC.

31.- Una composición que comprende inhibidor de alfa-1 proteinasa, en donde el inhibidor de alfa-1 proteinasa se purificó de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 11 , o 30.