JP2003171308A - アンチトロンビン−ｉｉｉ製剤の保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】常温域を含む１０℃を越え、４５℃を越えない
温度域で、長時間保存可能なアンチトロンビン−III乾
燥製剤の保存法の提供。 【解決手段】乾燥加熱法によりウイルスの不活化を行っ
たアンチトロンビンーIII乾燥製剤、または低ヘパリン
親和性アンチトロンビン−IIIが１０％以上は含まない
アンチトロンビン−III乾燥製剤を１０℃を越え、４５
℃を越えない温度域で保存することにより前記課題を解
決した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アンチトロンビン
−III乾燥製剤の常温保存法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アンチトロンビン−III(ＡＴ-IIIと称す
ることがある。)は血漿中に存在し、α２グロブリンに
属する分子量６５，０００〜６８，０００の糖蛋白質の
一種である。このＡＴ-IIIはプロテアーゼ阻害活性を有
し、トロンビンの血液凝固活性を強く阻害する。また、
トロンビン以外の凝固因子、例えば活性化Ｘ因子、活性
化IX因子などに対しても阻害作用を有している。その他
プラスミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも
報告されている。

【０００３】これらの阻害作用は通常ヘパリンの存在下
で、より速やかに進行することが知られている。このよ
うな作用を有するＡＴ-IIIは、血液凝固異常亢進の補
正、具体的には汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や血
中のＡＴ-IIIレベルが低下することによる各種疾患の治
療用に用いられている。ＡＴ-IIIは血漿由来の蛋白質で
あることから、それを治療用薬剤として用いる場合には
混入の虞のあるウイルスを不活性化する工程を組み込む
ことが必須である。従来ＡＴ-III製剤の製造において用
いられているＡＴ-III含有水溶液の加熱によるウイルス
不活性化処理は蛋白質に対しても負の影響を与え、それ
により変性又は不活性ＡＴ-IIIが生成する。

【０００４】そこで、熱により変性又は不活化されたＡ
Ｔ-IIIの生成率をできる限り低く抑えるＡＴ-III含有水
溶液のウイルス不活化加熱処理法が種々提案されてきた
（例えば特許文献１〜４参照）。しかしながら、ウイル
ス不活化のためにＡＴ-III含有水溶液を加熱処理した
後、前述の固定化ヘパリンを用いる精製法や他の精製法
を実施してもなお製剤中には無視し得ない量の変性また
は不活性ＡＴ-IIIが含まれてくる。そして近年の研究に
より、この変性または不活性ＡＴ-IIIの殆どはヘパリン
親和性の低下したＡＴ-IIIであることが明らかにされた
(非特許文献１参照）。

【０００５】本発明者らはこの低ヘパリン親和性ＡＴ-I
IIの中に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で
ネイティブなＡＴ-IIIよりも小さい移動度を示すものを
見付け、これを取り出してＮ末端部分アミノ酸配列分析
を行った結果、少なくともＡｒｇ３９３−Ｓｅｒ３９４
およびその周辺で開裂したＡＴ-IIIであることを突き止
めた（非特許文献２参照）。低ヘパリン親和性のＡＴ-I
IIの除去は、固定化ヘパリンによる精製では困難であ
り、またこれらは未変性のＡＴ-IIIと化学構造や物性が
極めて似ているため、それらの除去を厳密に行おうとす
れば収率の低下を免れない。

【０００６】本発明者らは低ヘパリン親和性である開裂
したＡＴ-IIIの生成を抑え、ウイルスを不活化する方法
について種々研究を重ねた結果、低温で固定化ヘパリン
等により精製したＡＴ-IIIをなるべく低い温度で乾燥
し、この乾燥状態のＡＴ-IIIをウイルスの不活化がなさ
れるまで加熱することによって得られた精製ＡＴ-IIIが
開裂ＡＴ-IIIを実質的に含んでいないことを知見し、こ
の知見に基づいて活性ウイルスおよび開裂したＡＴ-III
を実質的に含有しないＡＴ-III及びその製法の発明をな
し、特許出願した（特許文献５参照）。

【０００７】この出願の発明に関する先行技術文献情報
としては次のものが挙げられる。

【特許文献１】特開昭６３−２３８９６号公報

【特許文献２】特開平１−２７５６００号公報

【特許文献３】特開平１０−１４７５３８号公報

【特許文献４】特開平１１−４９７９９号公報

【特許文献５】特開２００１−３１６９８号公報

【非特許文献１】Winkelman, L. & Haddon, M.E. Throm
b. Res., 43:219〜227 (1986))。

【非特許文献２】牧島 敦ら、「薬理と臨床」医薬出版
第９巻（４）：３７１〜３７９（１９９９）

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】既に述べたとおり、Ａ
Ｔ-IIIは血漿等に含まれ、トロンビンの血液凝固活性を
阻害する作用等を有する蛋白であり、混在するウイルス
不活化のための６０℃前後の温度、１０〜２０時間の液
状加熱により活性がかなり低下する。したがってＡＴ-I
II製剤の保存は、ＡＴ-IIIの活性低下をなるべく低く抑
えるため、その凍結乾燥剤を１０℃以下の冷所に置くべ
きものとされてきた。しかし我が国において、夏期にこ
の温度を維持することは、コスト的にもかなり不利であ
る。もし、１０℃以上の常温を含む温度域でも力価がそ
れほど低下しないＡＴ-III製剤の保存法が確立されるな
らば、貯蔵並びに運搬時のコストを大幅に低減させるこ
とができる。

【０００９】

【課題を解決する手段】ところが、本発明者らが、ウイ
ルス不活化のために乾燥加熱（６５℃、９６時間）を行
ったＡＴ-III製剤を３０℃の高温下に約２７ヶ月間保存
した後その力価を測定してみたところ、意外にも活性の
低下は１０％にも満たない程度であることが判明した。
また、乾燥加熱処理を行った製剤が低ヘパリン親和性Ａ
Ｔ-IIIを多くは含まないことから、低ヘパリン親和性Ａ
Ｔ-IIIを一定量以上は含まない製剤が常温保存可能なこ
とも明らかになった。本発明者らはこれらの知見を基に
さらに研究を重ね、発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち本発明は、（１）アンチトロンビ
ン−III乾燥製剤を、１０℃を超え４５℃を超えない温
度域で保存するアンチトロンビン−III製剤の保存法、
（２）保存する温度域が１２〜３５℃である前記（１）
記載の保存法、（３）アンチトロンビン−III乾燥製剤
が低ヘパリン親和性アンチトロンビン−IIIを１０％以
上は含まないものである（１）記載の保存法、（４）ア
ンチトロンビン−III乾燥製剤が低ヘパリン親和性アン
チトロンビン−IIIを５％以上は含まないものである
（１）記載の保存法、（５）アンチトロンビン−III乾
燥製剤が、ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を固定化ヘ
パリンを用いる精製工程に付し、さらに乾燥工程に付し
た後、乾燥状態のアンチトロンビン−IIIをウイルスが
不活化されるまで加熱することにより得られたものであ
る保存法、（６）アンチトロンビン−III乾燥製剤が、
固定化ヘパリンを用いる精製工程に付した後、乾燥工程
に付す前に、アンチトロンビン−IIIを含む溶液を陰イ
オン交換体による吸脱着工程および固定化ヘパリンを用
いる精製工程に付すことにより得られたものである前記
（５）記載の保存法、（７）アンチトロンビン−III乾
燥製剤が、ウイルスの不活化を、５０〜８０℃、２４〜
１２０時間で行うことにより得られたものである前記
（５）または（６）記載の保存法、（８）保存する期間
が２年以上である（１）〜（７）のいずれかに記載の保
存法、および（９）アンチトロンビン−III乾燥製剤を
１００Ｐａ（Ｎ／ｍ^２）以下の減圧下に保存する前記
（１）〜（８）のいずれかに記載の保存法、である。

【００１１】

【発明の実施の形態】これまで、ＡＴ-III乾燥製剤の保
存や運搬は、力価の低下を極力抑えるために、通常０〜
１０℃の冷所でおこなわれてきた。しかし、前述のとお
り本発明者らの実験によりＡＴ-III乾燥製剤、特に低ヘ
パリン親和性ＡＴ-IIIを１０％以上は含まない、より好
ましくは５％以上は含まない乾燥製剤や乾燥状態のアン
チトロンビン−IIIを、ウイルスが不活化されるまで加
熱することによって得られる乾燥製剤は、例えば、１２
〜３５℃の、いわゆる常温域でも２年以上の長期に亘り
保存が可能であり、また４５℃といった過酷な条件下で
も１０℃保存の場合と大差の無いことが判った。

【００１２】本発明におけるＡＴ-III乾燥製剤は、例え
ば、前述の特開２００１−３１６９８に記載されている
ように、血漿由来のＡＴ-III含有画分を固定化ヘパリン
を用いる精製工程と、乾燥加熱によるウイルス不活化工
程を含む製法により製造することができる。より具体的
には、原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を、好まし
くは１３℃以下で、固定化ヘパリンを用いる精製法、つ
まりヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーに付
す。この工程自体は公知であり、好適に用いられる吸着
支持体は、たとえばヘパリンがセルロース、アガロース
等の不溶性担体に共有結合したものである。この工程に
より大部分の夾雑物を除去することができる。得られた
ＡＴ-IIIを含む溶液は、必要により自体公知の限外濾過
に付し、さらに必要により陰イオン交換体による吸脱着
処理工程に付される。これらの工程も１３℃以下で行う
ことが好ましい。使用される陰イオン交換体としては、
その解離度（ｐＫａ）が通常１０．３以上、好ましくは
１０．５以上のものである。その構造的特徴として、４
級アミノ基を有するもの、特にトリアルキルアミノアル
キル基を有するものが好適に使用される。陰イオン交換
体の具体例としては、たとえばトリメチルアミノメチル
基、ジエチルヒドロキシプロピルアミノエチル基などの
トリアルキルアミノアルキル基を有するものが挙げられ
る。これらの中でもトリメチルアミノメチル基を有する
ものが特に好ましい。

【００１３】これらの官能基を有する不溶性担体として
は、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリビニル共
重合体、ポリスチレン共重合体などが挙げられる。ＡＴ
-III含有液と陰イオン交換体との接触条件はｐＨ６〜８
程度、塩濃度０〜０．５Ｍ程度が好ましく、このような
条件を具有する溶媒としては、たとえば０．０５Ｍ塩化
ナトリウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜
７．５）等が挙げられる。また、溶出条件はｐＨ６〜８
程度、塩濃度０．１〜０．５Ｍ程度のものがよく、具体
例としては、溶媒として０．１７Ｍ塩化ナトリウム含有
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）などが挙げられる。

【００１４】接触方法はカラム法、バッチ法のいずれで
もよい。バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調整し
たＡＴ-III含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該強
陰イオン交換体に接触させる。その条件としては、該交
換体１ｍｌに対して該水溶液１〜１００ｍｌを用い、３
０分〜２時間程度混和した後に遠心分離して、該交換体
を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶媒を添加
する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心分離して
上澄を回収する。一方、カラム法にて行う場合、上記の
接触条件に調整したＡＴ-III含有水溶液を同じ条件で平
衡化し、且つカラムに充填された当該強陰イオン交換体
に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラムを
洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。

【００１５】この工程により、ヘパリン・アフィニティ
ークロマトグラフィーによっても除去しきれなかった、
ヘパリンと親和性を有する夾雑物および混在する可能性
のある各種ウイルスが実質的に除去される。この後、必
要により再度前述の固定化のヘパリンを用いる精製工程
に付してもよい。このようにして得られた精製ＡＴ-III
を含む水溶液は乾燥製剤、すなわち水分含量が５％以
下、望ましくは３％以下となるよう乾燥される。この乾
燥工程においても、処理温度はなるべく低い方が好まし
く、通常の凍結乾燥によりこの条件は満たされる。乾燥
製剤の形状は、粉末状、ケーキ状または他のいずれの形
態でもよい。得られた乾燥状のＡＴ-IIIは、さらにウイ
ルスが不活化されるまで加熱される。加熱温度は５０〜
８０℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６
０〜７０℃である、加熱時間は２４〜１２０時間、好ま
しくは７２〜１０８時間、さらに好ましくは８４〜１０
０時間程度である。加熱時の雰囲気としては通常大気圧
の空気が用いられるが必要により減圧空気、窒素その他
の不活性ガス中で行っても差し支えない。また加熱時の
ＡＴ-IIIの熱変性を極力防止する目的で糖、糖アルコー
ル、各種アミノ酸、有機酸塩類、及び無機酸塩類等を溶
液中に添加しておき、それを乾燥して加熱処理に付して
もよい。加熱はどのような手段でもよいが、オーブン、
赤外線照射、砂浴または水浴などの手段が適宜使用され
る。

【００１６】この加熱工程の操作によりウイルスは不活
化され、しかも液状加熱の場合と違って低ヘパリン親和
性ＡＴ-IIIの含量が少なく、且つ開裂したＡＴ-IIIが実
質的に含まれていない精製ＡＴ-IIIが得られる。ここに
活性ウイルスを実質的に含まないＡＴ-IIIとは、ウイル
スの不活化処理によりウイルスが培養不可能なレベルに
まで減少したＡＴ-IIIを意味し、この状態に至ったＡＴ
-IIIはヒトに投与してもウイルス感染の恐れはない。な
お、こうした精製工程中にウイルス除去膜処理等を施す
ことで、より安全な製剤を提供することができる。低ヘ
パリン親和性ＡＴ-IIIの含有率（％）は、後述の二次元
交叉免疫電気泳動法による総ＡＴ-IIIの沈降線下面積に
対する低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIの沈降線下面積の百分
率で表される。当該沈降線下面積での定量が困難な場合
は、ヘパリンアフィニティーカラムによる分析におい
て、ＡＴ−III抗原のピークのうち、ヘパリンへの親和
性の低いピークのものの総ＡＴ−IIIピークに対する百
分率で表すことにする。なお、簡易的には、加熱処理前
後のＡＴ−III活性（ヘパリンコファクター活性）の低
下率（％）を低ヘパリン親和性ＡＴ−IIIの含量とする
ことも可能である。いずれの方法を用いた場合において
も、低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIの含有率（％）は、総Ａ
Ｔ−III蛋白に占める低ヘパリン親和性のＡＴ−III蛋白
の百分率で示すものとする。乾燥製剤は、水分５重量％
以下、好ましくは３重量％以下の製剤であることが望ま
しい。乾燥製剤は、通常バイアル瓶などの密閉容器に保
存される。容器内の気体は、空気でもよく、窒素または
炭酸ガスなどにより置換されていてもよい。更に減圧で
もよく、その場合は、１００Ｐａ（Ｎ／ｍ^２）以下、好
ましくは、５０Ｐａ以下、特に好ましくは１０ｐａ以下
である。

【００１７】このようにして得られた乾燥ＡＴ-III製剤
は、１０℃を越え４５℃を越えない、いわゆる常温域を
含む温度域で少なくとも２年、高い力価を保持したまま
保存することができる。保存温度は、好ましくは１２〜
３５℃、さらに好ましくは１５〜３０℃である。即ち、
国内における通常の病院での室温保存管理下で保存する
ことが可能である。製剤化は、医薬上許容される添加剤
（希釈剤、等張化剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製
剤上の常套手段により行うことができる。乾燥製剤、特
に凍結乾燥製剤は用事に注射用蒸留水等の溶解液に溶解
して用いられる。本発明により保存されたＡＴ-III乾燥
製剤は、長期の常温保存にも拘わらず力価の低下が少な
く、再溶解したときも無色透明であり、可視的異物も認
められない。

【００１８】

【実施例】以下に実施例および試験例をあげてさらに本
発明を具体的に説明するが、本発明はそれらによって限
定されるものではない。 実施例１ コーン低温エタノール分画の上清Ｉ約１７５リットルを
ＤＥＡＥ陰イオン交換体で処理した後、未吸着分をプー
ルとして集めた。０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で予め平衡化したヘパリン−セファロース６ＦＦゲ
ル約３７００ｍｌを充填したカラムに前述のプール画分
を５℃で負荷した。引き続き、５〜１０℃で０．３Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．３）３０リットルで洗浄した後、２．０Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３
０リットルでＡＴ-IIIを溶出した。ヘパリン−セファロ
ースゲルから溶出したＡＴ-III画分を限外濾過装置（フ
ィルトロン社製、ポアサイズ１０Ｋ）を用い、５〜１０
℃で０．１Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００
０ｍｌになるまで濃縮した。前記画分を０．０１Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約１０リットルに希釈し
た。予め０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したＱ−セファロースＦＦゲル（ファルマシア製、
トリメチルアミノメチル／架橋アガロース）約３４００
ｍｌに前述の希釈液を５〜１０℃で負荷した。次いで、
同温度条件下で０．１２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を６０リットル送液し
て洗浄した後、０．１７Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０リットル送液
しＡＴ-IIIを溶出した。

【００１９】この溶出画分をさらに精製するため、再度
ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。すなわち
０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で予め平衡化
したヘパリンセファロースゲル約３７００ｍｌを充填し
たカラムに、前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液
を５〜１０℃で負荷した。引き続き、同温度条件下でそ
れぞれ０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０リットルで洗浄した後、
２．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．３）を３０リットルでＡＴ-IIIを溶出した。

【００２０】ヘパリン−セファロースゲルから溶出した
溶液を前述のものと同一の限外濾過装置を用い、１０℃
以下で濃縮・緩衝液交換を行った。交換緩衝液として、
０．０７Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を用い、２８０ｎｍの吸光度にて１
０になるよう希釈・調製したものを（ａ）液とした。そ
の（ａ）液を凍結乾燥し、得られた乾燥品（水分１％）
を品温６５℃で９６時間加熱処理を行った。このように
して得られた乾燥品１３ｇを注射用水３２５ミリリット
ルに溶解した。この溶液にＬ−グルタミン酸ナトリウム
を１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、ウイルス除去膜
（旭化成製、プラノバ（登録商標）３５Ｎ）処理を実施
した。得られた溶液各１０ｍｌをバイアル瓶に分注して
凍結乾燥し、減圧下（１０Ｐａ）に密栓し、ＡＴ-III乾
燥製剤（Ａ）を得た。

【００２１】試験例１ 乾燥製剤の保存期間、保存温度とＡＴ-IIIの力価の関係 乾燥製剤（Ａ）は、それぞれのバイアル瓶３本を遮光
下、１０℃、２５℃および４０℃の各温度において０〜
２７ヶ月保存したものの外観等を観察し、注射用水に溶
解して１０ｍｌとしたものを試料液とした。ついで、そ
れぞれの試験項目について観察、測定し、数値に関して
は３本の平均値を〔表１〕〜〔表３〕に示した。ＡＴ-I
II活性は、生物学的製剤基準記載のＡＴ-III力価測定法
により測定した。製造直後の乾燥製剤（Ａ）中の低ヘパ
リン親和性ＡＴ-IIIの含有率は試料液の二次元交叉免疫
電気泳動法での沈降線下面積を算出することにより求め
たが、検出限界以下であった。なお、二次元交叉免疫電
気泳動は、Sasらの方法〔BritishJournal of Haematolo
gy ３０巻 ２６５−２７２（１９７５）〕に従って、
４２単位／mlのヘパリンナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製
Ｈ−７００５）の存在下で１次元目の泳動を、抗ＡＴ-I
II抗体（ＳＩＧＭＡ社製 Ａ−８９０４）の存在下で２
次元目の泳動を行った。低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIはヘ
パリンの存在下での一次元目の泳動において動きが遅
く、ヘパリン親和性ＡＴ-IIIよりも陰極側に寄った沈降
線として現れる。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【表３】

【００２５】試験例２ 実施例１に準じて別途調製した乾燥製剤（Ｂ）とウイル
ス不活化を６０℃、１０時間の液状加熱により実施した
市販のＡＴ-III凍結乾燥製剤（Ｃ）について、遮光下、
５５℃，１ヶ月間保持後、性状を観察し、ＡＴ-IIIの力
価等を測定して、その結果を〔表４〕に示した。なお、
製剤（Ｃ）は、低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIの含有率が１
７％であった。なお、低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIの含有
率は二次元交叉免疫電気泳動法により測定した。

【００２６】

【表４】

【００２７】〔表１〕〜〔表３〕から明らかなように、
本発明の試料（Ａ）は、保存温度１０℃、２５℃および
４０℃のいずれの場合においても、性状には全く問題が
なく、かつＡＴ-III力価は初期値に対して９０％以上の
力価を保持していた。また、〔表４〕に示されているよ
うに、試料（Ｂ）は、５５℃、２ヶ月の苛酷条件によっ
ても、ＡＴ-IIIの残存力価は殆ど低下しなかったのに対
し、試料（Ｃ）は同条件で残存力価が９０％を割り、長
期の保存は困難であることを示した。

【００２８】実施例２ コーンエタノール分画の上清Ｉ約１７５Ｌを、０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したヘパリンセ
ファロース６ＦＦゲル３７００ｍｌを充填したカラムに
４℃で負荷した。引き続き、５〜１０℃で０．３Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０Ｌで洗浄後、２．０Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
３）３０ＬでＡＴ-IIIを溶出した。この溶出画分を限界
濾過装置（フィルトロン社製、ポアサイズ１０Ｋ）を用
い、０．１Ｍ以下の塩濃度になるように脱塩し、約２０
００ｍｌとなるように濃縮した。前記画分を予め０．０
１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セ
ファロースＦＦゲル（ファルマシア社製）約３４００ｍ
ｌに５〜１０℃で負荷した。ついで０．１２Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で洗浄後、０．１７Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ＬでＡＴ-IIIを溶出
した。この溶出画分を再度、０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．３）で平衡化したヘパリンセファロース６Ｆ
Ｆゲルを３７００ｍｌ充填したカラムに４℃で負荷し
た。引き続き、５〜１０℃で０．３Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．３）３０Ｌで洗浄後、２．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０Ｌ
でＡＴ-IIIを溶出した。上記のヘパリンセファロースゲ
ルから溶出したものを前述の限外濾過装置で１０℃で
０．０７Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に置換し、最終濃度として１０ｍｇ
／ｍｌとなるようにＬ−グルタミ酸ナトリウムを加え
（Ｘ）液を得た。（Ｘ）液を０，５Ｍクエン酸ナトリウ
ムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換
後、６０℃１０時間の液状加熱処理を行い、前述の
（Ｘ）液を同様の緩衝液組成に再度置換した液を（Ｙ）
液とした。さらに（Ｘ）液と（Ｙ）液を等量混合した液
を（Ｚ）液とした。（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）の各液は、
１０ｍｌずつバイアル瓶に充填後、凍結乾燥し、その後
密栓して（Ｘ）製剤、（Ｙ）製剤、（Ｚ）製剤をそれぞ
れ得た。

【００２９】試験例３ 低ヘパリン親和性のＡＴ-III含量の違いによる保存期間
中のＡＴ-III残存力価への影響を確認するため、低ヘパ
リン親和性ＡＴ-IIIを産生する液状加熱処理を行い、加
熱処理をしていないもの及び両者の混合物を調製し、４
０℃及び５５℃での残存力価を検討した。液状加熱処理
をしていない上記製剤（Ｘ）製剤とウイルス不活化処理
として６０℃１０時間加熱処理を行った（Ｙ）製剤、並
びに（Ｘ）と（Ｙ）液を等量混合して得られた（Ｚ）製
剤について、４０℃及び５５℃による経時的な保存期間
（０〜７ヶ月）後に注射用水１０ｍｌを加え、ＡＴ-III
活性を生物学的製剤基準に記載のＡＴ-III力価測定方法
により測定した。その結果を表５および表６に示した。
残存力価は、調製直後の保存期間０ヶ月のものを１００
として所定保存期間後の残存活性を百分率にて示した。
低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIの含有率は、（Ｘ）製剤のＡ
Ｔ-III活性（ヘパリンのコファクター活性）を１００と
し、保存試験開始前の（Ｙ）及び（Ｚ）製剤のＡＴ-III
活性を測定し、その活性低下率を低ヘパリン親和性ＡＴ
-III含有率として表示した。なお、（Ｘ）製剤の低ヘパ
リン親和性ＡＴ-IIIの含有率は、二次元交叉免疫電気泳
動法による測定で検出限界以下であった。

【００３０】

【表５】

【００３１】

【表６】 表５及び表６から明らかなように、製剤中の低ヘパリン
親和性ＡＴ-IIIの含有率が高くなるほど残存力価が低下
した。この結果は、表４に示す市販の液状加熱処理を行
った低ヘパリン親和性のＡＴ-IIIを多く含む試料におけ
る残存力価の低下が低ヘパリン親和性ＡＴ-IIIによるも
のであることを示すものである。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、アンチトロンビン−II
I乾燥製剤を１０℃を越え、４５℃を越えない、いわゆ
る常温域を含む温度域で少なくとも２年以上その力価を
あまり低下させず保存することができ、また溶解時、無
色澄明で可視的異物を認めない溶液が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 仁 千葉県成田市新泉３番地の１ 日本製薬株 式会社成田工場内 Ｆターム(参考） 4C076 AA29 BB11 CC14 DD43 DD51 FF36 GG07 4C084 AA02 AA03 BA44 DC35 MA44 MA66 NA01 NA03 ZA542

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アンチトロンビン−III乾燥製剤を、１０
   ℃を超え４５℃を超えない温度域で保存するアンチトロ
   ンビン−III製剤の保存法。
2. 【請求項２】保存する温度域が１２〜３５℃である請求
   項１記載の保存法。
3. 【請求項３】アンチトロンビン−III乾燥製剤が低ヘパ
   リン親和性アンチトロンビン−IIIを１０％以上は含ま
   ないものである請求項１記載の保存法。
4. 【請求項４】アンチトロンビン−III乾燥製剤が低ヘパ
   リン親和性アンチトロンビン−IIIを５％以上は含まな
   いものである請求項１記載の保存法。
5. 【請求項５】アンチトロンビン−III乾燥製剤が、ヒト
   血漿または誘導ヒト血漿画分を固定化ヘパリンを用いる
   精製工程に付し、さらに乾燥工程に付した後、乾燥状態
   のアンチトロンビン−IIIをウイルスが不活化されるま
   で加熱することにより得られたものである請求項１記載
   のアンチトロンビン−III製剤の保存法。
6. 【請求項６】アンチトロンビン−III乾燥製剤が、固定
   化ヘパリンを用いる精製工程に付した後、乾燥工程に付
   す前に、アンチトロンビン−IIIを含む溶液を陰イオン
   交換体による吸脱着工程および固定化ヘパリンを用いる
   精製工程に付すことにより得られたものである請求項５
   記載の保存法。
7. 【請求項７】アンチトロンビン−III乾燥製剤が、ウイ
   ルスの不活化を、５０〜８０℃、２４〜１２０時間で行
   うことにより得られたものである請求項５または６記載
   の保存法。
8. 【請求項８】保存する期間が２年以上である請求項１〜
   ７のいずれかに記載の保存法。
9. 【請求項９】アンチトロンビン−III乾燥製剤を１００
   Ｐａ（Ｎ／ｍ^２）以下の減圧下に保存する請求項１〜８
   のいずれかに記載の保存法。