JP2003342294A - タンパク質の失活を抑制する方法 - Google Patents
タンパク質の失活を抑制する方法Info
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- JP2003342294A JP2003342294A JP2002147371A JP2002147371A JP2003342294A JP 2003342294 A JP2003342294 A JP 2003342294A JP 2002147371 A JP2002147371 A JP 2002147371A JP 2002147371 A JP2002147371 A JP 2002147371A JP 2003342294 A JP2003342294 A JP 2003342294A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】エンドトキシン含有タンパク質を界面活性剤で
処理してエンドトキシンを不活化する際、目的とするタ
ンパク質が分解、変性して、その活性が低下する場合が
ある。そこで、界面活性剤処理において、エンドトキシ
ンの不活化を抑制せず、タンパク質の失活を極力抑制す
るようなタンパク質の安定化方法を提供することにあ
る。 【解決手段】エンドトキシン含有タンパク質溶液に、安
定化剤としてアミノ酸、糖類またはポリオールを加え、
界面活性剤処理することにより、前記課題を解決した。
処理してエンドトキシンを不活化する際、目的とするタ
ンパク質が分解、変性して、その活性が低下する場合が
ある。そこで、界面活性剤処理において、エンドトキシ
ンの不活化を抑制せず、タンパク質の失活を極力抑制す
るようなタンパク質の安定化方法を提供することにあ
る。 【解決手段】エンドトキシン含有タンパク質溶液に、安
定化剤としてアミノ酸、糖類またはポリオールを加え、
界面活性剤処理することにより、前記課題を解決した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンドトキシンを
含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目的
として界面活性剤で処理する際、目的タンパク質の失活
を抑制する方法に関する。
含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目的
として界面活性剤で処理する際、目的タンパク質の失活
を抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞膜
構成成分であるリポ多糖とタンパク質の複合体であり、
哺乳動物の体内に入ると動物を発熱させたり毒性を示す
物質である。タンパク質を医薬品として用いる場合や、
タンパク質を動物試験に用いる場合、使用に先立ちその
タンパク質溶液がエンドトキシンを含まないようにする
か、または含まれているエンドトキシンを除去または不
活化することが重要である。しかし、タンパク質溶液中
にエンドトキシンが含まれないようにするとか、含まれ
ている場合にそれを除去または不活化することは容易な
ことではない。
構成成分であるリポ多糖とタンパク質の複合体であり、
哺乳動物の体内に入ると動物を発熱させたり毒性を示す
物質である。タンパク質を医薬品として用いる場合や、
タンパク質を動物試験に用いる場合、使用に先立ちその
タンパク質溶液がエンドトキシンを含まないようにする
か、または含まれているエンドトキシンを除去または不
活化することが重要である。しかし、タンパク質溶液中
にエンドトキシンが含まれないようにするとか、含まれ
ている場合にそれを除去または不活化することは容易な
ことではない。
【０００３】従来エンドトキシンを除去する方法として
は、分画法、陰イオン交換体などを用いたクロマトグラ
フィー法など、エンドトキシンと目的タンパク質にそれ
ぞれ異なった挙動をとらせることによりエンドトキシン
をタンパク質から分画する方法が知られている。また、
エンドトキシンに特異的親和性を持つ、例えばポリミキ
シンＢをリガンドとしたクロマトグラフィーを用いるこ
とも効果的である。しかしこれらの方法ではエンドトキ
シン画分と目的タンパク質画分を完全に分離することは
難しい。一方、エンドトキシンを失活化する方法として
は、タンパク質溶液を熱、酸、アルカリ、ある種の界面
活性剤で処理する等の方法があげられる。しかし、これ
らの処理は多くの場合、目的とするタンパク質が致命的
かつ不可逆的なダメージを受けてしまう。
は、分画法、陰イオン交換体などを用いたクロマトグラ
フィー法など、エンドトキシンと目的タンパク質にそれ
ぞれ異なった挙動をとらせることによりエンドトキシン
をタンパク質から分画する方法が知られている。また、
エンドトキシンに特異的親和性を持つ、例えばポリミキ
シンＢをリガンドとしたクロマトグラフィーを用いるこ
とも効果的である。しかしこれらの方法ではエンドトキ
シン画分と目的タンパク質画分を完全に分離することは
難しい。一方、エンドトキシンを失活化する方法として
は、タンパク質溶液を熱、酸、アルカリ、ある種の界面
活性剤で処理する等の方法があげられる。しかし、これ
らの処理は多くの場合、目的とするタンパク質が致命的
かつ不可逆的なダメージを受けてしまう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、タン
パク質溶液中に含まれるエンドトキシンの活性を界面活
性剤を用いて低減する工程において、エンドトキシンの
活性を減弱化し、目的とするタンパク質の活性をなるべ
く高く保持できる方法を提供することにある。
パク質溶液中に含まれるエンドトキシンの活性を界面活
性剤を用いて低減する工程において、エンドトキシンの
活性を減弱化し、目的とするタンパク質の活性をなるべ
く高く保持できる方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため、界面活性剤処理による目的タンパク質
の変性を抑制する物質について種々研究を重ねた結果、
処理時にアミノ酸、糖類またはポリオールを存在させる
ことによってタンパク質が安定化させられることを知見
し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
を解決するため、界面活性剤処理による目的タンパク質
の変性を抑制する物質について種々研究を重ねた結果、
処理時にアミノ酸、糖類またはポリオールを存在させる
ことによってタンパク質が安定化させられることを知見
し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、（１）エンドトキシン
を含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目
的として界面活性剤で処理する際、アミノ酸、糖類およ
びポリオールから選ばれた少なくとも一種を存在させる
ことを特徴とするタンパク質の失活を抑制する方法、
（２）界面活性剤が陰イオン界面活性剤、両性界面活性
剤または非イオン界面活性剤である（１）記載の方法、
（３）界面活性剤がステロイド骨格を持つ化合物を主成
分とする界面活性剤である（１）記載の方法、（４）界
面活性剤が、コール酸ナトリウム、３−［（３−コール
アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン
スルホン酸（ＣＨＡＰＳ）またはポリオキシエチレンオ
クチルフェニルエーテルである（１）記載の方法、
（５）界面活性剤の濃度が０．５〜５ｗ／ｖ％である
（１）記載の方法、（６）アミノ酸の濃度が５〜２０ｗ
／ｖ％である（１）記載の方法、（７）アミノ酸がグル
タミン酸、リジンまたはグリシンである（１）または
（６）記載の方法、（８）糖類の濃度が５〜５０ｗ／ｖ
％である（１）記載の方法、（９）糖類がショ糖または
マンニトールである（１）または（８）記載の方法、
（１０）ポリオールの濃度が５〜５０ｗ／ｖ％である
（１）記載の方法、（１１）ポリオールがエチレングリ
コール、ポリエチレングリコールまたはグリセロールで
ある（１）または（１０）記載の方法、および（１２）
（１）記載の界面活性剤による処理の後に、タンパク質
溶液を限外ろ過膜を用いて界面活性剤を除去することを
特徴とするタンパク質含有水溶液の調製方法、である。
を含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目
的として界面活性剤で処理する際、アミノ酸、糖類およ
びポリオールから選ばれた少なくとも一種を存在させる
ことを特徴とするタンパク質の失活を抑制する方法、
（２）界面活性剤が陰イオン界面活性剤、両性界面活性
剤または非イオン界面活性剤である（１）記載の方法、
（３）界面活性剤がステロイド骨格を持つ化合物を主成
分とする界面活性剤である（１）記載の方法、（４）界
面活性剤が、コール酸ナトリウム、３−［（３−コール
アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン
スルホン酸（ＣＨＡＰＳ）またはポリオキシエチレンオ
クチルフェニルエーテルである（１）記載の方法、
（５）界面活性剤の濃度が０．５〜５ｗ／ｖ％である
（１）記載の方法、（６）アミノ酸の濃度が５〜２０ｗ
／ｖ％である（１）記載の方法、（７）アミノ酸がグル
タミン酸、リジンまたはグリシンである（１）または
（６）記載の方法、（８）糖類の濃度が５〜５０ｗ／ｖ
％である（１）記載の方法、（９）糖類がショ糖または
マンニトールである（１）または（８）記載の方法、
（１０）ポリオールの濃度が５〜５０ｗ／ｖ％である
（１）記載の方法、（１１）ポリオールがエチレングリ
コール、ポリエチレングリコールまたはグリセロールで
ある（１）または（１０）記載の方法、および（１２）
（１）記載の界面活性剤による処理の後に、タンパク質
溶液を限外ろ過膜を用いて界面活性剤を除去することを
特徴とするタンパク質含有水溶液の調製方法、である。
【０００７】
【発明の実施の形態】界面活性剤処理の対象となるエン
ドトキシン含有タンパク質としては、たとえば血漿タン
パク質、遺伝子組換え生産タンパク質等があり、特に自
体生理活性を有するタンパク質としては、たとえばトロ
ンビン、アンチトロンビン、血液凝固第IX因子、プロテ
インＣ、プロテインＳなど、原料またはいずれかの精製
工程においてエンドトキシンが混入してくる可能性のあ
るタンパク質が挙げられる。安定化剤として使用するア
ミノ酸の種類は特に限定されないが、グルタミン酸、リ
ジン、グリシン等が好ましい。その濃度は５〜２０ｗ／
ｖ％が適当である。糖類としてはたとえば単糖、二糖、
寡糖、糖アルコールなどが用いられ、その代表的な例と
して、たとえばショ糖、マンニトールなどが挙げられ
る。その濃度は５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。
ドトキシン含有タンパク質としては、たとえば血漿タン
パク質、遺伝子組換え生産タンパク質等があり、特に自
体生理活性を有するタンパク質としては、たとえばトロ
ンビン、アンチトロンビン、血液凝固第IX因子、プロテ
インＣ、プロテインＳなど、原料またはいずれかの精製
工程においてエンドトキシンが混入してくる可能性のあ
るタンパク質が挙げられる。安定化剤として使用するア
ミノ酸の種類は特に限定されないが、グルタミン酸、リ
ジン、グリシン等が好ましい。その濃度は５〜２０ｗ／
ｖ％が適当である。糖類としてはたとえば単糖、二糖、
寡糖、糖アルコールなどが用いられ、その代表的な例と
して、たとえばショ糖、マンニトールなどが挙げられ
る。その濃度は５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。
【０００８】ポリオールとしてはたとえばエチレングリ
コール、分子量１，０００〜２０，０００のポリエチレ
ングリコール、グリセロール等が例示され、それらの濃
度は、５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。界面活性剤の種
類は特に限定されないが、陰イオン界面活性剤、両性界
面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく、特に好まし
いものとしてコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰ
Ｓ）などの分子中にステロイド骨格を持つ界面活性剤
や、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルなど
の非イオン界面活性剤などが挙げられる。タンパク質溶
液中の界面活性剤の使用濃度は０．５〜５ｗ／ｖ％程度
が適当である。
コール、分子量１，０００〜２０，０００のポリエチレ
ングリコール、グリセロール等が例示され、それらの濃
度は、５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。界面活性剤の種
類は特に限定されないが、陰イオン界面活性剤、両性界
面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく、特に好まし
いものとしてコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰ
Ｓ）などの分子中にステロイド骨格を持つ界面活性剤
や、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルなど
の非イオン界面活性剤などが挙げられる。タンパク質溶
液中の界面活性剤の使用濃度は０．５〜５ｗ／ｖ％程度
が適当である。
【０００９】界面活性剤によるエンドトキシンの失活化
反応の反応温度、反応時間、ｐＨ等の条件は、目的とす
るタンパク質の安定性に従い決定すればよいが、通常反
応温度は、４〜２５℃、反応時間は１分〜２４時間程
度、ｐＨ範囲は５〜９程度である。反応液は必要により
撹拌することができる。添加した界面活性剤を除去する
場合は、沈澱法、透析法、限外ろ過法等が好ましい。限
外ろ過膜の分画分子量は、界面活性剤の大きさ、ミセル
の状態、限界ミセル濃度、目的タンパク質の大きさなど
の情報から総合的に判断すればよい。本発明は、タンパ
ク質が高濃度の界面活性剤に曝露された場合のタンパク
質の失活化を極力防ぐための方法を提供することにあ
る。そのため、高濃度の界面活性剤にタンパク質が曝露
される環境ならば、エンドトキシンの失活化を目的とす
ることに限らず使用することができる。その一例とし
て、ウイルス不活化を目的とした溶媒・洗浄剤処理（Ｓ
／Ｄ処理）が挙げられる。この場合は、タンパク質の失
活化の程度とウイルス不活化の程度を総合的に評価し、
条件を設定すればよい。
反応の反応温度、反応時間、ｐＨ等の条件は、目的とす
るタンパク質の安定性に従い決定すればよいが、通常反
応温度は、４〜２５℃、反応時間は１分〜２４時間程
度、ｐＨ範囲は５〜９程度である。反応液は必要により
撹拌することができる。添加した界面活性剤を除去する
場合は、沈澱法、透析法、限外ろ過法等が好ましい。限
外ろ過膜の分画分子量は、界面活性剤の大きさ、ミセル
の状態、限界ミセル濃度、目的タンパク質の大きさなど
の情報から総合的に判断すればよい。本発明は、タンパ
ク質が高濃度の界面活性剤に曝露された場合のタンパク
質の失活化を極力防ぐための方法を提供することにあ
る。そのため、高濃度の界面活性剤にタンパク質が曝露
される環境ならば、エンドトキシンの失活化を目的とす
ることに限らず使用することができる。その一例とし
て、ウイルス不活化を目的とした溶媒・洗浄剤処理（Ｓ
／Ｄ処理）が挙げられる。この場合は、タンパク質の失
活化の程度とウイルス不活化の程度を総合的に評価し、
条件を設定すればよい。
【００１０】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ ヒト・アンチトロンビン-IIIの安定化剤の効果実験 （１）アンチトロンビン−IIIの調製 コーン低温エタノール分画の上清I約１７．５リットル
を４００ｍＬのＤＥＡＥ陰イオン交換体により処理した
後、未吸着画分をプールとして集めた。０．０２Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘパリ
ン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラムに
前述のプール画分を負荷した。引き続き、０．０２Ｍの
リン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．
３）３．０リットルで洗浄した後、０．０２Ｍリン酸緩
衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．
０リットルでアンチトロンビン−IIIを溶出した。
る。 実施例１ ヒト・アンチトロンビン-IIIの安定化剤の効果実験 （１）アンチトロンビン−IIIの調製 コーン低温エタノール分画の上清I約１７．５リットル
を４００ｍＬのＤＥＡＥ陰イオン交換体により処理した
後、未吸着画分をプールとして集めた。０．０２Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘパリ
ン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラムに
前述のプール画分を負荷した。引き続き、０．０２Ｍの
リン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．
３）３．０リットルで洗浄した後、０．０２Ｍリン酸緩
衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．
０リットルでアンチトロンビン−IIIを溶出した。
【００１１】ついで、ヘパリン−セファーロースゲルか
ら溶出したアンチトロンビン−III画分を限外ろ過装置
（ポール社製 分画分子量１０ｋＤａ）を用い、０．１
Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍＬになる
まで濃縮した。前記画分を０．０１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で約１．０リットルに希釈した。前もっ
て０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
たＱ−セファロースＦＦゲル（トリメチルアミノメチル
／アガロース、アマシャムバイオサイエンス社製）約３
４０ｍＬに前述の希釈液を負荷した。次いで、０．０１
Ｍのリン酸緩衝液、０．１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７．０）を６．０リットル送液して洗浄した後、０．
０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶液
（ｐＨ７．０）を３．０リットル送液しアンチトロンビ
ン−IIIを溶出した。
ら溶出したアンチトロンビン−III画分を限外ろ過装置
（ポール社製 分画分子量１０ｋＤａ）を用い、０．１
Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍＬになる
まで濃縮した。前記画分を０．０１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で約１．０リットルに希釈した。前もっ
て０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
たＱ−セファロースＦＦゲル（トリメチルアミノメチル
／アガロース、アマシャムバイオサイエンス社製）約３
４０ｍＬに前述の希釈液を負荷した。次いで、０．０１
Ｍのリン酸緩衝液、０．１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７．０）を６．０リットル送液して洗浄した後、０．
０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶液
（ｐＨ７．０）を３．０リットル送液しアンチトロンビ
ン−IIIを溶出した。
【００１２】この溶出画分をさらに精製するため、再度
ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。０．０２Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘ
パリン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラ
ムに前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液を負荷し
た。引き続き、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩
化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄
した後、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナト
リウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでアンチトロ
ンビン−IIIを溶出した。得られたアンチトロンビン−I
II溶液のうち３００ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレッ
プ−１０ ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン酸
ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．
０）によりバッファーを交換した。得られた溶液中のア
ンチトロンビン−IIIの活性は１２０ＩＵ／ｍＬであっ
た。
ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。０．０２Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘ
パリン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラ
ムに前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液を負荷し
た。引き続き、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩
化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄
した後、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナト
リウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでアンチトロ
ンビン−IIIを溶出した。得られたアンチトロンビン−I
II溶液のうち３００ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレッ
プ−１０ ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン酸
ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．
０）によりバッファーを交換した。得られた溶液中のア
ンチトロンビン−IIIの活性は１２０ＩＵ／ｍＬであっ
た。
【００１３】（２）エンドトキシンを含むアンチトロン
ビン−III溶液の調製 得られたアンチトロンビン−III溶液１ｍＬに、終濃度
約１００ＩＵ／ｍＬ程度となるよう、エンドトキシン溶
液を添加した。さらに、アンチトロンビン活性が約５Ｉ
Ｕ／ｍＬとなるよう前記バッファーで希釈し、４℃に冷
却した。一方、表１の終濃度となるよう、ｐＨ調整を行
ったグルタミン酸ナトリウム、ショ糖、グリセロールの
前述バッファー溶解液に、終濃度１ｗ／ｖ％となるよう
５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム溶液を添加し、４℃に冷
却した。これを界面活性剤を含む安定化剤溶液とした。
次に、前述のエンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液０．１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶
液０．９ｍＬを混合し、すばやく且つ充分に撹拌した。
次に、４℃において２時間反応させ、エンドトキシンの
失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン活
性（テストチームＡＴIII・２キット第一化学薬品製）
およびエンドトキシン活性（エンドスペシー 生化学工
業社製）の測定を行った。被検溶液を、測定系への影響
がないよう、それぞれの希釈緩衝液を用いて２５０また
は５００倍に希釈し、各活性の測定を行った。この測定
結果を表１に示した。界面活性剤によりエンドトキシン
が全ての条件において十分に失活化していることが確認
され、さらに安定化剤を含まないものに比べ、安定化剤
を含有するものはアンチトロンビン活性が高率で保持さ
れ、安定化効果が奏されていることが確認された。
ビン−III溶液の調製 得られたアンチトロンビン−III溶液１ｍＬに、終濃度
約１００ＩＵ／ｍＬ程度となるよう、エンドトキシン溶
液を添加した。さらに、アンチトロンビン活性が約５Ｉ
Ｕ／ｍＬとなるよう前記バッファーで希釈し、４℃に冷
却した。一方、表１の終濃度となるよう、ｐＨ調整を行
ったグルタミン酸ナトリウム、ショ糖、グリセロールの
前述バッファー溶解液に、終濃度１ｗ／ｖ％となるよう
５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム溶液を添加し、４℃に冷
却した。これを界面活性剤を含む安定化剤溶液とした。
次に、前述のエンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液０．１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶
液０．９ｍＬを混合し、すばやく且つ充分に撹拌した。
次に、４℃において２時間反応させ、エンドトキシンの
失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン活
性（テストチームＡＴIII・２キット第一化学薬品製）
およびエンドトキシン活性（エンドスペシー 生化学工
業社製）の測定を行った。被検溶液を、測定系への影響
がないよう、それぞれの希釈緩衝液を用いて２５０また
は５００倍に希釈し、各活性の測定を行った。この測定
結果を表１に示した。界面活性剤によりエンドトキシン
が全ての条件において十分に失活化していることが確認
され、さらに安定化剤を含まないものに比べ、安定化剤
を含有するものはアンチトロンビン活性が高率で保持さ
れ、安定化効果が奏されていることが確認された。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例２
ヒト・プロテインＳを用いた安定化剤の効果実験
（１）ヒト・プロテインＳ溶液の調製
ヒト血漿またはコーン分画で得たＳＩ画分を、あらかじ
め２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂに負荷した。試料を
負荷した後、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝
液で洗浄し、ついで３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む平
衡化緩衝液で溶出し、ヒト・プロテインＳを含む画分を
得た。
め２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂに負荷した。試料を
負荷した後、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝
液で洗浄し、ついで３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む平
衡化緩衝液で溶出し、ヒト・プロテインＳを含む画分を
得た。
【００１６】（２）免疫吸着クロマトグラフィーによる
精製 ヒト・プロテインＳを含む画分に塩酸ベンズアミジンを
終濃度が１〜１０ｍＭとなるように加え、さらに塩化カ
ルシウムを終濃度が２ｍＭとなるように加えたのち、あ
らかじめ２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む平衡化緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し
た。カルシウム存在下でのみヒト・プロテインＳと結合
する単クローン抗体を不溶化したカラムに負荷した。カ
ラムを２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む平衡化緩衝液で洗浄したのち、５ｍＭＥＤ
ＴＡ緩衝液（ｐＨ７．３）で溶出した。得られたヒト・
プロテインＳ溶液３０ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレ
ップー１０：ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン
酸ナトリウム１５０ｍＭ、塩化ナトリウム溶液（ｐＨ
７．０）にてバッファー交換した。このプロテインＳ溶
液１５ｍＬに、終濃度８０ＥＵ／ｍＬ程度となるよう、
エンドトキシン溶液を添加した。さらに、前記バッファ
ーで希釈し、４℃に冷却した。
精製 ヒト・プロテインＳを含む画分に塩酸ベンズアミジンを
終濃度が１〜１０ｍＭとなるように加え、さらに塩化カ
ルシウムを終濃度が２ｍＭとなるように加えたのち、あ
らかじめ２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む平衡化緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し
た。カルシウム存在下でのみヒト・プロテインＳと結合
する単クローン抗体を不溶化したカラムに負荷した。カ
ラムを２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む平衡化緩衝液で洗浄したのち、５ｍＭＥＤ
ＴＡ緩衝液（ｐＨ７．３）で溶出した。得られたヒト・
プロテインＳ溶液３０ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレ
ップー１０：ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン
酸ナトリウム１５０ｍＭ、塩化ナトリウム溶液（ｐＨ
７．０）にてバッファー交換した。このプロテインＳ溶
液１５ｍＬに、終濃度８０ＥＵ／ｍＬ程度となるよう、
エンドトキシン溶液を添加した。さらに、前記バッファ
ーで希釈し、４℃に冷却した。
【００１７】一方、表２の終濃度となるようｐＨ調整を
行った各安定化剤の前述バッファー溶解液に、終濃度１
ｗ／ｖ％となるよう５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ溶液を添加
し、４℃に冷却した。これを界面活性剤を含む安定化剤
溶液とした。次に、前述のエンドトキシン含有プロテイ
ンＳ溶液１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶液
１ｍＬを混合し、素早く、且つ十分に撹拌した。４℃に
おいて１７時間反応させ、エンドトキシンの失活化を行
った。その後速やかに、プロテインＳ活性（スタクロッ
ト プロテインＳ：ロッシュ・ダイアグノスティックス
社製）およびエンドトキシン活性（エンドスペシー；生
化学工業社製）の測定を行った。被検溶液は、測定系へ
の影響が無いようそれぞれの希釈緩衝液で１０倍以上希
釈した。この測定結果を表２に示した。界面活性剤によ
りエンドトキシンが全ての条件において十分に失活化し
ていることが確認され、さらに安定化剤を含まないもの
に比べ、安定化剤を有するものにはプロテインＳ活性が
高率で保持され、安定化効果を示していることが確認さ
れた。
行った各安定化剤の前述バッファー溶解液に、終濃度１
ｗ／ｖ％となるよう５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ溶液を添加
し、４℃に冷却した。これを界面活性剤を含む安定化剤
溶液とした。次に、前述のエンドトキシン含有プロテイ
ンＳ溶液１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶液
１ｍＬを混合し、素早く、且つ十分に撹拌した。４℃に
おいて１７時間反応させ、エンドトキシンの失活化を行
った。その後速やかに、プロテインＳ活性（スタクロッ
ト プロテインＳ：ロッシュ・ダイアグノスティックス
社製）およびエンドトキシン活性（エンドスペシー；生
化学工業社製）の測定を行った。被検溶液は、測定系へ
の影響が無いようそれぞれの希釈緩衝液で１０倍以上希
釈した。この測定結果を表２に示した。界面活性剤によ
りエンドトキシンが全ての条件において十分に失活化し
ていることが確認され、さらに安定化剤を含まないもの
に比べ、安定化剤を有するものにはプロテインＳ活性が
高率で保持され、安定化効果を示していることが確認さ
れた。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例３
実施例１と同様にして、エンドトキシン含有アンチトロ
ンビン−III溶液を調製した。次に安定化剤として最終
濃度１０ｗ／ｖ％のグリセロールを含み、さらに表３に
示す界面活性剤を含むように調製し、これを界面活性剤
含有安定化剤溶液とした。これらの液を１０℃で保存し
た。次に前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液１ｍＬを混
合し、１０℃、２４時間反応させた後エンドトキシンの
失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン−
III活性およびエンドトキシン活性の測定を行い、その
結果を表３に示した。同じ界面活性剤を用いても、安定
化剤の存否により残存アンチトロンビンIII活性に差の
あることが確認された。
ンビン−III溶液を調製した。次に安定化剤として最終
濃度１０ｗ／ｖ％のグリセロールを含み、さらに表３に
示す界面活性剤を含むように調製し、これを界面活性剤
含有安定化剤溶液とした。これらの液を１０℃で保存し
た。次に前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液１ｍＬを混
合し、１０℃、２４時間反応させた後エンドトキシンの
失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン−
III活性およびエンドトキシン活性の測定を行い、その
結果を表３に示した。同じ界面活性剤を用いても、安定
化剤の存否により残存アンチトロンビンIII活性に差の
あることが確認された。
【００２０】
【表３】
＋：安定剤添加
−：安定剤無添加
【００２１】実施例４
実施例１と同様の方法で、エンドトキシン含有アンチト
ロンビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として
最終濃度５、１０または２０ｗ／ｖ％のグルタミン酸ナ
トリウム、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％ショ
糖、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％のグリセロー
ルに界面活性剤として、最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナ
トリウムを加えたものを界面活性剤含有安定化剤溶液と
した。これらの液を２５℃で保存した。実施例１と同様
にして、前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９
ｍＬを混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづ
いてアンチトロンビン−IIIおよびエンドトキシン活性
の測定を行い、その結果を表４に示した。この結果か
ら、同じ安定化剤を用いても、アンチトロンビンIIIの
安定効果は安定化剤の濃度に依存することが確認され
た。
ロンビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として
最終濃度５、１０または２０ｗ／ｖ％のグルタミン酸ナ
トリウム、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％ショ
糖、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％のグリセロー
ルに界面活性剤として、最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナ
トリウムを加えたものを界面活性剤含有安定化剤溶液と
した。これらの液を２５℃で保存した。実施例１と同様
にして、前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−II
I溶液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９
ｍＬを混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづ
いてアンチトロンビン−IIIおよびエンドトキシン活性
の測定を行い、その結果を表４に示した。この結果か
ら、同じ安定化剤を用いても、アンチトロンビンIIIの
安定効果は安定化剤の濃度に依存することが確認され
た。
【００２２】
【表４】
【００２３】実施例５
実施例４と同様にしてエンドトキシン含有アンチトロン
ビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として最終
濃度２０ｗ／ｖ％グリセロールを、界面活性剤として、
最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムを含む界面活性
剤含有安定化剤液を調製した。次いで、実施例１と同様
にして、エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶
液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９ｍＬ
を混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづい
て、緩衝液で４０倍に希釈した後、分画分子量１０ｋＤ
ａの限外ろ過膜を用いて緩衝液を交換し、界面活性剤を
除去した。その後、エンドトキシンおよびアンチトロン
ビン−IIIの活性を測定し、表５に示す結果を得た。こ
の結果から限外ろ過膜により界面活性剤が高度に除去さ
れ、且つ界面活性剤除去後も、低エンドトキシン活性を
維持していることが確認された。
ビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として最終
濃度２０ｗ／ｖ％グリセロールを、界面活性剤として、
最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムを含む界面活性
剤含有安定化剤液を調製した。次いで、実施例１と同様
にして、エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶
液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９ｍＬ
を混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづい
て、緩衝液で４０倍に希釈した後、分画分子量１０ｋＤ
ａの限外ろ過膜を用いて緩衝液を交換し、界面活性剤を
除去した。その後、エンドトキシンおよびアンチトロン
ビン−IIIの活性を測定し、表５に示す結果を得た。こ
の結果から限外ろ過膜により界面活性剤が高度に除去さ
れ、且つ界面活性剤除去後も、低エンドトキシン活性を
維持していることが確認された。
【００２４】
【表５】
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、エンドトキシンを含有
するタンパク質を、界面活性剤で処理してエンドトキシ
ンを不活化または活性を低減するに際して、エンドトキ
シンの不活化、活性低下は抑制せず、タンパク質、特に
アンチトロンビン−IIIなどのように自体生理活性を有
するタンパク質の失活、活性低下を極力抑制し、タンパ
ク質の収率を高いレベルに維持することができる。
するタンパク質を、界面活性剤で処理してエンドトキシ
ンを不活化または活性を低減するに際して、エンドトキ
シンの不活化、活性低下は抑制せず、タンパク質、特に
アンチトロンビン−IIIなどのように自体生理活性を有
するタンパク質の失活、活性低下を極力抑制し、タンパ
ク質の収率を高いレベルに維持することができる。
Claims (12)
- 【請求項１】エンドトキシンを含むタンパク質溶液をエ
ンドトキシン活性の低減を目的として界面活性剤で処理
する際、アミノ酸、糖類およびポリオールから選ばれた
少なくとも一種を存在させることを特徴とするタンパク
質の失活を抑制する方法。 - 【請求項２】界面活性剤が陰イオン界面活性剤、両性界
面活性剤または非イオン界面活性剤である請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】界面活性剤がステロイド骨格を持つ化合物
を主成分とする界面活性剤である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】界面活性剤が、コール酸ナトリウム、３−
［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］
−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）またはポリオ
キシエチレンオクチルフェニルエーテルである請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】界面活性剤の濃度が０．５〜５ｗ／ｖ％で
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項６】アミノ酸の濃度が５〜２０ｗ／ｖ％である
請求項１記載の方法。 - 【請求項７】アミノ酸がグルタミン酸、リジンまたはグ
リシンである請求項１または６記載の方法。 - 【請求項８】糖類の濃度が５〜５０ｗ／ｖ％である請求
項１記載の方法。 - 【請求項９】糖類がショ糖またはマンニトールである請
求項１または８記載の方法。 - 【請求項１０】ポリオールの濃度が５〜５０ｗ／ｖ％で
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】ポリオールがエチレングリコール、ポリ
エチレングリコールまたはグリセロールである請求項1
または１０記載の方法。 - 【請求項１２】請求項１記載の界面活性剤による処理の
後に、タンパク質溶液を限外ろ過膜を用いて界面活性剤
を除去することを特徴とするタンパク質含有水溶液の調
製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002147371A JP4060123B2 (ja) | 2002-05-22 | 2002-05-22 | タンパク質の失活を抑制する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002147371A JP4060123B2 (ja) | 2002-05-22 | 2002-05-22 | タンパク質の失活を抑制する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003342294A true JP2003342294A (ja) | 2003-12-03 |
| JP4060123B2 JP4060123B2 (ja) | 2008-03-12 |
Family
ID=29766514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002147371A Expired - Fee Related JP4060123B2 (ja) | 2002-05-22 | 2002-05-22 | タンパク質の失活を抑制する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4060123B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005074977A1 (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | Mitsubishi Pharma Corporation | パラオキソナーゼ含有製剤 |
| JP2009515938A (ja) * | 2005-11-15 | 2009-04-16 | ベリトロン・リミテッド | エンドトキシンの除去および精製工程 |
| CN113660953A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法 |
-
2002
- 2002-05-22 JP JP2002147371A patent/JP4060123B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005074977A1 (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | Mitsubishi Pharma Corporation | パラオキソナーゼ含有製剤 |
| JPWO2005074977A1 (ja) * | 2004-02-04 | 2007-10-11 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | パラオキソナーゼ含有製剤 |
| CN1925868B (zh) * | 2004-02-04 | 2011-07-20 | 田边三菱制药株式会社 | 含对氧磷酶制剂 |
| US9050331B2 (en) | 2004-02-04 | 2015-06-09 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Pharmaceutical formulations comprising paraoxonase |
| JP2009515938A (ja) * | 2005-11-15 | 2009-04-16 | ベリトロン・リミテッド | エンドトキシンの除去および精製工程 |
| CN113660953A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法 |
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|---|---|
| JP4060123B2 (ja) | 2008-03-12 |
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