JP2015042678A - 大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換fviiの組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】このため、組成物の各FVII分子が、Nグリコシル化部位に結合されたグリカン形態を有しており、組成物のFVIIのすべての分子の中で、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態の比率が、組成物のFVIIのNグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態のうちで多数である。
【選択図】図1
Description
FVIIは4つの明確な構造領域を含んでおり、それはN末端γカルボキシル(Gla)領域、2つの『外皮成長因子(EGF)状』領域、そしてセリン・プロテアーゼ領域である。
FVIIからFVIIaへの活性化は結合Arg152−Ile153 (アルギニン152−イソロイシン153)の断裂で特徴付けられる。
FVIIaは単一のジスルフィド架橋(Cys135 −Cts262 )で結合された分子量が約20kDaの152個のアミノ酸の軽鎖と分子量が約30kDaの254個のアミノ酸の重鎖で構成されている。
FVIIは脳血管損傷の治療のためにも使用が推奨される。
従って、注射用のFVIIa濃縮物を利用できるようにすることが必要である。
このプロセスの欠陥は、得られるFVII が依然として微量の凝固因子を含んでいることである。
このプロセスで得られるFVIIはその純度にもかかわらず、残留血栓形成性活性を示す。
さらに、こうしたプロセスは一次配列、つまり、ヒトの一次配列と同じ異なったアミノ酸間の連鎖を有する蛋白質を得ることを可能にする。
しかしながら、ヒト血漿性FVIIは複雑な翻訳後修飾を有しており、最初の10個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Asp63 (アスパラギン酸63)は部分的に水酸化されており、Ser52(セリン52)とSer60(セリン60)はO−グリコシル化されており、それぞれグルコース(キシロース)0−2 及びフコース部位を担持しており、Asn145 (アスパラギン145)及びAsn322 (アスパラギン322)はN−グリコシル化されており、主に二触角性のバイシアリル化された複合グリカン形態を有している。
特に、N−グリカン(アスパラギンに結合されたグリカン)の付加は蛋白質の正しい折り重なり、イン・ビトロ(in vitro、「細胞内で」と換言できる。)及びイン・ビボ(in vivo、「生体内で」と換言できる。)での安定性、生物活性、そして、生成された異質蛋白質の薬力学的特性(例えば、生物学的利用性)などに対して特に重要である。
従って、すべての翻訳後修飾の変差、あるいはその一部は前記蛋白質を一方では不活性化する危険性、他方では免疫源性にする危険性に曝すことになる。
また、それぞれの分子はNグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたFVII(因子VII)の組成物であって、前記組成物のFVIIのすべての分子の中で多数が二触角性のバイシアリル化されたグリカン形態であることを特徴とする組成物を調製するプロセスにおいて、シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からFVIIに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換された、あるいは遺伝子組み換えFVIIをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいることを特徴とする。
言い換えると、これは一定の時間間隔の中で前記物質がまったく含まれない流体の仮定量に対応する。
実際、本発明によるFVIIは、ヒトFVIIの場合と同様に、位置145と322の2つのN−グリコシル化部位と、位置52と60の2つのO−グリコシル化部位で構成されている。
1つのN−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖が1つのアスパラギン(N結合)に結合されている。
1つのO−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖はセリンに結合されている。
だから、本発明によるFVIIの各分子は2つのオリゴ糖N結合鎖で構成されている。
しかしながら、前記組成物のFVIIの分子は均一なグリコシル化は示さない。
つまり、すべてのN結合オリゴ糖鎖は同一ではない。
異なったグリカン形態の混合物である。
このグリコシル化は異なった細胞成分間のFVII蛋白質の移送に伴って細胞性オルガナイトによって行われる翻訳後修飾によるものである。
この生化学的修飾は蛋白質を非常に深く修飾するので、最終的な蛋白質は完全に構造化されてしまい、従って活性であり、生物によって良く受け入れられるようになっている。
この化学的修飾は蛋白質の活性の調整に関与し、さらに、その局所化にも関与している。
従って、FVIIの組成物全体において、さらにはその組成物のN結合オリゴ糖鎖全体において、そのFVII組成物内に存在している各グリカン形態と各糖の割合は定量とすることができる。
従って、『FVIIの組成物』とはそのグリカン形態の含有量によって特徴付けられる同じ一次配列を有する分子の混合物のことを意味する。
本発明においては、『FVII』という表現と『FVIIの組成物』という表現とは同等である。
その結果、本発明においては、『FVII』とはFVIIの分子自体を意味することもあれば、上に述べたような特徴を有するFVII分子の混合物を意味する場合もある。
これは、その組成物のすべてのN−結合オリゴ糖類のうちで、つまり、因子FVIIのNグリコシル化部位の結合しているすべてのグリカン形態のうちで、過半数が二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態であることを意味している。
特に好適なのは、この二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が45%以上の場合である。
さらに好適なのはこの二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が45%から65%の、さらに好ましくは50%から60%の間の範囲にある場合である。
本発明によるこの遺伝子組み換えあるいは形質転換FVIIは生物系で蛋白質の発現を可能にする当業者に公知の標準的な技術によって得ることが出来る。
例えば、以下の細胞株を挙げることができる。
BHK(ベビー・ハムスターの腎臓)及び具体的にはBHK tk−ts13 (CRL10314、 Waechter and Baserga、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106−1110.1982)、CHO (ATCC CCL、61)、 COS−1(ATCC CRL 1650)、HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al.、 J. Gen. Virol. 36:59−72、1977)、Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL、139)、ヒト肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)及びDUKX細胞(CHO細胞株)(Urlaub and Chasin、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216−4220、1980)、3T3細胞、ナマルワ細胞、無血清培養に適合させられたBHK細胞(米国特許No.6、903、069)などである。
従って、本発明によるFVIIの組成物は部分的にシアリル化されたFVIIの組成物(FVIIの開始組成物)上でシアリルトランスフェラーゼの作用で容易に得ることができる。
好適に、FVIIの開始組成物はその過半数がモノシアリル化されたグリカン形態を示す。
好適に、FVIIの開始組成物は、その過半数が二触角性ので、モノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態を示す。
シアリルトランスフェラーゼの作用は、モノシアリル化された形態に付加的にシアル酸を移入して、それらをバイシアリル化された形態に変えることができるようにする。
好適に、これらの二触角性のモノシアリル化された形態はFVIIの開始組成物内に40%以上の高い割合で存在しており、特に好適には50%、あるいは60%以上の割合で存在する。
好適に、前記組成物は、二触角性のモノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態の割合が、20%、あるいは30%、40%、さらには50%以上の高い割合を示す。
特に好適な場合、α2−6結合の存在を示すシアル酸の割合は60%より高く、さらに70%、80%、あるいは90%以上である。
特に、この割合は60%から90%の間の範囲である。
過半数を二触角性のバイシアリル化されフコース化されていないグリカン形態を得る必要がある場合、例えば、フコシダーゼの使用をあげることができる。
なお、上記フランス特許の内容は本明細書に組み入れられるものとする。
そうした配列は、例えばフランス特許0、200、421に示されている配列1bによってコード化することができる。
この変種のペプチド配列は、天然のヒトFVIIの配列と少なくとも70%、そして好適には少なくとも80%か90%、そしてより好適には少なくとも99%の同一性を示し、そうした変種は天然のFVIIと実質的に同じ生物学的活性を有している。
血栓症の治療あるいは予防のために用いられる遺伝子組み換えされた不活性化ヒトFVII:FFR−FVIIa(Holst et al.、 Eur. J. Vasc. ENdovasc. Surg.、 1998 Jun、15(6):515−520)を、例えば、その例として挙げることができる。
こうしたFVIIは1つ以上のアミノ酸が挿入されていたり、欠失されていたり、あるいは置換されていることによって天然のFVIIとは異なったアミノ酸配列を示すポリペプチドである。
米国特許第5、997、864に述べられているテストにおいては、生物学的活性は比較対照サンプルと比較しての凝固にかかる時間によって表現され、血清1mlあたり1単位(1UのFVII活性)を含んでいる標準的なヒト血清(プール)と比較しての『FVII単位』に換算される。
特に好適には、二触角性のバイシアリル化された形態の割合は60%、70%、80%、あるいは90%を上回っている。
この割合はその組成物のFVIIのすべてのグリカン形態に対して特製されるフコースの割合に対応している。
実際、市販されている遺伝子組み換えFVIIでは100%のフコース化の割合を示すが、血漿FVIIでのフコース化の割合は16%程度である。
従って、本発明によるFVIIのフコース化は血漿FVIIのそれに近く、そのことは非感染性という面で本発明のFVIIに利点をもたらしている。
特に好適な場合、α2−6結合の存在を示すシアル酸の割合は60%より高く、あるいは70%、80%、あるいは90%より高い。
具体的には、この割合は60%から90%の間の範囲である。
これは、血漿FVIIには含まれてはいるが、α2−3結合の存在を示すシアル酸だけで構成されている遺伝子組み換えされた市販のFVIIと比較しての利点を示すものである。
本発明によるFVIIの組成物はさらにα2−3結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
事実、市販の遺伝子組み換えFVIIのシアル酸はα2−3結合の存在を示唆するためである。
血漿FVIIはこれら2つの異性体の混合体である。
こうした血漿FVIIは例えば異性体の40%がα2−3結合の存在を示唆し、異性体の60%がα2−6結合の存在を示唆する。
しかしながら、後者の方がより多くのα2−6結合を含んでおり、このことは本発明のFVIIを血漿FVIIにより近づけている。
形質転換された哺乳動物とはヒト以外の哺乳動物において、外来性の蛋白質を発現するように遺伝子操作されたものを意味しており、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、仔ウシ、ウマ、ブタ、昆虫、ヒツジなどを意味している。
なお、これらは例示的なものであって、限定的な例ではない。
その外来性たちとはFVII、好ましくはヒトFVIIである。
ヒト以外の形質転換された哺乳動物は、FVIIに加えて、望ましいシアリル化を形質転換されたFVIIに付与するために外来性の酵素を発現することもできる。
この場合、上記の非ヒト形質転換性動物はFVIIをコードする遺伝子とシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同時に発現することができる。
この場合、その形質転換遺伝子の発現はその動物の乳腺内でその形質転換された遺伝子を確実につくりださせるようにするプロモータによって、組織に依存した状態で実行される。
WAPプロモータ(乳清酸性蛋白質)、カゼイン・プロモータ、特にβ−カゼインあるいはα−カゼイン・プロモータ、β−乳酸グロブリン、α−乳酸アルブミン・プロモータなどを挙げることができるが、これらは例示的なものであって、限定的なものではない。
逆に、ヒトと市販の遺伝子組み換えFVIIを産出するために使われるハムスターとの間の種の壁は、それほど重要な意味をもっていない。
これらの配列とはプロモータ配列と信号ペプチド配列である。
特に好適な態様においては、雌ウサギの乳酸の乳腺における発現は、β−カゼイン・プロモータ制御の下で行われる。
ヒトFVIIをコード化し、母乳内に自然に分泌される蛋白質のプロモータの制御下にある合成DNA分子をヒト以外の哺乳動物の胚に組み込む。
この胚を次に同じ種の雌の体内に入れる。
この胚から得られた哺乳動物が成長したら、その哺乳動物の乳の分泌を起こさせて、その乳を回収する。
そうすると、その母乳は問題の形質転換されたFVIIを含んでいる。
さらに、本発明によるFVIIの組成物はα2−3結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
具体的には、この割合は60%から90%の範囲である。
好適に、これらの二触角性のモノシアリル化されフコース化されていないグリカン形態はこの組成物のFVIIにおいては20%を上回る割合で存在している。
好適に、この割合は25%を上回り、40%を上回る場合もある。
本発明のさらに別の実施の形態では、この割合は15%を下回る場合もある。
a)上記母乳を保留分と透過分を形成するのに十分な孔度を有する膜を通じて接線ろ過にかけて、内因性蛋白質を含む透過分を得るステップと、
b)その透過分をクロマトグラフィ装置にかけて内因性蛋白質を取り出すと同時に、溶出液を得るステップと、
c)上記流出液と保留分を組み合わせるステップと、
d)脂質、カゼイン小球からFVIIを回収して、FVIIが少なくとも75%まで回収されるまでステップa)からc)までを繰り返すステップ。
形質転換された動物の母乳に含まれているFVIIの抽出及び精製プロセス(プロセスA)は以下のステップで構成されている。
a)母乳からFVIIを抽出するステップ。この因子VIIは前記母乳のカルシウムの有機及び/又は無機塩あるいは錯体と結合しており、これをその母乳に可溶性の塩を付加することで得られたカルシウム化合物を沈殿させ、その陰イオンは前記不溶性カルシウム化合物を形成する能力によって選択され、こうして因子VIIを前記塩及び/又は錯体から放出させ、因子VIIが液相で存在させるようにするステップ、
b)カルシウム化合物の沈殿物から蛋白質を大量に含む液相を分離し、さらにその液相を脂質相と前記蛋白質を含む非脂質相とに分離するステップ、
c)前記非脂質相を所定の濃度のリン酸塩に基づく溶出緩衝液を用いて親和性クロマトグラフィにかけるステップ、
及び
d)ステップc)で得られた因子VIIの溶出物を弱塩基性タイプの陰イオン交換カラム上で、そのカラムに捕捉された因子VIIを連続溶出させるのに適した緩衝液を用いて2、3回クロマトグラフィにかけるステップ。
形質転換された動物の母乳に含まれているFVIIの抽出及び精製のプロセス(プロセスB)は以下のステップで構成されている。
a)前記母乳の上澄みを採取して脱脂するステップ、
b)前記蛋白質を含んでいる脱脂しスキミングされた画分を疎水性とイオン性の両方の正確を示す移植されたリガンドを用いてクロマトグラフィ基質にかけ、前記蛋白質がその基質上に捕捉されるようなpH条件で反応を行わせるステップ、
d)上記蛋白質を溶出させるステップ、
e)前記溶出された画分から母乳蛋白質を除去することによって溶出された画分を精製するステップと、そして
f)前記蛋白質を回収するステップ。
実際、本発明によるFVIIの組成物はα2−6結合の存在を示唆するシアル酸を示すが、それはこの異性体が血漿性FVII内により多く存在するからである。
この反応培養液は、例えば、モルフォルノ−3−プロパノスルホン酸、及び例えばTweenに基づく緩衝液であってもよい。
この二価金属陽イオンは、例えば、カルシウム・イオン、亜鉛イオン、マグネシウム・イオン、クロム・イオン、銅イオン、鉄イオン、あるいはコバルト・イオンである。
情報のために述べるとすれば、その反応のための時間は、例えば少なくとも0.5時間、そして少なくとも5時間、あるいは7時間、8時間、9時間、さらには10時間の場合もある。
より好ましくは、培養は一昼夜をかけて行われる。
場合によっては、この反応は5−12時間かけて行われる。
FVIIの活性化は、イン・ビボ(in vivo、「生体内で」と換言できる。)では異なったプロテアーゼ(FIXa、 FXa、FVIIa)によってチモーゲンがジスルフィド架橋によって結合された2つの鎖に切断されることによって生じる。
FVIIaだけの場合は、酵素活性は非常に低いが、その共同因子との複合形態においては、FXとFIXを活性化することで、凝固プロセスを開始させる。
FVIIaは例えば循環性の抗体による血友病での止血に関与する凝固因子である。
特に好適な態様においては、本発明によるFVIIは完全に活性化されている。
好適には、本発明によるFVIIaはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、それは、最初の9個あるいは10個の末端グルタミン酸がγ−カルボキシル化されており、Asp63が部分的に水酸化されており、Ser52とSer60がO−グリコシル化されて、それぞれグルコース(キシロース)0−2 とフコースを担持しており、Asn145 とAsn322 はN−グリコシル化されていて、主として、複合的な二触角性のバイシアリル化されており、フコース化されていない形態を示す。
この反応を行うための条件は上に述べた通りであり、以下の実施例にも述べてある。
好適に、これらの二触角性のモノシアリル化された形態は40%以上、特に好適な場合50%、あるいは60%以上の割合で存在している。
好適に、二触角性のモノシアリル化されフコース化されていないグリカン形態は20%を上回っており、さらには30%、40%、場合によっては50%以上である。
実際、本発明による組成物のFVIIはα2−6結合の存在を示唆するシアル酸を示すFVIIであることは好適である。
というのは、この異性体は血漿性FVII内ではより多く存在しているからである。
この反応培養液はさらに、カコジル酸ナトリウム、モルホリノ−3−プロパンスルホン酸、Tris及び塩酸など、その培養液のpHを招請するための1種類あるいは複数の種類のイオン力調整剤を、40mMから60mMの範囲で含んでいても良い。
pH値は通常6から7.5の範囲である。この反応培養液はさらにBSA(仔ウシ血清アルブミン)を0.05から0.15mg/mlの範囲で含んでいてもよい。
この生物学的使い捨て性の改善は、上にも述べたように、その組成物をシアル酸ドナー基質及びシアリルトランスフェラーゼと接触させることによって得られる。
このステップはガラクトースが欠乏している形態、つまり、準ガラクトース化された、およびモノガラクトース化されたFVII形態にガラクトースを移入することを目的としている。
ガラクトースはGlcNAcに固定され、後のシアリル化ステップでシアル酸残基を固定しやすくなる。
このガラクトース化ステップは当業者に公知のUDP−Galウリジン(5’−ジホスホガラクトース)を含む反応培養液内でガラクトシル−トランスフェラーゼを用いて行うことができる。
そうしたグリカン形態を以下に示す。
このステップは上に述べたように実行される。
このステップはガラクトース化ステップの前に行っても良い。
なお、このフランス特許第06−04872の内容は本明細書に組み入れられるべきものとする。
FVII−Tg=FVIIa−Tg:本発明による活性化された形質転換されたFVII
VFII−r=VFIIa−r:市販されている遺伝子組み換え活性化FVII
FVII−p=FVIIa−p:活性化された血漿性FVII、つまり、ヒトの血漿から精製されたFVII
MALDI−TOF:基質支援レーザ脱着イオン化−飛行時間
HPCE−LIF:高性能毛細管電気泳動−レーザー誘発蛍光
ESI−MS:質量分光−イオン化『電気スプレイ』
LC−ESIMS:液体クロマトグラフィ−質量分光−イオン化『電気スプレイ』
NP−HPLC:正常相高性能液体クロマトグラフィ
PNgase F:ペプチド: N−グリコシダーゼ F
LC−MS:液体クロマトグラフィ−質量分光
この遺伝子を500コピー含んでいる1−2plをウサギの胚の雄性前核に注入した。
遺伝子操作された遺伝子を含むこのベクターのフラグメントを微量注射した。
その後、これらの胚をホルモン的に調整した養子関係の雌の卵管内に移した。
これらの遺伝子操作された胚の約10%が若いウサギを出産し、さらにこれら遺伝子操作された胚の2−5%が形質転換された若いウサギを出産した。
形質転換遺伝子の存在はウサギの尾から抽出されたDNAからのサザーンの移入の技術で明らかにされた。
これらの動物の血液と母乳内でのFVIIの濃度を特殊な放射免疫学的アッセイで評価した。
室温で30分攪拌した後、水性のFVIIの含量を増やした相を摂氏15度の温度で1時間、10000gで遠心分離にかける。
約835mlの6ポット分が必要となる。
それは、表面の資質相(クリーム)、水性非脂質でFVIIを多量に含んだ相(過半数の相)、そして、残りの白色の固体相(不溶性カゼイン及びカルシウム化合物の沈殿物)の3相である。
このクリーム相は別個に回収される。
固体相(沈殿物)は廃棄される。
このろ過ステップが終了した段階で、脂質相はこのろ過配列を通過して、母乳は母乳内に含まれる顆粒が完全に除去されるので、ろ過液は透明である。
分子量が約50kDaのFVIIは母乳に含まれている塩類、糖類、そしてペプチドとは違ってこの膜を透過しない。
初回に、上記溶液(約5000ml)が500mlに濃縮され、次に、限外ろ過によって体積を一定に保ちながら透析を行うことによって、電解汁を除去し、クロマトグラフィ・ステップのための生物素材を調製する。
この透析緩衝液は0.025Mリン酸ナトリウムで、pHは8.2である。
この製剤はそのプロセスを続ける前に摂氏−30度の温度で保存される。
この製剤のFVIIの純度は0.2%程度である。
この製剤全体を摂氏−30度で保存して、氷が完全に溶けるまで摂氏37度の水槽内で解凍し、次に、上記ゲル上に注入する(線形流量100cm/h、つまり105ml/分)。
捕捉されない画分は基線に戻るまで(RBL)、0.25Mリン酸ナトリウムと0.04塩化ナトリウムの混合物、pH8.2に通過させて廃棄される。
溶出された画分は、基線回帰まで回収される。
これらの化合物はλ=280nmでの吸着測定によって検出する。
比活性(S.A)は25倍に増幅される。
この段階で、純度4%のFVII−Tgが約85000IUが入手できる。
FVIIはこの100kDa膜でろ過され、分子量が100kDa以上の蛋白質はろ過されない。
透析用緩衝液は0.15M塩化ナトリウムである。
100kDa膜での処理は約50%の蛋白質の捕捉を可能にし、そのうちのFVII−Tgの95%に相当する高分子量蛋白質、つまり82、000IUのFVII−Tgがろ過される。
これらの化合物は波長λ=280nmでの吸収測定で検出される。
この画分をゲルに注入する前に(流量:13ml/分、つかり150cm/時間の線形流量に相当)、均衡化緩衝液で1/2体積パーセントまで希釈し、その後、保持されなかった画分は基線回帰まで緩衝液を通過させて廃棄する。
この透析用緩衝液は0.15M塩化ナトリウムである。
この画分は、二回目のイオン交換クロマトグラフィにかけられる前に摂氏+4度の温度で保存される。
これによって、FVIIがFVIIaに活性化される。
この溶出物を三回目のイオン交換クロマトトグラフィで精製し、調製する。
この生成物は静脈注射に用いることができる。
このプロセスの累積収量は22%であり、従って、処理される母乳1リットルあたり少なくとも20mgのFVIIの精製が可能である。
グリコシル化部位の局所化はMALDI−TOF(/TOF)及びエドマン配列決定法によって確認した。
Asn145 に関しても、三触角性のトリシアリル化されフコース化されていない形態(A3)(観察6220.0Da)とフコース化された形態(A3F)(観察された質量:6366.1 Da)の存在に注目。
グリカンA3F(三触角性、トリシアリル化されフコース化された形態)の存在も認められる。
Asn145 の過半数を示すオリゴ糖の存在は、二触角性のモノシアリル化されフコース化されていない形態(A1)(観察された質量:5272.3Da)及びフコース化された形態(A1F)(観察された質量:5418.7Da)の存在を示す。
三触角性形態はあまり示されていない。
なお、他方の触角の末端位置にGalNAcを有するモノシアリル化された形態は存在していない。
図1はAsn145 形態の場合と同様に成熟度が低い形態(二触角性及びシアリル化の程度がより低い形態)の存在を示している。
例えば、血漿生成物の場合、Asn322 ではAsn145 と比較して、三触角性形態はより低い割合で示され、FVIIa、r及びFVII−Tgでは存在していない。
さらに、Asn145 及び322 は100%の割合でグリコシル化されていることも注目すべきである。
準定量的だけではあるが、これらの結果はHPCE−LIF及びNP−HPLCによって得られる提供的データと一致している。
FVIIのサンプルはそれぞれの単離された構造の同定と識別が確実に行えるような方法で、エグゾゴルコキシダーゼ(シアリダーゼ(酵素/基質比:1mIU/10μg)、ガラクトシダーゼ、ヘキシナカーゼ(キット Prozyme)、フコーシダーゼ(E/S比率:1mUI/10μg)を用いて処理される。
得られたグリカンをフルオロクロムでラベルし、その質量と電荷に基づいて分離する。
2つの基準(グルコースのホモポリマー、オリゴ糖性)に基づいて、それらの構造を同定することができる。
定量は定量されたオリゴ糖全体に対する各ピークの減少した割合(%)を積分することで行われる。
分離用緩衝液『ゲル緩衝液N』(Backman Coulter)を用いる。
移行は25kVの電圧を、20分間、摂氏20度の温度でかけることによって行われる。
検出は励起波長λ488nmと励起波長λ520nmで行われる。
その分布はこれらの種々の形態間で異なっている。
これらの構造の場合に通常観察される移行時間と比較して、A2F及びA1F形態に関しては種々の移行時間が認められる。
FVII−Tg(バッチA及びB)はFVIIa、pと比較するとシアリル化の程度が低く、二触角性のバイシアリル化された形態が35%、そして三触角性のシアリル化された形態はわずか6%であった(結果は示さず)。
主要な形態はモノシアリル化された形態で、その構造の50%がAとA1Fである。
FVIIa、rもFVIIa、pと比較するとシアリル化の程度が低く、A2F構造が45%、そして三触角性でシアリル化さたグリカンはわずか6%であった(結果は示さず)。FVIIa、rのフコース化されていない形態がないことに注意。
蛋白質を脱塩、乾燥した後、この蛋白質を変性させ、当業者に公知の方法を用いて還元した。
その後、これらのグリカンを酵素反応(エンドグリコシダーゼ PNGase F)にかけて、エタノールで沈殿させて精製した。
このようにして得られたグリカンをフルオロフォア、2−アミノベンズアミド(2−AB)でラベルする。
ラベルされたグリカンその疎水性に基づいて、4.6x250mmのAmide‐80カラム(Tosohaas)を用いて30℃の温度に保って正常相HPLCクロマトグラフィによって分離する。
50mMギ酸アンモニウム、pH4.45の増大勾配で、140分間以上の時間をかけて溶出させる。
検出は波長330nmと波長420nmで蛍光測定で行う。
さらに、より少ない量ではあるが、二触角性でバイシアリル化されフコース化されたタイプ(A2F)、モノシアリル化されたタイプ(A1)、トリシアリル化されフコース化されたタイプとフコース化されていない形態(A3F及びA3)が認められる。
A1F、A2及びA2F形態の割合はより低く、三触角性の形態は微量である。
このことはFVIIa、pと因子FVII−Tg(バッチB)との間の差、シアリル化の程度がより低いことを示している。
形態A1Fの量はより少なく、三触角性の形態は微量である。
FVIIa、rの分析もA1F形態とA2F形態の保持時間の間に重要な時間差があることを示しており、これらの形態がFVIIa、p及びFVII−Tgに存在しているものと違っていることを示している。
主な基質は、ペプチドに対してはα−シアノ−4−水酸化桂皮酸(HCCA)、蛋白質に対してはシナピン酸(SA)、そしてオリゴ糖の分析用には2、5−ジヒドロ安息香酸(DHB)である。
ガス相でイオン化した後、この検体分子を飛行時間中に検出器を通過させる。
質量と飛行時間は直接的な相関関係を有しているので、後者を測定することは、目標の検体の質量判定を可能にしてくれる。
同定は観察された質量を測定して、それを理論値と比較することで行われる。
配列決定は得られた画分イオンに基づいて、MS/MSモードで行うことができる。
用いられる計器はTOF及びTOF/TOFモードで作動するBruker Autoflex2である。
因子FVIIa、rは部分的にしかフコース化されないFVII−Tgとは違って、ほぼ完璧にフコース化される。
なお、過半数のグリカン形態はA2Fで、NP−HPLCによって定量された比率は30%である。
二触角性でモノシアリル化され、フコース化された形態 (A1F)で、他方の触角部分の末端位置にGalNAcを含んでいる形態が同定され、一方及び/又は両方のアンテナ上にHex−Nac−HexNAc部位を有する天然の二触角性のフコース化された形態も同定される。
三触角性のトリシアリル化されフコース化された形態も注目される。
フコース化されていない形態は微量存在している。
PNGaseFによる脱グリコシル化を行った後、オリゴ糖を特殊なエグゾシアリダーゼを用いて、それぞれその結合の同定と各単離された構造の定量が行える方法で処理される。
用いられるシアリダーゼはS.pneumoniae(連鎖球菌感染症病原体)(α2−3結合固有、0.02IU、E/S=0.4 m/m)、C. perfringens(ガス壊疽脱疽菌群)(α2−3−及びα2−6−結合固有、0.04IU、E/S=0.1m/m)及び、A. urefaciens(α2−3、α2−6、α2−8及びα2−9結合を加水分解、0.01IU、E/S=0.05m/m)から得られた遺伝子組み換え酵素である。
これらのA2F及びA1F構造に関しては、これらの形態に通常認められる移行時間と比較してばらつきのある移行時間が観察されている。
特に、これらのオリゴ糖性ノシアリル化された形態は、HPCE−LIF及びNP−HPLCにおいてFVII−Tgのものと比較してばらつきのある移行時間を示す。
一方、オリゴ糖の組成物の分析においてNeu5Ac以外の特別のシアル酸は認められず、質量分光分析ではバイシアリル化されたタイプの質量を有するグリカンの存在を示す。
最終的に、FVIIa、rのグリカンを脱シアリル化すると、FVII−Tgのオリゴ糖のものと同等のクロマトグラフィ及び電気泳動挙動を見ることが出来る。
こうした仮定は、HPCE−LIF及びMSによる異なったアプローチで確認された。
実際、FVIIa、rのシアル酸はα2−3結合の存在を示唆しているが、FVII−Tgはα2−6分岐を示している。
この研究の目的は、イン・ビトロ(in vitro、「細胞内で」と換言できる。)でのシアリル化の実行可能性を実証することにある。
これら2つの試薬は不安定なので摂氏−80度の温度で保存する。
シアリル化基質(シチジン−5’−モノホスホ−N−アセチルノイラミン酸)と酵素α2−6−(N)−シアリルトランスフェラーゼ)を反応緩衝液内で混合して、一昼夜摂氏37度の温度で放置した。
用いられた反応緩衝液は50mMのモルフォリノ−3プロパンスルホン酸、0.1% Tween(登録商標)80、0.1mg/ml BSA(仔ウシ血清アルブミン)の混合物で、pHを7.4に調整したものである(試薬Sigma)。
再シアリル化後(図7、上側参照)、モノシアリル化された形態はわずか6%で、バイシアリル化された形態、特に非フコース化された形態の割合は過半数の52%である。
採血はJ−4(製品を注射する4日前)とJ−1(製品を注射した当日)に、T0.17h(注射当日、注射10分後)、T0.33h(注射当日、注射20分後)、T1h(注射当日、注射1時間後)、T3h(注射当日、注射3時間後)、T6h(注射当日、注射6時間後)、T8h(注射当日、注射8時間後)に行う。
ウサギの血漿でのFVII:Agの投与量を決めることで、一方では、除去特性、他方では、薬力学的パラメータを判定することができる。
薬量データと実験グループを表7に示す。
FVII−Tgを再シアリル化すると、半減期、平均残留時間(MRT)、Cmax及び『回収』が目立たない程度ではあるが向上する。
Claims (20)
- それぞれの分子はNグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたFVII(因子VII)の組成物であって、
前記組成物のFVIIのすべての分子の中で、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態の比率が、前記組成物のFVIIのNグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態のうちで多数であることを特徴とする形質転換FVII組成物。 - 二触角性でバイシアリル化された形態の比率が、フコース化されているか否かにかかわらず、50%を上回っていることを特徴とする請求項1に記載の形質転換FVII組成物。
- 前記組成物のFVIIのすべての分子の中で、前記組成物のFVIIのNグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態におけるフコースの比率が、20%から50%の範囲内であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の形質転換FVII組成物。
- 前記組成物のFVIIのNグリコシル化部位に結合したグリカン形態におけるシアル酸のうちの少なくとも一部が、α2−6結合の存在を示すことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 前記組成物のFVIIのNグリコシル化部位に結合したグリカン形態におけるすべてのシアル酸が、α2−6結合の存在を示すことを特徴とする請求項4に記載の形質転換FVII組成物。
- 前記組成物のFVIIが、さらにα2−3結合のシアル酸も含んでいることを特徴とする請求項4に記載の形質転換FVII組成物。
- 前記組成物のFVIIが、活性化されていることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 医薬品として使用することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 血友病患者の治療のための医薬品を調製するために使用することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 多重出血性トラウマ治療用医薬品を調製するために使用することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 抗凝血剤の過剰投与による出血治療用の医薬品を調製するために使用することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- 賦形剤及び/又は薬学的に許容される基質を含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の形質転換FVII組成物。
- それぞれの分子はNグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたFVII(因子VII)の組成物であって、
前記組成物のFVIIのすべての分子の中で、多数が二触角性のバイシアリル化されたグリカン形態である組成物を調製するプロセスにおいて、
シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からFVIIに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換されたFVIIあるいは遺伝子組み換えFVIIをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいることを特徴とする大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。 - 前記シアリル化のステップの前に、前記FVIIのガラクトース化が不十分でモノガラクトース化された状態を含むガラクトース欠乏形態にガラクトースを移植するためにガラクトース化のステップが行われることを特徴とする請求項13に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記部分的にシアリル化されたFVIIの組成物が、主として二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態を示すことを特徴とする請求項13又は請求項14に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記部分的にシアリル化されたFVIIの組成物の二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態のうちで、過半数のグリカン形態が、フコース化されていないことを特徴とする請求項15に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記部分的にシアリル化されたFVIIの組成物において、少なくとも一部のシアル酸が、α2−6結合の存在を示すことを特徴とする請求項13〜16のいずれか1項に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記シアリル化のステップの前に、形質転換された雌のウサギによって部分的にシアリル化された形質転換FVIIの組成物を精製するステップが含まれていることを特徴とする請求項13〜17のいずれか1項に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記部分的にシアリル化された組成物のFVIIが、活性化されていることを特徴とする請求項13〜18のいずれか1項に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
- 前記シアリルトランスフェラーゼがα2−6−(N)−シアリルトランスフェラーゼであり、前記シアル酸ドナー基がシチジン−5’−モノホスホ−アセチル−ノイラミン酸であることを特徴とする請求項13〜19のいずれか1項に記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
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