KR20090040892A

KR20090040892A - 바이안테너리 비아시알릴화 및 비푸코실화된 형태의 다수의글리칸을 가지는 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 화합물

Info

Publication number: KR20090040892A
Application number: KR1020097001954A
Authority: KR
Inventors: 압데사타르 사미 츠토우로우; 엠마누엘 노니; 니콜라스 비호레우
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2009-04-27
Also published as: WO2008015339A2; CA2658800C; FR2904558B1; EP2049150A2; AR062162A1; CN101495133A; CA2876621A1; TWI391400B; AR103027A2; US20090239788A1; AU2007280330A1; JP2015042678A; JP5653619B2; KR101233630B1; CA2658800A1; TW200825102A; CN103397011B; JP2009545575A; CN103397011A; US20130189244A1

Abstract

본 발명은 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물의 상기 인자 Ⅶ의 각 분자는 N-당화(glycosylation) 위치에 결합된 글리칸 형태를 포함하며, 상기 조성물의 모든 인자 Ⅶ 분자 중, 바이안테너리(biantennary), 바이시알릴화(bisialylated) 및 비푸코실화된(non fucosylated) 글리칸 형태가 다수이다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용되는 그런 조성물 및 다른 것 중에서, 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이안테너리 비아시알릴화 및 비푸코실화된 형태의 다수의 글리칸을 가지는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 화합물{RECOMBINANT OR TRANSGENIC FACTOR VII COMPOUND HAVING A MAJORITY OF GLYCAN, BIANTENNARY, BISIALYLATED AND NON-FUCOSYLATED FORMS}

본 발명은 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ의 조성물에 관한 것으로, 상기 인자 Ⅶ의 각 분자는 N-당화(glycosylation) 위치에 결합된 글리칸 형태를 포함하며, 상기 조성물의 모든 인자 Ⅶ 분자 중, 조성물의 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태에 비교하여, 다수가 바이안테너리(biantennary), 바이시알릴화(bisialylated) 및 비푸코실화된(non fucosylated) 글리칸 형태인 것을 특징으로 한다.

인자 Ⅶ(FⅦ)는 비타민 K에 의존적인 당단백질(vitamin K dependent glycoprotein)로서, 그것의 활성화된 형태(FⅦa)는 칼슘 및 조직 인자가 존재하는 경우 인자 Ⅹ 및 인자 Ⅸ를 활성화시키는 응고 과정에 참여한다. FⅦ는 약 50kDa의 분자량을 가지는 406 잔기의 단일 펩티드 사슬 형태로 분비된다. FⅦ는 4개의 특유한 구조상 도메인을 포함한다: N-터미널 γ-카르복실 도메인(N-terminal ν-carboxylic domain(Gla)), 두 개의 "상피세포성장인자-유사" 도메인("epidermal growth factor(EGF)-like" domains) 및 세린 프로테아제 도메인(serine protease domain). FⅦa로 FⅦ가 활성화되는 것은 Arg₁₅₂-Ile₁₅₃(아르기닌 152-이소류신 153) 결합이 끊어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, FⅦa는 약 20kDa의 분자량을 가진 152 아미노산의 경쇄 및 약 30kDa의 분자량을 가진 254 아미노산의 중연쇄를 가진 화합물이며, 서로 하나의 이황화 결합(disulfide bridge)(Cys₁₃₅-Cys₂₆₂)에 의해 연결되어 있다.

혈장(plasma) FⅦa는 몇몇 번역-후 변형을 포함한다: 첫 번째 10개의 글루탐산이 γ-카르복식화되고(γ-carboxylated); Asp₆₃는 부분적으로 수산화되며(hydroxylated); Ser₅₂(세린 52)와 Ser₆₀(세린 60)는 O-당화되고(O-glycosylated), 각각 글루코오즈(크실로오스)₀ _-2, 푸코오즈(Fucose) 모이어티를 전하고; Asn₁₄₅(아스파라긴 145) 및 Asn₃₂₂(아스파라긴 322)는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조(biantennary bisialylated complex structures)으로 N-당화된다.

FⅦ는 인자 Ⅷ 결핍증(유형 A 혈우병(hemophilia)) 또는 인자 Ⅸ 결핍증(유형 B 혈우병) 및 선청성 FⅦ 결핍증 등과 같은, 다른 응고 인자 결핍증을 나타내는, 혈우병 환자를 치료하는데 사용된다. 따라서, 주사 가능한 FⅦa 농축물을 사용할 수 있어야 한다. FⅦ는 또한 뇌졸증(cerebro-vascular accidents)의 치료에 권장된다. 따라서, 주사 가능한 FⅦa 농축물이 필요하다.

FⅦa 농축물을 얻기를 위한 가장 오래된 방법은 분별법(fractionation)에 의 해 얻어진 혈장 단백질에서 FⅦa를 정화하는 단계를 포함한다.

그 목적을 위해, 유럽특허 EP 0 346 241에서 FⅦa가 풍부한 단편을 제조하는 방법을 기술하며, 상세하게 상기 FⅦa가 풍부한 단편은 흡착 단계(adsorption) 및 FⅦ 및 FⅦa, 인자 Ⅸ(FⅨ), 인자 X(FX) 및 인자 Ⅱ(FⅡ)와 같은 다른 단백질을 포함하는 혈장 단백질, 즉 용출 전의 PPSB의 분별 부산물의 용출에 의해 얻어진다(P=프로트롬빈(prothrombin) 또는 FⅡ, P=프로콘버틴(proconvertin) 또는 FⅦ, S=스튜어트 인자(Stuart Factor) 또는 FX 및 B=항혈우병인자 B(antihemophilic Factor B) 또는 FⅨ). 이 공정의 결점은 얻어진 FⅦ에서 여전히 다른 응고 인자의 자취를 찾을 수 있다는 것이다.

마찬가지로, 유럽특허 EP 0 547 932에서 실질적으로 비타민-K-의존 인자(vitamin-K-dependent factor)와 FⅧ가 존재하지 않는 고순도의 FⅦa 농축물을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다. 그 순도에도, 이 공정에 의해 얻어진 FⅦ는 잔류 트롬보겐 활성(thrombogenic activity)을 나타낸다.

또한, 이 공정의 중요한 결점 중 하나는 생성물의 산출량이 낮다는 것이다.

게다가, 헌혈자에게서 모은 혈장의 양은 한정적이다.

그러므로 1980년 대부터, 인간의 인자 Ⅶ를 인코딩하는 DNA를 분리하여(Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83(8):2412-6), 포유동물의 BHK세포(아기 햄스터 신장)에서 발현시켰다(document EP 0 200 421). 또한 본 출원인에 의해 출원된 프랑스특허 출원 FR 06 04872에서는 형질전환 동물에서 FⅦa의 제조에 대해 기술하고 있다.

상기 제조방법에 의해 얻어진 단백질은 바이러스 및 다른 병원체 오염의 측면에서 더 안전하다. 게다가, 그런 과정을 통해 1차 서열(sequence)를 가지는 단백질, 즉 인간의 1차 서열와 동일한, 다른 아미노산 사이의 사슬을 얻을 수 있다. 그러나, 인간 혈장 FⅦ는 번역-후 변형을 포함한다: 첫 번째 10개의 글루탐산이 γ-카르복식화되고(γ-carboxylated); Asp₆₃(아스파트르산 63)은 부분적으로 수산화되며(hydroxylated); Ser₅₂(세린 52)와 Ser₆₀(세린 60)는 O-당화되고(O-glycosylated), 각각 글루코오즈(크실로오스))_0-2, 퓨코오즈 패턴을 전하고; Asn₁₄₅(아스파라긴 145) 및 Asn₃₂₂(아스파라긴 322)는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조(바이안테너리 바이시알릴화 complex structures)로 N-당화된다. 특히, N-글리칸(아스파라긴에 연결된 글리칸)의 추가는 단백질의 정확한 폴딩(folding), 생성된 이종조직 단백질의 생체외(in vitro ) 및 생체내(in vivo ) 안정성(stability), 생활성(bioactivity) 및 약역학적(pharmacokinetic) 특성(예를 들면, (생물학적 적용도(biodisponibility)))에 있어 중요하다. 따라서, 모든 또는 일부 번역-후 변형의 변이는 한편으로 단백질을 비활성화시킬 위험 및 다른 한편으로는 단백질을 면역성을 가지게 위험에 노출시킨다.

현재, 기존의 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ는 인간 시스템과 다른 시스템에서 발현되었기 때문에, 인간 혈장 FⅦ의 당화(glycosylation)와 다른 당화(glycosylation)를 나타내어, 재조합 단백질에 대항하는 항체가 증가할 수 있고 따라서 인간 혈장에서 정제된 인간 FⅦ보다 효율이 낮아진다.

그러므로 인간 혈장에서 정제된 인간 FⅦ와 유사한 기능성을 가지는, FⅦa의 치료 또는 예방 조성물 및 상당량의 인간 FⅦ의 요구에 양립할 수 있는 FⅦa의 치료 또는 예방 조성물의 제조방법이 요구된다.

놀랍게도, 본 출원인은 다수의 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비-푸코실화된 형태를 가지는 재조합 또는 형질전환 FⅦ 조성물은 낮은 비율의 바이시알릴화 형태를 가지는 재조합 또는 형질전환 FⅦ 조성물에 비해, 즉 다수의 바이안테너리, 모노시알릴화 및 비-푸코실화 형태를 가지는 재조합 또는 형질전화 FⅦ 조성물에 비하여, 증가한 생물학적 적용도(biodisponibility), 감소한 클리어런스(clearance) 및 증가한 안정성(stability)을 나타낸다는 것을 발견했다.

그러므로 본 발명의 FⅦ는 낮은 비율의 바이시알릴화 형태, 즉 높은 비율의 모노시알릴화 형태를 가지는 재조합 또는 형질전화 FⅦ 조성물에 비해 낮은 빈도 및 적은 복용량으로 환자에게 투여될 것이라고 추정될 수 있다.

생물학적 적용도(biodisponibility)는 혈액 순환계에 확산하는 투여된 FⅦ의 백분율을 의미하며 따라서 특히 출혈(hemorrhage) 위치에 도달할 수 있다.

클리어런스(clearance)는 완전히 정제된 이론적 양의 단편을 의미하며 즉 시간당위당 FⅦ는 포함되지 않는다. 즉 이것은 시간 단위의 간격 동안 기질(substance)이 완전히 없는 유체의 가설적 양에 대응한다.

안정성은 FⅦ의 전체 타당성(validity) 동안 특정 한계에서 FⅦ의 화학적, 신체적, 미생물학적, 생물약제학적(biopharmaceutical) 특성을 나타낸다.

"바이안테너리, 바이시알릴화 및 비-푸코실화 글리칸 형태"는 다음과 같다.

형태 A2 (바이안테너리, 바이시알릴화 및 비-푸코실화)

: 시알산(Sialic acid)

: 갈락토오스(galactose)

: N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamin(GlcNAc))

: 만노스(mannose)

이런 글리칸 형태는 아스파라긴 145(Asn145)와 아스파라긴 322(Asn322)로 이루어져 있는 N-당화 위치에 결합한다. 실제로, 본 발명의 FⅦ는 인간 FⅦ처럼, 위치 145와 322에 두 개의 N-당화 위치를, 위치 52와 60에 2개의 O-당화 위치를 포함한다. N-당화 위치에서, 올리고당(oligosaccharide) 사슬이 아스파라긴에 연결된다(N-linked). O-당화 위치에서, 올리고당(oligosaccharide) 사슬이 세린에 연결된다. 그러므로, 본 발명의 FⅦ 각 분자는 2개의 올리고당 N-연결형 사슬을 포함한다. 그러나, 조성물의 FⅦ 분자는 동질적인(homogeneous) 당화를 나타내지 않고, 즉 모든 N 연결형 올리고당 사슬이 동일하지 않다. 그것이 다른 글리칸 형태의 혼합물의 문제이다.

사실, 어떤 FⅦ든지, 즉, 혈장, 재조합 또는 형질전환 FⅦ든지, FⅦ의 몇몇 단백질의 혼합물의 형태로 존재하면, 이들 단백질은 특히 그들의 당화에서 그리고 다르게 지정된 당형태(glycoform)에서 차이점을 나타낸다. 번역-후 가공 때문에, 이 당화가 FⅦ 단백질이 다른 세포 구획(cellular compartment) 사이에서 이동할 때 세포 소기관에 의해 실행된다. 이 생화학적인 변형은 최종 단백질이 완벽하게 구조화되고 활성화되고 유기체에 의해 내성(well tolerated)을 가지도록 단백질을 변경한다. 이 화학적 변형은 단백질 활성의 조절 및 또한 조절의 국소화(localization)에 공헌한다. 따라서, FⅦ 전체 조성물에 있어서 및 따라서 조성물의 N-연결형 올리고당 사슬에 있어서, 각 글리칸 형태의 비율 또는 FⅦ 조성물에 존재하는 각 설탕의 비율의 양을 정할 수 있다.

O-당화는 본 출원에서 주어진 다른 글리칸의 백분율에서 고려되지 않는다.

"FⅦ 조성물"은 조성물의 유일한 분자물(molecular entity)이 FⅦ인, 바람직하게는 활성화된 FⅦ 조성물을 의미한다.

FⅦ 조성물의 각 분자는 동일한 1차 서열을 나타내지만 당화는 한 분자에서 다른 분자로 변화한다. 따라서, "FⅦ 조성물"는 글리칸 형태의 함량에 의해 특징화된 동일한 1차 서열를 가지는 분자 혼합물을 의미한다. 본 발명에 있어, 표현 "FⅦ"와 "FⅦ 조성물"는 동등하다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, "FⅦ"는 그 자체로서 FⅦ 분자, 또는 상술하는 특성을 가진 FⅦ 분자의 혼합물을 의미한다.

본 발명의 FⅦ 조성물은 주로 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태를 포함하는 FⅦ 조성물이다. 이는 조성물의 모든 N 연결형 올리고당 중, 즉 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 연결된 모든 글리칸 형태 중에서, 바이안테너리 바이시알릴화 및 비푸코실화된 형태가 가장 대표적이다.

유리하게, 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태의 비율은 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상이다. 특히 유리한 방법에서는, 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태의 비율은 45% 이상이다. 특히 유리한 방법에서는, 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태의 비율은 45~65% 및 바람직하게는 50~60%이다.

시알릴화 종의 비율은 다른 글리칸에 대응하는 피크 영역을 측정하거나 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 다른 방법에 의한 정량화(quantification)와 함께 HPCE-LIF(High Performance Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence) 분석 및/또는 NP-HPLC(Normal Phase High Performance Liquid Chromatography)에 의해 실험적으로 결정된다.

본 발명의 FⅦ 조성물은 또한 적은 바이안테너리, 모노시알릴화 형태, 및 트리안테너리(triantennary) 형태 및 또한 시알산을 나타내지 않는 중립(neutral) 형태를 포함할 수 있다.

"재조합 또는 형질전환 FⅦ"는 유전자 공학에 의한, 즉 유전자 재조합에 의해 DNA가 변형된 세포가 FⅦ 분자를 발현하며 상기 기술된 당화 특성을 나타내는 모든 FⅦ를 의미한다.

따라서, 본 발명의 FⅦ는 세포 숙주(cellular host) 또는 형질전환 동물에서 FⅦ를 인코딩하는 DNA 분자의 전사(transcription)에 이은 번역(translation)에서 유래한다. 본 발명의 재조합 또는 형질전환 FⅦ는 생물 시스템에서 단백질 발현을 허용하는, 기술분야의 숙련자에게 공지된 표준 기술로 얻을 수 있다.

특히, "재조합 Ⅶ"는 유전자 재조합에 의해 얻고 배양된 세포주(cell line)에서 발현된 모든 FⅦ를 의미한다. 예로서, 다음의 세포주를 들 수 있다: BHK(아기 햄스터 신장) 및 즉 BHK tk^-ts13(CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 79:1106-1110. 1982), CHO(ATCC CCL 61), COS-1(ATCC CRL 1650), HEK293(ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen . Virol . 36:59-72, 1977), Rat Hep I(Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II(Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK(ATCC CCL 139), 인간 폐(Human lung)(ATCC HB 8065), NCTC 1469(ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포(CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220, 1980), 3T3 세포, 나말와 세포(Namalwa cell), 또는 무혈청 배양에 알맞은 BHK 세포(BHK cells adapted to serum-free culture)(미국등록특허 US 6,903,069).

게다가, 특히 "형질전환 FⅦ"는 유전 재결합에 의해 얻고 살아있는 조직, 동물 또는 식물에서 발현된 모든 FⅦ를 의미한다.

본 발명의 바이시알릴화 형태의 비율은 다른 방법으로 얻어질 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 FⅦ는 상술한 당화 특성이 부여된, 즉 대부분 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 형태인 미생물, 세포, 식물 또는 동물에서 발현된다.

다른 구체예에서, 원하는 시알릴화(sialylation)가 실행되도록 하나 이상의 효소를 사용하여 생체외(in vitro)에서 연속적으로 시알릴화(sialylation)가 이루어지는, 즉 바이안테너리 및 바이시알릴화된 형태가 다수이고 트리안테너리(triantennary) 형태가 트리시알릴화되는(trisialylated), 대부분 바이안테너리 바이시알릴화 및 비푸코실화된 형태를 나타내는 FⅦ 조성물을 허용하지 않는 미생물, 식물 또는 동물에서 발현된다.

예로서, 시알산 전이효소(sialyltransferase)는 원하는 시알릴화를 허용하기 위하여, 적당한 조건 하에서, 그 유리한 특성을 위해 선택된 FⅦ 조성물에서, 생체외에서, 작용하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 FⅦ 조성물은 (개시 FⅦ 조성물(starting composition of FⅦ)) 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물에서 시알산 전이효소의 작용에 의해 얻어질 수 있다. 유리하게, 개시 FⅦ 조성물은 대부분 바이안테너리, 모노시알릴화 글리칸 형태(monosialylated glycan forms)이다. 유리하게, 개시 FⅦ 조성물은 대부분 바이안테너리, 모노시알릴화(monosialylated) 및 비푸코실화된 글리칸 형태를 나타낸다. 시알산 전이효소의 작용에 의해 모노시알릴화 형태에서 바이시알릴화 형태로 변화시키기 위해 모노시알릴화 형태에 부가적인 시알산을 붙인다.

유리하게, 이 바이안테너리, 모노시알릴화 형태는 40% 이상의 비율로 개시 FⅦ 조성물에 존재하며, 더 유리하게는 50% 또는 60% 이상의 비율로 존재한다. 유리하게, 개시 조성물은 바이안테너리, 모노시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태의 비율이 20% 이상, 특히 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상을 나타낸다.

유리하게, FⅦ의 개시 조성물의 적어도 일부 시알산은 α2-6-연결을 포함한다. 특히 유리한 방법에서는, 특히 유리하게, α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율은 60%이상, 또는 70%, 80%, 90% 이상이다. 특히, 이 비율은 60~90%이다.

우선적으로, FⅦ 개시 조성물의 모든 시알산은 α2-6-연결(α2-6-link)을 포함한다.

특정한 구체예에서, FⅦ의 개시 조성물이 너무 높은 비율의 푸코실화(fucosylated) 형태를 포함하면, 예를 들어, 50% 이상 또는 60% 이상이면, 조성물을 탈푸코실화시키는(defucosylate) 하나 이상의 효소를 사용하여 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 형태를 얻을 수 있다. 예로서, 다수의 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태를 얻기 위해서 한동안 푸코시데아제(fucosidase)의 사용에 대해 언급할 수 있다.

특히 유리한 방법에서는, FⅦ 개시 조성물은 그것의 낮은 면역원성(immunogenicity)을 위해 선택된다.

유리하게, 개시 조성물은 문서 FR 06 04872에서 기술된 FⅦ 조성물이며, 그 내용은 본 문서에 포함되는 것으로 간주된다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ는 폴리펩티드이며, 그 펩티드 서열는 본래 인간 FⅦ의 펩티드 서열일 수 있고, 즉 FⅦ에 관련된 아무 문제도 나타나지 않는 인간에 존재하는 서열일 수 있다. 예를 들면 그런 서열는 문서 EP 0 200 421에서 기술된 서열 1b에 의해 인코드될 수 있다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ의 순서는 SEQ ID 번호: 1의 서열이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 FⅦ는 본래 인간 FⅦ의 변이체일 수 있고, 이 변이는 본래 FⅦ보다 면역성이 없다. 따라서, 이 변이체의 펩티드 서열은 본래 인간 FⅦ의 서열과 적어도 70%, 유리하게 적어도 80% 또는 적어도 90%이고 더 유리하게는 적어도 99%의 동일성(identity)을 나타낼 수 있고, 그런 변이체는 본래 FⅦ와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가진다.

게다가, 본 발명의 FⅦ는 변형된 FⅦ의 모든 서열을 의미해서 단백질의 생물학적 활성이 본래 인간 FⅦ와 비교하여 감소한다. 혈전증(thromboses)의 치료 또는 예방(prophylaxy)에 사용되는(Holst et al., Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg., 1998 Jun, 15(6)　: 515-520), 재조합된 비활성화된 인간 FⅦ, FFR-FⅦa가 그 예로서 언급될 수 있다. 그런 FⅦ는 하나 이상 아미노산의 삽입, 결실(deletion) 또는 치환(substitution)에 의하여 본래 FⅦ의 서열과 다른 아미노산 서열을 나타내는 폴리펩티드이다.

본 발명의 FⅦ의 생물학적 활성은 예를 들면, 미국특허 US 5,997,864에서 기술된 것처럼, FⅦ-결핍 혈장의 사용 및 트롬보플라스틴(thromboplastin)의 사용에 의해 혈액 응고를 유도하는 FⅦ 조성물의 능력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 미국특허 US 5,997,864에서 기술된 테스트에서, 생물학적 활성은 대조구 샘플과 비교하여 응고 시간이 감소하는 것에 의해 표현되고, 혈청 1유닛(FⅦ 활성의 1U)/㎖을 포함하는 인간 혈청(풀(pool))의 표준과 비교하여 "FⅦ 유닛"으로 변경된다.

본 발명의 FⅦ 조성물은 혈장 FⅦ의 당화와 유사한 당화 특성을 나타낸다. 사실, 혈장 FⅦ의 주요 N-글리칸 형태는 (또는 혈장 FⅦ 조성물은) 바이안테너리, 바이시알릴화 형태이다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ 조성물의 바이안테너리, 바이시알릴화 (푸코실화된 및 비푸코실화된) 형태의 비율은 30%이상, 40% 이상, 50% 이상이다. 특히 유리한 방법에서, 바이안테너리, 바이시알릴화 형태의 비율은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이다. 특히 유리한 방법에서, 바이시알릴화 (푸코실화된 및 비푸코실화된) 형태의 비율은 50% 내지 80% 또는 60% 내지 90%, 또는 70% 내지 85%를 포함한다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ 조성물의 푸코오즈(fucose)의 비율은 20% 이상이며, 유리하게 20% 내지 50%를 포함한다. 이 비율은 FⅦ 조성물의 모든 글리칸 형태에 있어 측정된 푸코오즈의 비율에 대응한다.

이 특징은 본 발명의 FⅦ의 이점 중 하나이다. 실제로, 상업적으로 이용 가능한 재조합 FⅦ는 100% 비율의 푸코실화(fucosylation)를 나타내는 반면, 혈장 FⅦ는 약 16%의 푸코실화(fucosylation)의 비율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 FⅦ의 푸코실화는 이상독성부정(innocuity)의 측면에서 본 발명의 FⅦ에 장점을 제공하는, 혈장 FⅦ의 푸코실화와 유사하다.

유리하게, 적어도 일부 본 발명의 인자 Ⅶ 조성물의 시알산은 α2-6-연결을 포함한다. 특히 유리한 방법에서, α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율은 60% 이상, 또는 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이다. 특히, 이 비율은 60% 내지 90%를 포함한다.

따라서, 본 발명의 FⅦ 조성물은 α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율이 0이 아닌 비율을 포함한다. 이것은 α2-6-연결을 포함하는 시알산만 포함하는 상업적인 재조합 FⅦ에 비해 유리하고, 반면에 이들은 혈장 FⅦ에 포함된다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 FⅦ 조성물의 모든 시알산은 α2-6-연결을 포함한다.

바람직한 방법에서, 모든 시알산은 α2-6-연결을 포함하며, 즉, 모든 시알산은 α2-6-연결에 의해 갈락토오스에 결합하고, 특히, FⅦ의 시알산의 적어도 90%는 α2-6-연결을 포함한다. 본 발명에 따른 FⅦ 조성물은 또한 α2-3-연결을 포함하는 시알산을 더 포함할 수 있다.

FⅦ 조성물의 시알산이 α2-6-분기(branching)를 포함한다는 사실은 본 발명의 FⅦ의 이점 중 하나이다. 실제로, 상업적으로 이용 가능한 재조합 FⅦ의 시알산은 α2-3-연결만 포함한다. 혈장 FⅦ는 이러한 두 종류 이성체(isomer)의 혼합물이다. 예를 들면 그런 혈장 FⅦ는 40%의 이성체 α2-6 및 60%의 이성체 α2-3를 포함한다. 그러나, 후자는 더 많은 α2-6-연결을 포함하며, 이는 본 발명의 FⅦ를 혈장 FⅦ에 더 유사하게 한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 FⅦ 조성물의 어떤 시알산은 α2-3-연결을 포함한다.

따라서, 본 발명의 특정한 구체예에서, 조성물의 재조합 또는 형질전환 FⅦ는 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태와 비교된 주로 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태 및 90% 이상의 α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율을 나타낸다.

본 발명의 구체예에서, 조성물의 재조합 또는 형질전환 FⅦ는 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태와 비교된 주로 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태 및 100%의 α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율을 나타낸다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 조성물의 재조합 또는 형질전환 FⅦ는 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태와 비교된 주로 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태 및 20% 내지 50%를 포함하는 FⅦ 조성물의 푸코오즈의 비율을 나타낸다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 조성물의 재조합 또는 형질전환 FⅦ는 인자 Ⅶ의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태와 비교된 주로 바이안테너리, 바이시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태, α2-6-연결을 포함하는 모든 시알산 및 20% 내지 50%를 포함하는 FⅦ 조성물의 푸코오즈의 비율을 나타낸다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ 조성물은 인간에 의해 생산되지 않고, 형질전환 포유동물에 의해 생성될 것이다.

그러므로, 이 구체예에서, 본 발명의 FⅦ 조성물은 "형질전환"으로 간주될 것이다. 형질전환 포유동물은 외래 단백질(exogenous protein)을 발현시키기 위해 유전적으로 조작된, 인간을 제외한 모든 포유동물을 의미하며, 예를 들면 토끼, 산양, 쥐(mouse), 쥐(rat), 소(bovine), 말, 돼지, 곤충, 양을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 외래 단백질은 FⅦ, 가급적이면 인간 FⅦ이다. 인간이 아닌 형질전환 포유동물은, FⅦ 이외에, 형질전환 FⅦ 조성물에 원하는 시알릴화를 부여하기 위해 외래 효소(exogenous enzyme)를 발현시킬 수 있다. 이 때문에, 인간이 아닌 형질전환 동물은 FⅦ를 인코딩하는 유전자 및 시알산 전이효소(sialyltransferase)를 인코딩하는 유전자를 같이 발현시킬 수 있다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 형질전환 FⅦ는 형질전환 포유동물의 유선(mammary gland)에서 발현되고, 유선의 우유에서 생성된다. 이 때문에, 형질전환 유전자(transgene)의 발현은 동물의 유선에서 형질전환 유전자의 생성을 보장하는 프로모터(promoter)에 의해 조직-의존 방법으로 이루어진다. WAP 프로모터(유장 산성 단백질(whey acidic protein)), 카세인 프로모터, 특히 β-카세인 또는 α-카세인 프로모터, β-락토글로불린(lactoglobulin) 프로모터, α-락토알부민(lactalbumin) 프로모터를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ 조성물은 형질전환 암컷 토끼에 의해 생성될 수 있을 것이며, 상기 조성물은 생체외(in vitro)에서 시알릴화되어서 대부분 바이안테너리, 바이시알릴화 형태일 것이다.

토끼가 프리온, 특히 공중보건문제인, 전파성 아급성 해면양 뇌병증(transmissible subacute spongiform encephalopathy)에 과민성을 보이기 않기 때문에, 토끼가 치료 단백질의 생산에 특히 유리한 종이다.

게다가, 토끼와 인간 사이의 종간 장벽(species barrier)은 중요하다. 반대로, 인간과, 상업적으로 이용가능한 재조합 FⅦ가 생성되는 생물계인 햄스터 사이의 종간 장벽은 덜 중요하다.

따라서, 토끼에서 FⅦ를 생산하는 것은 프리온 유형의 비-전통적인 병원균을 포함하여, 병원균 전염에 대한 안전성의 측면에서 유리하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 FⅦ는 암컷 토끼의 유선에서 생성된다.

형질전환 포유동물이 우유를 분비하는, 유선에서 관심대상 단백질을 분비하는 것은 조직-의존적 방법(tissue-dependent manner)으로 재조합 단백질의 발현을 제어하는 것을 포함하는 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 기술이다.

동물의 특정 조직으로 단백질 발현을 지시하게 하는 서열 때문에 발현의 조직 제어가 이루어진다. 이런 서열은 또한 프로모터 서열 및 펩티드 신호 서열이다.

유선에서 관심대상 단백질을 발현시키는 프로모터의 예로는 WAP 프로모터(유장 산성 단백질(whey acidic protein)), 카세인 프로모터, 특히 β-카세인 프로모터, α-카세인 프로모터, β-락토글로불린 프로모터(β-lactoglobulin promoter), α-락토글로불린 프로모터가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 유리한 방법에서는, 암컷 토끼의 유선에서의 발현은 β-카세인 프로모터 통제 하에서 이루어진다.

형질전환 동물의 우유에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: 선천적으로 우유로 분비되는 단백질의 프로모터의 제어하에 있는, 인간 FⅦ를 인코딩하는 유전자를 포함하는 합성 DNA 분자를 인간이 아닌 포유동물의 배(embryo)에 통합시킨다. 이후에, 배를 동종의 암컷 포유동물로 이식한다. 일단 배에서 얻은 포유동물이 충분히 발육하면, 포유동물의 젖 분비(lactation)를 유도하고, 우유를 모은다. 그러면 우유는 관심대상 형질전환 FⅦ를 포함한다.

인간 이외에 포유동물 암컷의 우유에서 형질전환 단백질을 제조하는 방법의 예는 유럽특허 EP 0 264 166에 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 FⅦ을 생성하기 위해 참조될 수 있다.

인간 이외에 포유동물 암컷의 우유에서 형질전환 단백질을 제조하는 방법의 또 다른 예는 유럽특허 EP 0 527 063에 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 FⅦ을 생성하기 위해 참조될 수 있다.

암컷 토끼의 유선에서 생성된 FⅦ 조성물은 적어도 몇 인자 Ⅶ의 시알산이 α2-6-연결을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 방법에서, 모든 시알산은 α2-6-연결을 포함하고, 특히 FⅦ의 시알산의 적어도 90%는 α2-6-연결을 포함한다. 게다가 본 발명에 따른 FⅦ 조성물은 α2-3-연결의 시알산을 포함할 수 있다.

특히 유리한 방법에서, α2-6-연결을 포함하는 시알산의 비율은 60% 이상, 또는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상이다. 특히, 이 비율은 60% 내지 90% 사이를 포함한다.

암컷 토끼에서 발현된 FⅦ 조성물의 바이안테너리, 모노시알릴화 글리칸 형태 중에서, 대부분의 글리칸 형태는 비푸코실화된다. 유리하게, 이 바이안테너리, 모노시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태는 20% 이상의 비율로 이 FⅦ 조성물에 존재한다. 유리하게, 이 비율은 25% 이상, 또는 40% 이상이다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 이 FⅦ 조성물의 푸코실화 비율은 20% 내지 50%를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이 비율은 15% 이하 일 수 있다.

암컷 토끼의 형질전환 FⅦ는 몇몇 번역-후 변형을 포함한다: 첫 번째 9개 또는 10개의 N-터미널 글루탐산이 γ-카르복식화되고; Asp₆₃(Asparagine 63)는 부분적으로 수산화되며; Ser₅₂(세린 52)와 Ser₆₀(세린 60)는 O-당화되고, 각각 글루코오즈(크실로오스)₀ _-2, 푸코오즈(Fucose) 모이어티를 전달하고; Asn₁₄₅ 및 Asn₃₂₂는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 글리칸 복합 구조에 의하여 N-당화된다.

암컷 토끼의 유선에서 생성된 그런 FⅦ 조성물은 그 내용이 본 개시로 통합된, 문서 FR 06 04872에서 기술된다.

형질전환 포유동물에 의해 우유에서 생성된 FⅦ는 기술분야에서 숙련되는 사람에게 공지된 기술을 이용해서 우유에서 정제될 수 있다.

예를 들면, 미국특허 6,268,487에서 기술된 것처럼, 우유로부터 관심대상 단백질을 정제하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: a) 미투과물(retentate)과 외래 단백질을 포함하는 투과액(permeate)을 형성하기에 충분한 공극률을 가지는 막에 우유를 접선 여과시키는 단계; b) 외래 단백질을 대체하고 용출액(effluent)을 얻기 위해, 크로마토그래피에 의해 포획 장치(capture apparatus)로 상기 투과액을 통과시키는 단계, c) 용출액 및 미투과물을 조합하는 단계, d) 지질, 카세인 미셸로부터 FⅦ가 분리될 때까지 단계 a)에서 c)를 반복하는 단계. FⅦ는 적어도 75%까지 회수된다.

형질전환 포유동물의 우유에서 생성된 FⅦ의 다른 정제 기술은 그 내용이 참조에 의해 통합되는, 본 출원인에 의해 출원된 특허 출원 FR 06 04864에서 기술된다. 형질전환 동물의 우유에 포함된 형질전환 FⅦ의 추출 및 정제 과정(단계 A)은 다음의 단계를 포함한다:

a) 우유에, 가용성 염의 음이온이 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에서, 액체상(liquid phase)에 존재하는, FⅦ를 분리하기 위해 불용성 칼슘 화합물을 형성할 수 있도록 선택된, 가용성 염을 첨가하여 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 우유에서 상기 우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 결합하는 FⅦ를 추출하는 단계,

b) 칼슘 화합물의 침전물에서 단백질이 풍부한, 지질상과 단백질을 포함하는 수성 비-지질상(aqueous nonlipidic phase)으로 더 분리되는 액체상을 분리하는 단계,

c) 미리 결정된 농도로 인산염에 기반을 둔 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여, 수성 비-지질상을 친화성 크로마토그래피를 하는 단계, 및

d) 약 염기 유형 음이온 교환기 컬럼에 투과되지 않는 인자 Ⅶ의 연속적인 용출액에 적절한 버퍼를 이용하여 약 염기 유형 음이온 교환기 컬럼에서 두 번 또는 세 번의 크로마토그래피 단계를 통해 상기 c) 단계에 따라 얻어진, 인자 Ⅶ을 용출시키는 단계.

실제로, 본 출원인은 WAP 프로모터 또는 β 카세인 프로모터 등과 같은, 락토세럼(lactoserum)에서 선천적으로 생성된 프로모터의 제어 하에 놓이면 FⅦ가 우유의 칼슘 이온에 결합되어서 카세인 미셀로 결합된다는 것을 알게 되었다.

형질전환 포유동물의 우유에서 생성된 FⅦ을 정제하는 다른 기술은 본 출원인에 의해 출원되고, 그 내용이 참조에 의해 통합된, 특허 출원 FR 06 11536에 기재되어 있다. 형질전환 포유동물의 우유에 포함된 FⅦ의 추출 및 정제 과정은 다음의 단계를 포함한다:

a) 상기 우유에서 지방을 걷어내고 탈지질화(delipidation)하는 단계,

b) 크로마토그래피 지지상(chromatographic support)에 상기 단백질이 유지되게 하는 pH 상태 하에서, 소수성(hydrophobic) 및 이온성을 나타내는 융합된 리간드(grafted ligand)를 가지는 크로마토그래피 지지상에 상기 단백질을 포함하는 탈지화된 단편을 통과시키는 단계,

d) 단백질을 용출(elution)시키는 단계,

e) 상기 용출된 단편에서 우유 단백질을 제거하여 상기 용출 단편을 정제하는 단계, 및

e) 상기 단백질을 회수하는 단계.

FⅦ 조성물이 형질전환 암컷 토끼에 의해 생성될 때, 생체 외에서 시알릴화가 일어나서 바이안테너리, 바이시알릴화 형태가 다수일 것이다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 시알릴화는 시알산 전이효소(sialyl-transferase)의 이용에 의해 이루어지며, 예를 들면, α2,6-(N)시알산 전이효소(sialyl-transferase)(또는 β-D-갈락토실-β1,4-N-아세틸-β-D-글루코사민-α 2,6 시알산 전이효소(β-D-galactosyl-β1,4-N-acetyl-β-D-glucosamin-α2,6-sialyltransferase)), 또는 Gal beta 1,3GalNAc 알파 2,3-시알산전이효소(Gal beta 1,3GalNAc alpha 2,3-sialyltransferase), 또는 Gal beta 1,3(4) GlcNAc 알파 2,3 시알산전이효소(Gal beta 1,3(4) GlcNAc alpha 2,3 sialyltransferase), 또는 GalNAc 알파-2,6-시알산 전이효소 I(GalNAc alpha-2,6-sialyltransferase I)이며, 이들 효소는 상업적으로 이용 가능하다.

우선적으로, 사용된 시알산 전이효소는 α2-6-연결을 통해 시알산을 전이시키는 시알산 전이효소이다. 사실, 이 이성체가 혈장 FⅦ에서 더 많이 나타나기 때문에, 본 발명의 FⅦ 조성물이 α2-6-연결을 포함하는 시알산을 나타낸다는 것이 유리하다.

시알릴화는 예를 들면, 시알산 자체 또는 하나 이상의 시알산 그룹(sialic acid group)을 포함하는 모든 분자와 같은, 시알산 공여체 기질(sialic acid donor substrate)에 의해 이루어지며, 시알산 그룹(sialic acid group)을 방출할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따르면, 효소가 α2-6-(N)-시알산전이효소(α2,6-(N)-sialyltransferase)인 경우에, 기질은 시알산 공여체 그룹에서 FⅦ로 시알산을 이동시키기에 적당한 반응 매체(reaction medium)에서, 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산(cytidine-5'-monophospho-N-acetyl-neuraminic acid)이며, 바이안테너리, 바이시알릴화 형태가 다수이다. 이 반응 매체는 모르폴리노-3-프로판술폰산(morpholino-3-propanesulfonic acid), 및 Tween 등에 기반을 둔 버퍼로 이루어져 있는 버퍼 등에 기반을 둘 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 반응이 일어나도록 하기 위해서 기질은 시티딘 모노포스페이트(CMP)-시알릭산 합성효소(cytidine monophosphate (CMP)-sialic acid synthetase), 시알산, CTP(시티딘 트리포스페이트(cytidine triphosphate)) 및 충분한 양의 2가 금속 양이온(divalent metal cation)을 포함하는 반응 매체에서 합성될 수 있다. 예로, 2가 금속 양이온은 칼슘 이온, 아연 이온, 마그네슘 이온, 크롬 이온, 구리 이온, 철 이온 또는 코발트 이온일 수 있다.

FⅦ 조성물의 시알릴화를 실행하기 위하여 적용된 방법이 무엇이라도, 반응은 바이시알릴화 형태가 충분히 증가하도록 충분한 시간과 적당한 조건에서 항상 일어나서, 바이시알릴화 형태가 다수이다. 정보를 위해, 반응은 적어도 0.5시간 동안, 및 특히 5시간 동안, 특히 유리한 방법에서는 7시간 또는 8시간, 9시간, 심지어 10시간 동안 일어난다. 우선적으로, 인큐베이션은 밤에 일어난다. 특히, 이 반응은 5 내지 12 시간을 포함한 기간 동안 실행될 것이다.

유리하게, 본 발명의 조성물의 FⅦ는 활성화된다(FⅦa).

이 때문에, F FⅦa가 FⅦ를 대신하여 조직 인자(tissue factor; TF)와 상호작용할 때 FⅦa는 FⅦ보다 25 내지 100배 더 큰 응고 활성을 나타낸다. 이황화 결합에 의해 연결된 두 사슬이 다른 프로테아제(FⅨa, FXa, FⅦa)에 의하여 효소원(zymogen)이 끊어지면 FⅦ이 활성화된다. FⅦa만으로는 매우 낮은 효소 활성을 나타내지만, 조직 인자(TF)인 공동인자와의 복합체 형태는 FX 및 FⅨ를 활성화함으로써 응고 과정을 유발시킨다. 예를 들면, FⅦa는 순환 항체(circulating antibody)를 가진 혈우병 환자의 지혈(hemostasis)을 책임지는 응고 인자이다. 특히 유리한 방법에서, 본 발명의 FⅦ는 완전히 활성화된다. 유리하게, 본 발명의 FⅦa는 몇몇 번역-후 변형을 포함할 수 있다: 첫 번째 9개 또는 10개의 N-터미널 글루탐산이 γ-카르복식화되고; Asp₆₃는 부분적으로 수산화되며, Ser₅₂와 Ser₆₀는 O-당화되고, 각각 글루코오즈(크실로오스)₀ _-2, 푸코오즈(Fucose) 모이어티를 전하고; Asn₁₄₅ 및 Asn₃₂₂는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조(biantennary bisialylated complex structures)에 의하여 N-당화된다.

예를 들면, FⅦ의 활성화는 또한 본 발명의 FⅦ 정제 동안, 생체외에서(in vitro) 실행된 과정에서 유래할 수 있다(실시예 2 참조).

그러므로 본 발명의 FⅦa는 하나의 이황화 결합(Cys₁₃₅-Cys₂₆₂)에 의해 연결된 약 20kDa의 분자량을 가진 152 아미노산의 경쇄와 약 30kDa의 분자량을 가진 254 아미노산의 중연쇄로 이루어져 있는 화합물이다.

따라서, 본 발명의 FⅦ는 혈장 FⅦ에 유사한 활성 및 구조를 가지는 활성화된 FⅦ이다.

FⅦa는 조직 인자(TF)와의 상호작용에 따라 FⅦ보다 25 내지 100배 더 큰 응고 활성을 나타낸다.

본 발명의 구체예에서, FⅦ는 인자 Xa, VⅡa, Ⅱa, Ⅸa 및 XⅡa에 의해 생체외에서(in vitro) 활성화될 수 있다.

본 발명의 FⅦ는 또한 그 정제 과정 중에 활성화될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 의약품으로 사용을 위한 본 발명의 FⅦ 조성물이다.

본 발명의 다른 목적은 혈우병(haemophilia) 환자의 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다발성 출혈성 외상(multiple hemorrhagic trauma)의 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항응고제(anticoagulant)의 과량 복용에 의한 출혈(bleedings or hemorrages)의 치료에 사용될 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 인자 Ⅶ 및 약제로 허용될 수 있는 첨가제(excipient) 및/또는 약제로 허용가능한 캐리어(carrier)를 포함하는 약제 조성물이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물의 제조방법으로, 조성물의 인자 Ⅶ의 각 분자는 N-당화 위치에 결합한 글리칸 형태를 포함하며, 상기 조성물의 인자 Ⅶ의 모든 분자 중에서, 바이안테너리, 바이시알릴화 글리칸 형태가 대부분이며, 바이시알화된 형태가 대부분이 되도록, 시알산 전이효소가 활성화되고 바이시알화 형태가 충분히 증가하도록 하기 위해 적당한 반응 매체에서 시알산 공여체 기질 및 시알산 전이효소와 함께, 충분한 시간 동안 시알산 공여체 기질에서 FⅦ로 시알산이 전이되도록 하는 적당한 상태에서, 상기에서 정의된 대로 부분적으로 시알릴화된 형절전환 또는 재조합 인자 Ⅶ에 접합하여 시알릴화되는 단계를 포함한다. 반응을 실행하는 조건은 상기에서, 또한 실시예에 기술되어 있다.

"부분적으로 시알릴화된"은 N에 결합된 FⅦ의 글리칸 형태가 모두 바이시알릴화되지 않은 FⅦ 조성물을 의미한다, 즉, 어떤 형태는 모노시알릴화되어 있다. 유리하게, 이 바이안테너리, 모노시알릴화 형태는 40% 이상, 특히 유리한 방법으로 50% 이상, 또는 60% 이상의 비율로 존재한다. 유리하게, 바이안테너리, 모노시알릴화 및 비푸코실화된 글리칸 형태의 비율은 20% 이상, 또는 특히 30%, 40% 또는 50%이상이다.

유리하게, 시알산 전이효소는 α2,6-(N)-시알산 전이효소(α2,6-(N)-sialyltransferase) (또는 β-D-갈리토실-β1,4-N-아세틸-β-D-글루코사민-α2,6-시알산 전이효소(β-D-Galactosyl-β1,4-N-acetyl-β-D-glucosamine-α2,6-sialyl-transferase)), 또는 Gal beta 1,3GalNAc 알파 2,3-시알산 전이효소(Gal beta 1,3GalNAc alpha 2,3-sialyltransferase), 또는 Gal beta 1,3(4) GlcNAc 알파 2,3 시알산 전이효소(Gal beta 1,3(4) GlcNAc alpha 2,3 sialyltransferase), 또는 GalNAc 알파-2,6-시알산 전이효소 Ⅰ(GalNAc alpha-2,6-sialyltransferase I)이다.

우선적으로, 사용된 시알산 전이효소는 α2,6-연결을 통해 시알산이 전이되게 하는 시알산 전이효소이다. 이 이성체가 혈장 FⅦ에 더 많이 존재하기 때문에, 본 발명의 FⅦ 조성물이 α2-6-연결을 포함하는 시알산을 나타내는 것이 유리하다.

시알릴화는 어떤 시알산 공여체 기질로도 실행될 수 있다.

구체예에 따르면, 효소가 α2-6-(N)-시알산전이효소(α2,6-(N)-sialyl-transferase)인 경우에, 기질은 시알산 공여체 그룹에서 FⅦ로 시알산을 전이시키기에 적당한 반응 매체(reaction medium)에서의, 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산(cytidine-5'-monophospho-N-acetyl-neuraminic acid)이며, 바이안테너리, 바이시알릴화 형태가 대다수이다.

반응 매체는 0.01% 내지 0.2%의 농도의 Tween®80 또는 Triton®X-100 또는 그들의 혼합물 등과 같은, 생물학적으로 호환성이 있는 텐시드(tenside) 혼합물, 또는 5mM 내지 10mM의 농도의 Ca² ⁺ Mn² ⁺, Mg² ⁺과 같은 또는 Co² ⁺, Ca² ⁺가 바람직한 2가 금속 양이온이다. 이 반응 매체는 40mM 내지 60mM의 변화하는 농도의 카코딜산 나트륨(sodium cacodylate), 모르폴리노-3-프로판술폰산(morpholino-3-propane-sulfonic acid), Tris 및 NaCl 등과 같은 매체의 pH를 유지하는 이온세기 조정제 및/또는 이온 세기 조정제들을 더 포함할 수 있다. pH 값은 일반적으로 6 내지 7.5이다. 반응 매체는 0.05 내지0.15㎎/㎖의 농도의 BSA(Bovine Serum Albumin)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 반응이 일어나도록 하기 위해서 기질은 시티딘 모노포스페이트(CMP)-시알산 합성효소(cytidine monophosphate (CMP)-sialic acid synthetase), 시알산, CTP(시티딘 트리포스페이트(cytidine triphosphate)) 및 충분한 양의 2가 금속 양이온(divalent metal cation)을 포함하는 반응 매체에서 합성될 수 있다.

FⅦ 조성물의 시알릴화 방법이 무엇이든지, 반응은 바이시알릴화 형태가 대부분이 되도록, 상기에서 정의한 대로, 바이시알릴화 형태가 충분히 증가하도록 충분한 시간 동안 그리고 적당한 조건 하에서 이루어진다.

과정이 고정화 효소(immobilized enzyme)를 이용할 때, 반응 시간은 유리하게 4℃ 내지 37℃에서, 바람직하게 4℃ 내지 20℃에서, 바람직하게 0.5 내지 3시간이다.

과정이 배치 반응(batch reaction)에서 실행될 때, 반응 시간은 유리하게 4℃ 내지 37℃에서, 바람직하게 4℃ 내지 20℃에서, 바람직하게 1 내지 9시간, 바람직하게 1 내지 6 시간이다.

바람직하게, 본 발명의 과정은 부분적으로 시알릴화된 형질전환 또는 재조합 인자 Ⅶ의 조성물의 생물학적 적용도(biodisponibility)를 향상하는 것을 목적으로 하는 과정이다. 생물학적 적용도의 향상은 상기에서 개시한 대로, 상기 조성물이 시알산 공여체 기질 및 시알산 전이효소와 접촉하여 얻어진다.

"생물학적 적용도의 향상"은 동일한 FⅦ 조성물의 시알릴화가 변형되지 않은 것에 비해 FⅦ 조성물의 생물학적 적용도가 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 유리하게 적어도 30% 또는 50%, 바람직한 방법에서 80% 또는 90% 증가하는 것을 의미한다.

다른 특정한 구체예에서, 시알릴화 단계 이전에, 갈락토실화(galactosylation) 단계가 실행된다. 이 단계는 갈락토오즈-부족 형태에서 갈락토오즈를 붙이는 것, 즉 FⅦ의 갈락토실화(galactosylated) 및 모노갈락토실화(monogalactosylated) 형태를 목적으로 한다. 갈락토오즈는 GlcNAc에 붙고, 연속적인 시알릴화 단계에서 시알산 잔기에 붙을 것이다. 이 갈락토실화(galactosylation) 단계는 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된, UDP-gal 우리딘(5'-디포스포갈락토오즈)(UDP-gal uridine (5'-diphosphogalactose))를 포함하는 반응 매체에서 갈락토실화 전이효소(galactosyl-transferase)를 이용하여 수행될 수 있다.

유리하게, 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물의 대다수 글리칸 형태는 복합체 바이안테너리, 모노시알릴화 유형이다.

그런 글리칸 형태를 다음에서 묘사한다:

본 발명의 특정한 구체예에서, 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물은 바이안티네리 바이시알릴화(푸코실화 또는 비푸코실화된), 트리안테너리 바이시알릴화 (푸코실화 또는 비푸코실화된), 및 바이시알릴화 (푸코실화 또는 비푸코실화된) 복합체 형태를 또한 포함한다.

유리하게, 상기 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물의 바이안테너리, 모노시알릴화된 글리칸 형태 중에서, 대다수 글리칸 형태는 비푸코실화된다.

유리하게, 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물은 적어도 상술한 것처럼, α2-6-연결을 포함하는 적어도 몇 시알산을 나타낸다.

바람직하게, 과정은 시알릴화 단계 이전에, 형질전환 암컷 토끼에 의해 부분적으로 시알릴화된 형질전환 FⅦ 조성물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 이 단계는 상술한 것과 같이 이루어진다. 이 단계는 또한 갈락토실화(galactosylation) 단계 이전에 실행될 수 있다.

유리하게, 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물의 FⅦ는 활성화된다.

본 발명의 과정은 상기 조성물의 인자 Ⅶ의 모든 분자 중 대부분 비율의 바이안테너리, 바이시알릴화 형태를 얻는 것을 허용한다.

유리하게, 시알산 공여체 그룹은 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산(cytidine-5'-monophospho-N-acetyl-neuraminic acid)이고, 시알산 전이효소는 α2-6-(N)-시알산전이효소(α2,6-(N)-sialyltransferase)이다.

부분적으로 시알릴화된 FⅦ의 그런 조성물은 형질전환 암컷 토끼의 유선에서 생성된 형질전환 FⅦ 조성물일 수 있다.

특히 유리한 방법에서는, 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물은 문서 FR 06 04872에서 기술된 조성물로서, 그 내용은 본 문서에 포함된다.

도 1: 실시예 1에서 얻은 FⅦ 조성물의 추출 및 정제.

도 2: NN-당화 자리를 나르는 펩티드의 탈회선된(deconvoluted) 질량 스펙트럼 ESI.

도 3: PNGase F에 의한 FⅦ의 탈당화(deglycosylation) 후의 전기영동상(Electropherograms) HPCE-LIF;

리간드: 전기영동상(electropherograms) 상부: FⅦa,p;

양쪽 전기영동상 중앙; FⅦ-Tg

전기영동 하부: FⅦa,r.

도 4: NP-HPLC에 의한 FⅦ의 특성;

리간드: 크로마토그램 상부: FⅦa, p;

크로마토그램 중앙: FⅦ-Tg;

크로마토그램 하부: FⅦa,r.

도 5: MALDI-TOFMS에 의한 FⅦ-Tg의 대부분의 글리칸 형태의 동정(Identification).

도 6: MALDI-TOFMS에 의한 FⅦa,r의 대다수 글리칸 형태의 동정.

도 7: 생체외에서 재시알릴화(resialylation)의 HPCE-LIF 분석: (하부) 본래 FⅦ-Tg의 올리고당(oligosaccharidic) 맵; (상부) 재시알릴화 후의 FⅦ-Tg의 올리고당 맵.

도 8: 시간당 바이안테너리, 바이시알릴화, 비푸코실화된(A2) 형태 및 푸코 실화된(A2F) 형태에 따른 FⅦ-Tg의 시알릴화의 동역학(Kinetics).

도 9: 토끼에서의 비교 연구 기초 PK (PK; 약동학(pharmacokinetics))의 결과: 형질전환 재시알릴화된 FⅦ (FⅦTgRS)에 비교된 형질전환 비-재시알릴화된(non resialylated) FⅦ (FⅦTgNRS): 제거의 반(半)로그(semilog) 곡선.

본 발명의 다른 측면 및 장점은 설명할 목적으로 본 발명의 범위를 제한하지 않는 다음의 실시예에 의해 기술될 것이다.

실시예에서 사용되는 약어

FⅦ-Tg = FⅦa-Tg: 본 발명에 다른 활성화된 형질전환 FⅦ

FⅦ-r= FⅦa r: 상업적으로 이용 가능한 활성화된 재조합 FⅦ

FⅦ-p= FⅦa p: 혈장 유래의 활성화된 FⅦ으로, 인간 혈장에서 정제됨

MALDI-TOF: 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)-비행시간(Time of Flight)

HPCE-LIF: 고성능 모세관 전기 이동법-레이저 유도 형광(High Performance Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence)

ESI-MS: 질량 분석-이온화법 "전자분사"(Mass spectrometry-Ionisation "Electrospray")

LC-ESIMS: 액체 크로마토그래피-질량분석-이온화법 "전자 분사"(Liquid chromatography-Mass spectrometry- Ionisation "Electrospray")

NP-HPLC: 정상 고성능 액체 크로마토그래피(Normal Phase High Performance Liquid Chromatography)

PNGase F: 펩티드: N-글리코시다아제 F(Peptide : N-glycosidase F)

LC-MS: 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법(Liquid Chromatography-Mass spectrometry)

[실시예 1] 우유에서 인간 FⅦ 단백질을 생성하는 형질전환 암컷 토끼의 생성

먼저, 벡터 p-poly Ⅲ-I의 폴리링커(polylinker)(described in the document Lathe et al, Gene (1987) 57, 193-201)로 WAP 유전자의 서열을 도입하여(described in the document Devinoy et al, Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16, 25 August 1988, p. 8180) 플라스미드 p1를 제조한다.

플라스미드 p1에서 얻어진, 플라스미드 p2는 토끼 WAP 유전자의 프로모터(6.3Kb) 및 인간 FⅦ 유전자를 포함한다.

전통적인 미량주사(microinjection) 기술로 형질전환 암컷 토끼를 생산하였다(Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442). 500 카피의 유전자를 포함하는 1-2 pl을 토끼 배(embryo)의 수 생식핵(pronucleus)으로 주입하였다. 재조합 유전자를 포함하는 이 벡터의 단편을 미량주입하였다. 이후, 배를 호르몬적으로 준비된 암컷(adoptive female)의 수란관(oviduct)에 이식하였다. 조작된 배의 약 10%가 어린 토끼를 낳았고 조작된 배의 2~5%가 형질전환 어린 토끼를 낳았다. 형질전환 유전자(transgene)의 존재 여부는 토끼 꼬리에서 추출된 DNA 에서 서던 트랜스퍼 기술(Southern transfer technique)에 의해 밝혀졌다. 동물의 혈액과 우유에서의 FⅦ 농도는 특이 방사선면역분석법(Radioimmunological assay)에 의해 평가되었다.

세포 배양 배지 또는 토끼 포유동물 외식 배양 배지(rabbbit mammal explants culture medium)에 우유를 첨가하여 FⅦ의 생물 활성도를 평가하였다.

[실시예 2] 얻은 FⅦ의 추출 및 정제

a) FⅦ의 추출

500㎖의 원유를 취하여 pH 8.2인, 0.25M 인산나트륨 버퍼의 9배 양으로 희석하였다. 상온에서 30분 동안 교반한 후, FⅦ가 풍부한 수상을 15℃에서 1시간 동안 10,000g에서 원심분리하였다(centrifuge Sorval Evolution RC - 6700rev/min - rotor SLC-6000). 약 835㎖의 6개 포트가 필요하다.

원심분리 후, 3개의 상이 존재한다: 표면의 지질상(크림), (대부분의 상인) FⅦ가 풍부한 투명한 비-지질 수상 및 남은 흰 고체상(불용성 카세인 및 칼슘 화합물의 침전물).

연동펌프(peristaltic pump)에 의해 크림상 및 FⅦ을 포함하는 비-지질 수상을 모으고 나서, 크림상을 따로 모은다. 고체상(침전물)을 제거한다.

그러나 여전히 소량의 지질을 포함하는 비-지질 수상을 일련의 필터(Pall SLK7002U010ZP-1㎛의 세공을 가지는 유리섬유의 프리필터(prefilter)- Pall SLK7002NXP-0.45㎛의 세공을 가지는 나일론 66(Nylon 66))로 여과한다. 여과가 끝 난 후에, 우유의 지방구(fat globules)가 잔류되어 있는 상기 일련의 필터 장치를 지질상이 통과하며, 여과액이 투명하다.

크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)을 가지도록 하기 위해, 여과된 비-지질 수상을 울트라 필터용 막(Millipore Biomax 50kDa - 0.1㎡)에서 더 투석시킨다. 우유의 염, 당 및 펩티드와 달리, 약 50kDa의 고 분자량을 가진 FⅦ는 막을 통해 여과되지 않는다. 처음에, 용액(약 5,000㎖)을 500㎖으로 농축시키고 나서, 일정한 양을 유지하는 울트라 필터 장치에 의한 투석에 의해 전해질(electrolyte)을 제거하고 크로마토그래피 단계를 위한 생물학적 물질로 제조한다. 투석 버퍼는 pH 8.2의 0.025M 인산나트륨 버퍼이다.

FⅦ를 포함하는 이 비-지질 수상은 FⅦ-Tg가 풍부한 락토세럼에 동화될 수 있다. 방법을 계속하기 전에 -30℃에서 이 제조물을 저장한다.

이 단계에 의하여 FⅦ의 전체적인 회수량이 만족할 정도가 된다: 90%(인산염을 가진 91%의 추출물 + 99% 투석/농축).

이 단계에서 유래하는 FⅦ를 포함하는 비-지질 수상은 완전히 투명하고 다른 크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)이 있다.

약 93,000IU의 FⅦ-Tg가 이 단계에서 추출된다. 이 제조물에서 FⅦ의 순도는 약 0.2%이다.

b) FⅦ의 정제

1. 하이드록시아파타이트 젤( hydroxyapatite gel ) 크로마토그래피(친화성 크 로마토그래피( affinity chromatography ))

Amicon 90(지름 9㎝-단면 64㎠) 컬럼을 BioRad 세라믹 하이드록시아파타이트 젤 유형 I(CHT-I)로 채운다.

젤은 pH 8.0의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨의 혼합물로 이루어진 수성 버퍼 A로 평형을 유지된다. -30℃에서 저장된, 전체 제조물을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃로 중탕냄비(water bath)에서 해동시키고 나서, 젤에 주입한다(선형 유속(linear flow rate) 100㎝/h, 즉, 105㎖/min). pH 8.2의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨으로 이루어진 버퍼를 통과시켜, 기준선(RBL)으로 복귀할 때까지, 잔류되지 않는 단편을 제거한다.

FⅦ-Tg를 포함하는 단편을 pH 8.0인 0.25M의 인산나트륨 및 0.4M의 염화나트륨으로 조성된 버퍼 B로 용출시킨다. 용출된 단편을 기준선에 복귀할 때까지 모은다. λ=280㎚에서의 흡수도 측정을 통해 화합물을 탐지한다.

95% 이상의 락틴 단백질을 제거하면서, 이 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 FⅦ-Tg를 회수한다. 고유 활성도(specific activity; S.A.)를 25로 곱한다. 4%의 순도를 가지는 약 85,000IU의 FⅦ-Tg를 이 단계에서 이용할 수 있다.

2. 100 kDa 접선 여과( Tangential filtration ) 및 50 kDa 농축/투석

이전 단계의 전체 용출액을 100kDa 울트라 필터용 막(Pall OMEGA SC 100K-0.1㎡)에서 접선 형태로 여과시킨다. FⅦ는 100kDa 막을 통해서 여과되는 반면, 100kDa이상의 분자량을 가진 단백질은 여과되지 않는다.

여과된 단편을 약 500㎖ 부피로 더 농축하고 나서 상기에서 기술된 50kDa 울트라 필터에서 투석한다. 투석 버퍼는 0.15M 염화나트륨이다.

이 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피를 시행하기 전에 생성물을 -30℃에서 저장한다.

이 단계를 통해 100kDa 이상의 분자량을 가진 단백질과 특히 프로-효소(pro-enzyme)의 부하(charge)를 감소시킨다. 100kDa 막 처리를 통해 분자량이 높은 단백질 중에, 단백질의 약 50%가 남는 반면 95%의 FⅦ-Tg, 즉 82,000IU의 FⅦ-Tg가 여과된다.

이 처리를 통해 이후 단계(downstream step)의 단백질 가수분해(proteolytic hydrolysis)의 위험을 감소시킬 수 있다.

3. Q- Sepharose ® FF 젤에서의 크로마토그래피(단계 d-방법 A)

유효성분(active principle)을 정제하고, 활성화된 FⅦ(FⅦa)로 FⅦ를 활성화하며, 마지막으로 FⅦ 조성물을 농축하고 성분배합을 하기 위해 이온 교환기 젤 Q-Sepharose® Fast Flow(QSFF)에서 3번의 연속 크로마토그래피를 실시한다. λ=280㎚에서 흡수도 측정을 통해 화합물을 탐지한다.

3.1 Q- Sepharose ® FF 1단계 - 용출 "고 칼슘"

2.6㎝의 지름(단면 5.3㎠)의 컬럼을 100㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스(Tris) 버퍼로 평형을 유지한다.

-30℃에 보존된 전체 단편을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃로 중탕냄비에서 해동시킨다. 젤로 주입하기 전에(유속 13㎖/min, 즉 선형 유속 150㎝/h) 평형 버퍼에 의해 단편을 ½[v/v]로 희석하고 나서, 잔류되지 않는 단편을 RLB까지 버퍼를 통과시켜 제거한다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스 및 0.15M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 소량의 FⅦ를 가지는 첫 번째 단백질 단편을 용출시켜서, 계속 제거한다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.05M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 두 번째 FⅦ가 풍부한 단백질 단편을 용출시킨다.

이 두 번째 단편을 상술한 50kDa 울트라 필터로 투석시킨다. 투석 버퍼는 0.15M의 염화나트륨이다. 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피를 통과하기 전에 이 단편을 +4℃에서 밤 사이에 보존한다.

이 단계를 통해 80%의 결합 단백질을 제거하면서 73%의 FⅦ(즉, 60,000IU의 FⅦ-Tg)를 회수한다. 또한, 이 단계에 의해 FⅦ가 FⅦa로 활성화된다.

3.2 Q- Sepharose ® FF 2단계 - 용출 "저 칼슘"

2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 30㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.

젤로 주입(유속 9㎖/min, 즉 선형 유속 100㎝/h)하기 전에, +4℃에서 저장된 이전에 용출된 단편(두 번째 단편)을 희석시킨다.

두 번째 단편을 주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해, RBL 까지, 평형 버퍼로 젤을 세척한다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.005M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 4.5㎖/min(즉, 50㎝/h)의 속도로, 높은 순도의 FⅦ를 포함하는 단편을 용출시킨다.

약 23,000IU의 FⅦ-Tg, 즉 12㎎의 FⅦ-Tg를 정제하였다.

이 단계를 통해 95% 이상의 결합 단백질(암컷 토끼의 우유 단백질)을 제거한다.

90% 이상의 순도를 가진 이 용출액은 선천적으로 존재하는 인간 FⅦ 분자에 가까운 구조적 특징 및 기능성 특징으로 나타낸다. 용출액은 세 번째 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 농축되고 성분 배합된다.

3.3 Q- Sepharose ® FF 3단계 - 용출 "나트륨"

2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 10㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.

주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해, RBL 까지, 평형 버퍼로 젤을 세척한다.

젤로 주입(유속 4.5㎖/min, 즉 선형 유속 50㎝/h)하기 전에, 이전 단계에서 용출되고 정제된 단편을 주사용 정제수(purified water for injection; PWI)로 5배로 희석시킨다.

이후에, pH 7.0인 0.02M의 트리스, 0.28M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 3㎖/min(즉, 36㎝/h)의 유속으로, FⅦ-Tg을 용출시킨다.

95% 이상의 순도의 농축물의 형태로 FⅦ-Tg 조성물을 제조하였다. 생성물은 정맥 주사와 친화성이 있다. 방법은 처리된 우유 리터당 적어도 20㎎의 FⅦ로 정제되어, 22%의 축적량을 가진다.

표 A는 정제된 FⅦ 조성물을 제공하기 위한 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 과정 단계를 요약하며, 각 단계에서 얻은 다른 수득량, 순도 및 특정 활성을 제공한다.

[표 A]

배치번호 479030	부피 (㎖)	단백질 함량(㎎)	FⅦ:Ag(IU) 함량	FⅦ 수확량 /단계(%)	FⅦ 수확 량/농축된%	SA (IU/㎎)	FⅦ 순도(%)
원유	500	42750	103450	100%	100%	2.4	0.12%
인산염 추출	4785	ND	93650	91%	91%	-	-
농축/투석 (50DKa UF)	657	29610	93233	99%	90%	3.1	0.20%
하이드록시아파타이트 용출액(CHT-I)	2644	1071	85692	92%	79%	80.0	4.0%
접선 여과 (100Ka UF)	459	518	81684	95%	72%	157.6	7.9%
용출액 QSFF1 (고Ca² ⁺)	402	105	59757	73%	58%	572	28.6%
용출액 QSFF2 (저Ca² ⁺)	157	12.8	22447	38%	22%	1749	87%
용출액 QSFF3 (나트륨)	42.5	12.7	21929	98%	21%	1727	86%
최종 생성물 (살균 0.2㎛)	50	12.4	23197	106%	22%	1878	94%

이후에서, 조성물의 FⅦ-Tg는 다음의 실시예에서 기술하는 것과 같은, 다른 구조 분석을 한다.

실시예 3: MS-ESI에 의한 당화 위치 및 당펩타이드의 특성

FⅦ-Tg, FⅦa,p(혈장 FⅦ) 및 FⅦa, r의 N-당화 위치를 MALDI-TOFMS에 의해 확인된 LC-ESIMS(/MS)에 의해 확인하였고, LC-ESIMS에 의해 각 위치에 존재하는 다른 글리칸의 상대비율(relative proportion)을 결정하였다.

도 2는 두 Asn 당화 잔기를 포함하는 당펩타이드의 탈회선된(deconvoluted) ESI 스펙트럼을 묘사한다. 당화 위치의 국소화(localisation)를 MALDI-TOF(/TOF) 및 에드만의 서열결정(Edman's sequencing)에 확인하였다.

당화 위치 Asn₁₄₅ 및 Asn₃₂₂를 나타내는, FⅦa,p의 당펩타이드[D₁₂₃-R₁₅₂] 및 [K_31.6-R₃₅₃]의 질량 스펙트럼의 분석에 의하면 각각 바이안테너리, 바이시알릴화 비푸코실화된 형태(A2)(Asn₁₄₅를 포함하는 당펩타이드의 관찰된 질량: 5563.8Da)와 푸코실화된 형태(A2F)(Asn₁₄₅를 가진 당펩타이드의 관찰된 질량: 5709.8Da)이 존재함이 밝혀진다. Asn₁₄₅에 있어서 또한 트리안테너리, 트리시알릴화, 비푸코실화된 형태(A3)(관찰된 질량 6220.0Da) 및 푸코실화된 형태(A3F)(관찰된 질량 6366.1 Da)도 존재한다.

FⅦa,r에 있어서, Asn₁₄₅는 A2F, A1F 유형의 글리칸에 의해 변경되고 "A1F"은 다른 안테나에 GalNAc 터미널 위치를 가진 모노시알릴화 형태에 일치한다. 글리칸 A3F (트리안테너리, 트리시알릴화, 푸코실화된 형태)도 존재한다.

FⅦ-Tg에 있어서, 당화 위치 Asn₁₄₅ 및 Asn₃₂₂를 나타내는, FⅦ-Tg의 당펩타이드 [D₁₂₃-R₁₅₂] 및 [K₃₁ _.6-R₃₅₃]의 질량 스펙트럼의 분석에 의하면, 각각, 바이안테너리, 바이시알릴화 비푸코실화된 형태(A2)(Asn₁₄₅를 포함하는 당펩타이드의 관찰된 질량: 5563.8Da)와 푸코실화 형태(A2F)(관찰된 질량: 5709.7Da)가 존재함이 밝혀진다. Asn₁₄₅에 위치한, 대부분의 올리고당은 바이안테너리 모노시알릴화 및 비푸코실화된 형태(A1) (관찰된 질량: 5272.3Da)와 푸코실화된 형태(A1F) (관찰된 질량: 5418.7Da)가 존재한다. 트리안테너리 형태는 거의 나타나지 않는다. 다른 안테나에 서의 터미널 위치에 GalNAc를 가진 모노시알릴화된 형태가 존재하지 않는 것을 주목해야 한다.

Asn₃₂₂의 대부분의 글리코형태(glycoforms)에 관하여, 동일한 글리칸 구조가 다른 비율로 관찰된다. 도 1은 Asn₁₄₅에서와 같이 덜 성숙한 형태(덜 안테너리 및 시알릴화)가 존재함을 보여준다. 예를 들면, 트리안테너리 형태는 혈장 생성물에 있어서 Asn₁₄₅와 비교해보면 Asn₃₂₂에 보다 적게 나타나고 FⅦa,r 및 FⅦ-Tg

에는 없다. Asn 145와 322가 100%까지 당화된다는 것을 또한 주의해야 한다. 유일한 반정량(semi-quantitative)에도 불구하고, 이 결과는 HPCE-LIF 및 NP-HPLC에 의해 얻어진 정량 자료와 일치한다.

실시예 4: HPCE-LIF에 의한 N-글리칸의 정량화

PNGase F로 탈당화(deglycosylation)를 한 후 HPCE-LIF에 의해 N 연결된 올리고당의 동정 및 정량화를 실시하였다. 각 분리된 구조를 동정하고 정량화하기 위해 엑소글리코시다아제(exoglycosidases)(시알리다아제(sialidase)(비율 효소/기질(FⅦ):1mIU/10㎍), 갈락토시다아제, HexNAcase(프로자임 키트), 푸코시다제(fucosidase) (비율 E/S:1mIU/10㎍)로 FⅦ 샘플을 처리하였다. 얻어진 글리칸을 형광색소(fluorochrome)로 라벨링하고, 질량 및 전하량에 따라 분리한다. 2 기준(포도당 호모폴리머(glucose homopolymer) 및 올리고당)을 통해 구조를 동정하였다. 전체 정량화된 올리고당에 대한 각 피크를 통합하여 정량화를 하였다.

그 모세관이 50㎝×50㎛의 내부 지름을 가지는 N-CHO (Beckman-Coulter)으로 "코팅된", 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 장치 ProteoLab PA800(Beckman-Coulter)를 사용한다. "젤-버퍼-N"(Beckman-Coulter)이라는 분리 버퍼를 사용한다. 20℃에서 20분 동안 25㎸의 전압을 적용하여 이동시킨다. λ_여기( _excitation ₎ 488㎚ ; λ_방출( _emission ₎520㎚에서 레이저를 이용하여 탐지한다.

시알리다아제, 갈락토시다아제 및 HexNAcase에 의한 동시 탈당화 후에, "코어(core)"에 대응하는 피크 영역과 푸코실화된 "코어" 사이의 비율에 의해 푸코실화(fucosylation) 비율을 계산한다.

FⅦ-a,p의 글리칸의 대부분은 바이안테너리, 바이시알릴화(A2) 유형 및 바이안테너리 바이시알릴화, 푸코실화(A2F) 유형이다. FⅦ-Tg의 글리칸 프로파일은 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화 유형 또는 바이안테너리, 모노시알릴화, 비-푸코실화 유형(A1F, A1) 및 바이안테너리, 바이시알릴화, 비-푸코실화 유형 또는 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화 유형(A2, A2F)이 존재함을 밝힌다. 양 전하에서 이들 다른 유형 사이의 분산이 변한다.

FⅦ-a,r은 대부분의 A2F 유형을 가진 바이안테너리, 시알릴화, 푸코실화된 글리칸 형태 및 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화된(A1F) 유형을 나타낸다. 이들 구조에 일반적으로 부딪친 이동 시간과 비교하여 A2F 및 A1F 형태에서 불규칙한 이동시간이 관찰된다.

FⅦ-Tg의 양 배치(A 및 B)의 글리칸 프로파일(cf. 도 3-양 전기영동상의 중 앙)은 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화된 형태 또는 바이안테너리, 모노시알릴화, 비푸코실화된 형태(A1F, A1) 및 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화 또는 비푸코실화된 형태(A2F, A2)의 존재를 밝힌다.

[표 1] 다른 배치의 FⅦ의 천연(native) 샘플에서 유래한 시알릴화 형태의 백분율의 개요

백분율	FⅦ-a,p	FⅦ-Tg 배치 A	FⅦ-Tg 배치 B	FⅦ a,r
천연 A2	41.9	19.3	13.9	-
A2F	8.9	14.8	21.5	44.8
A1	2.6	38.4	25.2	-
A1F	-	11.7	22.2	16.5
전체 A2+A2F	50.8	34.1	35.4	44.8
전체 A1+A1F	2.6	50.1	47.4	16.5

다른 글리칸 형태의 정량 분석(표 1)은 FⅦ-a,r에 있어서, 51%의 바이시알릴화 글리칸(A2 및 A2F)과 30%의 트리안테너리, 시알릴화, 비-푸코실화 또는 푸코실화 형태(G3와 G3F)를 가지는 FⅦa,p에 대한 시알릴화 구조의 우세를 나타낸다(결과 미도시). FⅦ-Tg(배치 A와 B)는 35%의 바이안테너리, 바이시알릴화 유형 및 단지 6%의 트리안테너리, 시알릴화 형태를 가지는 FⅦ-a,p보다 덜 시알릴화된다. 주요 형태는 50%의 구조 A1와 A1F으로 모노시알릴화된다. FⅦ-a,r는 또한 45%의 A2F 구조 및 단지 6%의 트리안테너리, 시알릴화된 글리칸를 가진 FⅦ-a,p보다 덜 시알릴화된다(결과 미제시). FⅦ-a,r에 있어서, 비-푸코실화 구조가 없는 것이 주목된다.

[표 2] 다른 FⅦ의 푸코실화 비율

	FⅦa,p	FⅦ-Tg 배치 A	FⅦ-Tg 배치 B	FⅦa,r
푸코실화 비율(%)	16.2	23.6	41.8	100

결과는 FⅦa, p에서의 낮은 비율의 푸코실화(16%), FⅦ-Tg에서의 24 내지 42%의 푸코실화 비율, FⅦ-a,r에서의 100%의 푸코실화 비율을 나타낸다.

[실시예 5] NP-HPLC에 의한 N-글리칸의 정량화

NP-HPLC에 의해 FⅦa,p, FⅦ-a,r 및 FⅦ-Tg의 N-당화에 대한 정성분석 및 정량분석을 하였다. 단백질을 탈염 처리(desalization) 및 건조한 후, 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 방법에 따라 이 단백질을 변성하고 환원한다. 이 후, 글리칸은 효소 반응(엔도글리코시다아제(endoglycosidase) PNGase F)에 의해 분리되고 에탄올 침전에 의해 정제된다. 따라서, 얻어진 글리칸을 형광원(fluorophore), 2-아미노벤조아마이드(aminobenzamide)(2-AB)로 라벨링한다. 30℃에서 자동온도가 조절된 Amide-80 column, 4.6×250㎜(Tosohaas)에서 정상 HPLC 크로마토그래피(normal phase HPLC chromatography)에 의해, 라벨링된 글리칸을 친수성(hydrophilicity)에 따라 분리한다.

샘플의 주입 전에, 컬럼을 80%의 아세토니트릴(acetonitrile) 버퍼로 평형을 맞춘다. 포름산 암모늄(Ammonium formate) 50mM, pH4.45의 증가 구배(increasing gradient)에서 140분 이상 동안 올리고당을 용출시킨다. λ_여기( _excitation ₎ 488㎚ ; λ_방출( _emission ₎520㎚에서 형광측정법(fluorometry)으로 탐지한다.

FⅦa,p의 크로마토그래피 프로파일(profile)은 대부분의 글리칸이 39%의 비율로, 바이안테너리, 바이시알릴화 유형(A2)임을 보여준다. 또한, 소량으로, 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화 유형(A2F), 모노시알릴화(A1) 및 트리시알릴화, 푸코실화 및 비-푸코실화(A3F 및 A3) 형태도 관찰된다.

FⅦ-Tg에 실행된 NP-HPLC에 의한 분석을 통해 대부분의 올리고당이, 27%의 비율로 유형 A1으로 존재함을 확인한다. A1F, A2 및 A2F 유형은 덜 나타나고, 트리안테너리 형태는 자취로 존재한다. 이것은 FⅦa,p과 덜 시알릴화된 인자 FⅦ-Tg(배치 B) 사이의 시알릴화의 차이를 나타낸다.

인자 FⅦ-a,r에서 수행된 동일한 분석은 대부분 형태의 유형 A2F30%가 30% 존재함을 밝힌다. 유형 A1F는 덜 나타나고 트리안테너리 형태는 자취로 존재한다. FⅦ-a,r의 분석은 또한 FⅦ a,p 및 FⅦ-Tg에서 존재하는 것과 다른 유형을 암시하는 A1F 및 A2F 유형의 정체시간(retention time)의 중요한 시간 지연을 보여준다.

이들 결과세트는 HPCE-LIF에 의해 얻어진 것과 일치한다.

실시예 6: MALDI-TOFMS에 의한 동정

질량 분석기(Mass Spectrometry) MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser DEsorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry)는 펩티드, 단백질, 글리칸, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 대부분의 이온화 가능한 중합체(ionisable polymer)의 분자량을 높은 정밀도로 측정하는 기술이다.

분석될 펩티드, 단백질 및 글리칸을 사용될 레이저의 파장에서 흡수하는 매 트릭스(matrix)로 혼합한다. 주요 매트릭스로는 펩티드 분석에 있어 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), 단백질 분석에 있어 시나피닌산(sinapinic acid; SA), 올리고당 분석에 있어 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)이다.

방법은 매트릭스 및 분석물 분자의 조인트 탈착(joint desorption)의 결과를 포함하는, 매트릭스/분석물 공동-결정체(co-crystal)를 펄스 레이저로 조사하는 것을 포함한다. 기체상(gas phase)에서의 이온화(ionisation) 후에, 분석물 분자는 비행시간(flight time)에 검출기(detector)를 통과할 것이다. 질량과 비행시간이 직접 연관된 것을 고려하여, 후자를 측정하는 것을 통해 대상 분석물 질량을 결정할 수 있다. 이론적 질량과 비교함으로써, 관찰된 질량 측량을 통해 동정을 한다. MS/MS 모드에서, 얻어진 이온 단편을 근거로, 서열결정(sequencing)을 할 수 있다. 사용된 기구는 TOF와 TOF/TOF 모드에서 작동하는 Bruker Autoflex 2이다.

FⅦ-Tg 및 FⅦ a,r에 존재하는 글리칸 구조를 동정하기 위하여, 예비 NP-HPLC에 의해 얻어진 용출된 단편에 MALDI-TOF MS 분석을 한다.

FⅦ-Tg의 MALDI-TOF 분석에 의해, NP-HPLC로 분리된 글리칸의 동정, 즉 대부분 모노시알릴화된 A1 형태 및 소수 형태의 A1F, A2F 및 A2 유형으로, 확인할 수 있다.

이 연구는 또한 트리안테너리, 바이시알릴화 형태, 및 트리시알릴화 유형, 혼성(hybrid) 형태 및 Man5 및 Man6-P-HexNAc 유형의 올리고만노스(oligomannose)를 동정할 수 있다.

FⅦa,r에서 수행된 MALDI-TOF MS 분석을 통해 도 6에 도시된 글리칸 형태가 존재함을 알게 된다. 단지 부분적으로 푸코실화된 FⅦ-Tg와 달리, 인자 FⅦa,r은 거의 완전하게 푸코실화된다. 대부분의 글리칸 형태가 NP-HPLC에 의해 정량화된 비율이 30%인 A2F이다. 다른 안테나에서 터미널 위치에 GalNAc를 포함하는, 바이안테너리. 모노시알릴화, 푸코시화된 형태(A1F)가 동정되고 또한, 하나 및/또는 두 안테나에서 Hex-NAc-HexNAc를 가지는 중성(neutral) 바이안테너리 푸코실화된 형태도 동정된다. 트리안테너리, 트리시알릴화 및 푸코실화된 유형의 글리칸이 존재하는 것이 주목된다. 비푸코실화된 유형이 자취로 존재한다.

실시예 7: 시알산의 HPCE-LIF 분석 - 갈락토오스 연결

시알산-갈락토오스 연결("분기(branching)")의 연구와 관련하여, 실험 방법은 실시예 4에 기술된 것과 유사하다. PNGase F으로 탈당화한 후에, 링크를 동정하고 각 분리된 구조를 정량화하기 위해 올리고당을 특정한 엑소시알리다아제(exosialidase)로 처리한다. 사용된 시알리다아제는 S. pneumoniae(특정한 α2-3 연결, 0.02IU, E/S=0.4m/m), C. perfringens(특정한 α2-3 연결과 α2-6 연결, 0.04IU, E/S=0.1m/m) 및 A. urefaciens(α2-3, α2-6, α2-8 및 α2-9 연결을 가수분해함, 0.01IU, E/S=0.05m/m)에서 얻은 재조합 효소이다.

FⅦ-a,r는 다수의 A2F를 가진 바이안테너리, 시알릴화, 푸코실화 글리칸 형태 및 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화(A1F) 형태를 가진다는 것을 분석에 의해 알게 되었다. 이 구조에서 일반적으로 충돌하는 이동시간과 비교하여, 이 구 조 A2F와 A1F에 대한 불규칙한 이동 시간이 관찰된다. 즉, 이 올리고당 시알릴화 형태는 FⅦ-Tg의 이동시간에 비교하여 HPCE-LIF와 NP-HPLC에서 불규칙한 이동 시간을 나타낸다. 반면에, 단당류 조성물의 분석에서 Neu5Ac와 다른 어떤 특정 시알산도 나타나지 않으며 질량 분석기는 바이시알릴화 유형에 따른 질량을 가진 글리칸을 나타낸다. 마지막으로, FⅦ-a,r의 글리칸이 탈시알릴화되면 FⅦ-Tg의 올리고당의 탈시알릴화와 동등한 크로마토그래피 거동 및 전기영동 거동을 다시 발견할 수 있다.

그러므로 전기영동 및 크로마토그래피 거동에서의 이런 차이는 시알산의 분기의 차이로서 설명할 수 있다. 이 가설은 HPCE-LIF와 MS의 다른 접근에 의해 평가되었다.

결과를 이하의 도 3에 요약한다.

[표 3] FⅦ의 다른 배치에서 시알산의 분기

	시알릴화(%)	α2-3 (%)	α2-6 (%)	α2-8 (%)
FⅦ-a,r	91	100	0	0
FⅦ-Tg 배치 C	96	0	100	0

결과는 두 FⅦ 사이에서 독특한 시알산 수준에서 이성질체가 존재함을 밝힌다. 실제로, FⅦ-a,r의 시알산은 α2-3-연결을 포함하고, 반면 FⅦ-Tg는 α2-6 분기를 나타낸다,

FⅦ-Tg에 대한 FⅦ-a,r의 글리칸에서 관찰된 HPCE-LIF와 NP-HPLC에서의 거동 차이는 시알산에 이 이성질체의 차이와 연결된다.

실시예 8: FⅦ-Tg의 생체외 재시알릴화

문헌(Zhang X. et al, Biochim. Biophys. Acta 1998, 1425; 441-52)에, 당단백질이 더 완전히 시알릴화가 되면 생체외 및 생체내에서(in vivo)의 안정성의 향상에 기여한다고 기재되어 있다. 한다. 이 연구의 목적은 생체외에서 시알릴화의 실현가능성을 증명하기 위함이다.

α2-6-(N)-시알산 전이효소(α2,6-(N)-sialyltransferase) (rat, Spodotera frugiperda, S.A. ≥ 1 unit/mg (S.A.: 고유 활성(Specific Activity)), 41 kDa, Calbiochem) 및 기질 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산(cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid(Calbiochem))을 이용해서 재시알릴화를 실행하였다. 이러한 두 종류 시약은 그 불안정성 때문에 -80℃에서 저장된다. 시알릴화 기질(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산) 및 효소(α2-6-(N)-시알산 전이효소)를 37℃에서 밤새 반응 버퍼에 혼합한다. 사용한 반응 버퍼는 pH 7.4로 조정된 모르폴리노-3-프로판술폰산(morpholino-3 propanesulfonic acid) 50mM, 0.1% Tween®80, 및 0.1㎎/㎖ BSA(bovine serum albumine)이다(reagents Sigma).

하기의 표 4에서 실험 조건을 요약한다.

[표 4] 실험 조건의 개요

	대조구 천연 FⅦ	재시알릴화된 FⅦ
FⅦ(㎍)	50	50
반응 버퍼(㎕)	200	200
MP-Neu5Ac(㎕) (cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid)	-	2
A2,6-NST (㎕) (α2,6-(N)-시알산 전이효소)	20	20
인큐베이션(Incubation)	밤새	밤새

실시예 2의 정제 후에 얻어진 것과 같은, 천연 FⅦ-Tg의 전기영동상(electropherogram)(도 1의 하단 프로파일)은 대부분 바이안테너리, 모노시알릴화된 A1 형태(42%) 및 조금 표현된 구조 A2, A2F 및 A1F를 나타낸다. 재시알릴화 후에(도 7의 상부 프로파일), 모노시알릴화 형태는 대부분으로 변한(52%), 바이시알릴화된 형태, 특히 비푸코실화된 형태에 의해 단지 6%를 나타낸다.

재시알릴화 전후의 글리칸의 정량화를 하기의 표 5에서 보인다.

[표 5] 시알릴화 전후의 올리고당 구조의 정량화

	천연(Native) FⅦ-Tg	재시알릴화된 FⅦ-Tg
A2	19.8	52.4
A2F	15.5	25.1
A1	42.1	6.4
A1F	13.6	11.6
중성(Neutral)	9.0	4.5
% 시알릴화	91.1	95.5
바이시알릴화의 비율	35.3	77.5

형질전환 FⅦ의 시알릴화의 동역학은 도 8에서 묘사된다.

이 연구는 100%까지 증가된 바이시알릴화 형태의 비율로 생체외에서(in vitro) 재시알릴화의 효율성을 보여준다.

실시예 9: 형질전환 재시알릴화된 FⅦ (실시예 8에서 유래한 FⅦ-Tg RS)에 비교하여 형질전환 비-재시알릴화된 FⅦ(FⅦ-Tg NRS)의 토끼에 경쟁적 약역학 연구

이 연구의 목적은 뉴질랜드 수컷 비길 토끼(vigil rabbit)에서 FⅦ-Tg NRS과 FⅦ-TgRS의 약역학(pharmacokinetic) 프로파일을 비교하기 위함이다.

시험 복용량은 인간에게 투여된 재조합 FⅦ의 치료 복용량의 두 배인, 동물당 200㎍/㎏이다.

J-4(제품의 주입 4일 전)에 채혈을 하였고 또한 T0.17h(주입 당일, 주입 후 10분), T0.33h(주입 당일, 주입 후 20분), T1h(주입 당일, 주입 후 1시간), T3h (주입 당일, 주입 후 3시간), T6h(주입 당일, 주입 후 6시간), T8h(주입 당일, 주입 후 8시간)에 J1(제품의 주입 당일) 채혈을 하였다.

ELISA(Asserachrom kit)로 FⅦ:Ag(FⅦ의 항원)의 투약(dosage)을 한다. 토끼 혈장에서 FⅦ:Ag의 투약 결과를 통해 한편으로는 제거 프로파일을 다른 한편으로는 약역학(pharmacokinetic) 매개변수를 결정한다. 약량학(posologies) 및 실험 그룹을 표 6에 나타낸다.

[표 6] 약량학과 실험 그룹

실험 그룹	투여된 제품	동물수/질량	J1에서의 복용량	단백질 비율 /FⅦ:Ag	주입부피
그룹 1	FⅦ-Tg RS	토끼 세마리 (1 내지 3) 2.315±0.124㎏	200 ㎍/㎏	143 ㎍/㎖ 단백질 FⅦ:Ag = 253.7 ±5.8 U/㎖	1.4 ㎖/㎏
그룹 2	FⅦ-Tg NRS	토끼 세마리 (4 내지 6) 2.352 ±0.130 ㎏	200 ㎍/㎏	145 ㎍/㎖ 단백질 FⅦ:Ag = 263.7 ±2.9 U/㎖	1.4 ㎖/㎏
그룹 3	NaCl 0.9%	토끼 세마리 (7 내지 9)	NA	NA	1.4 ㎖/㎏

NA: 적용 가능하지 않음

제거 곡선은 도 9에 묘사된다.

결과를 표 7에 나타낸다.

[표 7]

매개변수 PK	복용량 (U)	T1/2 (h)	MRT (h)	Cmax (mU/㎖)	회수률 (%)	AUC (h x mU/㎖)	Cl (㎖/h)	Vd (㎖)
FⅦ-Tgg RS	822±44	1.85 ±0.08	2.93 ±0.09	2060 ±394	20 ±4	2563 ±335	320± 46	856 ±151
FⅦ-Tgg NRS	868 ±48	1.76 ±0.08	2.81±0.03	1797 ±389	17 ±4	1863 ±346	479 ±103	1216 ±288

투여된 복용량으로, 제거 반감기(removal half-life), 평균 체류 시간(mean residence time; MRT), 최대 농도(Cmax) 및 회수율("회수")은 두 실험 그룹 전부에서 대등하다.

FⅦ-TgRS는 FⅦ-TgNRS와 다른 역학 프로파일을 나타낸다. FⅦ-Tg의 재시알릴화는 눈에 띄지 않는 방법으로 반감기, 평균 체류 시간(MRT), Cmax 및 "회수율"를 향상시킨다.

혈액 순환에서 FⅦ-Tg RS의 제거가 덜 중요함을 암시하는, 차이는 AUC 매개변수(피크 넓이), Cl(clearance) 및 분산량(Vd)(이 양은 혈장농도에 의해 투여된 또는 흡수된 복용량을 나눠서 얻는다)에서 관찰된다.

FⅦ-Tg의 재시알릴화는 약 30%까지 제품의 생물학적 적용도의 증가를 유도한다.

Claims

재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물로서,

상기 조성물의 상기 인자 Ⅶ의 각 분자는 N-당화(glycosylation) 위치에 결합된 글리칸 형태를 포함하며,

상기 조성물의 모든 인자 Ⅶ 분자 중, 상기 인자 Ⅶ 조성물의 N-당화 위치에 결합된 모든 글리칸 형태에 비교하여 다수가 바이안테너리(biantennary), 바이시알릴화(bisialylated) 및 비푸코실화된(non fucosylated) 글리칸 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 바이안테너리(biantennary), 바이시알릴화(bisialylated) 푸코실화(fucosylated) 및 비푸코실화된(non fucosylated) 형태의 비율은 50% 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 인자 Ⅶ 조성물의 모든 분자 중에서, 푸코오즈의 비율은 20 내지 50%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 인자 Ⅶ 조성물의 적어도 몇 시알산은 α2-6-연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 인자 Ⅶ 조성물의 모든 시알산은 α2-6-연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 인자 Ⅶ 조성물은 α2-3-연결의 시알산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 FⅦ는 활성화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물을 의약품으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
혈우병(haemophilia) 환자의 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 조성물의 사용.
다발성 출혈성 외상(multiple hemorrhagic trauma) 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 조성물의 사용.
항응고제(anticoagulant)의 과량 복용에 의한 출혈(bleedings or hemorrages)의 치료에 사용될 의약품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 조성물의 사용.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 인자 Ⅶ 및 약제로 허용될 수 있는 첨가제(excipient) 및/또는 캐리어(carrier)를 포함하는 약제 조성물.
재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물의 제조방법으로서,

상기 인자 Ⅶ 조성물의 각 분자는 N-당화 위치에 결합한 글리칸 형태를 포함하며,

상기 인자 Ⅶ 조성물의 모든 분자 중에서, 다수가 바이안테너리, 바이시알릴화 글리칸 형태이고,

상기 바이시알릴화된 형태가 다수가 되도록 시알산 공여체 기질에서 FⅦ로 시알산을 전이하기 위해 충분한 시간 동안 및 적당한 조건 하에서 시알산 전이효소가 활성화되기 위한 적당한 반응 매체에서, 시알산 공여체 기질 및 시알산 전이효소에 상기 조성물의 부분적으로 시알릴화된 형절전환 또는 재조합 인자 Ⅶ를 접촉시켜 시알릴화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 시알릴화 단계 이전에, FⅦ의 갈락토실화(galactosylated) 및 모노갈락토실화(monogalactosylated) 형태를 나타내는, 갈락토오즈-부족 형태에서 갈락토오즈를 붙이기 위해 갈락토실화(galactosylation) 단계를 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,

부분적으로 시알릴화된 FⅦ의 상기 조성물은 대부분 바이안테너리, 모노시알릴화된 글리칸 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 부분적으로 시알릴화된 FⅦ 조성물의 바이안테너리, 모노시알릴화된 글리칸 형태 중에서, 대부분의 글리칸 형태는 비푸코실화된 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

부분적으로 시알릴화된 상기 FⅦ 조성물은 α2-6-연결을 포함하는 적어도 몇 시알산을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 방법은 상기 시알릴화 단계 이전에, 형질전환된 암컷 토기에 의해 부분적으로 시알릴화된 형질전환 FⅦ 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,

부분적으로 시알릴화된 상기 FⅦ 조성물이 활성화된 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 시알산 전이효소는 α2-6-(N)-시알산전이효소(α2,6-(N)-sialyl-transferase)이고, 상기 시알산 공여체 그룹은 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸-뉴라민산(cytidine-5'-monophospho-N-acetyl-neuraminic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.