BRPI0715420A2 - fator recombinante ou transgÊnico vii contendo uma maior parte de formas de glicano, formas biantenÁrias, bissialiladas e nço fucosiladas - Google Patents

Abstract

FATOR RECOMBINANTE OU TRANSGÊNICO VII CONTENDO UMA MAIOR PARTE DE FORMAS DE GLICANO, FORMAS BIANTENÁRIAS, BISSIALILADAS E NçO FUCOSILADAS. A presente invenção se refere a um composto de Fator VII recombinante ou transgênico, cada molécula de Fator VII do composto tendo formas de glicano ligadas a locais de N-glicosilação, onde, entre todas as moléculas do fator VII do citado composto, as formas de glicano biantenárias, bissialiladas e não fucosiladas são maioria. A invenção também envolve tal composto para uso como medicação, um método para preparar tal composto, entre outros.

Description

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"FATOR RECOMBINANTE OU TRANSGÊNICO Vll CONTENDO UMA MAIOR PARTE DE FORMAS DE GLICANO, FORMAS BIANTENÁRIAS, BISSIALILADAS

E NÃO FUCOSILADAS".

O FatorVII (FVII) é uma glicoproteína dependente de vitamina K que, em forma ativada (FVIIa)1 é envolvida no processo de coagulação ativando o Fator Xeo Fator IX na presença de cálcio e de fator de tecido. O FVII é segregado na forma de uma única cadeia de peptídios de 406 resíduos com peso molecular de » cerca de 50 kDa. O FVII contém quatro domínios estruturais distintos: o domínio N-

terminal γ-carboxil (Gla), dois domínios "semelhantes a Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)" e domínio de protease de serina. A ativação do FVII para FVIIa é caracterizada pela separação da Argi52-Mei53 (Arginina 152-lsoleucina 153) de ligação. O FVIIa consiste de uma cadeia leve de 152 aminoácidos com peso molecular de cerca de 20 kDa e uma cadeia pesada de 254 aminoácidos com peso molecular de cerca de 30 kDa unidas por uma única ponte bissulfeto (Cysi35-Cys262). O Plasma FVIIa (FVIIa.p) inclui diversas modificações pós-translacionais:

os dez primeiros ácidos glutâmicos são γ-carboxilados, a Asp63 (ácido aspártico) é parcialmente hidroxilada, a Ser52(Serina 52) e Ser60(Serina 60) são O-glicosilados e carregam as metades de Glicose (Xilose)0-2 e Fucose, respectivamente, Asn-145 (Asparagina 145) e Asn322 (Asparagina 322) são N-glicosiladas com formas complexas de glicano principalmente biantenárias e bissialiladas.

O FVII é usado para o tratamento de pacientes que sofrem de hemofilia, demonstrando deficiência de Fator Vlll (hemofilia tipo A) ou deficiência de Fator IX (hemofilia tipo B) e pacientes que demonstram ainda deficiências de fator de coagulação, por exemplo, uma deficiência congênita de FVII. O FVII também é recomendado para o tratamento de acidentes cérebro-vasculares. Assim, é necessario que estejam disponiveis concentrados de FVIIa para injegao.

O metodo mais antigo para se obterem concentrados FVIIa consistia na purificagao do FVIIa de proteinas de plasma obtidas por fracionamento.

Para este fim, ο documento EP O 346 241 descreve a preparagao da fragao enriquecida com FVIIa obtida apos a adsorgao, depois a eluigao de um subproduto do fracionamento de proteinas de plasma contendo ο FVII e ο FVIIa e outras proteinas como os Fatores IX (FIX), X (FX) e Il (FIl)1 ou seja, ο pre-eluato de PPSB (P = protrombina ou Fll1 P = proconvertina ou FVII, S = Fator Stuart ou FX e B = Fator anti-hemofilico B ou FIX). A desvantagem deste processo e que ο FVII obtido ainda contem alguns vestigios de outros fatores coagulantes.

Da mesma forma, ο documento EP O 547 932 descreve um processo de fabricagao de um concentrado de FVIIa de alto grau de pureza, substancialmente sem fatores dependentes de vitamina K e de FVIII. O FVII obtido neste processo, apesar de sua pureza, mostra uma atividade trombogenica residual. Uma grande desvantagem desses processos e que eles proporcionam

somente baixos rendimentos dos produtos.

Alem disso, ο volume de plasma coletado de doadores de sangue permanece limitado.

Assim, desde os anos 80, ο DNA codificando ο Fator Vll humano foi isolado (Hagen et al. (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Abr 83 (8):2412-6) e expresso em celulas mamarias BHK (Baby Hamster Kidney - Rim de Hamster Bebe) (documento EP O 200 421). A inscri?ao de patente FR 06 04872 encaminhada pelo Solicitante tambem descreve a fabricagao de FVIIa em um animal transgenico.

As proteinas obtidas por esses metodos de fabricagao se tornam mais seguras em relagao a contaminagao por virus ou outros agentes patogenicos. Alem disso, tais processos permitem que se obtenham proteinas com uma sequencia primaria, ou seja, um encadeamento entre os diferentes aminoacidos, identica a sequencia humana primaria. No entanto, ο plasma humano FVII contem modificagoes pos-translacionais complexas: os dez primeiros acidos glutamicos sao γ-carboxilados, ο Asp63 e parcialmente hidroxilado (acido aspartico 63), a Ser52 (Serina 52) e Ser60 (Serina 60) sao O-glicosilados e carregam as metades de Glicose (Xilose)0-2 e Fucose1 respectivamente, Asn14S (Asparagina 145) e As η 322 (Asparagina 322) sao N-glicosiladas principalmente com formas complexas biantenarias e bissialiladas. Em especial, a adigao de N-glicanos (glicanos Iigados a asparagina) e particularmente importante para ο correto enovelamento da proteina’ a estabilidade in vitro e in vivo, a bioatividade e as propriedades farmacocineticas (biodisponibilidade, por exemplo) da proteina heterologa produzida. Assim, as variagdes de todas as modificagoes pos-translacionais, ou parte delas, estao expondo a proteina, por um lado, ao risco de ficar inativa e, por outro, ao risco de ficar imunogenica.

Os Fatores Vll recombinantes ou transgenicos existentes podem exibir, em razao de sua expressao em sistemas diferentes de sistemas humanos, uma glicosilagao diferente da glicosilagao do plasma humano FVII, ο que pode Ievar ao surgimento de anticorpos direcionados contra a proteina recombinante e assim a uma menor eficiencia do que a do FVII humano purificado do plasma humano.

Assim, existe uma necessidade de composigoes terapeuticas ou profilaticas de FVIIa, as propriedades funcionais do mesmo estao proximas as do FVII humano purificado de plasma humano, e 0 metodo de fabricagao do mesmo e compativel com a necessidade de grandes quantidades dessa proteina.

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Assim, a invengao se relaciona a uma composigao de recombinante ou Fator Vll transgenico, cada molecula de Fator Vll da composigao contendo formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao, caracterizada pelo fato de que, entre as moleculas de Fator Vll da citada composigao, a maioria sao formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas em compara^ao com todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao de Fator Vll da composigao.

Surpreendentemente, ο Solicitante descobriu que uma composigao de recombinante ou transgenico FVII contendo uma maioria de formas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas exibe uma maior biodisponibilidade, uma maior Iimpeza e uma maior estabilidade em comparagao com uma composigao de recombinante ou transgenico FVII com uma taxa mais baixa de formas bissialiladas, ou seja, em comparagao com uma composigao de recombinante ou transgenico FVII com uma taxa majoritaria de formas biantenarias, monossialiladas e nao fucosiladas.

Assim, pode-se presumir que ο FVII da invengao seria administrado ao paciente com uma menor freqiiencia e em doses menores em comparagao com uma composigao de recombinante ou transgenico FVII com uma taxa mais baixa de formas bissialiladas, ou seja, uma taxa majoritaria de formas monossialiladas.

A biodisponibilidade se refere ao percentual do FVII administrado que se difunde na circulagao sanguinea, assim sendo passivel, em particular, de atingir ο local da hemorragia.

A Iimpeza se refere a fragao de um volume teorico completamente purificado, ou seja, nao e mais contido FVII por unidade de tempo. Em outras palavras, isso corresponde a quantidade hipotetica de fluido que estara completamente Iivre da substancia em um intervalo da unidade de tempo. A estabilidade se refere a capacidade do FVII de manter as respectivas capacidades quimicas, fisicas, microbiologicas e biofarmaceuticas em Iimites especificos durante a total validade do mesmo.

"Formas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas de glicano" se referem as formas abaixo:

Forma A2 (biantenaria, bissialilada e nao fucosilada)

Acido sialico # : Galactose

■ N-acetilglucosamina (GIcNAc)

· : Manose

Essas formas de glicano sao Iigadas a Iocais de N-glicosilagao consistindo de asparagina 145 (Asn145) e asparagina 322 (Asn322). Com efeito, ο FVII da invengao contem, como ο FVII humano, dois Iocais de N-glicosilagao nas posigoes 145 e 322, e dois Iocais de O-glicosilagao nas posigoes 52 e 60. Em um local de N- glicosilagao, as cadeias de oligossacarideo sao Iigadas a uma asparagina (N- ligada). Em um local de O-glicosilagao, as cadeias de oligossacarideo sao Iigadas a uma serina. Assim, cad a molecula de FVII da invenfao inclui duas cadeias N- Iigadas de oligossacarideo. No entanto, as moleculas de FVII da composigao nao exibem uma glicosilagao homogenea, ou seja, todas as cadeias N-Iigadas de

oligossacarideo nao sao identicas. E uma questao de mistura de diferentes formas de glicano.

De fato, qualquer FVII, seja plasma, recombinante ou transgenico, esta presente na forma de uma mistura de diversas proteinas de FVII. Essas proteinas exibem diferengas, especialmente em sua glicosilagao e em glicoformas designadas de formas diferentes. Essa glicosilagao se deve a um processamento p0s-translacional executado por organitos celulares na transferencia da proteina FVII entre os diferentes compartimentos celulares. Essa modificagao bioquimica altera profundamente a proteina de forma que a proteina final e perfeitamente estruturada, sendo ativa e bem tolerada pelo organismo. Essa modificagao quimica contribui para a regulamentagao da atividade proteica e tambem para a localizagao da mesma. Assim, para tod a a composigao de FVI I, e por conseguinte para todas as cadeias de oligossacarideo N-Iigadas da composigao, ο indice de cada forma de glicano ou de cada a^iicar presente na composigao de FVII pode ser quantificado.

A O-glicosilagao nao e Ievada em consideragao no percentual dos diferentes glicanos dado na presente aplicagao.

"Composigao de FVII" se refere a uma composigao, a Linica entidade molecular da qual ο FVII e preferencialmente ativado.

Cada molecula de FVII da composigao exibe a mesma seqiiencia primaria, mas uma glicosila?ao variando de uma molecula para outra. Assim, "composigao de FVII" se refere a uma mistura de moleculas com a mesma sequencia caracterizada por seu teor de formas de glicano. Para fins da invengao, as express5es "FVII" e "composigao de FVII" sao equivalentes. Conseqiientemente, no contexto da invengao, "FVII" se refere a uma molecula de FVII como tal, ou a uma mistura de moleculas de FVII contendo as mesmas caracteristicas acima mencionadas. A composigao de FVII da invengao e uma composigao de FVII contendo principalmente formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas. Isso significa que, entre todos os oligossacarideos N-Iigados da composigao, ou seja, todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao de Fator VII, as formas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas sao as mais representadas.

Com vantagem, ο indice de formas de glicano biantenarias, bissialiladas e

nao fucosiladas e maior ou igual do que 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 95%. De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas e maior ou igual do que 45% De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas se compoe entre 45% e 65% e de preferencia entre 50% e 60%.

Os indices das especies sialiladas podem ser empiricamente determinados pela analise HPCE-LIF (Eletroforese Capilar de Alto Desempenho - Fluorescencia Induzida por Laser) e/ou NP-HPLC (Cromatografia Liquida de Alto Desempenho de Fase Normal) com quantificagao pela medigao da area dos picos correspondentes a diferentes glicanos, ou por qualquer metodo conhecido por pessoas com experiencia no oficio.

A composigao do FVII da inven?ao tambem pode incluir formas menores biantenarias, monossialiladas e triantenarias e tambem formas neutras nao exibindo acidos sialicos.

"Recombinante ou transgenico FVII" se refere a qualquer FVII resultante de engenharia genetica, ou seja, produzida por celulas de DNA das quais foi modificado por recombinagao genetica de forma que expressam uma molecula de FVII e exibem as caracteristicas descritas de glicosilagao.

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Assim, ο FVII da invengao resulta da transcrigao, depois a transla^ao de uma molecula de DNA codificando ο FVII em um hospedeiro celular ou em um animal transgenico. O FVII recombinante ou transgenico da invengao pode ser obtido por tecnicas padrao conhecidas por pessoas com experiencia no oficio, permitindo a expressao de uma proteina em um sistema biologico.

Mais particularmente, "recombinante VII" se refere a qualquer FVII obtido

por recombinagao genetica e expresso em uma Iinha de celulas cultivadas. A titulo de exemplo, podem ser mencionadas as seguintes Iinhas de celulas: BHK (Rim de Bebe de Hamster) e no caso BHK tkts13 (CRL 10314, Waechter e Baserga, Proc Natl. Acad. Sci. EUA 79:1106-1110. 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Hepatoma de Rato I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Hepatoma de Rato Il (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Pulmao humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) e celulas DUKX (linha de celula CHO) (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, 1980), celulas 3T3, celulas Namalwa ou celulas BHK adaptadas a uma cuItura Iivre de soro (Documento US 6,903,069).

Mais particularmente, "transgenico VII" se refere a qualquer FVII obtido por recombinagao genetica e expresso em um tecido vivo, em um animal ou em uma planta.

O indice de formas bissialiladas da invengao pode ser obtido de formas

diferentes.

Em uma configuragao particular, ο FVII da invengao e expresso em um microorganism。，em uma celula, em uma planta ou em um animal demonstrando as caracteristicas de glicosilagao, ou seja, em formas majoritarias biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas. Em uma configuragao particular, ο FVII da invengao e expresso em urn microorganismo, em uma planta ou em um animal nao permitindo que se obtenha uma composigao de FVII exibindo principalmente formas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas, a sialila9ao sendo realizada posteriormente in vitro usando uma ou mais enzimas para realizar a sialilagao desejada, ou seja, as formas biantenarias e bissialiladas se tornam maioria e as formas triantenarias se tornam trissialiladas.

A titulo de exemplo, a sialiltransferase pode ser ativada, in vitro, em uma composigao de FVII selecionada por suas propriedades favoraveis, sob condigoes adequadas, para permitir a sialilagao desejada. Assim, a composisao do FVII da invengao e passivel de ser obtida pela agao de ima sialiltransferase de uma composigao parcialmente sialilada de FVII (composigao inicial de FVII).

Com vantagem, a composigao inicial de FVII exibe uma maioria de formas de glicano biantenarias e monossialiladas. Com vantagem, a composigao inicial de FVII exibe uma maioria de formas de glicano biantenarias, monossialiladas e nao fucosiladas. A agao da sialiltransferase permite enxertar um acido sialico adicional nas formas monossialiladas convertendo-as em uma forma bissialilada. Com vantagem, essas formas biantenarias, monossialiladas estao presentes na composigao inicial de FVII a um indice maior do que 40%, em uma forma particularmente vantajosa a um indice maior do que 50%, ou ainda 60%. Com vantagem, a composigao inicial exibe um indice de formas de glicano biantenarias, monossialiladas e nao fucosiladas maior do que 20%, ou particularmente maior do que 30%, do que 40% ou ainda 50%.

Com vantagem, pelo menos alguns dos acidos sialicos da composi9ao inicial de FVII implicam Iigagoes a2-6. De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de acidos sialicos implicando Iigagoes α2-6 e maior do que 60%, ou ainda maior do que 70%, 80% ou 90%.

Particularmente, este indice se mantem entre 60% e 90%. Preferencialmente, todos os acidos sialicos da composigao inicial de FVII implicam Iigagoes α 2-6.

Em uma configuragao particular, se a composigao inicial de FVII contiver um indice muito alto de formas fucosiladas, por exemplo, maiores do que 50%, ou ainda maiores do que 60%, e possivel obter formas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas usando uma ou mais enzimas permitindo defucosilar a composipao.〇 uso de uma fucosidade pode ser citado a titulo de exemplo, pelo periodo de tempo necessario para obter uma maioria de formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas.

De uma forma particularmente vantajosa, a composigao inicial de FVII e selecionada por sua baixa imunogenicidade. Com vantagem, a composigao inicial e a composigao de FVII descrita no

documento FR 06 04872, cujo conteiido e considerado como incluido no presente documento.

Com vantagem, ο FVII da invengao e um polipeptidio. A sequencia peptidica do mesmo pode ser a do FVII natural humano, ou seja, a sequencia presente em um homem que nao apresente problemas associados ao FVII Tal sequencia pode ser codificada, por exemplo, pela sequencia 1b descrita no documento EP 0 200 421.

Com vantagem, a seqQencia de FVII da invengao e a seqQencia de SEQ ID

NO : 1.

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Em uma configurasao adicional ο FVII da invensao pode ser uma variante do FVII natural humano, na medida em que essa variante nao seja mais imunogenica do que ο FVII natural; Assim, a sequencia peptidica dessa variante pode apresentar uma identidade de pelo menos 70%, e com vantagem, de pelo menos 80% ou 90%, e ainda com mais vantagem, uma identidade de pelo menos 99% com a sequencia do FVII natural humano, tal como uma variante contendo substancialmente a mesma atividade biologica que seu FVII natural.

Alem disso, ο FVII da invengao se refere tambem a qualquer sequencia de FVII modificada de forma que a atividade biologica da proteina seja reduzida em compara?ao com ο FVII natural humano. O FVII humano inativado recombinante, FFR-FVIIa, usado para ο tratamento ou profilaxia de tromboses,(Hoist et al., Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg., 1998 Jun, 15(6) : 515-520). Tal FVII sao polipeptidios apresentando uma sequencia de aminoacidos que difere da sequencia do FVII natural por insergao, exclusao ou substituigao de um ou mais aminoacidos.

A atividade biologica do FVII da invengao pode ser quantificada medindo-se a capacidade de uma composigao de FVII para induzir a coagulagao de sangue pelo uso de um plasma deficiente em FVII e de tromboplastins, como descrito, por exemplo, em US 5,997,864. No teste descrito na patente US 5,997,864, a atividade biologica e expressa por uma redugao do tempo de coagula?ao em comparagao com uma amostra de controle, e e convertida em "unidades de FVII" em comparagao com um padrao de soro humano (grupo) contendo uma unidade (1 U de atividade FVII)/ml de soro.

A composigao de FVII da inven^ao exibe caracteristicas de glicosilagao proxima das do plasma FVII. Na verdade, a principal forma de N- glicano do plasma FVII (ou composigao do plasma FVII) e tambem a forma biantenaria, bissialilada. Com vantagem, ο indice de formas biantenarias, bissialiladas (fucosiladas e nao fucosiladas) de FVII da composigao da invengao e maior do que 30%, ou 40%. ou 50%. De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de formas biantenarias, bissialiladas e maior do que 60%, ou 70%, ou 80% ou ainda 90%. Em uma forma particularmente vantajosa, ο indice de formas bissialiladas (fucosiladas e nao fucosiladas) fica entre 50% e 80% ou entre 60% e 90%, ou preferencialmente entre 70% e 85%.

Com vantagem, ο indice de fucose da composigao de FVII da inver^ao e maior do que 20%, e com vantagem se mantem entre 20% e 50%. Esse indice corresponde ao indice de fucose medido para todas as formas de glicano de FVII da composigao.

Essa caracteristica e uma das vantagens do FVII da invengao. Com efeito, ο FVII recombinante comercialmente disponivel apresenta um indice de 100% de fucosilagao, enquanto ο plasma FVII possui um indice de fucosilagao de cerca de 16%. Assim, a fucosilagao do FVII da invengao esta proximo ao do plasma FVII: ο que proporciona uma vantagem ao FVII da invengao em termos de inocuidade.

Com vantagem, pelo menos alguns dos acidos sialicos da composi^ao de Fator Vll da invengao implicam Iigagoes a2-6. De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6 e maior do que 60%, ou ainda maior do que 70%, 80% ou 90%. Particularmente, este indice se mantem entre 60% e 90%.

Assim, a composigao de FVII da invengao inclui um indice diferente de zero de acido sialico, implicando Iigagoes a2-6. Esta e a vantagem sob re ο FVII recombinante comercial contendo somente acidos sialicos implicando Iigagoes a2 3, enquanto esses estao contidos no FVII plasma. Em uma configuragao particularmente preferida da invengao, todos os acidos sialicos da composigao de FVII da invengao implicam Iigagoes a2-6.

De uma forma particularmente preferida, todos os acidos sialicos implicam Iigagoes a2,6, ou seja, todos os acidos sialicos sao Iigados a galactose por uma a2,6-liga9ao e, em particular, pelo menos 90% dos acidos sialicos de FVII implicam Iigagoes a2,6. A composigao do FVII de acordo com a invengao pode incluir ainda acidos sialicos implicando Iigagoes a2-3.

O fato de que ο acido sialico do FVII da composigao implica ramificagoes a2’6 e uma das vantagens do FVII da invengao. Com efeito, os acidos sialicos de FVII recombinante comercialmente disponivel implicam somente Iigagoes a2,3. O FVII plasma e uma mistura desses dois isdmeros. Tal FVII plasma contem, por exemplo, 40% de isomeros a2,3 e 60% de isdmeros a2，6. No entanto, ο Ciltimo inclui mais Iigagoes α2’6, ο que traz ο FVII da invengao para mais perto do FVII plasma.

Em uma configuragao adicional, alguns acidos sialicos da composigao FVII

da invengao implicam Iigagoes a2-3.

Assim, em uma configuragao particular da inven^ao, ο FVII recombinante ou transgenico da composigao exibe principalmente formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas em comparagao com todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao do Fator VII, e um indice de acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6 maior do que 90%.

Em uma configuragao particularmente preferida da inven^ao, ο FVII recombinante ou transgenico da composigao exibe principalmente formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas em comparagao com todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao do Fator Vll e um indice de acidos sialicos implicando Iigagoes α2-6 igual a 100%.

Em uma configuragao particular da invengao, ο FVII recombinante ou transgenico da composigao exibe principalmente formas de glicano biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas em comparagao com todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao do Fator VII，ο indice de fucose da composigao de FVII ficando entre 20% e 50%.

Em uma configuraqao particular da invengao, ο FVII recombinante ou transgenico da composigao exibe uma maioria de formas de glicano biantenarias bissialiladas e nao fucosiladas em comparagao com todas as formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao do Fator VII, todos os acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6 e ο indice de fucose da composi^ao de FVII ficando entre 20% e 50%.

Com vantagem, a composigao de FVII da invengao e passivel de ser produzida por um mamifero transgenico nao-humano.

Nessa configuragao, a composigao de FVII da inven?ao sera entao considerada "transgenica". Mamifero transgenico se refere a qualquer mamifero, exceto ο ser humano, geneticamente manipulado para expressar uma proteina exogena, por exemplo, coelho, cabra, camundongo, rato, bovino, cavalo, porco, insetos, carneiro, esta Iista nao sendo restritiva. A proteina exogena e ο FVII, de preferencia ο FVII humano. O mamifero transgenico nao-humano pode, alem do FVII, expressar uma enzima exogena de forma a conferir a sialilagao desejada a composigao do FVII transgenico. Por conta disso, ο animal transgenico nao- humano pode co-expressar ο gene que codifica ο FVII e ο gene que codifica uma sialiltransferase.

Em uma configuragao particular da invengao, ο FVII transgenico da invengao e expresso nas glandulas mamarias do mamifero transgenico e produzido no Ieite do mesmo. Por conta disso, a expressao do transgene e realizada de uma forma dependente de tecido por meio de um promotor garantindo a produgao do transgene nas glandulas mamarias do animal. O promotor de WAP (proteina acidifera de soro de leite), ο promotor de caseina, em particular ο promotor de caseina-β ou caseina-α, ο promotor de lactoglobulina-β, ο promotor de lactalbumina-α podem ser citados, esta Iista nao sendo restritiva.

Com vantagem, a composigao de FVII da invengao e passivel de ser produzida por uma coelha transgenica, tal composigao sendo ainda submetida a sialilagao in vitro de forma que a maioria sera de formas biantenarias, bissialiladas.

O coelho e uma especie particularmente vantajosa pela produgao de proteina terapeutica, ja que ο coelho parece ser insensivel a prions, especialmente a encefalopatia espongiforme subaguda transmissivel, que e um grande problema de saCide piiblica.

Alem disso, a barreira de especies entre ο coelho e ο homem e importante.

Ao contrario, a barreira de especies entre ο homem e ο hamster, que e ο sistema biologico onde e produzido ο FVII recombinante comercialmente disponivel, e menos importante.

Assim, a produgao de FVII em coelhos e vantajosa em termos de seguranga contra a transmissao de agentes patogenicos, incluindo agentes patogenicos nao convencionais do tipo prions.

Em uma configuragao preferida da invengao, ο FVII da invengao e produzido nas glandulas mamarias de coelhas transgenicas.

A secregao da proteina de interesse por glandulas mamarias, permitindo a secregao para dentro do leite de um mamifero transgenico, e uma tecnica bem conhecida de pessoas com experiencia no oficio, implicando ο controle da expressao na proteina recombinante de forma dependente de tecido.

O controle de tecido da expressao e realizado gramas as sequencias que permitem que a expressao da proteina se oriente em diregao a um tecido em particular do animal. Estas sequencias sao chamadas seqQencias promotoras e tambem seqijencias de peptidio de sinal.

Exemplos de promotores conduzindo a expressao de uma proteina de interesse nas glandulas mamarias sao ο promotor WAP (proteina acidifera de soro de leite), ο promotor de caseina, especialmente ο promotor de caseina-β, ο promotor de caseina-α, ο promotor de lactoglobulina-β, ο promotor de Iactalbumina- α, esta Iista nao sendo restritiva. De uma forma particularmente vantajosa, a expressao nas glandulas mamarias da coelha e realizada sob ο controle do

promotor de caseina-β.

Um metodo de produgao de uma proteina recombinante no leite de um animal transgenico pode incluir os seguintes passos: uma molecula de DNA sintetico incluindo um gene codificando ο FVII humano, este gene estando sob ο controle de um promotor e de uma proteina naturalmente secretada para dentro do leite, e integrada no embriao de um mamifero nao-humano O embriao e posteriormente colocado em na femea de um mamifero da mesma especie. Assim que ο mamifero obtido do embriao estiver suficientemente desenvolvido, a Iactagao do mamifero e induzida e a seguir ο leite e coletado. Depois ο leite contem ο FVII

transgenico de interesse.

Um exemplo do processo para preparar proteina transgenica no leite da femea de um mamifero que nao ο homem e descrito no documento EP O 264 166, cujos ensinamentos podem ser consultados para a produgao do FVII da invengao. Um exemplo adicional de um processo para preparar proteina no Ieite da femea de um mamifero que nao ο homem e fornecido no documento EP O 527 063. cujos ensinamentos podem ser consultados para a produgao do FVII da invengao.

A composigao do FVII produzido nas glandulas mamarias de coelhas e caracterizada pelo fato de que pelo menos alguns dos acidos sialicos do Fator Vll

implicam Iigagoes a2-6.

De uma forma particularmente preferida, todos os acidos sialicos implicam Iigagoes a2,6, e, em particular, pelo menos 90% dos acidos sialicos de FVII implicam Iigagoes a2,6. Alem disso, a composigao do FVII de acordo com a invengao pode conter acidos sialicos de Iigagoes a2-3.

De uma forma particularmente vantajosa, ο indice de acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6 e maior do que 60%, ou ainda maior do que 70%, 80% ou 90%. Em particular, este indice se mantem entre 60% e 90%.

Entre as formas de glicano biantenarias, monossialiladas da composigao de FVII expressa na coelha, a maioria das formas de glicano sao nao fucosiladas. Com vantagem, essas formas de glicano biantenarias, monossialiladas e nao fucosiladas estao presentes no FVII desta composigao a um indice maior do que 20%. Com vantagem, este indice e maior do que 25%, ou ainda maior do que 40%.

Em uma configuragao da invengao, ο indice de fucosilagao do FVII desta composigao da invengao fica eritre 20% e 50%. Em uma configuragao adicional da invengao, este indice pode ser inferior a 15%.

O FVII transgenico de coelhas inclui varias modificagoes pos-translacionais: os nove ou dez primeiros acidos glutamicos N-terminais sao γ-carboxilados, a Asp63 (Arparagina 63) e parcialmente hidroxilada, a Ser52 (Serina 52) e SerG。（Serina 60) sao O-glicosilados e carregam as metades de Glicose (Xilose)0-2 e Fucose, respectivamente, Asn145 e Asn322 sao N-glicosiladas principalmente com formas de glicano complexas biantenarias e bissialiladas.

Tal composigao de FVII produzida nas glandulas mamarias da coelha e descrita no documento FR 06 04872, cujo conteijdo e aqui incorporado no presente ensinamento.

O FVII produzido no Ieite de mamiferos transgenicos pode ser purificado a partir do Ieite pelo uso de tecnicas conhecidas por pessoas experientes no oficio.

Por exemplo, um metodo de purificagao da proteina de interesse a partir do Ieite como descrito na patente US 6,268,487, pode incluir os seguintes passos consistindo de: a) submeter ο Ieite a uma fiItragem tangencial atraves de uma membrana que possua uma porosidade suficiente para formar um retentado e um permeado, ο permeado contem a proteina exogena, b) submeter ο permeado a um dispositivo de captura por cromatografia de forma a deslocar a proteina exogena e obter um efluente, c) combinar ο efluente e ο retentado, d) repetir os passos a) a c) ate a separagao do FVII dos lipidios, das micelas de caseina, e que ο FVII tenha sido recuperado em pelo menos 75%.

Uma tecnica de purificagao adicional do FVII produzido no Ieite de um mamifero transgenico e descrita na inscrigao de patente FR 06 04864 encaminhada pelo Solicitante, cujo conteiido e incorporado por referenda. Este processo de extrapao e purificagao do FVII (Processo A) contido no Ieite de um animal transgenico inclui os seguintes passos de:

a) extrair ο FVII do leite, ο Fator Vll estando Iigado aos sais organicos e/ou inorganic。e/ou complexos de calcio do citado leite, por precipitagao dos compostos de calcio obtidos por adigao de um sal soliiivel ao leite, cujo

25

anion e selecionado por sua capacidade de formar os citados compostos de calcio insolCiveis para Iiberar dessa forma ο Fator Vll dos citados sais e/ou complexos, ο Fator Vll estando presente em uma fase liquida,

b) separar a fase liquida enriquecida com proteina do precipitado de compostos de calcio, tal fase liquida sendo ainda separada em uma fase Iipidica e uma fase Iipidica nao aquosa contendo a proteina,

c) submeter a fase Iipidica nao aquosa a um passo de cromatografia de afinidade, usando um amortecedor de eluigao com base em sal de fosfato em uma concentragao predeterminada, e

d) submeter ο eluato de Fator Vll obtido de acordo com ο passo c) a dois ou tres passos de cromatografia nas colunas de troca de anions do tipo base fraca usando amortecedores adequados para sucessivas elui?0es do Fator Vll retido nas citadas colunas.

Com efeito, ο Solicitante notou, com surpresa, que ο FVII, mesmo se colocado sob ο controle de um promotor de uma proteina naturalmente produzida no soro de leite, como ο promotor de WAP ou ο promotor de casein a β, pur exemplo, e ainda assim passivel de ser associado com os ions de calcio do leite, e dessa forma com as miceles de caseina.

Uma tecnica de purificagao adicional do FVII produzido no leite de um mamifero transgenico e descrita na inscri^ao de patente FR 06 11536 encaminhada pelo Solicitante, cujo conteiido e incorporado por referenda. Este processo de extragao e purificagao do FVII contido no leite de um animal transgenico (Processo B) inclui os seguintes passos de:

a) escumagao e deslipidificagao do citado leite,

b) passagem da fra?ao deslipidificada e escumada contendo a citada proteina em um suporte cromatografico com um Iigante enxertado apresentando carater hidrofobico e ionico, sob condigoes de pH permitindo que a citada proteina seja retida no citado suporte,

c) eluipao da proteina,

d) purificagao da fragao eluida pela remogao das proteinas de Ieite das citadas fragQes eluidas, e

e) recuperagao da citada proteina.

Quando a composigao de FVII e produzida por uma coelha transgenica, ela e submetida a uma sialilagao in vitro de forma que as formas biantenarias e bissialiladas serao maioria. Em uma configuragao particular da invengao, a sialilagao e realizada por

uso de uma sialil-transferase, por exemplo, a a2’6-(N)-sialil-transferase (ou β-D- galactosil^1,4-N-acetil-P-D-glucosamina-a2,6-sialiltransferase), ou ο Gal beta 1,3GalNAc aIfa 2,3-sialiltransferase, ou ο Gal beta 1,3(4) GIcNAc aIfa 2,3 sialiltransferase, ou GaINAc alfa-2,6-sialiltransferase I, essas enzimas estando disponiveis comercialmente.

De preferencia, a sialiltransferase utilizada e uma sialiltransferase que permite transferir acidos sialicos por meio de uma Iigagao a2,6. Com efeito, e vantajoso que a composigao de FVII da invengao apresente acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6, pois esse isomero e mais representado no plasma FVII. A sialilagao pode ser realizada com um substrato de doador de acido

sialico, como, por exemplo, acido sialico como tal ou qualquer molecula incluindo um ou mais grupos de acido sialico e que seja passivel de Iiberar grupos de acido sialico.

De acordo com uma configuragao da invengao, se a enzima e a2,6-(N)- sialiltransferase, ο substrato e acido citidina-5'-monofosfo-N-acetil-neuraminico, em um meio de reagao adequado para a transferencia do acido sialico do grupo de doador de acido sialico para ο FVII1 as formas biantenarias, bissialiladas se tornando maioria. Esse meio de reagao pode ser basear, por exemplo, em um amortecedor consistindo de acido morfolina-3-propanossulfonico e um amortecedor baseado, por exemplo, em Tween.

De acordo com uma configuragao adicional da invengao, ο substrato pode ser sintetizado no meio de reagao, incluindo nesse meio uma sintetase citidina monofosfato (CMP)-acido sialico, acido sialico, CTP (citidina trifosfato) e uma quantidade suficiente de um cation de metal bivalente para permitir que a reasao acontepa. Como exemplo, ο cation de metal bivalente pode ser ion de calcio, ion de zinco, ion de magnesio, ion de cromo, ion de cob re, ion de ferro ou ion de cobalto.

Qualquer que seja ο metodo aplicado para realizar a sialilagao da composigao de FVII1 a reagao e sempre realizada por um periodo de tempo suficiente e sob condigoes adequadas.permitindo um aumento suficiente nas formas bissialiladas, de forma que se tornem maioria. Apenas a titulo de informa^ao, a reagao pode ser efetuada por pelo menos 0,5 horas e, mais especialmente, pelo menos 5 horas, de uma forma particularmente vantajosa por 7 horas ou ainda por 8 horas, 9 horas, mesmo 10 horas. De preferencia, a incubapao acontece durante a noite. Em particular, esta reagao sera realizada por periodos de tempo entre 5 e 12 horas.

Com vantagem, ο FVII da composigao da inven^ao e ativado (FVIIa).

Por conta disso, ο FVIIa pode apresentar uma atividade de coagulagao de a 100 vezes maior do que ο FVII (nao ativado), pela interagao do ύItimo com ο fator de tecido (TF) em favor do primeiro. A ativagao do FVII results, in vivo, da separagao do zimogenio por diferentes proteases (FIXa, FXa1 FVIIa) em duas cadeias Iigadas por uma ponte de bissulfeto. O FVIIa1 sozinho, apresenta uma atividade muito baixa de enzimas, mas num complexo com seu co-fator, ο fator de tecido (TF), desencadeia ο processo de coagulagao pela ativagao do FX e ο FIX O FVIIa e ο fator de coagula?ao responsavel pela hemostasia em hemofilicos com anticorpos circulantes, por exemplo. De forma particularmente vantajosa, ο FVII da inven9§o e completamente ativado. Com vantagem, ο FVIIa da invengao inclui diversas modificagoes pos-translacionais: os primeiros nove ou dez primeiros acidos glutamicos N-terminais sao γ-carboxilados, a Asp63 e parcialmente hidroxilada, a Ser52 e Ser60 sao O-glicosilados e carregam as metades de Glicose(Xilose)0-2 e Fucose, respectivamente, Asn145 e As η 322 sao N-glicosiladas principalmente com formas complexas biantenarias, bissialiladas e nao fucosiladas.

A ativado do FVII tambem pode resultar de um processo realizado in vitro, por exemplo, pela purificagao do FVII da invengao (ver Exemplo 2).

Assim ο FVIIa da inven?ao e constituido de uma cadeia Ieve de 152 aminoacidos com peso molecular de cerca de 20 kDa e uma cadeia pesada de 254 aminoacidos com peso molecular de cerca de 30 kDa unidas uma a outra por uma Linica ponte bissulfeto (Cys13S-Cys262).

Assim, 0 FVII da invengao e um FVII ativado com uma movimentagao e estrutura proximas do FVII plasma. O FVIIa apresenta uma atividade de coagulagao de 25 a 100 vezes mais

aIta do que ο FVII pela interagao com ο fator de tecido (TF).

Em uma configuragao da invengao, ο FVII pode ser ativado in vitro por Fatores Xa, Vila, lla, IXa e Xlla.

O FVII da invengao tambem pode ser ativado pelo processo de purificagao

do mesmo. Um objetivo adicional da invengao e uma composigao de FVII da invengao para ser usada como medicamento.

Um objetivo adicional da invengao e ο uso de uma composigao de Fator Vll de acordo com a invengao, para preparar um medicamento para ο tratamento de pacientes que sofrem de hemofilia.

Um objetivo adicional da invengao e ο uso de uma composigao de Fator Vll de acordo com a inven^ao, para preparar um medicamento destinado ao tratamento de traumas hemorragicos miiltiplos.

Um objetivo adicional da invengao e ο uso de uma composigao de Fator Vll de acordo com a inverigao, para preparar um medicamento destinado ao tratamento de sangramentos decorrentes de uma dose excessiva de anticoagulantes.

Um objetivo adicional da invengao e uma composigao farmaceutica incluindo ο Fator Vll de acordo com a invengao e um excipiente e/ou um portador farmaceuticamente aceitavel.

Um objetivo adicional da invengao e um processo para preparar uma composigao de recombinante ou Fator Vll transgenico, cada molecula de Fator Vll da composigao incluindo formas de glicano Iigadas a Iocais de N-glicosilagao, e entre todas as moleculas de Fator Vll da citada composigao, as formas de glicano biantenarias, bissialiladas sao maioria, incluindo uma etapa de sialilagao pelo contado da composigao de Fator Vll transgenico ou recombinante parcialmente sialilado como definido acima com um substrato de doador de acido sialico e uma sialiltransferase em um meio de reagao adequado para permitir a atividade da sialiltransferase por um periodo de tempo suficiente e sob condigoes adequadas para permitir a transferencia do acido sialico do substrato de doador de acido sialico para ο FVII e um aumento suficiente nas formas bissialiladas de forma que as citadas formas bissialiladas se tornem maioria. As condi?5es para efetuar a reagao sao descritas acima, e tambem nos exemplos.

"Parcialmente sialiladas" se refere a uma composigao de FVII cujas formas de glicano Iigadas a N nao sao todas bissialiladas, ou seja, algumas formas sao moriossialiladas. Com vantagem, essas formas biantenarias, monossialiladas estao presentes um indice maior do que 40%, em uma forma particularmente vantajosa a um indice maior do que 50%, ou ainda 60%. Com vantagem, ο indice de formas de glicano biantenarias, monossialiladas e nao fucosiladas e maior do que 20%, ou particularmente maior do que 30%, do que 40% ou ainda 50%.

Com vantagem, a sialiltransferase e a2,6-(N)-sialiltransferase (ou β-D- Galactosil^1,4-N-acetil-3-D-glucosamina-a2,6-sialiltransferase), ou Gal beta 1,3GalNAc aIfa 2,3-sialiltransferase, ou Gal beta 1,3(4) GIcNAc aIfa 2,3 sialiltransferase, ou GaINAc alfa-2,6-sialiltransferase I. De preferencia, a sialiltransferase utilizada e uma sialiltransferase que

permite a transferencia de acidos sialicos por meio de uma Iigagao a2,6. Com efeito, e uma vantagem que ο FVII da composigao da invengao apreserite acidos sialicos implicando Iigagdes a2-6, pois esse isomero e mais presente no plasma FVI I.

A sialilagao pode ser realizada sem qualquer substrato de doador de acido

sialico.

De acordo com uma configuragao, se a enzima e a2,6-(N)-sialiltransferase, ο substrato e acido citidina-5'-monofosfo-N-acetil-neuraminico, em um meio de reagao adequado para permitir a transferencia do acido sialico do grupo de doador de acido sialico para ο FVII, as formas biantenarias, bissialiladas se tomando maioria.

O meio de rea9§o pode se basear em uma mistura de surfactante biologicamente compativel, como Tween®80 ou Triton®X-100 ou uma mistura destes em uma concentragao de 0,01% a 0,2% ou um cation de metal bivalente, como os cations Ca2+, Mn2+, Mg2+ ou Co2+, Ca2+, sendo ο preferido, em uma concentragao entre 5 mM e 10 mM. Este meio de reagao pode incluir ainda agentes de ajuste de for?a ionica e/ou agentes mantendo ο pH do meio, tais como cacodilato de sodio, acido morfolina-3-propanossulf5nico, Tris e NaCI em concentragao variando de 40 mM ate 60 mM. Os valores de pH tipicamente ficam entre 6 e 7,5. O meio de rea?ao pode incluir ainda BSA (Soroalbumina Bovina) a uma concentragao variando de 0,05 e 0,15 mg/ml.

De acordo com uma configuragao adicional da ίηνβηςειο, ο substrato pode ser sintetizado no meio de reagao, por introdugao nesse meio de uma sintetase CMP-acido sialico, acido sialico, CTP (citidina trifosfato) e de uma quantidade suficiente de um cation de metal bivalente, exemplos dos quais sao citados acima.

Qualquer que seja ο metodo aplicado para realizar a sialilagao da composigao de FVII, a reagao e sempre realizada por um periodo de tempo suficiente e sob condi?5es adequadas para permitir um aumento suficiente nas formas bissialiladas, de forma que se tornem maioria, como definido acima. Quando ο processo usa uma enzima imobilizada ο tempo de reagao de

preferencia fica entre 0,5 e 3 horas, a uma temperatura, com vantagem, situada entre 4 e 37°C, de preferencia entre 4°C e 20°C.

Quando ο processo e realizado numa reagao em lote, ο tempo de reagao preferencialmente se situa entre 1 e 9 horas, de preferencia entre 1 e 6 horas, a uma temperatura, com vantagem, situada entre 4 e 37°C, de preferencia entre 4°C e20°C.

De ρ referenda, ο processo da invengao visa a melhorar a biodisponibilidade da composigao do Fator Vll parcialmente sialilado transgenico ou recombinante. Essa melhora na biodisponibilidade e obtido pelo contato da citada composigao com um substrato de doador de acido sialico e uma sialiltransferase, tal como especificado acima.

"Aumentar a biodisponibilidade" se refere a um aumento de pelo menos 5%, ou de pelo menos 10%, ou, com vantagem, de pelo menos 30% ou 50%, e de preferencia de pelo menos 80% ou 90% da biodisponibilidade da composigao de FVII em compara^ao com a mesma composiQao de FVII cuja sialilagao nao foi modificada.

Em uma corifiguragao particular adicional, antes da etapa de sialilagao, e realizada uma etapa de galactosilagao. Esta etapa visa a enxertar galactose em formas deficientes em galactose, ou seja, formas agalactosiladas e moriogalactosiladas de FVII. A galactose e fixada ao GIcNAc e sera passivel de fixar um residuo de acido sialico na proxima etapa de sialilagao. Esta etapa de galactosilagao pode ser realizada pelo uso de galactosil-transferase em um meio de reagao incluindo uridina UDP-gal (5'-difosfogalactose) conhecido por pessoas com experiencia no oficio.

Com vantagem, a maioria das formas de glicano da composigao de FVII

parcialmente sialiladas sao de um tipo complexo, biantenario, monossialilado.

Tais formas de glicano sao mostradas abaixo:

Q

AAy

o-

25 Acido sialico Galactose

N-acetilglucosamina (GIcNAc) Manose Fucose

uma configuragao particular da invengao, a composi^ao do FVII parcialmente sialilado inclui tambem formas complexas biantenarias nao sialiladas (fucosiladas ou nao fucosiladas), triantenarias nao sialiladas (fucosiladas ou nao fucosiladas) e bissialiladas (fucosiladas ou nao fucosiladas).

Com vantagem, entre as formas de glicano biantenarias, monossialiladas

da citada composigao de FVII parcialmente sialilado, a maioria das formas de glicano sao nao fucosiladas.

Com vantagem, a composigao de FVII parcialmente sialilado apresenta pelo menos alguns dos acidos sialicos implicando Iigagoes a2-6, como anteriormente

m E

5 11

mencionado. De preferencia, ο processo inclui ainda, antes da etapa de sialilagao, uma etapa de produgao da composigao de FVII transgenico parcialmente sialilado por coelhas transgenicas. Essa etapa e executada como descrito anteriormerite. Essa etapa tambem pode ser realizada antes da etapa de galactosilagao.

Com vantagem, ο FVII da composigao da invengao do FVII parcialmente sialilado e ativado.

O processo da invengao permite obter, entre todas as moleculas de Fator Vll da citada composi9ao, um indice majoritario de formas biantenarias, bissialiladas.

Com vantagem, ο grupo de doador de acido sialico e acido citidina-5'- monofosfo-N-acetilneuraminico e a sialiltransferase e a2,6-(N)-sialil-transferase.

Tal composigao de FVII parcialmente sialilado pode ser uma composigao de FVII transgenico produzido nas glandulas mamarias de uma coelha transgenica.

De forma particularmente vantajosa, a composigao de FVII parcialmente sialilado e a composigao descrita no documento FR 06 04872, cujo conteiido e considerado como incluido no presente documento.

Aspectos e vantagens adicionais da invengao sera ο descritos nos seguintes Exemplos, os quais sao dados somente a titulo de ilustragao da invengao da qual nao constituem, de forma alguma, uma limitagao. Abreviagoes

FVII-Tg = FVIla-Tg: FVII transgenico ativado de acordo com a invengao

FVII-r = FVIIa-r: FVII ativado recombinante comercialmente disponivel

FVII-p = FVIIa-p: FVII ativado de origem de plasma, ou seja, purificado de plasma

humano.

MALDI-TOF: Dessorgao/loniza9ao a Laser Assistida por Matriz - Tempo de Voo HPCE-LIF: Electroforese Capilar de Alto Desempenho - Fluorescencia Induzida por Laser

ESI-MS: Espectrometria de massa por ionizagao "eletrospray"

LC-ESIMS: Cromatografia Iiquida - Espectrometria de massa por ionizagao

"eletrospray"

NP-HPLC: Cromatografia Liquida de Alto Desempenho de Fase Normal PNGase F: Peptidio: N-glicosidase F LC-MS: Cromatografia Iiquida - Espectrometria de massa Descripao das fiquras

Figura 1: Extragao e purificagao da composigao de FVII obtida no Exemplo 1 Figura 2: Espectro de massa deconvoluido ESI de peptidios contendo Iocais de N- glicosilagao

Figura 3: Eletroferogramas HPCE-LIF apos a deglicosilagao do FVII pelo PNGase F;

Legenda: Parte superior do eletroferograma: FVIIa.p; centra de ambos os eletroferogramas: FVII-Tg; parte inferior do eletroferograma: FVIIa.r. Figura 4: Caracterizagao de FVII por NP-HPLC;

Legenda: Parte superior do cromatograma: FVIIa.p; centro do cromatograma: FVII- Tg; parte inferior do cromatograma: FVIIa,r.

Figura 5: Identificagao da maioria das formas de glicano de FVII-Tg por MALDI- TOFMS.

Figura 6: Identificagao da maioria das formas de glicano de FVIIa.r por MALDI- TOFMS.

Figura 7: Analises HPCE-LIF da ressialilagao in vitro: (parte inferior) mapa oligossacaridico do FVII-Tg nativo; (parte superior) mapa oligossacaridico do FVII- Tg apos a ressialilagao.

Figura 8: Cinetica da sialilapao de FVII-Tg de acordo com ο percentual de formas biantenarias, bissialiladas, nao fucosiladas (A2) e fucosiladas (A2F) no tempo. Figura 9: Resultados do estudo comparativo preliminar de PK (PK: farmacocinetica) em coelho, FVII transgenico nao ressialilado (FVIITgNRS) comparado ao FVII transgenico ressialilado: curvas semilogaritmicas de eliminagao. Exemplos

Exemplo 1: Produpao de coelhas transqenicas PRODUZINDQ uma proteina de FVII humano em seu Ieite

Primeiro, um plasmidio p1 e preparado pela introdu^o da sequencia do gene WAP (descrito por Devinoy et al., Nucleic Acids Research, vol. 16, n0 16, 25 aout 1988, p. 8180)no poliligador do vetor p-poli Ill-I (descrito no documento Lathe etai, Gene (1987) 57, 193-201).

O plasmidio p2, obtido do plasmidio p1, contem ο promotor do gene WAP do coelho e ο gene de FVII humano.

As coelhas transgenicas foram obtidas pela tecnica classica da microinje?ao (Brinster et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442). 1-2 pi contendo 500 copias do gene foram injetadas no proniicleo macho de embrioes de coelhos. Os fragmentos desse vetor contendo os genes recombinados foram microinjetados. Posteriormente1 os embrioes foram transferidos para ο oviduto de femeas adotivas preparadas hormonalmente. Cerca de 10% dos embrioes manipulados geraram coelhos jovens e 2-5% dos embrioes manipulados geraram coelhos jovens transgenicos. A presenga de transgenes foi revel ad a pela tecnica da transferencia de Southern de DNA extraido de caudas de coelho. As concentragoes de FVII no sangue e no Ieite dos animais foram avaliadas por ensaios radioimunologicos especificos.

A movimentagao biologica do FVII foi avaliada pela adigao de Ieite ao meio de cultura de celula ou ao meio de cuItura de explantes mamarios de coelho. Exemplo 2: Extrapao e purificapao do FVII obtido

5

a) Extrapao do FVII

Foram usados 500 ml de Ieite cru nao escumado, diluido com 9 volumes de 0,25 M de fosfato de sodio, pH 8,2. Apos ser mexida por 30 minutos a temperatura ambiente, a fase aquosa enriquecida com FVII e submetida a centrifugagao a IOOOOg por 1 hora a 15°C (centrifugadora Sorval Evolution RC - 6700 ver/min - rotor SLC-6000). Sao necessario 6 potes de cerca de 835 ml.

Apos a centrifugagao, estao presentes tres fases: uma fase Iipidica na superficie (nata), uma fase Iimpa aquosa nao Iipidica enriquecida com FVII (fase majoritaria) e uma fase solida branca no residuo (precipitados de caseinas insoliiveis e de compostos de calcio).

A fase aquosa nao Iipidica enriquecida com FVII e coletada com uma bomba peristaltica ate a fase de nata. A fase de nata e coletada separadamente. A fase solida (precipitado) e descartada.

A fase aquosa nao lipidica, no entanto, ainda contendo quantidades muito baixas de lipidios, e filtrada atraves de uma sequencia de filtro (Pall SLK7002U010ZP - pre-filtro de fibra de vidro com tamanho de poro de 1 μηι - depois Pall SLK7002NXP - Nylon 66 com tamanho de poro de 0,45) Ao final da filtragem, a fase lipidica e passada nessa sequencia de filtragem, a qual retem completamente os globulos gordurosos do leite, e ο fiItradο esta limpo. A fase aquosa nao lipidica filtrada e entao dializada em uma membrana de

uItrafiltragem (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2)para torna-lo compativel com a fase cromatografica. O FVII com um peso molecular de cerca de 50 kDa nao e fiItradο atraves da membrana, ao contrario dos sais, dos agCicares e dos peptidios do leite. Em um primeiro momento, a solugao (cerca de 5.000 ml) e concentrada a 500 ml, depois uma dialise por ultrafiltragem, mantendo ο volume constante, permite remover os eletrolitos e preparar ο material biologico para a etapa cromatografica. O amortecedor de dialise e fosfato de sodio 0,025M, pH 8,2.

Esta fase aquosa nao Iipidica contendo ο FVII pode ser assimilada no soro de leite enriquecido com FVII-Tg. Este preparado e armazenado a -30°C antes de continuar ο processo.

O rendimento total da recuperagao de FVII nesta etapa e bastante

satisfatorio: 90% (91% de extragao com fosfato + 99% de dialise/concentragao).

A fase aquosa nao Iipidica contendo ο FVII resultante desta etapa esta perfeitamente Iimpa e compativel com as etapas cromatograficas adicionais.

Neste estagio, sao extraidos cerca de 93.000 IU de FVII-Tg. A pureza de FVII neste preparo e da ordem de 0,2%. b) Purificapao de FVM

1 Cromatoqrafia em gel de hidroxiapatita (cromatoqrafia de afinidade)

Uma coluna Amicon 90 (diametro 9 cm - corte transversal 64 cm2) e preenchida com gel de hidroxiapatita de Ceramica BioRad do tipo I (CHT-I). O gel e equilibrado com um amortecedor aquoso A consistindo de uma

mistura de fosfato de sodio de 0,025 M e cloreto de sodio de 0,04 M, pH 8,0. O preparado todo, armazenado a -30°C, e descongelado em um banho de agua a 37°C, ate a completa dissolugao do bloco de gelo, depois e injetado no gel (indice de fluxo linear de 100 cm/h, que e 105 ml/min). A fragao nao retida e descartada pela passagem de um amortecedor consistindo de 0,25 M de fosfato de sodio e 0,04 M de cloreto de sodio pH 8,2, ate ο retorno a Iinha de base (RBL).

A eluigao da fragao contendo ο FVII-Tg e realizada com ο amortecedor B consistindo de 0,025 M de fosfato de sodio e 0,4 M de cloreto de sodio, pH 8’0.A fragao eluida e coletada ate ο retorno a Iinha de base. Os compostos sao detectados pelas medidas de absorgao a λ = 280 nm.

Esta cromatografia permite recuperar mais de 90% do FVII-Tg, enquanto remove mais de 95% das proteinas lacticas. A atividade especifica (S.A.) e multiplicada por 25. Nesse estagio, estao disponiveis cerca de 85.000 IU de FVII- Tg com pureza de 4%.

Z FjJtragem tariqencial de 100 kDa e concentracao/dialise de 50 kDa

O total do eluato da etapa anterior e filtrado em modo tangencial atraves de uma membrana de ultrafiltragem de 100 kDa (Pall OMEGA SC 100K - 0,1 m2). O FVII e filtrado atraves da membrana de 100 kDa, enquanto proteinas com um peso molecular maior do que 100 kDa nao sao filtraveis.

A fragao filtrada e adicionalmente concentrada a um volume de cerca de

500 ml, depois dializada em um uItrafiItro de 50 kDa acima descrito. O amortecedor de dialise e cloreto de sodio 0,15 M.

Neste estagio do processo, ο produto e armazenado a -30°C antes da passagem na cromatografia de troca de ions.

Este estagio permitiu reduzir a carga de proteinas com peso molecular

maior do que 100 kDa e em particular as pro-enzimas. O tratamento na membrana de 100 kDa permite reter cerca de 50% das proteinas, entre as quais as proteinas de alto peso molecular, enquanto 95%, ou seja, 82.000 IU do FVII-Tg, e filtrado.

Este tratamento permite reduzir ο risco de hidrolise proteolitica nas etapas

adicionais. 3, Cromatoqrafias em gel Q-Sepharose® FF (etapa d) - Processo A)

Estas tres cromatografias sucessivas em gel de troca de ions Q- Sepharose® Fast Flow (QSFF) sao realizadas para purificar ο ingrediente ativo, para permitir a ativagao de FVII para FVII ativado (FVIIa) e finalmente concentrar e formular a composiQao do FVII. Os compostos sao detectados por medidas de absorgao a λ = 280 nm.

3.1 Etapa da Q-Sepharose® FF 1 - "Alto Calcio" de eluicao

Uma coluna de 2,6 cm de diametro (segao transversal de 5,3 cm2) e preenchida com 100 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare). O gel e equilibrado com 0,05 M Tris, pH 7,5.

A fra9§o total armazenada a -30°C e descongelada em um banho de agua a 37°C ate a completa dissolugao do bloco de gelo. A ira^ao e diluida a 1/2 [v/v] com ο amortecedor equilibrador antes da injegao no gel (indice de fluxo 13 ml/min, que e um indice de fluxo linear de 150 cm/h), depois a fragao nao retida e descartada pela passagem do amortecedor ate RBL.

Uma primeira fragao de proteina com baixo teor de FVII e eluida a 9 ml/min (ou seja, 100 cm/h) com um amortecedor de 0,05 M Tris e 0,15 M de cloreto de sodio, pH 7,5, e e posteriormente descartado.

Uma segunda fragao de proteina rica em FVII e eluida a 9 ml/min (ou seja, 100 cm/h), com 0,05 M Tris e 0,05 de cloreto de sodio e 0,05 M de amortecedor de cloreto de calcio, pH 7.5.

Esta segunda fragao e dializada em um uItrafiItro de 50 kDa ja descrito acima. O amortecedor de dialise e cloreto de sodio 0,15 M Esta fragao e armazenada a +4°C durante a noite, antes da segunda passagem de cromatografia de troca de ions. Esta etapa permite recuperar 73% do FVII (isto e, 60000 IU de FVII-Tg), enquanto elimina 80% das proteinas que acompanham. Isso tambem permite a ativagao de FVII para FVIIa.

3.2 Etapa da Q-Sepharose® FF 2 - "Baixo Calcio" de eluicao

Uma coluna de 2,5 cm de diametro (segao transversal de 4,9 cm2) e

preenchida com 30 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare).

O gel e equilibrado com um amortecedor 0,05 M Tris1 pH 7,5. A fragao anteriormente eluida (segunda fragao), armazenada a +4°C, e diluida antes de injegao no gel (indice de fluxo de 9 ml/min, que e um indice de fluxo linear de 100 cm/h).

Depois da injegao da segunda fragao, ο gel e Iavado com ο amortecedor equilibrador para remogao da fragao nao retida, ate ο RBL.

Uma fragao contendo FVII de aIta pureza e eluida a 4.5 ml/mm (ou seja, 50 cm/h), com 0,05 M Tris’0’05 de cloreto de sodio e 0,005 M de cloreto de calcio, pH 7,5.

Cerca de 23.000 IU de FVII-Tg foram purificados, ou seja, 12 mg de FVII-

Tg-

Esta etapa permite remover mais de 95% das proteinas associadas (proteina de Ieite de coelha). Este eluado, com pureza maior do que 90%, apresenta caracteristicas

estruturais e funcionais proximas as moleculas naturais do FVII humano. O eluado e concentrado e formulado por uma terceira cromatografia de troca de ions.

3.3 Etapa da Q-Sepharose® FF 3 - "Sodio" de eluipao

Uma coluna de 2,5 cm de diametro (segao transversal de 4,9 cm2) e preenchida com 10 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare). O gel e equilibrado com um amortecedor 0,05 M Tris, pH 7,5.

Apos a injegao da fragao, ο gel e Iavado com ο amortecedor equilibrador para remogao da fragao nao retida, ate ο RBL.

A fragao eluida e purificada da etapa anterior e diluida cinco vezes com agua purificada para injegao (PWI) antes da injegao no gel (indice de fluxo de 4,5 ml/min, ou seja, um indice de fluxo linear de 50 cm/h).

Posteriormente, ο FVII-Tg e eluido com um indice de fluxo de 3 ml/min (ou seja, 36 cm/h) com ο amortecedor 0,02 M Tris e cloreto de sodio de 0,28 M, pH 7,0.

Uma composigao de FVII-Tg foi preparada na forma de um concentrado com pureza acima de 95%. O produto e compativel com uma injegao intravenosa. 〇 processo proporciona um rendimento acumulado de 22%, desta forma permitindo purificar pelo menos 20 mg de FVII por Iitro de Ieite tratado.

A Tabela A resume os passos do processo de acordo com uma configuragao preferida da invengao para fornecer a composigao de FVII purificado e fornece diferentes rendimentos, purezas e atividades especificas obtidas em cada etapa.

Posteriormente, ο FVII-Tg da composig;ao e submetido a diferentes analises estruturais, tais como descritas nos seguintes exemplos. Exemplo 3: Caracterizapao dos Iocais de alicosilacao dos glicopeptidios por MS-ESI " Os Iocais de N-glicosilagao de FVII-Tg1 de FVIIa.p (FVII de plasma) e de FVIIa.r fora identificados por LC-ESIMS(/MS), confirmados por MALDI-TOFMS. e as proporgdes relativas dos diferentes glicanos presentes em cada local foram determinados por LC-ESIMS.

A Figura 2 mostra os espectros ESI deconvoluidos de glicopeptidios contendo ambos os residuos glicosilados de Asn. A Iocalizagao dos Iocais de glicosila9ao foi confirmado por MALDI-TOF(/TOF) e pela sequencia de Edman.

A analise dos espectros de massa dos glicopeptidios [D123-R152] e [K316-R353] de FVIla,p, apresentando os Iocais de N-glicosilapao Asn145 e Asn322, respectivamente, revela a presenga de uma forma biantenaria, bissialilada nao fucosilada (A2)(massa observada do glicopeptidio contendo Asn145: 5563,8 Da) e uma forma fucosilada (A2F) (massa observada de glicopeptidio com Asrh45: 5709,8 Da). Tambem observada para ο Asn145 a presenga de formas triantenarias, trissialiladas e nao fucosiladas (massa observada 6220.0 Da) e fucosiladas (A3F) (massa observada 6366,1 Da).

Para ο FVIIa,r, ο Asn145 e modificado por glicanos do tipo A2F, A1F e "A1F", este correspondendo a forma monossialilada com uma posigao terminal GaINAc na outra antena. A presenga de glicanos A3F (formas triantenarias, trissialiladas, fucosiladas) e notada.

Para ο FVII-Tg1 analise dos espectros de massa dos glicopeptidios [D123-

R152] e [K3I 6-Rs53] de FVII-Tg, apresentando os Iocais de N-glicosilagao Asn145 e Asn322, respectivamente, revela a presen?a de formas biantenarias, bissialiladas nao fucosiladas (A2)(massa observada do glicopeptidio contendo Asn145: 5563,8 Da) e formas fucosiladas (A2F) (massa observada: 5709,7 Da). A presenga de oligossacaridios majoritarios, Iocalizados em Asn145, biantenarios, monossialilados e nao fucosilados (A1) (massa observada: 5272,3 Da) e fucosilados (A1F) (massa observada: 5418,7 Da). As formas triantenarias sao pouco representadas. Deve-se observar que nao esta presente nenhuma forma monossialilada com um GaINAc na posigao terminal na outra antena.

25

Em relagao as glicoformas majoritarias de Asn322 as mesmas estruturas de glicano sao observadas em diferentes proporgoes. A Figura 1 mostra a presenga de formas menos maduras (menos antenarias e sialiladas) como no Asn!45 Por exemplo, as formas triantenarias sao menos representadas no Asn322 em comparagao com ο Asn145 para ο produto de plasma e estao ausentes no FVIIa,r e FVII-Tg. Tambem deve-se observar que ο Asn 145 e 322 sao glicosilados a 100%. Embora unicamente semi-quantitativos, esses resultados estao de acordo com os dados quantitativos obtidos por HPCE-LIF e NP-HPLC. Exemplo 4: Quantificacpao de N-qlicanos por HPCE-LIF A identifica?ao e quantificagao de oligossacarideos N-Iigados sao

executadas por HPCE-LIF apos a deglicosilagao por PNGase F. Amostras de FVII sao tratadas com exoglicosidades (sialidase (razao ENZIMA/SUBSTRATO 1/Mil/10 pg), galactosidase, hexnacase (kit Prozyme), fucosidase (razao E/S: 1 mUI/10 pg) de forma a assegurar a identificagao e quantificagao de cada estrutura isolada. Os glicanos obtidos sao marcados com fluorocromo e separados conforme sua massa e sua carga. Dois padroes (homopolimeros de glicose, oligossacarideos) perm item identificar as estruturas. A quantificagao e realizada pela integragao de cada pico reduzido, em percentual, ao todo dos oligossacarideos quantificados.

Um aparelho de electroforese capilar ProteomeLab PA800 (Beckman Coulter) e usado, cuja capilaridade e N-CHO "revestido" (Beckman-CouIter) de diametro interno de 50 cm χ 50 μιη. Um amortecedor de separa^ao "gel amortecedor-N" (Beckman-CouIter) e usado. A migragao e realizada aplicando-se uma voltagem de 25 kV por 20 min a 20°C. A detecgao e realizada por um laser a

Aexcita均o488nm e Aemissao 520 ΠΠΊ.

O indice de fucosilagao e calculado apos a deglicosilagao ao mesmo que a

sialidase, galactosidase e hexcanase, pela relagao entre as superficies dos picos correspondentes ao "nCicleo" e ao "nCicleo" fucosilado.

Os glicanos de FVIIa,p sao, na maioria, do tipo biantenario, bissialilado, nao fucosilado (A2) e do tipo biantenario, bissialilado, fucosilada (A2F). Os perfis de glicano de FVII-Tg revelam a presenga de formas biantenarias, monossialiladas, fucosiladas ou nao fucosiladas (A1F, A1), e de formas biantenarias, bissialiladas, fucosiladas ou nao fucosiladas (A2F, A2). A distribuisao varia entre essas duas formas nas duas cargas.

O FVIIa.r apresenta formas de glicano biantenarias, sialiladas, fucosiladas com uma maioria de formas A2F, e formas biantenaria, monossialiladas, fucosilada (A1F). Sao observados momentos atipicos de migragao para as formas A2F e A1F em comparagao aos momentos de migra^ao normalmente encontrados nessas estruturas.

Os perfis de glicano dos dois Iotes (A e B) de FVII-Tg (cf Figura 3 - ambos

electroferogramas no centro) revelam a presen?a de formas biantenarias,

monossialiladas, fucosiladas e nao fucosiladas (A1F, A1) e formas biantenarias,

bissialiladas, fucosiladas ou nao fucosiladas (A2F, A2).

Tabela 1. Resumo do percentual de formas sialiladas resultantes de amostras nativas de diferentes Iotes de FVlI.

Percentual FVIIa.p FVII-Tg Iote A FVII-Tg Iote B FVIIa，r A2 Nativo 41,9 19,3 13,9 - A2F 8,9 14,8 21,5 44,8 A1 2,6 38,4 25,2 - A1F - 11,7 22,2 16,5 Total A2+A2F 50,8 34,1 35,4 44,8 Total A1+A1F 2,6 50,1 47,4 16,5

A analise quantitativa de diferentes formas de glicano (Tabela 1) mostra

que, para ο FVIIa.p, a predominancia de formas sialiladas com 51% de glicanos bissialilados (A2 e A2F), e 30% de formas triantenarias sialiladas nao fucosiladas e fucosiladas (G3 e G3F respectivamente) (resultados nao mostrados). O FVII-Tg (lotes A e B) e menos sialilado do que ο FVIIa.p com 35% de formas biantenarias, bissialiladas, e somente 6% de formas triantenarias, sialiladas (resultados nao mostrados). As principals formas sao monossialiladas com 50% de estruturas A1 e A1F. Tambem ο FVIIa,r e menos sialilado do que ο FVIIa,p com 45% das estruturas A2F e somente 6% de glicanos triantenarios, sialilados (resultados nao mostrados). A faIta de formas nao fucosiladas de FVIIa,r e notada.

Tabela 2. O indice de fucosilapao de diferentes FVIl

___

FVIIa.p FVII-Tg Iote A FVII-Tg Iote B FVIIa.r Indice de fucosilagao (%) 16,2 23,6 41,8 100

Os resultados mostram um baixo indice de fucosilapao do FVIIa.p (16%), um indice de fucosila?ao de 24 a 42% do FVII-Tg e um 100% de fucosilagao do FVIIa.r.

Exemplo 5: Quantificapao dos N-qlicanos por NP-HPLC

15

A analise qualitativa e quantitativa de N-glicosilagao de FVIIa,p, FVIIa.r e FVII-Tg foi estudada por NP-HPLC (cf. Figura 4). Apos a dessalinizagao e secamento da proteina, essa proteina e desnaturada e reduzida por metodos conhecidos por pessoas experientes no oficio. Posteriormente, os glicanos sao Iiberados em uma reagao enzimatica (endoglicosidase, PNGase F) e purificados por precipita?ao com etanol. Os glicanos assim obtidos sao marcados com fluorocromo, 2-aminobenzamida (2-AB). Os glicanos rotulados sao separados conforme ο seu carater hidrofilo por cromatografia HPLC de fase normal em uma

coluna de Amida-80, 4,6 χ 250 mm (Tosohaas) termostatizada a 30°C Antes da injegao da amostra, a coluna e equilibrada com um amortecedor de 80% de acetonitrila. Os oligossacarideos sao eluidos em um gradiente crescente de 50 mM de formato de amonio, pH 4,45’ por periodos de tempo maiores ou iguais a 140 minutos. A detecgao e realizada por fluorimetria a Aexcita?§。a 330nm e Aemissao a 420nm.

O perfil cromatografico de FVIIa.p mostra que a maioria dos glicanos sao do tipo biantenario, bissialilado (A2) com indice de 39%. Tambem sao observadas, em quantidades menores, formas biantenarias, bissialiladas, fucosiladas (A2F), monossialiladas (A1) e trissialiladas fucosiladas e nao fucosiladas (A3F e A3). A analise NP-HPLC realizada no FVII-Tg confirma a presenga de

oligossacarideos em maioria de tipo A1, a um indice de 27%. As formas A1F, A2 e A2F sao menos representadas e as formas triantenarias estao preserves em vestigios. Isso revela uma diferenga de sialilagao entre FVIIa.p e ο Fator FVII-Tg (lote B), menos sialilado. A mesma analise, realizada em um Fator FVIIa,r, revela as formas

majoritarias do tipo A2F presentes em uma quantidade de 30%. As formas A1F sao menos representadas e as formas triantenarias estao presentes em vestigios. A analise de FVIIa.r tambem mostra um importante intervalo no tempo de retengao das formas A1F e A2F, sugerindo formas diferentes das que estao presentes no FVIIa.p e no FVII-Tg.

O conjunto desses resultados e consistente com os obtidos por HPCE-LIF. Exemplo 6: Identificacao por MALDI-TOFMS

A espectrometria de massa MALDI-TOF MS (Espectrometria de Massa por Dessorgao/lonizagao a Laser Assistida por Matriz - Tempo de Voo) e uma tecnica que mede com aIta precisao ο peso molecular de peptidios, proteinas, glicanos, oligonucleotideos e a maioria dos polimeros ionizaveis.

Os peptidios, proteinas e glicanos a serem analisados sao misturados com uma matriz que absorve a um comprimento de onda do laser utilizado. As principals matrizes sao acido D-Ciano-^hidroxicinamico (HCCA) para peptidios, acido sinapico (AS) para proteinas e acido 2,5-diidroxibenzoico (DHB) para analise oligossacarideos.

O metodo consiste de uma irradiagao da matriz/analito de co-cristais com um laser pulsado, ο que induz a dessorgao conjunta da matriz e das moleculas de analito. Apos a ioniza^ao na fase gasosa, as moleculas de analito passam atraves do detector no tempo de voo. Como as massas e ο tempo de voo sao diretamente relacionados, a medigao do ύItimo permite determinar a massa do analito alvo. A identificagao e realizada pela medigao da massa observada, comparando com a massa teorica. A sequencia pode ser efetuada em modo MS/MS com base nos fragmentos de ion obtidos. O instrumento utilizado e um Bruker Autoflex 2 operando em modos TOFe TOF/TOF.

Para identificar as formas de glicano presentes no FVII-Tg e no FVIIaj1 foram realizadas analises MALDI-TOF MS em frag5es de eluigao resuItantes se NP-HPLC preparatorio.

A analise MALDI-TOF do FVII-Tg permitiu confirmar a identifica^ao dos glicanos separados por NP-HPLC, no caso, a formas majoritarias monossialiladas A1 e as formas minoritarias do tipo A1 F, A2F e A2.

Este estudo tambem permitiu identificar as formas minoritarias do tipo triantenarias bissialiladas e trissialiladas, formas hibridas e oligomanoses do tipo Man5 e Man6-P-HexNAc (cf. Figura 5). A analise MALDI-TOF MS realizada no FVIIa.r revelou a presenga de formas de glicano mostradas na Figura 6. O Fator FVIIa.r e quase completamente

fucosilado, ao contrario do FVII-Tg1 que e apenas parcialmente fucosilado. Nota-se

que a forma majoritaria de glicano e A2F com um indice quantificado por NP-HPLC

em 30%. As formas biantenarias, monossialiladas, fucosiladas (A1F) e incluindo um

GaINAc na posigao terminal na outra antena, sao identificadas nas formas neutras

biantenarias fucosiladas, tambem, com as metades Hex-NAc-HexNAc em uma e/ou

duas antenas. Nota-se tambem a presenga de formas triantenarias, trissialiladas e

fucosiladas. As formas nao fucosiladas estao preserves em vestigios.

Exemplo 7: analise HPCE-LIF da Iiqacao acidos sialicos - galactose Em relagao ao estudo da Iigagao acido sialico-galactose ("ramificagao"), ο

procedimento experimental e semelhante ao especificado no Exemplo 4. Apos a

deglicosilagao com PNGaseF1 os oligossacarideos sao tratados com exossialidades

de forma a garantir a identificagao da Iigagao e a quantificado de cada estrutura

isolada. As sialidases empregadas sao enzimas recombinantes obtidas de S.

pneumoniae (ligagao a2-3 especifica, 0,02 IU, E/S=0,4 m/m), C. perfringens

(ligagoes a2-3 and a2-6 especificas, 0,04 III, E/S=0,1 m/m) e A. urefaciens

(hidrolizando as Iigagoes a2-3, a2-6, a2-8 e a2-9, 0.01 IU, E/S=0,05 m/m).

As analises mostraram que ο FVIIa,r tem formas de glicano biantenarias, sialiladas, fucosiladas com a maioria de A2F, e formas biantenarias, monossialiladas e fucosiladas (A1F). Sao observados momentos atipicos de migragao para essas formas A2F e A1F em comparagao com momentos de migragao normalmente encontrados nessas formas. Especialmente1 essas formas sialiladas oligossacaridicas apresentam momentos atipicos de migragao em HPCE- LIF e NP-HPLC em comparagao aos de FVII-Tg. Por outro lado, nenhum acido sialico particular que nao Neu5Ac foi revelado na analise da composigao de monossacarideos e a espectrometria de massa revel a glicanos, com uma massa de acordo com os tipos bissia川ados. Finalmente, a dessialilagao de glicanos de FVIIa.r permite encontrar comportamentos cromatograficos e eletroforeticos equivalentes aos dos oligossacarideos do FVII-Tg.

Assim, essas diferengas no comportamento cromatografico e eletroforetico podem ser explicadas com base em uma diferente ramificagao de acidos sialicos. Essa presungao foi avaliada por diferentes abordagens por HPCE-LIF e MS.

Os resultados sao resumidos na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Ramificapoes de acidos sialicos nos diferentes Iotes de FVII.

Sialilagao (%) □2-3 (%) a2-6 (%) □2-8 (%) FVIIa.r 91 100 0 0 FVII-Tg Iote C 96 0 100 0

Os resultados mostram uma isomeria no nivel dos acidos sialicos distinta

entre ambos os FVII. Com efeito, os acidos sialicos de FVIIa.r implicam Iigagoes a2- 3, enquanto ο FVII-Tg apresenta ramificagoes α2-6.

As diferengas nos comportamentos de HPCE-LIF e NP-HPLC observados para os glicanos de FVIIa.r em comparagao ao FVII-Tg sao relacionadas a essas diferengas na isomeria no nivel dos acidos sialicos. Exemplo 8: Ressialilagao in vitro do FVII-Tg

A Iiteratura (Zhang X. et al, Biochim. Biophys. Acta 1998, 1425; 441-52) menciona que uma sialilagao mais completa de uma glicoproteina contribuiu para as estabilidades melhoradas in vitro e in vivo. O objetivo deste estudo e demonstrar a viabilidade de uma sialilagao in vitro.

A ressialilagao foi executada pelo uso de uma a2,6-(N)-sialiltransferase (rat, Spodotera frugiperda, S.A. > 1 unidade/mg (S.A.: Atividade Especifica), 41 kDa, Calbiochem). Esses dois reagentes sao armazenados a -80°C em razao de sua instabilidade. O substrato de sialilagao (acito citidina -5'-monosfo-N- acetilneuraminico) e a enzima a2,6-(N)-sialiltransferase) e misturado no amortecedor de reagao durante a noite a 37°C. O amortecedor de rea?ao utilizado e 50 mM de acido morfolina-3 propanossulfonico, 0,1% Tween®80, 0,1 mg/ml BSA (albumina de soro de bovino) ajustado a um pH de 7,4 (reagentes Sigma).

A Tabela 4 abaixo resume as condigoes experimentais.

Tabela 4: Resumo das condipoes experimentais

FVII nativo de controle FVII Ressialilado FVII (_ 50 50 Amortecedor de reagao (μΙ) 200 200 CMP-Neu5Ac (μΙ) (acido citid ina-5'-monofosfo-N- acetilneuraminico) 2 A2.6-NST (μΙ) (a2,6-(N)-sialiltrarisferase) 20 20 Incubagao Durante a noite Durante a noite

O electroferograma to FVII-Tg, nativo, tal como obtido apos a purificagao do

Exemplo 2 (Figura 7，perfil inferior) mostra a forma majoritaria biantenaria, monossialilada A1 (42%) e as estruturas menos representadas A2, A2F e A1F Apos a ressialilagao (Figura 7, perfil superior) a forma monossialilada representa somente 6% em beneficio da forma bissialilada, especialmente nao fucosilada, tornando-se maioria (52%). A quantificagao de glicanos antes e depois da ressialilagao e mostrada na

Tabela % abaixo.

Tabela 5: Quantificagao de estruturas oligossacaridicas antes e depois da sialilagao FVII-Tg Nativo FVII-Tg Ressialilado A2 19,8 52,4 A2F 15,5 25,1 A1 42,1 6,4 A1F 13,6 11,6 Neutro 9,0 4,5 % de Sialilagao 91,1 95,5 Indice de bissialilados 35,3 77,5

A cinetica da sialilagao do FVII transgenico e mostrada na Figura 8.

Este estudo mostra a eficiencia da ressialilagao in vitro com um indice de formas bissialiladas aumentada em mais de 100%.

Exemolo 9: Estudo comparativo farmacocinetico em um coelho de FVII transgenico nao ressialilado (FVII Ta NRS) comparado a um FVII transgenico ressialilado (FVII Ta RSV resultante do exemplo 8)

O objetivo deste estudo e a comparagao dos perfis farmacocineticos do

FVII-TgRS com ο FVII-TgNRS em um coelho macho da Nova Zelaridia.

A dose testada e 200 pg/kg por animal, ο que e ο dobro da dose terapeutica

do FVII recombinante administrado em humanos.

As coletas de sangue sao feitas em J-4 (4 dais antes da inje^ao do produto)

e em J1 (dia da injegao do produto), a T0.17h (dia da inje?ao, 10 min. apos a

injegao), T0.33h (dia da injegao, 20 min. apos a inje?§o) T1h (dia da injegao, 1 hora

apos a injegao), 丁3h (dia da injegao, 3 horas apos a injegao), T6h (dia da injegao, 6

horas apos a injegao), 丁8h (dia da injegao, 8 horas apos a injegao).

A dosagem de FVII:Ag (antigeno de FVII) e realizada com um ELISA (kit

Asserachrom). Os resultados das dosagens do FVII:Ag no plasma de coelho

permitem determinar, por um lado， os perfis de remogao, e por outro lado, os

parametros farmacocineticos. As posologias e grupos experimentais sao

mostrados na Tabela 6. Tabela 6: Posologias e grupos experimentais

Grupo experimental Produto administrado Numero/peso animais Dose em J1 indice de proteina/FVII:Ag Volume injetado Grupo 1 FVII-Tg RS 3 coelhos (1 a 3) 2,315 i 0,124 kg 200 MQ/kg Proteinasl43 pg/ mL FVI I: Ag = 253,7，土 5.8 U/ml 1,4 mL/kg Grupo 2 FVII-Tg NRS 3 coelhos (4 a 6) 2,352 ± 0,130 kg 200 MQ/kg Proteinas 145 Mg/mL FVI I: Ag = 263.7 ± 2,9 U/ml 1,4 mL/kg Grupo 3 NaCI 0,9% 3 coelhos (7 a 9) NA NA 1,4 mL/kg

ΝΑ: Nao Aplicavel

As curvas de remogao sao mostradas na Figura 9. Os resultados sao reproduzidos na Tabela 7.

Tabela 7: Resultados

Parametros PK Dose (U) T1/2 (h) MRT (h) Cmax (mU/ml) Recup eragao (%) AUC (h χ mU/ ml) Cl (ml/h) Vd (ml) FVII-TgRS 822 i 44 1,85 ί 0,08 2,93 ± 0,09 2060 ± 394 20 土 4 2563 ± 335 320 土 46 856土151 FVII-Tg NRS 868 ± 48 1,76 ± 0,08 2,81 士 0,03 1797 ί 389 17 ± 4 1863 ± 346 479土103 1216土 288

Com as doses administradas, a meia-vida de remogao, ο tempo medio de residencia (MRT), a concentragao maxima (Cmax) e ο indice de recuperagao

("recuperagao") sao comparaveis em ambos os grupos experimentais.

O FVII-TgRS apresenta um perfil de cinetica diferente do FVII-TgNRS. A

ressialilagao do FVII-Tg melhora de forma imperceptivel a meia-vida, a media de tempo de residencia，(MRT)1 ο Cmax e a "recuperagao".

A diferenga e observada no nivel de parametros AUC (area de pico), Cl (limpeza), e volume de distribuigao (Vd) (Este volume e obtido dividindo-se a dose administrada ou absorvida pela concentragao de plasma) sugerindo uma eliminagao menos importante do FVII-TgRS da circulagao sanguinea.

A ressiali_o do FVII-Tg induz um aumento na biodisponibilidade do

ρ rod u to em cerca de 30%. Tabela A

Rdt: Rendimento LISTAGEM DE SEQLIENCIAS TITULAR: LFB BIOTECHNOLOGIES

ENDEREQO: DISCOVERER, 3 AVENUE DES TROPIQUES, ZA DE COURTABOEUF, F- 91940 LES ULIS, FRANQA TiTULO DA ΙΝνΕΝςΑΟ: FATOR RECOMBINANTE OU TRANGENICO Vll CONTENDO UMA MAIOR PARTE DE FORMAS DE GLICANO, FORMAS BIANTENARIAS, BISSIALILADAS E NAO FUCOSILADAS. NLJMERO DE SEQLIENCIA CONSTANTE NO PEDIDO: 1 NLJMERO IDENTIFICADOR DA SEQLIENCIA: 1 TAMANHO: 406 TIPO: PRT

NOME: Homo sapiens 1

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys

25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 40 45

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60

Leu Gln Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala

180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gln Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285

25

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380

Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (20)

1. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", caracterizado por cada molécula de Fator Vll da composição conter formas de glicano ligadas a locais de N-glicosilação, caracterizada pelo fato de que todas as moléculas de Fator Vll da citada composição são formas de glicano biantenárias, bissialiladas e não fucosiladas em comparação com todas as formas de glicano ligadas a locais de N-glicosilação de FatorVII da composição .

2. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo índice de formas biantenárias, bissialiladas, fucosiladas e não fucosiladas ser maior do que 50%.

3. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada por entre todas as moléculas do Fator Vll da citada composição, o índice de fucose ficar entre 20% e 50%.

4. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada por pelo menos alguns dos ácidos siálicos do Fator Vll da citada composição implicarem ligações a2-6.

5. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com reivindicação 4, caracterizada por todos os ácidos siálicos do Fator Vll da citada composição implicarem ligações a2-6. .

6. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com reivindicação 4, caracterizada pelo Fator Vll da citada composição incluir ainda ácidos siálicos de ligações a2-3. .

7. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo citado FVII ser ativado.

8. "COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO (FVII)", de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo uso como medicamento .

9. "USO DE UMA COMPOSIÇÃO DO FATOR VII", de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por preparar um medicamento destinado ao tratamento de pacientes sofrendo de hemofilia.

10. "USO DE UMA COMPOSIÇÃO DO FATOR VII", de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por preparar um medicamento destinado ao tratamento de múltiplos traumas hemorrágicos.

11. "USO DE UMA COMPOSIÇÃO DO FATOR VII", de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por preparar um medicamento destinado ao tratamento de sangramentos decorrentes de uma dose excessiva de anticoagulantes.

12. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA INCLUINDO UM FVII", como definido de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por um excipiente e/ ou um portador farmaceuticamente aceito.

13. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", caracterizado por cada molécula do Fator Vll da composição incluindo formas de glicano ligadas a locais de N-glicosilação e onde todas as moléculas do Fator Vll da citada composição são na maioria formas de glicano biantenárias, bissialiladas, incluindo uma etapa de sialilação pelo contato de uma composição de Fator Vll transgênico ou recombinante parcialmente sialilado com um substrato de doador de ácido sialilado e uma sialialtransferase, em um meio adequado de reação para permitir a atividade da sialiltransferase por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas para permitir uma transferência do ácido siálico do substrato de doador de ácido siálico para o FVII e um aumento suficiente nas formas sialiladas de forma que as citadas formas sialiladas se tornem maioria .

14. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com a Reivindicação 13 caracterizado por antes da etapa de sialilação, ser realizada uma etapa de galactosilação, para enxertar galactose em formas com deficiência de galactose, representando as formas agalactosiladas e monogalactosiladas de FVII.

15. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com qualquer das reivindicações 13 e 14, caracterizado pela citada composição de FVII parcialmente sialilado apresentar formas de glicano majoritárias biantenárias, monossialiladas.

16. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por entre as formas de glicano biantenárias, monossialiladas da citada composição de FVII parcialmente sialilado, a maioria das formas de glicano serem não fucosiladas .

17. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 16, caracterizado pela citada composição de FVII parcialmente sialilado apresentar pelo menos alguns dos ácidos siálicos implicando ligações a2-6 .

18. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 17, caracterizada por antes da etapa de sialilação, ser incluída uma etapa de ΑΙΑ produção da composição de FVII transgênico parcialmente sialilados por coelhas transgênicas.

19. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18, caracterizado pela citada composição de FVII parcialmente sialilado ser ativada.

20. "PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE RECOMBINANTE OU FATOR Vll TRANSGÊNICO", de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 19, caracterizado pela dita sialiltransferase ser a2,6-(N)-sialiltransferase e o grupo de doador de ácido siálico ser o ácido citidina-5'-monofosfo-N-acetil-neuramínico.