CN103397011B - 大部分为二天线、二唾液酸和非岩藻糖基化聚糖结构的重组或转基因因子vii合成物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组或转基因因子VII合成物,该合成物的每个因子VII分子具有连接到N‑糖基化位点的聚糖结构,其中所述合成物的所有因子VII分子中,二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构占大多数。本发明还涉及所述合成物用作药物的用途,以及用于制备所述合成物的方法。
Description
本申请是申请日为2007年7月31日、申请号为200780027968.1、发明名称为“大部分为二天线、二唾液酸和非岩藻糖基化聚糖结构的重组或转基因因子VII合成物”的发明专利申请的分案申请。
背景技术
因子VII(FVII)是一种维他命K依赖糖蛋白,在其活化形态(FVIIa)下参与凝血过程,在存在钙和组织因子的情况下活化因子X和因子IX。FVII以具有406个氨基酸残基的单肽链形态分泌,其分子量约为50kDa。FVII包含四个特别的结构域:N端γ-羧基域(Gla)、两个“类表皮生长因子(EGF)”域、以及丝氨酸蛋白酶域。将FVII活化为FVIIa是以精氨酸152-异亮氨酸153域(精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解为特征的。因此,FVIIa由具有分子量约为20kDa的具有152个氨基酸的轻链、和分子量约为30kDa的具有254个氨基酸的重链组成,两条链通过单二硫键相互连接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。
血浆FVIIa(FVIIa,p)包含几种翻译后修饰:前十个谷氨酸被γ-羧基化,Asp63(天冬氨酸)被部分羟化,Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被氧-糖基化,并携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖成分,分别地,Asn145(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated)的复合聚糖结构而N-糖基化。
FVII用于治疗表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失的血友病病人,以及对于表现出凝血因子的其他缺失的病人,例如,FVII的先天性缺失。FVII还用于脑血管意外的治疗。因此有必要获得注射用FVIIa浓缩物。
获取FVIIa浓缩物的最古老的方法为从通过分馏所获得的血浆蛋白质中提纯FVIIa。
为这一目的,EP0346241描述了富含FVIIa的馏分的制备,其在吸附后获得,接着洗提包含FVII、FVIIa以及其他蛋白质的血浆蛋白质的分馏副产物,即PPSB的预洗提液(P=凝血素或FII,P=转变加速因子前体或FVII,S=斯图亚特因子或FX,以及B=抗血友病因子B或FIX),其他蛋白质例如为因子IX(FIX)、X(FX)和II(FII)。这种方法的缺点是获取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。
同样的,EP 0547932描述了基本上不含维他命K依赖因子和FVIII的高纯度FVIIa浓缩物的制备过程。通过这一过程获得的FVII尽管其纯度高,但仍表现出残留的形成血栓活性。
这些方法的主要缺点是它们只能获得低产量的产品。
而且,从献血者采集的血浆的量仍然受到限制。
因此,自从二十世纪八十年代,编码人体因子VII的DNA被分离出来(Hagen et al.(1986);Proc.Natl.Acad.Sci.USA;Apr83(8):2412-6),并在哺乳动物BHK细胞(幼仓鼠肾)中进行表达(EP 0200421)。申请人提交的专利申请FR 0604872也描述了FVIIa在转基因动物中的生产。
通过这些生产方法获得的蛋白在病毒或其他致病剂污染方面更为安全。而且,这些方法获得蛋白具有基本序列,即在不同氨基酸之间的等同于基本人类序列的链。然而,人类血浆FVII包含复杂的翻译后修饰:前十个谷氨酸被γ-羧基化,Asp63(天冬氨酸63)被部分羟化,Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被氧-糖基化,并携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖成分,分别地,Asn145(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated)的复合结构而N-糖基化。特别的,N-聚糖的加入(连接到天冬酰胺的聚糖)对于外源蛋白的蛋白质的正确折叠、体内体外稳定性、生物活性以及药代动力学(例如,生物处理能力)尤其重要。因此,全部或部分翻译后修饰的变化使得蛋白一方面有失活的危险,另一方面还有致免疫的风险。
目前,现有的重组或转基因因子VII由于其在不同于人类系统中的表达,而表现出与人类血浆FVII不同的糖基化,该糖基化能导致针对重组蛋白的抗体的增加,从而导致其效率低于提纯自人类血浆的人类FVII。
因此,需要获得治疗性或预防性的FVIIa合成物,其功能性质接近于提出自人类血浆的人类FVII,而且其生产方法能满足该蛋白的大量需求。
发明内容
因此,本发明涉及一种重组或转基因因子VII合成物,该合成物的每个因子VII分子含有结合到N-糖基化位点的聚糖结构,其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中,与所有聚糖结构结合到N-糖基化位点的因子VII合成物相比,大部分为二天线、二唾液酸、非岩藻糖基化聚糖结构。
申请人惊奇的发现,大部分为二天线、二唾液酸、非岩藻糖基化结构的重组或转基因FVII合成物与具有较低比率的二唾液酸化结构的重组或转基因FVII相比,即与大部分为二天线、单唾液酸化、非岩藻糖基化结构的重组或转基因FVII相比,其生物处理能力(biodisponibility)更强、清除率更低以及稳定性更高。
因此,与具有较低比率的二唾液酸化结构的重组或转基因FVII合成物相比,即与大部分为单唾液酸化结构的重组或转基因FVII合成物相比,本发明的FVII可以以更低频率以及以更低的用量提供给病人。
生物处理能力指的是分散到血液循环中并尤其是因此易于到达出血位点的施加的FVII的百分比。
清除率指的是完全纯化的理论体积的百分率,即每时间单元不再含有FVII。换句话说,它对应于在一时间单元区间内完全不含物质的流体的假定量。
稳定性指的是FVII在其完全有效的指定期间内维持其化学、物理、微生物活性以及生物药性的能力
《二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构》指的是下列结构:
A2结构(二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化)
:唾液酸
:半乳糖
:N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)
:甘露糖
这些聚糖结构结合到由天冬酰胺145(Asn145)和天冬酰胺322(Asn322)组成的N-糖基化位点。事实上,本发明的FVII象人类FVII一样包含两个位于145和322位置的N-糖基化位点和两个位于52和60位置的O-糖基化位点。在一个N-糖基化位点,寡糖链连接到一个天冬酰胺(N-连接)。在一个O-糖基化位点,寡糖链连接到一个丝氨酸。因此,本发明的FVII的每个分子包含两个寡糖N-连接链。然而,合成物的FVII分子并不表现出均一的糖基化,即所有的N-连接寡糖链不相同。问题在于其为不同聚糖结构的混合物。
事实上,无论是血浆的、重组的还是转基因的,任何FVII都是几种FVII蛋白的混合物,这些蛋白表现出不同的性质,尤其是糖基化和指定糖形。该糖基化是一翻译后过程,该翻译后过程是由细胞单元通过在不同细胞分区内转移FVII蛋白而实现的。这一生化修饰强烈的修饰了蛋白,最终的蛋白完美的被结构化,并因此具有活性,而且能被有机体良好的耐受。这一化学修饰促进了蛋白活性的调节和定位。因此,对于所有的FVII合成物以及所有的合成物中的N-连接寡糖链而言,FVII合成物中的每个聚糖结构或者每个糖的比率能够被量化。
本发明中,不同聚糖结构的比例并没有考虑O-糖基化。
《FVII合成物》指的是一种合成物,该合成物中唯一的分子实体是FVII,优选是被活化了的。
合成物中的每个FVII分子表现出相同的基本序列,但是不同分子的糖基化不同。因此,《FVII合成物》指的是具有相同基本序列的分子混合物,特征在于其聚糖结构的含量。本发明中,术语《FVII》和《FVII合成物》是等同的。因此,本发明的内容中,“FVII”指的是FVII分子本身,或者指的是具有上述提到的特征的FVII分子混合物。
本发明的FVII合成物是一种主要含有二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构的FVII合成物。这意味着在合成物的所有N-连接寡糖中,即在所有的连接到因子FVII的N-糖基化位点的聚糖结构中,二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化结构占大多数。
有利的,二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构的比率高于或等于30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或者95%。特别有利的,二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构的比率高于或等于45%。特别有利的,二天线、二唾液酸、非岩藻糖基化聚糖结构的比率在45-60%之间,优选的在50-60%之间。
唾液酸化结构的比率根据经验可以通过HPCE-LIF分析(高效毛细管电泳-激光诱导荧光法)和/或NP-HPLC(正相高效液相色谱)确定,通过测量对应于不同聚糖的峰的面积而进行量化。唾液酸化结构的比率或者还可以通过本领域技术人员公知的任何方法确定。
本发明FVII合成物也能含有少量的二天线、单唾液酸化结构和三天线结构,以及不表现出唾液酸的中性结构。
《重组或转基因FVII》指的是通过基因工程获得的任何FVII,即通过细胞生产的FVII,通过基因重组对该细胞的DNA进行修饰,以使其表达FVII分子并表现出所述的糖基化特征。
因此,通过转录,接着在细胞宿主或转基因动物内对编码FVII的DNA分子进行修饰,进而获得本发明的FVII。本发明的重组或转基因FVII能通过本领域技术人员公知的允许在生物系统内表达蛋白的标准技术获得。
更特别的,《重组VII》指的是在人工培养的细胞系中通过基因重组和表达获得的任何FVII。例如,下列的细胞系:BHK(幼仓鼠肾)和即BHK tk-ts13(CRL10314,Waechter and Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1106-1110.1982)、CHO(ATCC CCL61)、COS-1(ATCC CRL1650)、HEK293(ATCC CRL1573;Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59-72,1977)、Rat Hep I(大鼠肝癌;ATCC CRL1600)、Rat Hep II(大鼠肝癌;ATCC CRL1548)、TCMK(ATCC CCL139)、人肺(ATCC HB8065)、NCTC1469(ATCC CCL9.1)以及DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,1980)、3T3细胞、Namalwa细胞、或者适于无血清培养基的BHK细胞(US6,903,069).
而且,更特别的,《转基因FVII》指的是通过在动物或者植物活体组织内的基因重组和表达获得的任何FVII。
本发明的二唾液酸化结构的比率能通过不同方法获得。
特别的,例如,本发明的FVII在能够传授所述的糖基化特征的微生物、细胞、植物或者动物内表达,所述的糖基化特征即为大部分为二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化结构。
更特别的,例如,本发明的FVII在不能获得主要为二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化结构的FVII合成物的微生物、植物或动物内表达,接着在体外使用一个或多个酶进行唾液酸化,以获得所需的唾液酸化,即二天线、二唾液酸化结构成为占大部分,三天线结构成为三唾液酸化结构。
例如,由于其良好的性质,在合适的条件下,唾液酸转移酶可以用来在体外作用FVII合成物,以获得需要的唾液酸化。因此,本发明的FVII合成物易于通过唾液酸转移酶对部分唾液酸化的FVII合成物(起始FVII合成物)进行作用获得。有利的,起始FVII合成物大部分为二天线、单唾液酸化聚糖结构。有利的,起始FVII合成物大部分为二天线、单唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构。唾液酸转移酶的作用允许在单唾液酸化结构上接枝一个另外的唾液酸,以将其转换成二唾液酸化结构。有利的,这些二天线、单唾液酸结构在起始FVII合成物中的比率高于40%,特别有利的,比率高于50%或者60%。有利的,起始FVII合成物中二天线、单唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构的比率高于20%,或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50%。
有利的,起始FVII合成物中至少部分唾液酸含有α2-6连接。特别有利的,含有α2-6连接的唾液酸的比率高于60%、或者高于70%、80%、或者90%。特别的,该比率在60-90%之间。
优选的,起始FVII合成物的所有唾液酸含有α2-6连接。
在一特别的实施例中,如果起始FVII合成物包含太多比率的岩藻糖基化结构,例如高于50%、或者高于60%,就有可能通过使用一个或多个允许对合成物去岩藻糖基化的酶而获得二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化结构。例如,使用岩藻糖基酶经过一段必须的时间,用于获得大部分为二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构。
特别有利的,根据其低的免疫原性而选择起始FVII合成物。
有利的,起始合成物为专利FR 0604872中所描述的FVII合成物,该专利也被视为包含在本申请文件中。
有利的,本发明的FVII是一种多肽,其肽序列可以是天然人类FVII的肽序列,即存在于人类中的与FVII相关的没有问题的序列。这样的序列能够被编码,例如通过EP 0200421所描述的序列1b进行编码。
有利的,本发明的FVII序列为SEQ ID NO:1序列.
在另一实施例中,本发明的FVII可以是天然人类FVII的变异体,只要该变异体不比天然FVII更免疫原性。因此,该变异体的肽序列能表现出与天然人类FVII至少70%、有利的为至少80%或90%、更有利的为至少99%的同一性,该变异体具有与人类FVII基本相同的生物活性。
而且,本发明的FVII还指的是经过修饰的任何FVII序列,与天然人类FVII相比,该蛋白的生物活性降低。例如,用于治疗或预防血栓形成的重组失活人类FVII,FFR-FVIIa(Holst et al.,Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.,1998Jun,15(6):515-520)。这些FVII为多肽,其氨基酸序列不同于人类FVII的序列,该区别为一个或多个氨基酸的插入、删除或替代。
本发明的FVII的生物活性能够通过使用FVII-缺陷血浆和凝血活酶测量FVII合成物引起血凝的能力而量化,例如US 5997864所描述的。生物活性通过与对照样品相比的凝血时间的减少来表达,转化为与含有1单元(1UFVII活性)/ml血清的标准人类血清对比的《FVII单元》。
本发明的FVII合成物具有接近于血浆FVII的糖基化特征。事实上,血浆FVII(或者血浆FVII合成物)的主要N-聚糖结构也是二天线、二唾液酸化结构。
有利的,本发明的FVII合成物中二天线、二唾液酸化结构(岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的)的比率高于30%、或者高于40%、或者高于50%。特别有利的,二天线、二唾液酸化结构的比率高于60%、或者高于70%、或者高于80%、或者高于90%。特别有利的,二唾液酸化结构(岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的)的比率在50%-80%之间,或者在60%-90%之间,优选的在70%-85%之间。
有利的,本发明的FVII合成物的岩藻糖比率高于20%,有利的在20%-50%之间。这一比率相当于测得的FVII合成物的所有聚糖结构的岩藻糖比率。
这一特征是本发明的FVII的优势之一。事实上,商购的重组FVII表现出100%的岩藻糖基化,而血浆FVII的岩藻糖基化比率大约为16%。因此,本发明的FVII的岩藻糖基化接近于血浆FVII的岩藻糖基化,这给本发明的FVII带来了无毒的优势。
有利的,本发明的因子VII合成物中至少部分唾液酸含有α2-6连接。特别有利的,含有α2-6连接的唾液酸的比率高于60%、或者高于70%、80%、或者90%。特别的,该比率在60-90%之间。
因此,本发明的FVII合成物的含有α2-6连接的唾液酸的比率不为0。而这在血浆FVII中也含有,相对于商购的重组FVII仅包含含有α2-3连接的唾液酸,这为本发明的一个优势。
本发明的一个特别优选的实施例中,本发明的FVII合成物中所有的唾液酸含有α2-6连接。
特别有利的,所有的唾液酸含有α2,6连接,即为所有的唾液酸都通过α2,6连接结合到半乳糖,而且,特别的至少90%的FVII的唾液酸含有α2,6连接。而且,本发明的FVII合成物包含含有α2-3连接的唾液酸。
事实上,合成物的FVII的唾液酸中含有α2,6分支是本发明FVII的优势之一。实际上,商购的重组FVII的唾液酸仅含有α2,3连接。血浆FVII是这两种异构体的混合物。这样,血浆FVII含有例如为40%的α2,3异构体和60%的α2,6异构体。然而,由于本发明的FVII含有更多的α2,6连接,这使得本发明的FVII更接近于血浆FVII。
在另一实施例中,本发明的FVII合成物的一些唾液酸含有α2-3连接。
因此,本发明的一个特别实施例中,合成物的重组或转基因FVII与所有聚糖结构结合到N-糖基化位点的因子VII相比,大部分二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构,且含有α2-6连接的唾液酸的比率高于90%。
本发明的一个特别优选的实施例中,合成物的重组或转基因FVII与所有聚糖结构结合到N-糖基化位点的因子VII相比,大部分二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构,且含有α2-6连接的唾液酸的比率为100%。
本发明的一个特别的实施例中,合成物的重组或转基因FVII与所有聚糖结构结合到N-糖基化位点的因子VII相比,大部分二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构,且FVII合成物的岩藻糖比率在20%-50%之间。
本发明的一个特别的实施例中,合成物的重组或转基因FVII与所有聚糖结构结合到N-糖基化位点的因子VII相比,大部分二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构,所有的唾液酸含有α2-6连接,且FVII合成物的岩藻糖比率在20%-50%之间。
有利的,本发明的FVII合成物易于通过非人类转基因哺乳动物生产。
因此,在这一实施例中,本发明的FVII合成物被认为为《转基因》。转基因哺乳动物指的是任何非人类哺乳动物,基因改变后用于表达一外源蛋白,例如兔、山羊、小白鼠、大鼠、牛、马、猪、昆虫、绵羊,该列举为非限制性的。外源蛋白为FVII,优选为人类FVII。非人类转基因哺乳动物除了表达FVII外,还能表达一外源酶,以对转基因FVII进行需要的唾液酸化。由于这个原因,非人类转基因动物能共同表达编码FVII的基因和编码唾液酸转移酶的基因。
本发明的一特别的实施例中,本发明的转基因FVII在转基因哺乳动物的乳腺中表达,并在其奶中生产。由于这个原因,转基因表达以组织依赖的方式,通过能保证在动物的乳腺中生产转基因的启动子实现。例如为WAP启动子(乳清酸蛋白)、酪蛋白启动子、尤其是β-酪蛋白或α-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、α-乳球蛋白启动子,该列举是非限制性的。
有利的,本发明的FVII合成物易于通过转基因雌兔生产,所述合成物还经受体外唾液酸化,以使其大部分为二天线、二唾液酸化结构。
由于兔对朊病毒不敏感,尤其是对可转移的海绵状亚急性脑病这一主要公共健康问题不敏感,因而兔是用于生产药用蛋白的特别有利的物种。
而且,兔和人之间的种间屏障也是重要的。相反,人和仓鼠之间的种间屏障的重要性要低,其中仓鼠是生产商购重组FVII的生物系统。
因此,在兔中生产FVII在防止致病剂转移的安全方面有优势,该致病剂包括非传统朊病毒致病剂。
本发明的一个优选实施例中,本发明的FVII为在转基因雌兔的乳腺中生产。
通过乳腺分泌感兴趣的蛋白,允许分泌物进入转基因哺乳动物的奶中,这对于本领域技术人员而言是公知的,其包含以组织依赖方式对重组蛋白表达的控制。
表达的组织控制是由于允许蛋白表达到动物的特定组织的序列而实现的。这些序列即为启动子序列以及信号肽序列。
驱动感兴趣蛋白在乳腺中表达的启动子例如为WAP启动子(乳清酸蛋白)、酪蛋白启动子、尤其是β-酪蛋白或α-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、α-乳球蛋白启动子,该列举是非限制性的。一个特别有利的方式,在雌兔乳腺中的表达是在β-酪蛋白启动子的控制下进行的。
在转基因动物奶中生产重组蛋白的方法包括下列步骤:包含编码人类FVII的基因的DNA分子的合成,该基因在天然分泌蛋白到奶中的启动子的控制下,集成到非人类哺乳动物的胚胎中。该胚胎接着被植入到相同种类的雌性哺乳动物中。一旦从胚胎获得的哺乳动物生长足够了,其会分泌乳汁,接着收集奶。奶中包含感兴趣的转基因FVII。
EP 0264166描述了在非人类雌性哺乳动物的奶中生产转基因蛋白的例子,其给出的教导可用于本发明FVII的生产。
EP 0527063描述了在非人类雌性哺乳动物的奶中生产转基因蛋白的另一个例子,其给出的教导可用于本发明FVII的生产。
在雌兔的乳腺中生产的FVII合成物的特征在于因子VII的至少部分唾液酸含有α2-6连接。
一个特别优选的方式,所有的唾液酸含有α2,6连接,尤其是,至少90%的FVII的唾液酸含有α2,6连接。而且,本发明的FVII合成物可以包含含有α2-3连接的唾液酸。
特别有利的,含有α2-6连接的唾液酸的比率高于60%、或者高于70%、80%、或者90%。特别的,该比率在60-90%之间。
在雌兔中表达的FVII合成物的二天线、单唾液酸化聚糖结构中,大部分是非岩藻糖基化的。有利的,这些二天线、单唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构在FVII合成物中的比率高于20%。有利的,这一比率高于25%、或者高于40%。
本发明的一个实施例中,本发明的合成物中FVII的岩藻糖基化比率在20-50%之间。本发明的另一实施例中,这一比率低于15%。
从雌兔种获得的转基因FVII包含数个翻译后修饰:前九个或十个N-端谷氨酸被γ-羧基化,Asp63(天冬酰胺63)被部分羟化,Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被氧-糖基化,并分别携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖成分,Asn145和Asn322主要通过二天线、单唾液酸化的聚糖复合结构而N-糖基化。
FR 0604872描述了在雌兔乳腺中生产这样的FVII合成物,其内容并入本教导中。
通过转基因哺乳动物在奶中生产FVII可以使用本领域公知技术来从奶中纯化。
例如,US 6,268,487中描述了从奶中纯化感兴趣蛋白的方法,该方法包括下列步骤:a)将奶通过具有足够孔隙度的膜进行切向过滤,以形成滞留物和透过物,透过物含有外源蛋白,b)对透过物用利用色谱的采集装置进行处理,以转移出外源蛋白并获得一流出物,c)合并流出物和滞留物,d)重复步骤a)到c)直到分离脂中的FVII、酪蛋白胶粒,并直到FVII应被回收至少75%。
申请人提交的FR 06 04864中描述了另一个从转基因哺乳动物的奶中生产的FVII的纯化技术,并引入其内容以供参考。对含在转基因动物奶中的FVII的提取和纯化方法(方法A),包含下列步骤:
a)从奶中提取FVII,因子VII与所述奶中钙的有机和/或无机盐和/或复合物相结合,通过向奶中加入可溶性盐来获得钙化合物沉淀,其阴离子具有能形成所述不溶钙化合物以用这种方式从所述盐和/或复合物中释放因子VII,因子VII存在于液相中;
b)把富含蛋白的液相从钙化合物沉淀中分离,所述液相再被分离成脂相和含有蛋白的水性非脂相;
c)对水性非脂相进行亲和层析步骤,该步骤使用预定浓度的基于磷酸盐的洗脱缓冲液;
d)对根据步骤c)获得的因子VII洗提液进行两次或三次弱碱性阴离子交换柱的层析步骤,使用适合于对保留在所述柱上的因子VII进行连续洗提的缓冲液。
事实上,申请人惊奇的注意到,即使置于在抗乳血清中天然生产的蛋白启动子的控制下,例如,在WAP启动子或β-酪蛋白启动子的控制下,FVII仍然易于与奶中的钙离子结合,并因此易于与酪蛋白胶束结合。
申请人提交的FR 06 11536中描述了另一个对从转基因哺乳动物的奶中生产FVII的纯化技术,并引入其内容以供参考。对含在转基因动物奶中的FVII的提取和纯化方法(方法B),包含下列步骤:
a)撇清并脱脂所述奶;
b)在能允许所述蛋白保留在所述载体上的pH条件下,将含有所述蛋白的撇清脱脂部分进行通过层析载体,该层析载体具有表现出疏水和离子特性的接枝配体;
c)蛋白的洗提;
d)通过从所述洗提部分中移除奶蛋白,对洗提部分进行纯化;并且
e)回收所述蛋白。
当通过转基因雌兔生产FVII合成物时,对其进行体外唾液酸化,以使二天线、二唾液酸化结构占多数。
在本发明的一个特别的实施例中,唾液酸化是通过使用唾液酸转移酶进行的,例如α2,6-(N)-唾液酸转移酶(或者β-D-半乳糖-β1,4-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖-α2,6-唾液酸转移酶)、或者半乳糖β1,3乙酰氨基半乳糖α2,3-唾液酸转移酶、或者半乳糖-β1,3(4)-乙酰氨基半乳糖-α2,3-唾液酸转移酶、或者乙酰氨基半乳糖α2,6-唾液酸转移酶I,这些酶都是商购的。
优选的,使用的唾液酸转移酶是一种能允许通过α2,6连接转移唾液酸的唾液酸转移酶。事实上,有利的,本发明的FVII合成物具有包含α2-6连接的唾液酸,因为该异构体在血浆FVII中更多。
唾液酸化可以使用唾液酸供体底物进行,例如,唾液酸或者任何含有一个或多个唾液酸基团并易于释放唾液酸基团的分子。
根据本发明的一个实施例,如果酶为α2,6-(N)-唾液酸转移酶,底物为胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸,该底物在一适合于唾液酸从唾液酸供体基团转移到FVII的反应介质中,二天线、二唾液酸结构成为主要。该反应介质可以为基于例如由吗啉-3-丙磺酸组成的缓冲液,以及基于例如为吐温的缓冲液。
根据本发明的另一个实施例,底物可以在反应介质中合成,该介质中包括胞苷单磷酸(CMP)-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及能使得反应发生的足够量的二价金属阳离子。例如,二价金属阳离子为钙离子、锌离子、镁离子、铬离子、铜离子、铁离子或者钴离子。
无论什么方法应用来实现FVII合成物的唾液酸化,反应总是在足够的时间和合适的条件下进行,以使得二唾液酸化结构增加到足够以占大多数。只供参考的是,反应可以至少进行0.5小时,且尤其是至少5小时,特别有利的是7小时、或者8小时、9小时、甚至10小时。优选的,培育在夜间进行。特别的,该反应进行的时间在5小时到12小时之间。
有利的,本发明的合成物的FVII是活化的(FVIIa)。
由于这个原因,跟据FVII(未活化的)代表FVIIa与组织因子的相互作用,FVIIa能表现出凝固能力高于FVII(未活化的)25-100倍。FVII体外的活化是通过用二硫键连接的两个链中的不同的蛋白酶(FIXa,FXa,FVIIa)对酶原的分裂得到的。FVIIa单独表现出非常弱的酶活性,但是和辅因子复合时,组织因子(TF)通过活化FX和FIX而触发凝固过程。FVIIa是负责止血的凝固因子,例如在带有循环抗体的血友病中。在一特别有利的方式中,本发明的FVII完全被活化。有利的,本发明的FVIIa包含数个翻译后修饰:前九个或十个N-端谷氨酸被γ-羧基化,Asp63被部分羟化,Ser52和Ser60被氧-糖基化,并分别携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖成分,Asn145和Asn322主要与二天线、二唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖复合结构而被N-糖基化。
FVII的活化也能由一体外的方法获得,例如,通过本发明的FVII的纯化(参见实施例2)。
因此,FVIIa由具有分子量约为20kDa的具有152个氨基酸的轻链、和分子量约为30kDa的具有254个氨基酸的重链组成,两条链通过单二硫键相互连接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。
因此,本发明的FVII是一种活化的FVII,其活性和结构接近于血浆FVII。
通过与组织因子(TF)的相互作用,FVIIa表现出的凝血凝力高于FVII25-100倍。
本发明的一个实施例中,FVII能被因子Xa、VIIa、IIa、IXa和XIIa体外活化。
本发明的FVII也能被其自身的纯化过程活化。
本发明的另一个目的是使用本发明的FVII合成物作为药物。
本发明的另一目的是将根据本发明的因子VII合成物用于制备用于治疗血友病病人的药物。
本发明的另一目的是将根据本发明的因子VII合成物用于制备用于治疗多出血性创伤的药物。
本发明的另一目的是将根据本发明的因子VII合成物用于制备用于治疗由于抗凝药过量而出血的药物。
本发明的另一目的是一种含有根据本发明的因子VII和赋形剂和/或药物可接受载体的药物合成物。
本发明的另一目的是用于制备重组或转基因因子VII合成物的方法,该合成物的每个因子VII分子包含连接到N-糖基化位点的聚糖结构,所述合成物的所有因子VII分子中,二天线、二唾液酸聚糖结构占大多数,包括一唾液酸化步骤,通过将如上所述的部分唾液酸化的转基因或重组因子VII合成物与唾液酸供体底物和唾液酸转移酶在合适的保留唾液酸转移酶活性的反应介质中接触,经过足够时间和在合适的允许从唾液酸供体底物向FVII转移唾液酸的条件下,所述二唾液酸化结构增长到足够占大多数。进行反应的条件如上和实施例中所述。
《部分唾液酸化》指的是FVII合成物的连接到N的聚糖结构未全被二唾液酸化,即有些结构为单唾液酸化。有利的,这些二天线、单唾液酸化结构的比率高于40%,特别有利的高于50%,或者高于60%。有利的,二天线、单唾液酸化、非岩藻糖基化聚糖结构的比率高于20%,或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50%。
有利的,唾液酸转移酶为α2,6-(N)-唾液酸转移酶(或者β-D-半乳糖-β1,4-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖-α2,6-唾液酸转移酶)、或者半乳糖β1,3乙酰氨基半乳糖α2,3-唾液酸转移酶、或者半乳糖-β1,3(4)-乙酰氨基半乳糖-α2,3-唾液酸转移酶、或者乙酰氨基半乳糖α2,6-唾液酸转移酶I。
优选的,使用的唾液酸转移酶是一种能允许通过α2,6连接转移唾液酸的唾液酸转移酶。事实上,本发明的FVII合成物具有包含α2-6连接的唾液酸是一种优势,因为该异构体在血浆FVII中更多。
唾液酸化能用任何唾液酸供体底物进行。
根据本发明的一个实施例,如果酶为α2,6-(N)-唾液酸转移酶,底物为胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸,该底物在一适合于唾液酸从唾液酸供体基团转移到FVII的反应介质中,二天线、二唾液酸结构成为主要。
反应介质可以是基于生物兼容的表面活性剂混合物,例如浓度为0.01%到0.2%的Tween80或TritonX-100或者上述的混合物,或者浓度为5mM-10mM之间的二价金属阳离子,优选的例如为Ca2+、Mn2+、Mg2+、或Co2+、Ca2+。该反应介质还能进一步包括离子强度调节剂和/或保持介质pH的试剂,例如从40mM到60mM之间不同浓度的二钾砷酸钠、吗啉-3-丙磺酸、Tris和NaCl。pH值典型的为6-7.5之间。反应介质能进一步包含浓度范围在0.05-0.15mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)。
根据另一实施例,底物可以在反应介质中通过向该介质中引入CMP-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及足够量的二价金属阳离子而合成,例子如上所述。
无论应用什么方法来实现FVII合成物的唾液酸化,反应总是在足够的时间和合适的条件下进行,以使得二唾液酸化结构增加到足够以占大多数,如前所定义。
当方法使用一固定化酶,反应时间优选在0.5-3小时之间,有利的,温度在4-37℃之间,优选的在4-20℃之间。
当方法在一间歇反应中进行,反应时间优选在1-9小时之间,优选的在1-6小时之间,反应温度有利的在4-37℃之间,优选的在4-20℃之间。
优选的,本发明的方法的目的是提高部分唾液酸化的转基因或重组因子VII合成物的生物处理能力。该生物处理能力的提高是通过将所述合成物与唾液酸供体底物、唾液酸转移酶接触而获得的,如前所阐述。
《提高生物处理能力》指的是与唾液酸化没有被修饰的相同的FVII合成物相比,FVII合成物的生物处理能力提高了至少5%、或者至少10%、或者有利的至少30%或50%、优选的至少80%或90%。
在另一特别的实施例中,在唾液酸化步骤之前,进行半乳糖基化步骤。该步骤的目的是在半乳糖-缺陷的结构上接枝半乳糖,半乳糖-缺陷的结构即为FVII的无半乳糖(agalactosylated)和单半乳糖结构,半乳糖被固定到GlcNAc上,并且易于在接下来的唾液酸化步骤中易于固定唾液酸残基。本领域技术人员公知的是,该半乳糖基化步骤可以通过使用半乳糖基-转移酶在包含UDP-gal尿苷(5′-二磷酸半乳糖)的反应介质中实现,
有利的,部分唾液酸化的FVII合成物的大部分聚糖结构是一复合的二天线、单唾液酸化型。
这些聚糖结构如下图所示:
以及
唾液酸
半乳糖
N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)
甘露糖
岩藻糖
本发明的一个特别的实施例中,部分唾液酸化的FVII合成物中还包括二天线非唾液酸化(岩藻糖基化或非岩藻糖基化)、三天线非唾液酸化(岩藻糖基化或非岩藻糖基化)、以及二唾液酸化(岩藻糖基化或非岩藻糖基化)的复合结构。
有利的,在部分唾液酸化的FVII的合成物的二天线、单唾液酸化聚糖结构中,大部分聚糖结构是非岩藻糖基化的。
有利的,部分唾液酸化的FVII合成物表现出至少部分唾液酸包含α2-6连接,如前所述。
优选的,方法还包括在唾液酸化步骤之前的,通过转基因雌兔生产部分唾液酸化的转基因FVII合成物的步骤。该步骤也如前所述。该步骤还可以在半乳糖基化步骤之前进行。
有利的,部分唾液酸化FVII合成物的FVII是活化的。
本发明的方法允许获得在所述合成物的所有FVII分子中二天线、二唾液酸化结构占大多数。
有利的,唾液酸供体基团是胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸,唾液酸转移酶是α2,6-(N)-唾液酸转移酶。
这样的部分唾液酸化FVII合成物可以是在转基因雌兔的乳腺中生产的转基因FVII合成物。
特别有利的,部分唾液酸化的FVII合成物为专利FR 0604872中所描述的合成物,该专利的内容也被视为包含在本申请文件中。
本发明优势的更多方面将在下列实施例中描述,这些实施例仅用于阐述本发明,而不构成对本发明的任何限制。
缩略语
FVII-Tg=FVIIa-Tg:根据本发明的活化的转基因FVII
FVII-r=FVIIa-r:商购的重组活化FVII
FVII-p=FVIIa-p:血浆来源的活化的FVII,即从人类血浆中纯化得到的
MALDI-TOF:基质辅助激光解析电离-飞行时间
HPCE-LIF:高效毛细管电泳-激光诱导荧光
ESI-MS:质谱-电离《电喷雾》
LC-ESIMS:液相色谱-质谱-电离《电喷雾》
NP-HPLC:正相高效液相色谱
PNGase F:肽:N-糖苷酶F
LC-MS:液相色谱-质谱
附图说明
图1:对实施例1中获得的FVII合成物的提取与纯化
图2:携带N-糖基化位点的肽的去卷积(deconvoltuted)质谱ESI
图3:通过PNGase F对FVII去糖基化之后的HPCE-LIF的电泳图谱
图例:顶端电泳图:FVIIa,p;两条中央电泳图谱:FVII-Tg;底端电泳图:FVIIa,r
图4:用NP-HPLC得到的FVII特征;
图例:最上面色谱图:FVIIa,p;中间色谱图:FVII-Tg;底端色谱图:FVIIa,r
图5:使用MALDI-TOFMS对FVII-Tg的主要聚糖结构的鉴定
图6:使用MALDI-TOFMS对FVIIa,r的主要聚糖结构的鉴定
图7:体外再次唾液酸化的HPCE-LIF分析天然FVII-Tg的寡糖图(底端);再次唾液酸化后的FVII-Tg的寡糖图(顶端)
图8:根据二天线二唾液酸化非岩藻糖基化(A2)的和岩藻糖基化的(A2F)结构随时间的百分比的FVII-Tg唾液酸化动力学
图9:在兔中初步PK(药代动力学)比较研究的结果:转基因非唾液酸化FVII(FVIITgNRs)与转基因唾液酸化FVII(FVIITgRS)比较:消除的半对数曲线
具体实施方式
实施例1:在转基因雌兔的奶中生产人类FVII蛋白
首先,通过将WAP基因序列引入(在文件Devinoy et al,Nucleic AcidsResearch,vol.16,no.16,25August1988,p.8180中描述)到p-poly III-I载体的多连接子中(在文件Lathe et al,Gene(1987)57,193-201中描述)而制备质粒p1。
从质粒p1获得的质粒p2,包含兔的WAP基因启动子和人类FVII的基因。
转基因雌兔通过传统的显微注射技术(Brinster et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,4438-4442)获得。包含500份基因拷贝的1-2p1被注入鼠胚胎的雄原核中。包含重组基因的该质粒的Not 1-Not 1片段被显微注射。之后,胚胎被转移到激素制备的继承性雌性的输卵管中。约10%的被操作的胚胎产生幼兔,而2%到5%的被操作的胚胎产生转基因的幼兔。转基因的存在通过对提取自兔尾的DNA进行Southern转换技术来显示。动物血液中以及奶中FVII的浓度通过特异性放射免疫检测得到计算。
FVII的生物学活性通过将奶加入到细胞培养介质或者兔哺乳动物外植体培养介质中而进行评估。
实施例2:对获得的FVII的提取和纯化
a)FVII的提取
取500ml全原奶,用9倍体积的0.25M、pH8.2的磷酸钠稀释。室温下搅拌30分钟后,对富含FVII的水相在15℃下10000g离心1小时(离心机SorvallEvolution RC-6700rev/min-转子SLC-6000)。约835ml的6罐是必需的。
离心后,存在三个相:在表层的脂相(乳脂),清澈富含FVII的水性非脂相(主要相)以及剩余的白色固相(不溶性酪蛋白和钙化合物沉淀)。
通过蠕动泵收集富含FVII的水性非脂相,直至脂相。脂相单独回收。固相(沉淀)被去除。
然而,水性非脂相仍然含有非常少量的脂,对其通过一系列过滤器进行过滤(Pall SLK7002U010ZP-孔径为1μm的玻璃纤维预滤器-之后PallSLK7002NXP-孔径为0.45μm的尼龙66)。在过滤的最后,脂相通过该过滤系列,奶中的脂肪球被完全截留,且滤出液是清澈的。
过滤过的非脂水相接着在超滤膜上进行透析(Millipore Biomax50kDa-0.1m2)以使其与层析相相容。分子量约为50kDa的FVII不滤过该膜,这与奶中的盐、糖以及肽不同。第一时间内,溶液(约5000ml)被浓缩到500ml,接着维持这个恒定体积,通过超滤膜透析以去除电解质,并制备用于层析步骤的生物材料。透析缓冲液是0.025M的磷酸钠缓冲液,pH8.2。
含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含FVII-tg的抗乳血清中。该制备物在后继处理前被保存于-30℃。
这步的FVII的总回收率非常令人满意:90%(用磷酸盐提取91%+透析/浓缩99%)。
这一步得到的包含FVII的非脂水相完全清澈,并适于后续层析步骤。
在这一步中,提取了大约93000IU的FVII-Tg。制备的FVII的纯度在0.2%的级别。
b)FVII的纯化
1.羟磷灰石胶上的层析(亲和层析)
用BioRad陶瓷羟磷灰石I型胶(CHT-I)填充Amicon90柱(直径9cm-横截面64cm2)。
该胶用水性缓冲液A平衡,A由0.025M磷酸钠和0.04氯化钠的混合物组成,pH8.0。存于-30℃的所有制备物用水浴在37℃解冻,直到冰块完全溶解,接着注入到胶上(直线流动速率100cm/h,即105ml/min)。未保留的部分利用缓冲液的通过而去除,直到回到基线(RBL),该缓冲液由0.025M磷酸钠和0.04M氯化钠组成,pH8.2。
含有FVII-Tg部分用缓冲液B实施洗提,该缓冲液由0.25M磷酸钠和0.4M氯化钠组成,pH8.0。收集洗提部分,直到回到基线。通过波长(λ)为280nm处的吸收测量检测该化合物。
该层析可以回收超过90%的FVII-Tg,同时去除超过95%的乳蛋白。该特异活性(S.A.)增加了25倍。在这一步,可获得约85000IU的FVII-Tg,纯度为4%。
2.100kDa切向过滤以及50kDa浓缩/透析
前一步骤得到的所有的洗提液在切向模式下通过100kDa超滤膜(PallOMEGA SC100K-0.1m2)过滤。FVII滤过100kDa的膜,同时分子量超过100kDa的蛋白不能滤过。
之后,滤过的部分被进一步浓缩到约500ml体积,接着如前所述,在50kDa的超滤器上透析。透析缓冲液使用0.15M的氯化钠。
在这阶段的处理中,产品在进行离子交换层析前被保存于-30℃。
这一阶段可以减少分子量超过100kDa蛋白的量,并且尤其是酶前体。在100kDa膜上的处理可以截留留约50%的蛋白,其中为高分子量蛋白,同时滤过95%的FVII-Tg,即滤过82000IU的FVII-Tg。
该处理可以减少后续步骤中的蛋白酶水解的风险。
这在离子交换胶Q-SepharoseFast Flow(QSFF)上进行的连续三步层析是为了对活性成分进行纯化,以允许将FVII活化为活化FVII(FVIIa),以及最终浓缩并制备为FVII合成物。通过波长(λ)为280nm处的吸收测量检测该化合物。
用100ml Q-SepharoseFF胶(GE Healthcare)填充一直径2.6cm(横截面5.3cm2)的柱。
该胶用0.05M、pH7.5的Tris缓冲液平衡。
保存于-30℃的所有部分在37℃水浴中解冻,直到所有冰块都溶解。该部分先用平衡缓冲液稀释到1/2[v/v],再注入到胶(流速13ml/min,即直线速度150cm/h),未保留部分随后随缓冲液的通过去除,直到RBL。
对具有低FVII含量的第一蛋白部分用0.05M的Tris和0.15M氯化钠、pH7.5的缓冲液以9ml/min(即100cm/h)洗提,并随后被去除。
用0.05M的Tris和0.05M氯化钠和0.05M氯化钙、pH7.5的缓冲液对富含FVII的第二蛋白部分以9ml/min(即100cm/h)洗提。
如前所述,对该第二部分在50kDa的超滤器上进行透析。透析缓冲液为0.15M的氯化钠。该部分在第二次通过阴离子交换层析前在夜间被存储于+4℃。
这一步可以回收73%的FVII(即60000IU的FVII-Tg),同时消除80%的结合蛋白。这一步还使得将FVII活化成FVIIa。
用30ml Q-SepharoseFF胶(GE Healthcare)填充一直径2.5cm(横截面4.9cm2)的柱。
该胶用0.05M、pH7.5的Tris缓冲液平衡。
先对存储于+4℃的先前的洗提部分(第二部分)进行稀释,再将其注入到胶上(9ml/min,即直线流速100cm/h)。
在注入第二部分后,对该胶用平衡缓冲液冲洗以去除不保留的部分,直到RBL。
对含有非常高纯度FVII的部分用0.05M的Tris、0.05M氯化钠和0.005M氯化钙、pH7.5的缓冲液以4.5ml/min(即50cm/h)洗提。
约23000IU的FVII-Tg被纯化,即12mg的FVII-Tg。
这一步可以消除超过95%的结合蛋白(雌兔奶蛋白)。
该纯度高于90%的洗提液表现出的结构与功能特征接近天然人类FVII分子。该洗提液在第三次离子交换层析时被浓缩和制备。
用10ml Q-SepharoseFF胶(GE Healthcare)填充一直径2.5cm(横截面4.9cm2)的柱。
该胶用0.05M、pH7.5的Tris缓冲液平衡。
在注入所述部分后,对该胶用平衡缓冲液冲洗以去除不保留的部分,直到RBL。
前一步骤中洗提、纯化的部分用注射用纯水(PWI)稀释五倍,然后注入到胶中(流速4.5ml/min,即直线速度50cm/h)。
之后,用0.02M的Tris和0.28M氯化钠、pH7.0的缓冲液以3ml/min(即36cm/h)对FVII-Tg进行洗提。
纯度高于95%的FVII-Tg合成物被制备出来。该产品适于静脉注射。该方法累积产率为22%,因此每升被处理的奶可以纯化出至少20mg的FVII。
表A再现了根据本发明一优选实施例用于生产纯化FVII合成物的方法步骤,并提供了每步获得的不同产率、纯度和特异活性。
然后,对FVII-Tg合成物进行不同的结构分析,例如下列实施例所示。
实施例3:通过MS-ESI对糖基化位点和糖肽进行表征
通过LC-ESIMS(/MS)鉴别FVII-Tg、FVIIa,p(血浆FVII)以及FVIIa,r的N-糖基化位点,通过MALDI-TOFMS进行证实,通过LC-ESIMS对每个位点的不同聚糖的相对比例进行确定。
图2描述了包含两个糖基化天冬酰胺残基的糖肽的去卷积ESI光谱。通过MALDI-TOF(/TOF)和Edman测序对糖基化位点的位置进行确认。
对分别表现出N-糖基化位点Asn145和Asn322的FVIIa,p的糖肽[D123-R152]和[K31.6-R353]的质谱分析显示存在二天线的、二唾液酸的、未岩藻糖基化结构(A2)(观察到的含有Asn145的糖肽质量:5563.8Da)以及岩藻糖基化结构(A2F)(观察到的带有Asn145的糖肽质量:5709.8Da)。同样注意到,Asn145存在三天线的、三唾液酸的、未岩藻糖基化(A3)(观察到的质量:6220.0Da)和岩藻糖基化(A3F)(观察到的质量:6366.1Da)。
对于转基因FVIIa,p,Asn145被A2F、A1F型聚糖所修饰,“A1F”对应于其他天线带有GalNAc端位置的单唾液酸化结构。注意到有聚糖A3F(三天线、三唾液酸化、岩藻糖基化结构)的存在。
对于FVII-Tg,对分别带有N-糖基化位点Asn145和Asn322的FVII-Tg的糖肽[D123-R152]和[K31.6-R353]的质谱分析显示存在着二天线的、二唾液酸的、未岩藻糖基化的结构(A2)(观察到的含有Asn145的糖肽质量:5563.8Da)和岩藻糖基化结构(A2F)(观察到的质量:5709.7 Da)。位于Asn145的大部分寡糖为二天线、单唾液酸、非岩藻糖基化结构(A1)(观察到的质量:5272.3Da)和岩藻糖基化结构(A2F)(观察到的质量:5418.7Da)。三天线结构几乎不存在。需要注意的是在其他天线的端位置没有带有GalNAc的单唾液酸化结构存在。
关于Asn322的主要糖型,可以观察到不同比例的相同聚糖结构。图1显示与Asn145相比,成熟结构较少(较少天线和唾液酸的)。例如,对于血浆产物,在Asn322上三天线的结构比在Asn145上出现的少,而对于FVIIa,r和FVII-Tg,则没有。应当注意的是,Asn145和322被100%糖基化。虽然是半定量的,这些结果与通过HPCE-LIF和NP-HPLC获得的定量数值是一致的。
实施例4:利用HPCE-LIF对N-聚糖定量
在用PNGase F去糖基化后,通过HPCE-LIF对N-连接寡糖进行识别和量化。FVII样品用外切糖苷酶(唾液酸酶(酶/底物比例为1mIU/10μg)、半乳糖苷酶、乙酰氨基己糖苷酶(Prozyme试剂盒)、岩藻糖苷酶(酶/底物比例:1mUI/10μg)以一定方式处理,以保证对每个独立的结构进行识别和量化。所获得的聚糖用荧光染料标记,并根据其质量和电荷进行分离。两个标准(葡萄糖均聚物和寡糖)可以用来识别结构。通过累计每个峰对所有量化的寡糖的比例而进行量化。
使用了毛细管电泳设备ProteoLab PA800(Beckman-Coulter),其毛细管为50cm×50μm内径的N-CHO《涂层》(Beckman-Coulter)。还使用了《胶缓冲液-N》(Beckman-Coulter)分离缓冲液。在20℃、电压为25kV下进行迁移20分钟。通过使用λ激发488nm和λ发射520nm的激光进行检测。
在同时用唾液酸酶、半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶去糖基化后,根据“核”和岩藻糖基化“核”的峰区域之间的关系来计算岩藻糖基化的比率。
FVIIa,p中大部分聚糖为二天线的、二唾液酸化、非岩藻糖基化类型(A2)以及二天线的、二唾液酸的、岩藻糖基化类型(A2F)。FVII-Tg的聚糖结构显示存在着二天线、单唾液酸、岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的结构类型(A1F,A1),以及存在着二天线的、二唾液酸的、岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的类型(A2F,A2)。在这些不同结构之间,分布不同。
FVIIa,r表现出大部分为A2F结构的二天线、唾液酸化的、岩藻糖基化聚糖结构和二天线、单唾液酸化的、岩藻糖基化结构(A1F)对于A2F和A1F结构,可以观察到与这些结构的通常迁移时间相比的非典型的迁移时间。
两批(A和B)FVII-Tg的聚糖结构(参见图3-在中间的两个电泳图谱)显示存在着二天线、单唾液酸、岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的结构类型(A1F,A1),以及存在着二天线的、二唾液酸的、岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的类型(A2F,A2)。
表1.FVII的不同批次的从天然样品获得的唾液酸化结构的百分比的汇总
不同聚糖结构(表1)的量化分析显示,对于FVIIa,p,其唾液酸化的结构的主要形态为约51%的二唾液酸化聚糖(A2和A2F)以及30%三天线的、唾液酸化的、未岩藻糖基化的和岩藻糖基化的结构(G3和G3F)(结果未显示)。FVII-Tg(A批和B批)与FVIIa,p相比,较少的被唾液酸化,35%为二天线的、二唾液酸化的结构而只有6%为三天线的,唾液酸化结构(结果未显示)。主要结构是单唾液酸化的,其中50%具有A1和A1F结构。同样,FVIIa,r与FVIIa,p相比较少的被唾液酸化,其45%为A2F结构,而仅6%为三天线的、唾液酸化的聚糖(结果未示出)。没有发现FVIIa,r的非岩藻糖基化结构。
表2.不同FVII的岩藻糖基化比率
结果显示FVIIa,p岩藻糖基化比例低(16%),对于FVII-Tg,岩藻糖基化的比例从24到42%,而对于FVIIa,r则是100%的岩藻糖基化了。
实施例5:利用NP-HPLC对N-聚糖定量
通过NP-HPLC对FVIIa,p、FVIIa,r以及FVII-Tg的N-糖基化进行了定性和定量分析(参见图4)。对蛋白进行脱盐和干燥后,通过本领域公知的方法对该蛋白进行变性和简化。然后,在酶促反应中释放聚糖,并通过乙醇的沉淀进行纯化。获得的聚糖用荧光2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记。所标记的聚糖根据其亲水性通过正相HPLC用4.6x250mm氨基-80柱(Tosohaas)在30℃恒温下分离。
在注入样品前,对柱用80%乙腈缓冲液平衡。对寡糖用逐渐增加的50mM、pH4.5甲酸铵在等于或大于140分钟的时间内洗提。通过λ激发为330nm和λ发射为420nm荧光测定法进行检测。
FVIIa,p的色谱图显示主要的聚糖是二天线的、二唾液酸化的类型(A2),其比率为39%。同时观察到了较低的量的二天线的二唾液酸化的岩藻糖基化形式(A2F)、单唾液酸化形式(A1)、以及三唾液酸化的岩藻糖基化的和未岩藻糖基化的(A3F和A3)形式。
对FVII-Tg用NP-HPLC进行的分析证实了存在的主要寡糖是A1类型的,比例高达27%。A1F、A2和A2F的结构较少,而三天线的结构仅以痕量存在。这显示FVIIa,p和较少唾液酸化的因子FVII-Tg(B批)之间唾液酸化上的差异。
对因子FVIIa,r的同样的分析表明,主要形式A2F的量为30%。存在的A1F的结构较少,而三天线的结构仅以痕量存在。对FVIIa,r的分析同样表明A1F和A2F结构的保留时间的重要时间延迟,这表明该结构不同于FVIIa,p和FVII-Tg中的结构。
这些结果与那些通过HPCE-LIF获得的结果一致。
实施例6:用MALDI-TOFMS鉴定
质谱MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱)是一种可以精确测量肽、蛋白、聚糖、寡糖以及大部分可电离的聚合物的分子量的技术。
将要分析的肽、蛋白和聚糖与基质相混合,基质吸收所使用激光的波长。对于肽分析,主要的基质是α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA),对于蛋白分析,是芥子酸(SA),对于寡糖分析,是2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。
该方法包含用脉冲激光照射基质/被分析物的共晶,导致基质和被分析物分子的解吸附。在气相电离后,被分析物分子在飞行时间内穿过检测器。由于质量和飞行时间是直接相关的,检测后者可以确定目标被分析物的质量。通过将观测到的质量测量与理论质量相比而实施鉴定。基于所获得的离子碎片在MS/MS模式下进行排序。所使用的装置是Bruker Autoflex2,在TOF和TOF/TOF模式下工作。
为了鉴定存在于FVII-Tg和FVIIa,r的聚糖结构,对通过制备型NP-HPLC所获得的洗提部分进行MALDI-TOF MS分析。
对FVII-Tg进行MALDI-TOF分析可以证实对用NP-HPLC分离的聚糖的鉴定,即大部分单唾液酸化的A1结构和少量的A1F、A2F以及A2类型结构。
本研究还可以确定三天线二唾液酸化的和三唾液酸化的少数结构、杂交结构和Man5和Man6-P-HexNAc类型的寡糖(参见图5)。
对FVIIa,r进行的MALDI-TOF MS分析表明存在着如图6所示的聚糖结构。因子FVIIa,r近乎完全岩藻糖基化,而FVII-Tg仅部分岩藻糖基化。大部分聚糖结构是A2F,通过NP-HPLC量化的比率为30%。鉴别出二天线单唾液酸化岩藻糖基化结构(A1F)以及在端位置含有GalNAc的其他天线结构,中性二天线岩藻糖基化结构,在一个和/或两个天线带有Hex-NAc-HexNAc部分。还注意到有三天线、三唾液酸化、岩藻糖基化聚糖结构的存在。非岩藻糖基化结构以痕量存在。
实施例7:对唾液酸-半乳糖连接的HPCE-LIF分析
关于唾液酸-半乳糖连接(“分枝”)研究,实验步骤与在实施例4中描述的相似。在用PNGaseF去糖基化后,对寡糖用特异性外切唾液酸酶处理,来保证对连接进行鉴定和对每个单独结构的量化。所使用的唾液酸酶是来自S.pneumoniae(对于α2-3连接有特异性,0.02IU,E/S=0.4m/m),C.perfringens(对α2-3和α2-6连接有特异性,0.04IU,E/S=0.1m/m)以及A.urefaciens(可以水解α2-3、α2-6、α2-8和α2-9连接,0.01IU,E/S=0.05m/m)的重组酶。
通过分析显示,FVIIa,r具有二天线、唾液酸化的、岩藻糖基化的聚糖结构,主要是A2F以及二天线的、单唾液酸化的、岩藻糖基化的(A1F)结构。对于这些A2F和A1F结构,可以观察到与这些结构的通常迁移时间相比的非典型的迁移时间。尤其是,这些唾液酸化的寡糖结构在HPCE-LIF和NP-HPLC中表现出与FVII-Tg相比具有非典型性迁移时间。另一方面,对单糖合成物的分析没有显示任何特别的与Neu5Ac不同的唾液酸,而质谱工具分析显示聚糖具有与二唾液酸化类型一致的质量。最后,FVIIa,r聚糖的去唾液酸化可以发现其层析与电泳行为与FVII-Tg的寡糖的相同。
因此这些在电泳和层析行为上的差异可用唾液酸的不同分枝来解释。用HPCE-LIF和MS对该假设通过不同途径进行评估。
结果如表3所示。
表3:不同批次的FVII上唾液酸的分枝
该结果显示在两种FVII水平上显著的唾液酸异构。事实上,FVIIa,r的唾液酸包含α2-3连接,而FVII-Tg表现出α2-6分枝。
FVIIa,r的聚糖与FVII-Tg相比,在HPCE-LIF和NP-HPLC中行为的差异,与在唾液酸水平上的异构差异相关。
实施例8:FVII-Tg的体外再唾液酸化
文献(Zhang X.et al,Biochim.Biophys.Acta1998,1425;441-52)提到了糖蛋白更完全的唾液酸化有助于提高体外和体内的稳定性。该研究的目的是为了阐述体外唾液酸化的可行性。
通过使用α2,6-(N)-唾液酸转移酶(rat,Spodotera frugiperda,S.A.≥1单位/mg(S.A.:特异活性),41kDa,Calbiochem)以及底物胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(Calbiochem)来进行再唾液酸化。这两种试剂由于其不稳定性而储存于-80℃。唾液酸化底物(胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸)和酶α2,6-(N)-唾液酸转移酶在夜间37℃下在反应缓冲液中混合。所用的反应缓冲液是50mM的吗啉-3-丙磺酸、0.1%的Tween80、0.1mg/mlBSA(牛血清白蛋白),pH调整到7.4(Sigma试剂)。
实验条件如下表4所示。
表4:实验条件汇总
天然FVII-Tg的电泳图谱表明大部分结构为二天线、单唾液酸化A1结构(42%),少量的A2、A2F和A1F结构。天然FVII-Tg例如为实施例的纯化后获得的(图7,最下面的图)。再唾液酸化后(图7,上面的图),存在着的单唾液酸化结构仅6%,二唾液酸化结构,尤其是非岩藻糖基化的变得占大多数(52%)。
再唾液酸化前后的聚糖的量化结果如下表5所示。
表5:唾液酸化前后的寡糖结构的量化
转基因FVII的唾液酸化动力学如图8所示。
该研究表明再唾液酸化的效率为二唾液酸化结构的比率增长了超过100%。
实施例9:对从实施例8中获得的转基因非再唾液酸化FVII(FVII Tg NRS)与转基因再唾液酸化FVII(FVII Tg RS)在兔中的药代动力学比较研究。
本研究的目的是在新西兰雄兔中对FVII-TgRS和FVII-TgNRS进行药代动力学曲线比较研究。
试验剂量是每动物200μg/kg,是重组FVII施加到人类的药物剂量双倍。
在J-4(注射前4天)和J1(注射当天)的T0.17h(注射当天,注射后10分钟)、T0.33h(注射当天,注射后20分钟)、T1h(注射当天,注射后1小时)、T3h(注射当天,注射后3小时)、T6h(注射当天,注射后6小时)、T8h(注射当天,注射后8小时)进行采血。
FVII:Ag的剂量用ELISA方法(Asserachrom试剂盒)测量。兔血液中FVII:Ag的剂量结果一方面可以用来确定去除曲线,另一方面可以确定药代动力学参数。药量学组和实验组如表6所示。
表6:药量学和实验组
NA:没有应用
去除曲线如图9所示。
结果如表7所示。
表7:结果
两组实验的施加剂量、去除半衰期、平均停留时间(MRT)、最大浓度(Cmax)以及回收率(《回收》)都是可比的。
FVII-TgRS表现出的动力学曲线不同于FVII-TgNRS。对FVII-Tg的再唾液酸化非显著的提高了半衰期、平均停留时间(MRT)、Cmax以及《回收》。
AUC参数水平(峰面积)、Cl(清除)以及分布体积(Vd)(用血浆浓度除以施加或吸收剂量而获得)的差异表明从血液循环中清除FVII-TgRS不重要。
FVII-Tg的再唾液酸化提高了产品的生物处理能力大约30%。
表A
Claims (16)
1.一种重组或转基因因子VII合成物,该合成物的每个因子VII分子含有结合到N-糖基化位点的聚糖结构,其特征在于:所述重组或转基因因子VII合成物通过α2-6-(N)-唾液酸转移酶对因子VII起作用进行再唾液酸化的方式获得,在所述合成物的所有因子VII分子中,超过30%的结合到因子VII的N-糖基化位点的聚糖结构为二天线、二唾液酸、非岩藻糖基化聚糖结构,而且所述合成物的因子VII的所有唾液酸包含α2-6连接。
2.根据权利要求1所述的合成物,其特征在于二天线、二唾液酸化、岩藻糖基化和非岩藻糖基化结构的比率高于50%。
3.根据权利要求1所述的合成物,其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中,岩藻糖比率在20%-50%之间。
4.根据权利要求1或3中所述的合成物,其特征在于所述因子VII是活化的。
5.一种权利要求1-4中任一所述的合成物用于制备药物的用途。
6.根据权利要求5所述的合成物用于制备药物的用途,其特征在于所述药物为治疗血友病病人的药物。
7.根据权利要求5所述的合成物用于制备药物的用途,其特征在于所述药物为治疗多出血性创伤的药物。
8.根据权利要求5所述的合成物用于制备药物的用途,其特征在于所述药物为治疗由于抗凝剂过量而出血的药物。
9.一种药物组合物,包含根据权利要求1中所定义的因子VII合成物、和赋形剂和/或药学上可接受的载体。
10.一种用于制备重组或转基因因子VII合成物的方法,该合成物的每个因子VII分子包含连接到N-糖基化位点的聚糖结构,所述合成物的所有因子VII分子中,二天线、二唾液酸聚糖结构占30%以上,其中所有唾液酸为α2-6连接,该方法包括一唾液酸化步骤,通过将部分α2-6唾液酸化的、所有唾液酸为α2-6连接的转基因或重组因子VII合成物与唾液酸供体底物和α2-6-(N)-唾液酸转移酶在合适的能保留α2-6-(N)-唾液酸转移酶活性的反应介质中接触,经过足够时间和在合适的条件下,以使得唾液酸从唾液酸供体底物向因子VII转移,并使得所述的二唾液酸化结构足够增长至所有的二唾液酸化结构均为α2-6连接。
11.根据权利要求10所述的方法,其中在唾液酸化步骤之前,先进行半乳糖基化步骤,用于在半乳糖-缺陷结构上接枝一半乳糖,该半乳糖-缺陷结构表示因子VII的无半乳糖和单半乳糖结构。
12.根据权利要求10所述的方法,其特征在于所述部分α2-6唾液酸化的因子VII的合成物表现出50%以上为二天线、α2-6单唾液酸化聚糖结构。
13.根据权利要求10所述的方法,其特征在于所述的部分α2-6唾液酸化的因子VII的合成物的二天线、单唾液酸化聚糖结构中,50%以上聚糖结构是非岩藻糖基化的。
14.根据权利要求10所述的方法,其特征在于在唾液化步骤之前,还包括通过转基因雌兔生产部分α2-6唾液酸化的转基因因子VII的合成物的步骤。
15.根据权利要求10所述的方法,其特征在于所述部分唾液酸化的因子VII的合成物中的因子VII是活化的。
16.根据权利要求10所述的方法,其特征在于所述唾液酸供体底物是胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸。
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