CN103408655B - 重组或转基因因子vii合成物，每个因子vii分子有两个带有定义了聚糖单元的n－糖基化位点 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组的或转基因的因子VII的合成物，该因子VII合成物的每个分子均表现出两个N－糖基化位点，其中，在FVII合成物的所有分子中，所包含的Galα1,3Gal聚糖部分的比例在0到4％之间。本发明还涉及制备这样的FVII合成物的方法。
Description
本申请是申请日为2007年5月31日、申请号为200780020263.7、发明名称为“重组或转基因因子VII合成物，每个因子VII分子有两个带有定义了聚糖单元的N-糖基化位点”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种以因子VII合成物形式获得的重组的或转基因的因子VII，因子VII的每个分子具有两个带有所定义聚糖部分的N-糖基化位点，以及其作为药物的使用。
背景技术
因子VII(FVII)是一种依赖于维他命K的糖蛋白，在其活化形态(FVIIa)下参与凝血过程，在存在钙和组织因子的情况下活化因子X和因子IX。FVII以具有406个氨基酸残基的单肽链形态分泌，其分子量约为50kDa。FVII包含四个特别的结构域：N端γ-羧基域(Gla)，两个“类表皮生长因子(EGF)”域，以及丝氨酸蛋白酶域。将FVII活化为FVIIa是以精氨酸152-异亮氨酸153域(精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解为特征的。因此，FVIIa是具有分子量约为20kDa，具有152个氨基酸的轻链，和分子量约为30kDa，具有254个氨基酸的重链的化合物，两条链通过单二硫键相互连接(半胱氨酸135-半胱氨酸 262)。
血浆FVIIa包含几种翻译后修饰：前十个谷氨酸是γ-羧基化的，天冬酰胺 63部分羟化，丝氨酸52(丝氨酸52)和丝氨酸60(丝氨酸60)被氧-糖基化，并携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖模型，分别地，天冬酰胺145(天冬酰胺145)和天冬酰胺322(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated)的复合结构而N-糖基化。
FVII是用于治疗血友病病人的，表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失，对于病人表现出凝血因子的其他缺失，例如，FVII的 先天性缺失。因此获得可注射的FVIIa浓缩物是必需的。
获取FVIIa浓缩物的最古老的方法包含从血浆蛋白质中提纯由分馏所产生的FVIIa。
出于那个目的，文件EP0346241描述了FVIIa富集部分的制备，其在吸附后获得，接着洗提血浆蛋白质分馏第二产物，其包含FVII和FVIIa以及其他蛋白质，例如因子IX(FIX)，X(FX)和II(FII)，尤其是PPSB(P＝凝血素或FII，P＝转变加速因子前体或FVII，S＝司徒(Stuart)因子或FX，以及B＝抗血友病因子B或FIX)的预洗提液。这种方法的缺点是获取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。
同样的，文件EP0547932描述了基本上无维他命K依赖因子的高纯度FVIIa浓缩物和FVIII的制造方法。通过这种过程获得的FVII，不管其纯度，仍表现出残留的凝血酶原活性。
这样一来，这些方法的主要缺点之一是它们只产生少量的产品。此外，还难以获得完全无血浆中存在的其他蛋白质的产品。最后，虽然已在制备血浆凝血因子的每个阶段都采取了一系列措施来保证其病毒和细菌安全性(追踪献血者，为探测已知病毒性和细菌性污染物进行测试，严格纯化以及病毒失活处理来尽量减少血液起源的病原体的危害)，然而，病原体污染的风险并没有完全被排除。另外，克-雅病新变体的出现引发了对通过血液产品中非传统病原体传播的恐惧。而且，从献血者那所获得血浆的体积仍然受限。
因此，自从二十世纪八十年代，编码人体因子VII的DNA被分离(Hagen et al.(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Apr83(8)：2412-6)，并在哺乳动物BHK细胞(幼仓鼠肾)中进行表达(文件EP0200421)。即使这种制造FVII的方法具有控制感兴趣蛋白质生产媒介的优势，已知仓鼠细胞告知了其表达的Galα1，3Gal部分的蛋白质(Spiro RG et al，J.Biol.Chem，1984，vol.259，N° 15，9858 and Furukawa K.et al.，J.Biol.Chem，1992，vol.267，N° 12，8012)，其免疫原性已经被证实。
发现1％循环着的人体B淋巴细胞针对抗原表位(epitope)Galα1，3Gal产生抗体(Galili et al，Blood，1993，vol.82，2485)。该抗原表位与抗体形成复合物激活补体，并导致剧烈的免疫反应，例如异种移植产生的急性移植排异反应。15％到20％的使用由仓鼠细胞生产的FVII治疗的血友病患者产生免疫反应(Prowse C.V et al，Blood Reviews，1998，vol.12，99)。这种免疫反应对血友病患者而言是不幸的，因为变得免疫原性的FVII和FVIII将导致出血，而这是非常难 以治疗的。
因此，仍然需要获得具有较少免疫原性的重组的或转基因的FVIIa合成物，免疫原性尽可能的低，同时优选具有更大的病毒安全性。
发明内容
因此，申请人以发展优选的具有更大病毒安全性，展现出非常小的免疫原性的FVII合成物为目标进行了研究。
这样一来，本发明涉及因子VII的重组的或转基因的合成物，合成物中每个因子VII分子均表现出两个N-糖基化位点，其特征在于在合成物所有FVII分子中，所包含的Galα1，3Gal聚糖部分比例在0到4％之间。
令人惊讶的是，申请人已经发现在FVII合成物中这样的比例聚糖Galα1，3Gal部分在用于治疗病患时是非免疫原性的。
本发明的FVII是以合成物为形式的。实际上，任何FVII，血浆的，重组的或转基因的，都以几种FVII蛋白的混合物为形式，这些蛋白质特定地区别于它们不显示相同的翻译后修饰。该翻译后的处理由细胞单元对FVII蛋白在不同细胞分区间转移实施的。这些生化修饰深深地改变了蛋白质，最终蛋白质与直接由基因编码的分子有相当的不同。这些化学的修饰帮助调节蛋白质的活性，以及定位。这样，为了本发明的目的，《FVII》的表达和《FVII合成物》的表达是相同的。
《重组的或转基因的FVII》是指由基因工程产生并具有翻译后修饰特征的任何FVII，特别是前面提到的糖基化，即在FVII合成物中具有零或非常低比例的或足够低从而是非免疫原性的Galα1，3Gal的两个N-糖基化位点。不同的是，本发明的FVII不是血浆FVII，不是从人体或动物体血浆中提纯的产品。
更特定的，活化的FVII是指由基因工程产生的任何活化FVII，其具有前面提到的翻译后修饰特征，以及带有确定的聚糖部分、γ-羧化和特异性二硫键的两个氧-糖基化位点。
Galα1，3Gal部分具有含有两个α1，3-连接半乳糖的结构。其定位于氮-连接结构的寡糖天线的端部。这一部分已知是具有免疫原性的。实际上，该聚糖部分在人体以及一些猴子体内是缺乏的，因为编码诱导其合成的酶(α1，3半乳糖基转移酶)的基因是非活化的。因此，具有这样部分的蛋白质施用至人体会诱导针对如此糖基化蛋白质的抗体的产生。
因此非常需要在药物用蛋白质中没有这样的免疫原性部分。
优选的，该合成物的特征在于在出现的所有因子VII分子中缺少聚糖部分Galα1，3Gal。
可以理解，对于FVII，其Galα1，3Gal结构的比例是零或如此低以至于使用现有的分析设备无法从背景中区分，或者其比例特别的无法通过用4-氯-1-萘酚着色的凝集素-印迹检测方法检测出来。该量化方法在《实施例》部分进行阐述。该表达表示，以相同的方式，对于任何重组的或转基因的FVII，其Galα1，3Gal的比例接近于血浆FVII。无论何种情况，本发明的FVII合成物中Galα1，3Gal的比例对人体都是非免疫原性的。
相反的，可购得的重组FVII表现出可检测比例的Galα1，3Gal，也因此可以使用分析设备从背景噪音中区分出来。
因此，根据所使用的量化方法，Galα1，3Gal部分可以是完全没有的，或以小于4％，或小于3.5％的量或小于3％的量出现，这样的量不可能从背景噪音中区分。有利的是，Galα1，3Gal部分以与血浆FVII同样的或接近同样的比例存在。
本发明的FVII是一种多肽，其肽序列可以是天然人体中FVII的，即人体中出现的序列结合到FVII时不表现出混乱。这样的序列可以通过例如在文件EP0200421中所述的序列1b编码。
有利的是，本发明FVII的序列是序列SEQ ID NO：1。
在进一步的实施例中，本发明的FVII可以是在其免疫原性不大于天然FVII的范围内的天然人类FVII的变体。这样，这种变体的肽序列表现出至少70％的同一性，并有利地，至少80％或90％，更有利的与天然人类FVII序列具有至少99％的同一性，这样的变体具有与天然FVII基本相同的生物活性。
此外，本发明的FVII也指任何FVII，其生物活性与天然FVII相比被修饰或降低了。通过例子，重组的人类失活FVII，FFR-FVIIa，用于治疗或预防血栓(Holst et al，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.，1998 Jun，15(6)：515-520)可以被提及。这样的FVII是具有通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸而不同于天然FVII序列的氨基酸序列的多肽。
最终，在另一实施例中，本发明的FVII可以被活化(FVIIa)。当FVII代表FVIIa与组织因子(TF)相互作用时，FVIIa表现出比FVII大25到100倍的凝血活性。FVII的活化产生于不同蛋白酶(FIXa，Fxa，FVIIa)在两条由双硫键连接的链中对酶原的切除。FVIIa是负责在例如带有循环抗体的血友病患 者中止血的凝血因子。一种特别有利的方法是，本发明的FVII被全部活化。
本发明的FVIIa可以包括几种翻译后修饰：前九或十个N-端谷氨酸被γ-羧化，Asp63部分羟化，Ser52和Ser60被氧-糖基化并分别携带葡萄糖(木糖)0-2以及岩藻糖部分，Asn145和Asn32主要通过二天线单唾液酸化的复合结构被N-糖基化
本发明FVII的生物活性可以通过使用FVII-缺失血浆和例如美国专利5,997,864中所述的促凝血酶原激酶来测量FVII合成物触发血液凝结的能力而进行量化。在该专利描述的分析中，生物活性由相对于对照组的凝结时间的减少来表达，并通过与含有1单位/mlFVII活性的标准人体血浆比较，而被转换为《FVII单位》。
本发明的重组FVII可以通过使用本领域技术人员所知的标准技术而获得，蛋白在生物学系统中可以进行表达。
本发明的FVII可以在任何带有前面提到的糖基化特征的微生物、植物或动物中表达，即在合成物中Galα1，3Gal的比例非常低或是零。微生物指任何细菌、真菌、病毒或细胞系统，该细胞可以是植物或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是动物或人类细胞。还可以使用α1，3半乳糖基转移酶敲除的细胞。
本发明的FVII也可以在转基因的动物或植物内产生，只要这些动物或植物带有FVII或前面提到的糖基化特征的FVII合成物，即在FVII合成物中没有或非常低比例的Galα1，3Gal。这些动物可以是兔、猪、绵羊、山羊、牛、鸡或任何α1，3半乳糖基转移酶敲除的动物，这里所列的不是限制性的。
本发明的FVII像人类FVII一样在145和322位置包含两个N-糖基化位点，在52和60位置有两个氧-糖基化位点。在一N-糖基化位点上，寡糖链被连接到天冬酰胺(N-连接)。在氧-糖基化位点，寡糖链被连接到丝氨酸。连接到这些氨基酸的部分对于合成物的每个蛋白质都会不同。然而，对于整个合成物，有可能量化其每个聚糖部分或每个糖的量。
本申请给出的不同聚糖的百分比并没有将氧-糖基化计算在内。
优选地，FVII合成物的特征在于，在所有FVII合成物的聚糖部分中至少40％为二天线的、单唾液酸化的聚糖形式。在另一实施例中，存在的单唾液酸化的形式至少为50％。在另一实施例中，存在的单唾液酸化的形式至少为60％。
有利的，FVII的聚糖形式主要是二天线的单唾液酸化的聚糖形式。
FVII合成物的特征在于FVII中的至少部分唾液酸包含α2-6连接。
有利的，FVII中至少65％的唾液酸包含α2-6连接。更有利的，FVII中至少70％或80％，并且，特别的，至少90％的唾液酸包含α2-6连接。
根据本发明的一实施例，FVII的所有唾液酸包含α2-6连接，也就是所有唾液酸通过α2-6连接与半乳糖结合。本发明的FVII合成物可以进一步包含含有α2-3连接的唾液酸。
事实上，FVII中至少65％的唾液酸包含α2-6分枝是本发明FVII的优势之一。事实上，可购得的重组FVII中的唾液酸仅含有α2，3连接。然而，血浆FVII是这两种异构体的混合。然而，后者包含更多的α2，6连接，这使本发明的FVII更接近血浆FVII。根据本发明，FVII中65％到100％的唾液酸包含α2，6连接。在某些实施例中，FVII中从70％或80％到100％的唾液酸包含α2，6连接。
有利的，在FVII的二天线的、单唾液酸化的聚糖形式中，大部分是非岩藻糖基化的。
优选地，本发明的FVII合成物中出现的这些二天线，单唾液酸化的，未岩藻糖基化的聚糖形式的比例大于20％。有利的，该比例高于25％，或高于40％。
特别有利的，本发明的FVII所包含岩藻糖基化的比例在20％到50％之间。在本发明的一实施例中，该比例可以小于15％。
这个特征是本发明FVII的优势之一。事实上，可购得的重组FVII表现出100％的岩藻糖基化比例，然而血浆FVII具有的岩藻糖基化比例约为16％。这样，本发明的FVII的岩藻糖基化与血浆FVII接近，这在免疫原性上赋予了本发明的FVII优势。
有利的，本发明的FVII是转基因FVII。这样，本发明的FVII有利的是转基因生产的重组FVII产品。
在本发明的一特别实施例中，本发明的转基因FVII生产于转基因动物的奶中。
这种蛋白的生产可以通过移植负责合成奶蛋白的一个基因的调控区编码所感兴趣蛋白的基因实现，其会指导特别是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。
特别有利的，本发明的FVII是通过转基因雌兔生产的。
这一物种特别有优势，因为兔不表现出对朊病毒，特别是对可传染的亚急性海绵状脑病敏感，，而这是一个主要的公共健康问题。
另外，兔与人之间的物种屏障大。相反的，人与仓鼠之间的物种屏障没有那么大，其中仓鼠是可购得的重组FVII生产用的生物体系统。
因此，在兔中生产的FVII在考虑到病原体传染的安全方面是有利的。
在本发明优选的实施例中，本发明的FVII是在雌兔乳腺中生产的。
感兴趣的蛋白从乳腺分泌，允许该分泌物进入转基因哺乳动物的奶中，包含用组织依赖性方法来控制重组蛋白的表达，这对本领域技术人员是熟知的。
对表达的组织控制的执行是由于允许导向特定动物组织进行蛋白表达的序列。这些序列就是启动子序列和肽信号序列。
启动子推进感兴趣蛋白在乳腺中的表达的例子是WVP启动子(乳清酸蛋白)，酪蛋白启动子，例如β-酪蛋白启动子，β-乳球蛋白启动子，此处列表不是限制性的。
在转基因动物奶中重组蛋白的生产方法可以包括下列步骤：合成DNA分子包含编码人类FVII基因，该基因由天然分泌蛋白到奶中的启动子控制，该合成DNA分子被整合到非人类的哺乳动物胚胎中。之后，胚胎被置于同种的雌性哺乳动物中。一旦从该胚胎中获得的哺乳动物发育充分，诱导该哺乳动物进入哺乳期，收集奶。该奶中含有感兴趣的转基因FVII。
在非人类的雌性哺乳动物的奶中制备蛋白的方法示例在文件EP0527063中进行了描述，该教导可以作为本发明感兴趣蛋白生产的参考，该例子不是限制生的。
含有WAP启动子的血浆通过引入包含WAP基因启动子的序列而制备，该血浆制备成能够接受置于依赖WAP启动子之下的外来基因。编码人体FVII的基因被整合，并被置于依赖WAP启动子之下。含有该启动子和编码感兴趣蛋白的基因的血浆用来通过显微注射到兔雄原核中而获得转基因雌兔。之后，胚胎被转移至通过激素制备的雌性的输卵管中。转基因的存在通过对从所获得的转基因幼兔中提取的DNA的Southern杂交来显示。动物奶中的浓度通过专门的放射免疫学检测进行评估。
通过雌兔在其奶中生产的转基因FVII以合成物的形式获得，其中合成物中因子VII的每个分子表现出两个N-糖基化位点，其特征在于在FVII合成物的所有分子中，Galα1，3Gal聚糖部分的比例小于4％，或甚至为零。这样，有利的，通过雌兔生产的转基因FVII不包含Galα1，3Gal聚糖部分。
优选的，本发明的雌兔的转基因FVII合成物的特征在于，合成物所有的聚糖部分中，至少40％是二天线的，单唾液酸化的聚糖形式。在另一实施例中，存在的单唾液酸化的形式至少是50％。在另一实施例中，存在的单唾液酸化的形式至少是60％。
有利的，聚糖的主要形式是二天线的，单唾液酸化的聚糖形式。
FVII合成物的特征在于因子VII的至少部分唾液酸包含α2-6连接。
有利的，FVII中至少65％的唾液酸包含α2-6连接。更有利的，FVII中至少70％或80％，特别的，至少90％的唾液酸包含α2-6连接。
根据本发明的一实施例，FVII的所有唾液酸包含α2-6连接，即所有唾液酸通过α2-6连接与半乳糖结合。本发明的FVII合成物可以进一步包含含有α2-3连接的唾液酸。
优选的，在FVII的二天线，单唾液酸化的聚糖形式中，大部分是未岩藻糖基化的。有利的，本发明的FVII合成物中出现的这些二天线，单唾液酸化的，未岩藻糖基化的聚糖形式的比例大于20％。有利的，该比例高于25％，或高于40％。
优选的，本发明的FVII合成物所包含岩藻糖化的比例在20％到50％之间。
在本发明的一实施例中，该比例可以小于15％。
本发明的转基因FVIIa可以包含几种翻译后修饰：前九或十个N-端谷氨酸被γ-羧化，Asp63(门冬酰胺63)部分地羟化，Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被氧-糖基化并分别携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖部分，Asn145和Asn322主要通过二天线的单唾液酸化的复合结构而N-糖基化。
本发明的FVII可以从奶中利用本领域技术人员所知的技术进行提纯。例如，如美国专利6,268,487中所描述的一种从牛奶中提纯感兴趣蛋白的方法，其包含下列步骤：a)将奶在具有足够引起滞留物和透过物的多孔膜上进行切向过滤，透过物含有外源性蛋白，b)将透过物经过通过色谱进行捕获的装置来移置外源性蛋白，并得到流出物，c)将流出物与滞留物融合，d)重复步骤a)到c)直到FVII从脂质、酪蛋白胶粒中分离出来，且至少75％的FVII被回收。
有利的，本发明的FVII被活化。活体中，FVIIa由在两条由二硫键连接的链上用不同蛋白酶(FIXa，Fxa，FVIIa)对酶原的裂解形成。FVIIa自身具有非常低的酶活性，但是与其辅助因子，组织因子(TF)复合后，其通过活化FX和FIX而触发凝血过程。
因此，本发明的FVIIa是由通过单条二硫键相互连接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)的分子量约为20kDa，具有152个氨基酸的轻链，和分子量约为30kDa，具有254个氨基酸的重链组成的化合物。
这样，本发明的FVII是具有与血浆FVII相近活性和结构的活化的FVII。
FVIIa在与组织因子(TF)相互作用上表现出比FVII大25到100倍的凝 血活性。
在本发明的实施例中，FVII可以在体外通过因子Xa，VIIa，IIa，IXa和XIIa活化。
本发明的FVII也可以在其提纯过程中被活化。
申请人惊奇的注意到FVII即使置于抗乳血清中天然产生的蛋白质的启动子，例如WAP启动子，的控制下，其仍然易与奶中的钙离子结合，从而与酪蛋白胶粒结合。
这样，开发用于提取和提纯FVII的，易于捕获与抗乳血清复合物结合的或与酪蛋白胶粒结合的蛋白的方法将是非常有利的，该FVII表现出对奶中钙离子的亲和力。
例如，在转基因动物的奶中提取和纯化转基因FVII的方法包含以下步骤：a)从奶中提取FVII，因子VII结合到奶中钙的有机和/或无机盐以及/或复合物，通过由向奶中加入可溶性盐而获取的钙化合物沉淀，其阴离子由于其形成所述不可溶的钙化合物的能力而被选择，从而通过该途径从所述盐和/或复合物中释放因子VII，这样因子VII就存在于液相中了，
b)将蛋白质富集的液相与钙化合物沉淀分离，所述液相被进一步分离为脂相和包含蛋白的水性非脂相，
c)使用预定浓度的磷酸盐为基础的洗提缓冲液，对水性非脂相进行亲和层析步骤，以及
d)使用弱碱性阴离子交换柱，使用适合对残留在所述柱上的因子VII连续洗提的缓冲液，对根据步骤c)得到的因子VII的洗出液进行两至三次层析。
申请人惊奇地注意到，这样的方法使用了对结合到奶中钙的有机和/或无机盐以及/或复合物的FVII的提取步骤，通过由向奶中加入可溶性盐而获取的钙化合物沉淀，其阴离子由于其形成所述不可溶的钙化合物的能力而被选择，而FVII从这些所述奶的钙的有机和/或无机盐以及/或复合物和/或有机的和/或无机的复合物中被释放，并重新在液相溶液中被发现。
FVII结合到所述奶的钙的有机和/或无机盐以及/或复合物，这是指该FVII表现出对这些钙的盐和/或复合物的亲和性。因此FVII表现出足够数量的对这些盐和/或复合物完全或部分结合的固定位点。
奶的钙有机和/或无机盐以及/或复合物表示磷酸钙盐与胶态酪蛋白胶粒相互作用的。不同的酪蛋白在存在磷酸钙盐的情况下形成胶态的胶粒复合体，其直径能达到约0.5μm，例如以三钙磷酸盐的聚合《团簇》形式，即Ca9(PO4)6。这 些胶粒是由酪蛋白亚基形成的，酪蛋白亚基包含包围着疏水核的富含酪蛋白-κ的亲水层，磷酸钙盐通过静电作用与亲水层结合。这些磷酸盐也可存在于胶粒的内部空间中，不与酪蛋白结合。这些盐和/或复合物还以磷酸一钙和/或磷酸二钙的形式存在于奶中，这与钙的其他离子形式相平衡，取决于所执行的化学的和生化的反应。这些钙盐和/或复合物可以存在于酪蛋白胶粒的内部空间中。
这种FVII对该钙的有机和/或无机盐以及/或复合物的亲和力可以由未修饰的或体内或体外修饰过，例如通过翻译后修饰，的蛋白的相互作用产生。
在本发明的方法中，转基因FVII代表任何具有不同属性，特别涉及糖基化的转基因FVII。有利的，本发明的转基因FVII是前述已经定义的FVII。
不可溶钙化合物是指在奶中溶解度小于0.5％的钙盐或复合物。
大部分FVII与酪蛋白胶粒的磷酸钙盐结合。FVII表现出对钙的强烈的亲和力，具有高的亲和常数，即至少70％到90％的FVII被吸收于酪蛋白胶粒中。余下的FVII表现出对前面提到的其他形式的钙的有机和/或无机盐以及/或复合物的亲和力。
没有被任何所观察到机理的解释束缚，申请人假设可溶性盐的加入替换了胶粒的磷酸钙盐的平衡，从而导致其变性，以及酪蛋白亚基的聚合沉淀。吸收于胶粒中和/或上的与磷酸钙盐结合的FVII在其变性时被释放进入媒介中。另外，同时，FVII还被从磷酸钙盐上释放或分离，由于它们在本发明方法中所使用的可溶性盐的作用下以不溶性钙化合物的形式沉淀。同样的，与可溶性钙的有机和/或无机盐以及/或复合物结合的FVII将会由于相同类型的反应而分离。(见图9)
在本发明的范围内，该可溶性盐是任何可以获得期望效果的盐。
在本发明的方法中，为了成功将FVII从钙的盐和/或复合物上分离，所使用的可溶性盐可以以由本领域技术人员选择的浓度存在于奶中。事实上，该浓度足够允许至少20％的分离，或有利的，至少30％到50％的FVII分离。特别有利的，该浓度足够允许至少60％到80％的，或至少90％的FVII分离。
本发明的处理允许尤其是酪蛋白亚基聚合的沉淀。该沉淀是由于如前面提到的酪蛋白胶粒的变性。所应用的本发明的处理由于沉淀而破坏了奶的胶质状态。
因此，本发明的处理是一种允许奶从胶质状态转变为液体状态的处理，其对应于胶质/液体的直接提取。
本发明的处理还可以获得比初始奶中颜色更浅的抗乳血清。事实上，这是 酪蛋白将它们的白色赋予了奶。一旦沉淀，它们不再能够将它们的颜色赋予奶。
根据本发明的可溶性盐是指在奶中至少具有0.5份盐每份奶(w/w)的溶解度的盐。
有利的，处理中所使用的可溶性盐是磷酸盐。该盐可以是水溶液，其随后被加入到奶中，或是粉状的，其被直接加入到奶中。
优选的，该磷酸盐选自由磷酸钠，磷酸锂，磷酸钾，磷酸铷和磷酸铯组成的组，而特定的，是磷酸钠。
可选的，在本发明处理中所使用的可溶性盐可以是碱金属草酸盐，特别是草酸钠或钾，或碱金属碳酸盐，特别是碳酸钠或钾，或其的混合物。
有利的，为实施处理而制备的可溶性盐在水溶液中的浓度在100mM到3M之间，更优选的，在200mM到500mM之间，特别的，在200mM到300mM之间。
含有FVII的用于提取的奶可以是原始的全奶或脱脂奶。对脱脂奶采用本发明处理的优势在于其脂质含量较低。该处理同样可以应用于新鲜的或冰冻过的奶。
该方法包含步骤b)对脂相和含有蛋白的水性非脂相的液相分离，优选的是通过离心实现的。非脂水相实际上是抗乳血清。该分离步骤同时还可以分离酪蛋白胶粒状亚基的聚合体以及钙化合物的沉淀物。
在分离步骤之后，该处理还可以进一步包含对非脂水相连续过滤的步骤，孔隙度逐渐减小，优选的是1μm，接着是0.45μm。这些过滤器的使用，例如玻璃纤维基础的，可以减少油脂，脂肪球以及自然存在于奶中的磷脂的含量。孔隙度小于0.5μm的过滤器可以保持非脂水相以及随后执行纯化的载体(超滤器，层析柱等)(见此后)的细菌学质量。脂相优选的通过这些能完全保留奶中脂肪球的过滤器过滤，滤出液是清澈的。
这一步骤可以接着通过超滤的浓缩/透析的步骤。
该浓缩允许减少非脂水相的体积来保存它。超滤膜根据所感兴趣蛋白的特征由本领域技术人员选择。通常，空隙尺寸小于或等于FVII分子量的孔隙度限制可以在没有显著损失的情况下浓缩产品。例如，空隙尺寸为50kDa的膜可以无损失地浓缩分子量为50kDa的FVII。
透析意在为了接下来的纯化步骤，即层析法，调节含有FVII的非脂水相。透析也可以去除小分子量的化合物，例如乳糖，盐，肽，朊间质-蛋白胨以及任何会破坏产品保藏的试剂。最后，优选的使用保留限度为50kDa的膜，从而 FVII不会滤过该膜。
优选的，透析缓冲液是0.025到0.050M，pH7.5到8.5的磷酸钠溶液。
步骤b)之后，或者如果出现情况，在过滤和/或浓缩/透析的步骤之后获得的非脂水相可以在实施后继纯化步骤之前冰冻并存放于-30℃。
之后，根据步骤b)获得的非脂水相要进行步骤c)使用标准层析设备的亲和层析，有利的在层析柱上实施，其载体是羟磷灰石胶(Ca10(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Ca10(PO4)6F2)胶。这样水相中的FVII被留在载体上，大部分的未保留的乳蛋白被消除。
优选的，使用的层析柱与基于0.025M到0.035M磷酸钠、pH7.5到8.5的水缓冲液A相平衡。富含FVII的水相被注入到柱上，其能够保留FVII。未保留部分通过缓冲液A的浸透而去除，直到回到基线(RBL)来保证对如乳蛋白这样不期望的化合物进行良好的去除。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
根据步骤c)的FVII的洗提用基于磷酸盐的缓冲液，例如磷酸钠或钾或其混合，以预定浓度进行，优选的代表基于0.25M到0.35M，pH7.5到8.5的磷酸钠缓冲液B。被洗提的部分被收集直至RBL(回到基线)。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
由于这一步骤，超过90％的所有乳蛋白被去除，而超过90％的FVII被回收。在这一步，FVII在该洗提部分中的纯度约为5％。
纯度定义为FVII与被考虑的样品、部分或洗提液中存在的所有蛋白的重量比例。
有利的，FVII的特异活性作为FVII对层析载体的亲和力的结果从因子10增加到25。
之后，由步骤c)所得到的含有FVII的洗提液优选的进行切向过滤。
切向过滤膜由本领域技术人员根据FVII的特性选择。一般而言，孔隙尺寸比FVII分子量大两倍的孔隙度可以对其进行过滤。因此孔隙尺寸为100kDa的膜可以对FVII进行过滤，并有好的产量。
这一步过滤的目的是减少尤其是分子量大于FVII的蛋白质的量，特别的来去除非典型型FVII(例如聚合形态的FVII)，以及在一定时间后易于降解其的蛋白酶。最后，使用孔隙度为100kDa化合物的膜是非常有利的。
有利的，过滤后的FVII的洗提液通过用保留限度为50kDa的膜超滤再次进行浓缩和透析。透析缓冲液优选的是0.15到0.20M的氯化钠溶液。
在步骤c)最后获得的FVII的洗提液可选的通过过滤、浓缩和透析，接着 在弱碱性阴离子交换柱上使用合适的用于对保留在所述柱上因子VII进行后续洗提的缓冲液进行两或三次层析步骤(步骤d)。这些步骤能对FVII进一步纯化，特别的对于乳蛋白。这些步骤用标准层析设备实施。
第一次阴离子交换层析步骤有利的使用FF胶型层析载体进行，其根据下述优选的操作条件保留因子FVII。该载体用0.05M，pH7.0到7.5的Tris缓冲液冲洗。未保留的部分被冲洗缓冲液去除，直到回到基线。FVII的洗提液用基于0.05M Tris以及0.020M到0.05M，优选的0.05M，氯化钙的pH7.0到8.0的水性缓冲液进行，来获得FVII的第一次洗提液。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
这一步FVII的回收率至少为70％，并能去除约80％的所结合蛋白，尤其是奶蛋白。
之后，FVII的洗提液如前面所述的进行一透析步骤，使用0.15到0.20M氯化钠作为缓冲液。
第二次层析步骤有利的在FF胶型层析载体上进行，根据下述优选的操作条件，将在第一次阴离子交换层析步骤中获得的FVII的第一次洗提液注入其中。载体用0.05M，pH7.0到7.5的Tris缓冲液冲洗。未保留部分随冲洗缓冲液被去除，直到回到基线。通过在λ＝280nm吸收进行检测。
保留在载体上的FVII的洗提液用基于0.05M Tris和0.005M氯化钙，pH7.0到8.0的水性缓冲液实施，以获得高纯度的FVII的第二次洗提液，即纯度高于90％。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
第二步层析意在限制可能的蛋白质的蛋白降解。
在这一步，洗提液的纯度约为90％，超过95％的残留结合蛋白被消除。之后，该洗提液可以如前面所述的进行透析步骤，使用0.15到0.20M氯化钠作为缓冲液。
根据本发明非常优选的实施，该处理包括在弱碱性阴离子交换柱上使用适当的从所述柱上连续洗提因子VII的缓冲液进行的三次层析步骤。从而，在两次前面提到的阴离子交换层析后，实施第三次阴离子交换层析步骤。该步骤可以制备富含蛋白质的合成物，以适用于医药用途。
第三次层析步骤有利的在FF胶型层析载体上进行，根据下述优选的操作条件，将在第二次阴离子交换层析步骤中所获得的第二次FVII洗提液注入其中。
第二次阴离子交换层析步骤所获得的第二次洗提液优选的在用1到5倍体 积的注射用纯水(WFI)稀释后注入到充满能保留FVII的FF型载体的柱中。该载体用0.05M Tris，pH7.0到7.5的缓冲液进行冲洗。未保留部分用冲洗缓冲液去除，直到RBL(回到基线)。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
保留在载体上的FVII的洗提液用基于0.02M Tris和0.20到0.30M，优选地0.28M氯化钠的pH6.5到7.5的水性缓冲液实施。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
这样获得的转基因FVII合成物的纯度大于95％。非常有利的，该合成物以FVII的浓缩物形式出现。
该处理的实施导致累计的20％到25％的产率，每升被处理的奶至少能获得20mg纯化的FVII。
因此，三次在阴离子交换胶上的层析步骤能够进一步纯化FVII。此外，它们允许浓缩和制备FVII合成物。
FVII的活化在处理中发生，很可能在第一步阴离子交换层析中发生。
一旦最后的洗提液被回收，所述洗提液可以用0.22μm的过滤器进行一次过滤，并分装至容器中，再在-30℃下冰冻并储存。
本发明的处理还可包括至少以下步骤中的至少一步：配制、病毒灭活和杀菌。一般而言，该处理可包括，在亲和性层析步骤之前的一步抗病毒处理步骤，其有利的由溶剂/洗涤剂，特别的含有80(1％w/v)和TnBP(tri-n-磷酸丁酯)(0.3％v/v，)的混合物，导致包膜病毒的失活。此外，从第二次在阴离子交换柱上的层析步骤获得的FVII洗提液优选地进行一次纳米过滤来有效地消除病毒，特别是非包膜病毒，例如细小病毒B19。使用ASAHIPLANOVATM15过滤器来截留大小大于15nm的病毒是可能的。
本发明的另一目的是本发明的FVII合成物用于药物用途。
本发明的另一目的是根据本发明使用该FVII合成物来制备用于治疗血友病患者的药物。
本发明的另一目的是根据本发明使用该FVII合成物来制备用于治疗多发出血性损伤的药物。
本发明的另一目的是根据本发明使用该FVII合成物来制备用于采用手术止血治疗大量不可控制出血的药物。
本发明的另一目的是根据本发明使用该FVII合成物来制备用于治疗由于抗凝血剂过量而发生的出血或溢血(hemorrages)的药物。
本发明的另一目的是一种药物合成物，其包含根据本发明的因子VII和药物学可接收的赋形剂和/或载体。
该赋形剂可以是任何溶液，例如生理盐水，生理的、等压的或缓冲溶液，和任何悬浮液，胶或粉剂，还有适于药物学应用的以及本领域技术人员所知的。根据本发明的合成物可以进一步含有一种或多种药剂或载体，选自分散剂、增容剂、稳定剂、表面活化剂或防腐剂之中。另一方面，该合成物可以包含其他药剂或有效成分。
此外，该合成可以通过不同方式不同形式施用。施用可以是任何传统的医疗方法类型的方式，例如特别的通过系统的途径，特别的通过静脉内，皮内，瘤内，皮下，腹膜内，肌肉内或动脉内注射。例如，瘤内注射或瘤附近区域注射或冲洗瘤，可以被提及。
剂量可以根据施用的数量，与其他有效成分的结合，病理学发展的程度等等而变化。
本发明的其他方面和优势将通过以下例子进行描述，它们意在描述而不是限制本发明的范围。
实施例中使用的缩略语
FVII-tg＝FVIIa-tg：根据本发明的活化的转基因FVII
FVII-rec＝FVIIa-rec：可购得的重组的活化的FVII
FVII-pd＝FVIIa-pd：从人类血浆中提纯的、血浆来源的活化的FVII。
MALDI-TOF：基质辅助激光解析电离-飞行时间
HPCE-LIF：高效毛细管电泳-激光诱导荧光
ESI-MS：质谱-电喷雾电离
LC-ESIMS：液相色谱-质谱-电喷雾电离
NP-HPLC：正相高效液相色谱
PNGase F：肽：N-糖苷酶F
LC-MS：液相色谱-质谱
附图说明
图1：根据本发明的产于雌兔奶中的转基因FVII的提取和纯化/活化方法的例子的略图。
图2：携带N-糖基化位点的肽的去卷积(deconvoltuted)质谱ESI图。
图3：通过PNGase F的FVII去糖基化之后的HPCE-LIF的电泳图谱；
图例：在中央的两条电泳图谱：FVII-tg；岩藻糖，(■)GlcNAc(N-乙酰氨基葡糖)，(●)甘露糖，(●)半乳糖，(▲)唾液酸
顶部的电泳图谱：FVII-pd
中央(2)的电泳图谱：FVII-tg
底部的电泳图谱：FVII-rec
图4：用NP-HPLC得到的FVII-tg(中央的图谱)，FVII-pd(顶部的图谱)和FVII-rec(底部的图谱)的特征图。糖残基的图例：见图3。
图5：使用MALDI-TOFMS对FVII-tg的主要聚糖形式的确定。糖残基的图例：见图3
图6：甲状腺球蛋白的寡糖的HPCE-LIF分析。糖残基的图例：见图3
图7：转基因FVII的寡糖的HPCE-LIF分析。糖残基的图例：见图3
图8：Galα1，3Gal结构的量化
图9：FVII提取机制的例子
图10：携带氧-糖基化位点肽的去卷积ESI质谱。这些肽在用胰蛋白酶分解后获得，并进行LC-ESIMS分析。Fuc：岩藻糖，Glc：葡萄糖，Xyl：木糖
图11：携带γ-羧化位点肽的去卷积ESI质谱。这些肽在用Asp-N分解后获得，并进行LC-ESIMS分析。不同批FVII-tg之间所得到的结果非常相似。不同肽的质量是单一同位素质量。Gla：γ-羧酸。
具体实施方式
实施例1：在转基因雌兔的奶中生产生产人类FVII蛋白
首先，质粒p1通过引入WAP基因的Bam H1-HindIII(6.3Kb片段)序列(在文件Devinoy et al，Nucleic Acids Research，vol.16，no.16，25 August 1988，p.8180中描述)到处于序列Bam H1与Hind III之间的p-poly III-I载体的多连接子(在文件Lathe etal，Gene(1987)57，193-201中描述)而制备。
在这个克隆的过程中，位点Bam H1被抑制，并被存在于载体p1中的位点Cla I取代。因此载体p1是能接受外来基因，其被置于依赖于6.3Kb WAP启动子。引入的外来基因可以引入，例如到多连接子的Sal I位点。该包含启动子和外来基因全体的插入物可以在切断两个Not1位点之后从质粒中分离，这两个位点位于p-poly III-I质粒的多连接子的末端。
从质粒p1获得的质粒p2，包含兔的WAP基因的启动子(6.3Kb)和人类FVII的基因。用于获得转基因雌兔的片段被包含于两个Not1位点之间。
位点Hid III通过位点特异性突变引入基因的前导序列来作为克隆位点使用。
转基因雌兔通过传统的显微注射技术(Brinster et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，4438-4442)获得。包含500份基因拷贝的1-2p1被注入鼠胚胎的雄原核中。该构建在质粒p-poly III-I中进行(Lathe et al，Gene(1987)57，193-201)。包含重组基因的该质粒的Not1-Not1片段被显微注射。之后，胚胎被转移到激素制备的继承性雌性的输卵管中。约10％的被操作的胚胎产生幼兔，而2％到5％的被操作的胚胎产生转基因的幼兔。转基因的存在通过对提取自兔尾的DNA进行Southern转换技术来显示。动物血液中以及奶中FVII的浓度通过特异性放射免疫检测得到计算。
FVII的生物学活性通过往细胞间或兔哺乳动物移植培养基加入奶而得到评估。
为获得能在其奶中产生本发明FVII的转基因雌兔所采用的技术在文件EP0527063中有更详细的描述。
实施例2：获得的FVII的提取和纯化
a)FVII的提取
取500ml全原奶，用9倍体积的0.25M，pH8.2的磷酸钠缓冲液稀释。室温下搅拌30分钟后，富含FVII的水相在15℃下10000g离心1小时(离心机Sorvall Evolution RC-6700rpm-转子SLC-6000)。6罐约为835ml是必需的。
离心后，存在三个相：一脂相在表层(乳脂)，一非脂水性清澈富含FVII的相(主要相)以及一白色颗粒状固相(不溶性酪蛋白和钙化合物沉淀)。
含有FVII的非脂水相通过蠕动泵(persistaltic pump)收集直至脂相。脂相单独回收。固相(沉淀)被去除。
然而，非脂水相仍然含有非常少量的脂质，其在一系列过滤器上过滤(PallSLK7002U010ZP-孔径为1μm的玻璃纤维预滤器-之后Pall SLK7002NXP-孔径为0.45μm的尼龙66)。在过滤的最后，脂相通过该过滤系列，其完全截留了奶中的脂肪球，滤出液是清澈的。
过滤过的非脂水相接着在超滤膜上进行透析(Millipore Biomax 50 kDa-0.1m2)以使其与层析相相容。分子量约为50kDa的FVII不滤过该膜，不像奶 中的盐、糖以及肽。第一时间内，溶液(约5000ml)被浓缩到500ml，接着通过维持这个恒定体积的超滤膜透析可以去除电解质以及使该生物材料适于层析步骤。透析缓冲液是0.025M，pH8.2的磷酸钠缓冲液。
含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含FVII-tg的抗乳血清中。该制备物在后继处理前被保存于-30℃。
这步的FVII的总回收率非常令人满意：90％(用磷酸盐提取91％+透析/浓缩99％)。
包含FVII的非脂水相在这步的最后完全清澈，并适于后续层析步骤。
大约93000IU的FVII-tg在这一步被提取。在这一步制备中的FVII的纯度在0.2％的级别。
b)FVII的纯化
1.羟磷灰石胶上的层析
Amicon90柱(直径9cm-横截面64cm2)充满BioRad陶瓷羟磷灰石I型(CHT-I)胶。
该胶用水性缓冲液A平衡，A包含0.025M磷酸钠和0.04氯化钠的混合物，pH8.0。存于-30℃的所有制备物用水浴在37℃解冻，直到冰块完全溶解，接着注入到胶上(直线流动速率100cm/h，即105ml/min)。未保留的部分利用含有0.025M磷酸钠和0.04M氯化钠、pH8.2的缓冲液的经过而去除，直到回到基线(RBL)。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
含有FVII-tg部分用含有0.25M磷酸钠和0.4M氯化钠的、pH8.0的缓冲液B实施洗提。洗提部分被收集，直到回到基线。吸收测量在波长(λ)为280nm处进行。
该层析可以回收超过90％的FVII-tg，同时消除超过95％的乳蛋白。该特异活性(S.A.)增加了25倍。在这一步，可获得约85000IU，纯度为4％的FVII-tg。
2.100kDa切向过滤以及50kDa浓缩/透析
前一步骤中所有的洗提液在100kDa超滤膜(Pall OMEGA SC 100K-0.1m2)的切向模式下过滤。FVII滤过100kDa的膜，同时分子量超过100kDa的蛋白不能滤过。
之后，滤过的部分被浓缩到约500ml，接着在50kDa的已在之前描述了的超滤器上透析。透析缓冲液使用0.15M的氯化钠。
在这阶段的处理中，产品在进行离子交换层析前被保存于-30℃。
这一阶段可以减少分子量超过100kDa蛋白的量，并且特别的是酶前体。 在100kDa膜上的处理可以截留留约50％的蛋白，其中为高分子量蛋白，同时滤过95％的FVII-tg，为82000IU的FVII-tg。
该处理可以减少后续步骤中的蛋白酶水解的风险。
3.在
FF上的层析
这连续三步在离子交换胶Fast Flow(QSFF)上进行的层析是为了纯化有效成分，以允许FVII活化为活化的FVII(FVIIa)，以及最终浓缩并制备为FVII合成物。对化合物的检测通过λ＝280nm处的吸收测量而进行。
3.1
FF1步-洗提《高钙》
一直径2.6cm(横截面5.3cm2)的柱用100mlFF胶(GE Healthcare)填充。
该胶用0.05M，pH7.5的Tris缓冲液平衡。
保存于-30℃的整个部分在37℃水浴中解冻，直到所有冰块都溶解。在注入到胶之前(流速13ml/min，即直线速度150cm/h)，该部分用平衡缓冲液稀释到1/2[v/v]，未保留部分随后随缓冲液的通过去除，直到RBL。
具有低FVII含量的第一蛋白部分被0.05M的Tris和0.15M氯化钠、pH7.5的缓冲液以9ml/min(即100cm/h)洗提而被去除。
第二富含FVII的蛋白部分被0.05M的Tris和0.05M氯化钠和0.05M氯化钙、pH7.5的缓冲液以9ml/min(即100cm/h)洗提。
该第二部分在50kDa的之前已描述过的超滤器上进行透析。该透析缓冲液是0.15M氯化钠。该部分在第二次通过阴离子交换层析前在夜间被存储于+4℃。
这一步可以回收73％的FVII(即60000IU的FVII-tg)，同时消除80％的结合蛋白。它同时允许FVII活化成FVIIa。
3.2
FF2步-洗提《低钙》
一直径2.5cm(横截面4.9cm2)的柱用30mlFF胶(GE Healthcare)填充。
该胶用0.05M，pH7.5的Tris缓冲液平衡。
之前洗提存储于+4℃的部分(第二部分)在注入到胶(9ml/min，即直线流速100cm/h)之前被稀释。
在注入第二部分后，该胶用平衡缓冲液冲洗以去除未保留的部分，直到RBL。
含有很高纯度FVII的部分被0.05M的Tris和0.05M氯化钠和0.005M氯化 钙、pH7.5的缓冲液以4.5ml/min(即50cm/h)洗提。
约23000IU的FVII-tg被纯化，即12mg的FVII-tg。
这一步可以消除超过95％的结合蛋白(兔奶蛋白)。
该洗提液，纯度高于90％，表现出接近天然人类FVII分子的结构与功能特征。其在第三次通过离子交换层析时被浓缩和制备。
3.3
FF3步-《钠》洗提
一直径2.5cm(横截面4.9cm2)的柱用10mlFF胶(GE Healthcare)填充。
该胶用0.05M，pH7.5的Tris缓冲液平衡。
前一步骤中洗提的，纯化的部分在注入到胶上(流速4.5ml/min，即直线速度50cm/h)前用注射用纯水(PWI)稀释五倍。
在注入所述部分后，该胶用平衡缓冲液冲洗以去除未保留的部分，直到RBL。
之后，FVII-tg被0.02M的Tris和0.28M氯化钠，pH7.0的缓冲液以3ml/min(即36cm/h)洗提。
浓缩的FVII-tg合成物被制备，纯度高于95％。该产品适于静脉注射。该处理引起的产量为22％，每升所使用的奶可以纯化至少20mg的FVII。
另外，对合成物中的FVII-tg进行不同的结构分析，例如在下列例子中显示的：
实施例3：基本序列的研究
1.肽图
在胰蛋白酶和Asp-N(数据未显示)分解样品FVII-pd，FVII-rec和FVII-tg后，获得LC-MS和UV检测的色谱。
在对胰蛋白酶降解后所获得的肽图分析显示它们在小于65分钟的保留时间内它们是相似的。之后，对应于肽重链片段的种类在FVII-rec和FVII-tg中发现而未在FVII-pd中发现。这些具有高质量的肽(4500Da到8000Da)对应于未完成的裂解。这些肽在其他批FVII-pd中被发现，因此，它们的存在与不同的胰蛋白酶敏感性不相关联。
不同FVII之间在Asp-N降解后获得的肽图非常相似，这沿着整个保留时间的系列都是这样。所观察到的强度的不同只是因为注入量的变化而与不同结构无关。
2.序列的重叠
序列的重叠从由MS和/或MS/MS确定的肽计算出来。表1概括了不同样品所得到的结果。考虑到胰蛋白酶和Asp-N降解，超过95％的基本序列可以核实，所获得的结果与文献中描述的一致(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793)。
表1.不同样品用LC-ESIMS(/MS)分析获得的序列重叠
| 胰蛋白酶重叠(％) | Asp-N重叠(％) | 所有重叠(％) | |
| FVII-pd | 79.3 | 97.3 | 97.3 |
| FVII-rec | 97.5 | 95.8 | 100.0 |
| FVII-tg | - | 97.0 | 97.0 |
| FVII-tg | 96.6 | 91.1 | 100.0 |
| FVII-tg | 95.3 | 91.1 | 99.0 |
为了证实肽的鉴定，HPLC片段用MALDI和Edman测序(sequencing)分析。
所有的用Edman测序分析的HPLC部分可以获得80％的序列重叠。序列核实对FVII-tg和FVII-rec在LC-MS上实施，得出基本序列重叠＞95％。
实施例4：通过ESI-MS对糖基化位点以及糖肽的表征
FVII-tg的N-糖基化位点通过LC-ESIMS(/MS)识别，通过MALDI-TOFMS证实，以及微观不均一性通过LC-ESIMS确定。
图2描述了的包含两个糖基化天冬酰胺残基的糖肽的去卷积ESI光谱。糖基化位点的位置通过MALDI-TOF(/TOF)和Edman测序证实。
分别具有N-糖基化位点Asn145和Asn322的血浆FVII(FVII-pd)的糖肽质谱[D123-R152]和[K31.6-R353]的分析显示存在二天线的、二唾液酸的、未岩藻糖基化的结构(A2)(观察到的糖肽质量：5563.8Da)以及岩藻糖基化的结构(A2F)(观察到的质量：5709.8Da)。同样需要注意的是三天线的、三唾液酸的、未岩藻糖基化的寡糖(A3)(观察到的质量：6220.0Da)和岩藻糖基化的寡糖(A3F)(观察到的质量：6366.1Da)的存在。对于转基因FVII(FVII-tg)，大部分位于Asn145的寡糖是二天线的、单唾液酸的、未岩藻糖基化的或岩藻糖基化的(A1，A1F)和A2，A2F型的。三天线的形式的很少出现。
关于Asn322的主要糖形式，观察到不同比例的相同的聚糖结构。图2显示存在比在Asn145上少的被处理过的形式(较少天线的和唾液酸的)。例如，对于血浆产物三天线的结构在Asn322上比在Asn145上出现的少，而在FVII-tg上则是没有的。同时还应当注意到，天冬酰胺145和322被100％糖基化。虽然是半定量的，这些结果与通过HPCE-LIF和NP-HPLC获得的定量数值是一致的。
实施例5：用HPCE-LIF对N-聚糖定量
在用PNGase F去糖基化后，N-连接寡糖的识别和量化通过HPCE-LIF实现。FVII样品用外切糖苷酶(唾液酸酶(酶/底物(FVII)比例为1mIU/10μg)，半乳糖苷酶，乙酰氨基己糖苷酶(Prozyme试剂盒)，岩藻糖苷酶(酶/底物比例：1mIU/10μg))处理，来保证对每个独立的结构进行识别和量化。所获得的聚糖用荧光染料标记并根据其质量和电荷分离。两个标准(葡萄糖均聚物和寡糖)可以识别结构。通过综合每个关于整体量化的寡糖的峰而实施量化。
在本例中，使用了毛细管电泳设备ProteoLab PA800(Beckman-Coulter)，其毛细管为50cm×50μm内径的N-CHO(Beckman-Coulter)涂层，。还使用了名为“胶缓冲液-N”(Beckman-Coulter)的分离缓冲液。实验在20℃，25kV下进行20分钟。使用激光(激发λ＝488nm；发射λ＝520nm)进行检测。
在同时用唾液酸酶，半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶去糖基化后岩藻糖基化的比例通过对应“核”的和岩藻糖基化“核”的峰区域之间的比例而计算。
FVII-pd中大部分聚糖为二天线的，二唾液酸化的(A2)，以及二天线的、二唾液酸的、岩藻糖基化的(A2F)类型。FVII-tg的聚糖形式(见图3)显示二天线的，单唾液酸的，岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的结构类型(A1F，A1)，以及二天线的，双唾液酸的，未岩藻糖基化的或岩藻糖基化的类型(A2，A2F)的存在。FVII-rec的形态显示出对于不同的观察到的结构(A1F，A2F)的非典型性移动时间。
表2.由天然样品(未被去唾液酸的)获得的以及由不同批FVII：FVII-pd和FVII-tg的去唾液酸样品获得的唾液酸结构的百分比的汇总
*二岩藻糖化种类
G2，G2F：二天线的，二半乳糖基化的，未岩藻糖基化的或岩藻糖基化的形式
G2FB：二天线的，二半乳糖基化的，二等分的，岩藻糖基化的形式
不同聚糖结构(表2)的量化分析显示FVII-pd的唾液酸化的结构的主要状态为约51％的二唾液酸化聚糖(A2和A2F)以及30％三天线的，唾液酸化的，未岩藻糖基化的或岩藻糖基化的形式(G3和G3F)。FVII-tg(A批和B批)与FVII-pd相比较少的被唾液酸化，FVII-pd的35％为二天线的，二唾液酸化的形式而只有6％为三天线的，唾液酸化的形式。主要的形式是单唾液酸化的，其具有50％的A1和A1F结构。FVII-rec与相比较少的被唾液酸化，FVII-pd的45％为A2F结构，而仅6％为三天线的，唾液酸化的聚糖(结果未示出)。
对于FVII-rec，已注意到其未岩藻糖基化结构的低比例。
表3.不同FVII的岩藻糖基化比例
定量分析显示FVII-pd低的岩藻糖基化比例(16％)，对于FVII-tg，岩藻糖基化的比例从24到42％，而对于FVII-rec则是100％的岩藻糖基化了。
实施例6：用NP-HPLC对N-聚糖定量
通过NP-HPLC对FVII-pd和FVII-tg进行N-糖基化的定性和定量分析。在对蛋白去盐以及干燥后，该蛋白通过对本领域技术人员熟知的程序进行变性和还原。之后聚糖通过酶途径(内切糖苷酶PNGase F)被释放，并用乙醇沉淀纯化。这样获得的聚糖通过荧光团：2-氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记。所标记的聚糖根据其亲水性用NP-HPLC(氨基-80柱-4，6/250mm-Tosohaas)分离。在注入前，该柱用80％乙腈平衡。寡糖用逐渐增加的50mM，pH4.5甲酸铵梯度，在等于或大于140分钟的时间内洗提。检测由荧光测定法实现(激发λ＝330nm；发射λ＝420nm)。
FVII-pd的色谱图(图4)显示主要的聚糖是二天线的，二唾液酸化的类型(A2)，比例为39％。也观察到了较低的量的二天线的，二唾液酸化的岩藻糖基化的(A2F)，单唾液酸化的(A1)和三唾液酸化的岩藻糖基化的和未岩藻糖基化的(A3F和A3)形式。
对于FVII-tg用NP-HPLC进行的分析证实了存在的主要寡糖是A1类型的，比例高达27％。A1F，A2和A2F的结构较少，而三天线的形式仅以痕量存在。这显示FVII-pd和较少唾液酸化的因子FVII-tg之间唾液酸化上的差异。
实施例7：用MALDI-TOFMS鉴定
质谱MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱)是一种可以精确测量肽、蛋白、聚糖、寡糖以及大部分可电离的聚合物的分子量的技术。
肽、蛋白、聚糖与基质混合，基质吸收所使用激光的波长。对于分析肽主要的基质是α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA)，对于蛋白是芥子酸(SA)，对于寡糖是2，5-二羟基苯甲酸(DHB)。
该方法包含用脉冲激光照射基质/被分析物的共晶(co-cristals)，导致基质和被分析物分子的解吸附。在气相电离后，被分析物分子将穿过飞行时间检测 器。考虑到质量和飞行时间是直接相关的，检测后者可以确定目标被分析物的质量。通过观测到的质量测量与理论质量相比而实施鉴定。基于所获得的离子碎片在MS/MS模式下进行排序。所使用的装置是Bruker Autoflex 2，在TOF和TOF/TOF模式下工作。
为了鉴定存在于FVII-tg的聚糖结构，对通过制备型NP-HPLC所获得的洗提部分进行MALDI-TOF MS分析(图5)。
对FVII-tg进行MALDI-TOF分析可以证实对用NP-HPLC分离的聚糖的鉴定，即大部分单唾液酸化的A1结构和少量形式的A1F，A2F以及A2类型。
本研究还可以确定三天线的，二唾液酸化的和三唾液酸化的少数形式，杂交形式和类型Man5和Man6-P-HexNAc的寡糖。
为了进一步鉴定聚糖结构，在去唾液酸化后对FVII-tg进行MALDI-TOF MS分析。
去唾液酸化后，观察到两种主要形式比例分别为35％和28％(由NP-HPLC量化)的G2和G2F的存在。这些结果与《天然的》产品(产品未去唾液酸化)结构的确定是一致的。
其他被鉴定的形式以微小的量存在，实质上是寡糖，Man6-P-HexNAc和Man7-P-HexNAc类型以及氢化物类型。注意到存在二岩藻糖基化形式。
实施例8：唾液酸-半乳糖连接的HPCE-LIF分析
关于唾液酸-半乳糖连接(分枝)研究的实验程序与在实施例5中已描述的相似。在用PNGase F去糖基化后，寡糖用特异性外切唾液酸酶处理，来保证鉴定和量化每个单独的结构。所使用的唾液酸酶是来自S.pneumoniae(对于α2-3连接有特异性，0.02IU，E/S＝0.4w/w)，C.perfringens(对α2-3和α2-6连接有特异性，0.04IU，E/S＝0.1w/w)etA.urefaciens(可以水解α2-3，α2-6，α2-8和α2-9连接，0.01 IU，E/S＝0.05w/w)的重组酶。
通过分析显示，FVII-rec具有二天线的，唾液酸化的，岩藻糖基化的聚糖结构，主要是A2F，以及二天线的，单唾液酸化的，岩藻糖基化的(A1F)形式。注意到，对于A2F和A1F这些结构，其与一般遇到的这些结构的转移时间相比具有非典型性的转移时间。就是说，这些唾液酸化的寡糖结构表现出在HPCE-LIF和NP-HPLC中与FVII-tg相比具有非典型性转移时间。另一方面，对单糖化合物的分析没有显示任何特别的与Neu5Ac不同的唾液酸，而质谱工具显示聚糖具有与二唾液酸化类型一致的质量。最后，FVII-rec聚糖的去唾液 酸化可以再次发现与FVII-tg和FVII＝pd的寡糖相同的层析与电泳行为。
因此这些在电泳和层析行为上的差异可用唾液酸的不同分枝来解释。该假设用HPCE-LIF和MS通过不同途径进行了评估。
结果被概括在以下表4中。
该结果显示在三种FVII水平上显著的唾液酸异构现象。事实上，FVII-rec的唾液酸包含α2-3连接，而FVII-tg变现出α2-6分枝，而FVII-pd则是这两种异构体的混合。
表4：不同批FVII中唾液酸的分枝
| 唾液酸化(％) | α2-3(％) | α2-6(％) | α2-8(％) | |
| FVII-pd | 100 | 41 | 59 | 0 |
| FVII-rec | 91 | 100 | 0 | 0 |
| FVII-tg Batch C | 96 | 0 | 100 | 0 |
在HPCE-LIF和NP-HPLC中观察到的FVII-rec聚糖相对于FVII-tg和FVII-pd不同的表现是与在唾液酸水平上的异构体差异相关联的。
实施例9：氧-糖基化的研究
FVII具有两个位于Ser52和Ser60位置上的氧-糖基化位点。这些残基分别包含葡萄糖-(木糖)0-2和岩藻糖部分。在本研究的框架内，氧-糖基化用LC-ESIMS(/MS)研究，以及使用相似的方法用MALDI-TOF(/TOF)研究(结果未示出)。
图10图解了样品FVII-pd，FVII-rec和FVII-tg的氧-聚糖的结构。在m/z3297.4的峰对应于包含在Ser52的葡萄糖-(木糖)2部分和Ser60上的岩藻糖的肽[Leu39-Lys62]。在m/z3165.4和3033.3的峰分别对应于在糖肽上减少1个和2个木糖。三种类型的FVII都统一地被岩藻糖基化和糖基化了，但是木糖残基的数量以及相对应的糖形态比例不同。这样，带有0，1和2个木糖的形式以基本相等的比例存在于FVII-pd，而FVII-rec和FVII-tg只含有0和2个木糖的形式。
质谱分析显示在m/z 1516.6处双倍电荷的离子对应于携带岩藻糖和葡萄糖(木糖)0的肽[Leu39-Lys62]。通过MS/MS获得的对应于不同单糖的连续质量损失，证实Ser52和Ser60分别用葡萄糖和岩藻糖残基作修饰。Edman测序可以按 照修饰位点备份这些结果。
同样的，在m/z 1648.7处双倍电荷的离子对应于携带岩藻糖和葡萄糖(木糖)2的肽[Leu39-Lys62]。由MS/MS获得的不同的离子碎片证实木糖部分与葡萄糖结合。
实施例10：γ-羧化作用的研究
FVII-pd的前10个谷氨酸是γ-羧化的，而FVII-rec的第十个谷氨酸只部分γ-羧化。为了研究转基因FVII以及其比较者的γ-羧化作用，在Asp-N和胰蛋白酶分解后获得的肽用LC-MS分析。结论与这两种酶相似，只显示了关于Asp-N分解的数据。
在这些实验条件下，三条含有γ-羧化作用的肽[Ala1-Lys32]，[Asp33-Ser45]和[Asp33-Gly47]被鉴定。肽[Ala1-Lys32]包含前9个γ-羧化的酸(Gla)，而另外两条肽[Asp33-Ser45]和[Asp33-Gly47]只包含第十个Gla残基。这样，更容易特异地研究第十个Gla残基的部分修饰。
对FVII-pd的质谱分析(图11)显示在4296.8Da处存在一主峰(～90％)，对应于前9个谷氨酸(Glu)的完全γ-羧化的肽[Ala1-Lys32]，以及在1658.8Da的峰，其为在第十个谷氨酸Glu35完全γ-羧化的肽[Asp33-Ser45]的特征。这些结果显示出与文献中的一致(Jurlander B.et al，Semin.Thromb.Hemost.，2001，27，373-384)，即FVII-pd的前10个谷氨酸残基被羧化的。
由于在相同的实验条件下获得了不同的数据，对不同批的FVII之间进行比较研究是合理的(表5)。
图11显示对于FVII-rec和FVII-tg，位于4296.8Da的峰，其对应于完全γ-羧化的肽[Ala1-Lys32]，是主要的。另一方面，对于这两种FVII，在1614.9的主峰的存在可以看见，其代表未在Gla35γ-羧化的肽[Asp33-Ser45]。该结果表明对于FVII-rec而言第十个Gla的部分γ-羧化作用评估为大约35％到40％，其与已公布值～50％一致(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793 and Jurlander B.et al，Semin.Thromb.Hemost.，2001，27，373-383)。带有8Gla具有不可忽略强度的肽[Ala1-Lys32]的存在也应当被报道。这最后一点表明，在该肽中，一个和多个Gla部分γ-羧化，带有7Gla形式的痕量的存在更可以强调涉及单一残基。
表5.关于Glu的γ-羧化数据的汇总。这些数据来自LC-ESIMS分析。Gla：γ-羧酸。
实施例11：双硫键的研究
对在非还原性条件下获得的胰蛋白酶水解产物进行关于FVII的二硫键的研究，非还原性条件即为二硫键得到维持的条件。
带有碘乙酰胺(iodacetamid)反应步骤被包括在内，来阻止可能的自由半胱氨酸(cysteins)，从而避免在碱性pH中实施的步骤中替换二硫键。
在这些条件下，可能证实12个二硫键的存在，并配对10个半胱氨酸(表6)。然而，应强调的是，所得到的结果与FVII的这段序列有关，并与理论上的配对一致。这些结论适用于两种被调查的样本：FVII-pd和FVII-tg。
表6.在对双硫键研究中获得的结果的汇总
所使用的实验策略被应用到二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]上，且没有任何翻译后修饰(MPT)(结果未示出)。该策略包含4个互补方法：i)通过对 ESI-MS和MALDI-MS的实验性的和所观察的质量进行双质量“匹配”而对含有双硫键的二肽进行鉴定，ii)通过化学还原S-S键对结构进行确认，并对二肽产生的两条肽进行MS鉴定，以及iii)用MS/MS和自动Edman微序列测定对二肽进行测序。
结果表明对于二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]通过实验性质量(3264.6Da)与理论性质量(3264.5Da)的《匹配》进行的第一次鉴定指出一双硫键Cys340-Cys368。
还原后，对应于包含键Cys340-Cys368的该二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]的峰的消失被注意到是让位于在m/z2816.3的峰，其为含有Cys368的肽[Gly354-Ser379]的特征峰(理论质量2816.3Da)。通过MS/MS和Edman chemistry进行测序证实了对二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]和其二硫键Cys340-Cys368的鉴定。
实施例12：天冬氨酸63的β-羧基化研究
对肽的分析从蛋白的胰蛋白酶“消化”开始实施。肽用MALDI-MS进行分析。对羟基化肽的鉴定是通过观察到的质量与理论质量比较的测量进行的。所使用的装置是BrukerAutoflex 2，按TOF模式运行。
不同的结果表示在表7中。应当强调的是文献报道当FVII-pd和FVII-rec样品的部分修饰可被观察到时，两者的β-羟基化会消失(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793)，然而这种现象不如在FVII-tg中出现的多。
表7.关于Asp63羟基化的数据的汇总。这些数据来自对胰蛋白酶水解肽的LC-ESIMS分析。
(＊)与FVII-tg相比β-羟基化作用较少的“丰富”。
(＊＊)引用自Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793的值
| Asp63羟基化作用 | |
| FVII-pd | 部分* |
| FVII-rec | 无** |
| FVII-tg | 部分 |
| FVII-tg | 部分 |
| FVII-tg | 部分 |
实施例13：对存在的Galα1，3Gal结构的研究
为了研究可能出现的FVII-tg的Galα1，3Gal结构，使用牛甲状腺球蛋白作为Galα1，3Gal结构的阳性对照。
产品在用PNGase F去糖基化后，用Galα1，3Gal分枝特异性唾液酸酶，岩藻糖苷酶和α-半乳糖苷酶处理。
图6说明了在牛甲状腺球蛋白上进行的天然形态(“Natif”)和去唾液酸的，去岩藻糖的和去α-半乳糖(Dsial+Dfuc+Dgalα(1，3，4，6))的形态叠加的研究。在α-半乳糖苷化后获得的聚糖形态显示这个结构在用酶处理后完全消失，从而证明所使用的α-半乳糖苷酶极具活性。所获得的Galα1，3Gal结构的比例是17.8％，其与预期比例一致。
图7图解了FVII-tg产品的去唾液酸化的和去岩藻糖化的电泳图谱(Dsial+Dfuc)与去唾液酸化的，去岩藻糖化的和去α-半乳糖的产品(Dsial+Dfuc+Dgalα(1，3，4，6))的叠加。
应当注意，两种形态都可完美地叠加。这些结果表明在FVII-tg中无Galα1，3Gal结构。应当注意到的是少数结构(*)的出现对应于不在中线位置的岩藻糖聚糖。
实施例14：Galα1，3Gal糖部分的量化
10μg人类重组和转基因FVII被按照二硫键还原条件处理，置于电泳凝胶上，并被转移到硝化纤维膜上。牛甲状腺球蛋白样品(Sigma，T1001，源于牛甲状腺的甲状腺球蛋白)由于其高的α(1，3)半乳糖抗原含量而作为阳性对照使用。α-Gal部分(半乳糖-α1-3半乳糖-(3)4乙酰葡萄糖胺-R)的存在通过纯化的过氧化物酶标记的α-Gal抗原特异性(EYLaboratories，H-9001，MOA-HRP)的Marasmius oreades植物凝集素得到显示。之后，过氧化物酶活性用生色底物检测(Fluka，4-氯-1-萘酚)并用信号数字化(Bio-Rad，Quantity-one)量化。同样的膜用阿尔法-半乳糖苷酶(Prozyme，Green coffee bean)处理来确定信号特异性。与此同时，总蛋白量也通过同样的SDS-PAGE胶用考马斯蓝着色来评估。
结果显示了植物凝聚素Marasmius oreades(MOA)的特异性作为观察到的对于牛甲状腺球蛋白强信号以及接着用阿尔法-半乳糖苷酶处理后的消失的结果。该结果用MOA信号的强度除以对应于被分析蛋白量的信号强度来表达，展示了FVII-tg样品中残留的α-Gal信号(2，3à3，7)水平，而重组FVII表现出 更高的值。
这些结果(见图8)展示了在兔中表达的转基因FVII没有α-Gal抗原或者α-Gal抗原非常弱，例如与仓鼠细胞中重组FVII产品相比。
表A概括了按照本发明的为提供本发明FVII合成物的优选实施例的处理步骤，并提供了在每一步后获得的产量，纯度以及比活性。
表A
Yld：产量
Claims (14)
1.一种转基因的因子VII的合成物，合成物的每个因子VII分子表现出在145和322位置有两个N－糖基化位点和在52和60位置有两个氧－糖基化位点，其特征在于：在合成物的所有因子VII分子中，含有Galα1,3Gal聚糖部分的比例在0到4％之间；其中在合成物因子VII的所有聚糖部分中，二天线、单唾液酸化的聚糖形式至少占聚糖形式的40％；其中在合成物因子VII的所有聚糖部分中，二天线、单唾液酸化、未岩藻糖基化的聚糖形式比例高于40％，其中因子VII是从转基因雌兔的奶中获得的。
2.根据权利要求1的合成物，其中至少65％的因子VII的唾液酸含有α2-6连接。
3.根据权利要求2的合成物，其中所有的因子VII的唾液酸含有α2-6连接。
4.根据权利要求2的合成物，其中所述合成物的因子VII中还包含含有α2-3连接的唾液酸。
5.根据权利要求1的合成物，其中在合成物中因子VII的所有聚糖部分中，至少50％是二天线的、单唾液酸化的聚糖形式。
6.根据权利要求5的合成物，其中在合成物因子VII的所有聚糖部分中，至少60％是二天线、单唾液酸化的聚糖形式。
7.根据权利要求6的合成物，其中因子VII所包含的岩藻糖基化比例在20％到50％之间。
8.根据权利要求1的合成物，其中因子VII是活化的。
9.根据权利要求1到8中的任意一个的因子VII的合成物，用于药物用途。
10.一种根据权利要求1到8中任意一个的因子VII合成物的用途，用于制备用于治疗患有血友病的病人的药物。
11.一种根据权利要求1到8中任意一个的因子VII合成物的用途，用于制备用于治疗多发出血性损伤的药物。
12.一种根据权利要求1到8中任意一个的因子VII合成物的用途，用于制备采用手术止血治疗大量不可控制出血的药物。
13.一种根据权利要求1到8中任意一个的因子VII合成物的用途，用于制备用于治疗由于抗凝血剂过量而发生的流血或出血的药物。
14.一种药物合成物，其包含根据权利要求1到8中任一所定义的因子VII以及药物学上可接受的赋形剂和/或载体。
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