TW201509954A - 具有一實質上同質之等電點的因子ｖｉｉ組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種具有實質上同質之等電點的因子VII組成物，以及一種配製此種因子VII組成物的方法。本發明也係關於具有實質上同質之等電點的因子VII組成物的治療用途。

Description

具有一實質上同質之等電點的因子VII組成物
本發明係關於一種具有實質上同質之等電點的因子VII組成物，以及一種配製此種因子VII組成物的方法。本發明也係關於具有實質上同質之等電點的因子VII組成物的治療用途。
因子VII(Factor VII,FVII)是一種依賴維他命K的醣蛋白，其與外在途徑的血液凝結(blood coagulation)有關，在其活化型態(FVIIa)下，因子VIIa涉及藉由與組織因子(factor,TF)形成複合物，以及藉由分別活化因子X、因子IX成為因子Xa、因子IXa的凝結程序。當造成血液凝結的級聯(cascade)反應被中斷或缺乏時，例如：在缺少VII或IX的情況下，FVIIa更具有觸發血液之凝結的能力。這便是為什麼因子VII長時間以來已被用作治療一些由出血所表現之血液凝結特定疾病的藥物，特別是用來治療具有因子VIII缺失(A型血友病)或因子IX缺失(B型血友病)以及具有抵抗這些因子之抑制子(inhibitor)的病人、治療具有凝血因子VII缺失的病人，或是作為避免外科手術期間可能發生的溢血(hemorrhage)之產品。
血漿因子VII以具有406個胺基酸的一單肽鏈之形式被分泌，具有約為50kDa的分子量，當其活化成FVIIa時，精氨酸152-異白氨酸153(Arg152-Ile153)的鍵結會斷裂。因此由此產生的因子VIIa由具有約為20kDa之分子量之152個氨基酸的輕鏈)及具有約為30kDa之分子量之254個氨基酸的重鏈經由單一雙硫鍵結(Cys135-Cys262)連接在一起所組成。
因子VII的序列中可被辨識出四個不同的結構域：一個N端γ-羧基域(γ-carboxylic domain,Gla domain)、兩個“類表皮生長(epidermal growth factor(EGF)-like)因子”域以及一個絲氨酸蛋白酶(serine protease)域。
血漿因子VIIa更包含數種轉譯後修飾：γ-羧基化(γ-carboxylation)其序列的前10個谷氨酸(glutamine)、部分羥基化(hydroxylation)的天門冬胺酸63(Asp63)、O-糖基化(O-glycosylation)的絲氨酸52(Ser52)及絲氨酸60(Ser60)、N-糖化的天冬醯胺145(Asn145)及天冬醯胺322(Asn322)。(Fenaille F.et al.,Mass spectrometric characterization of N-and O-glycans of plasma-derived coagulation factor VII.Glycoconj.J.25.9(2008)：827-42.)
因此，因子VII的生物活性強烈地依賴其性質及連接到蛋白質上的寡糖(oligosaccharide)結構的比例，且蛋白質上的寡糖結構可能影響到治療效率的許多方面，例如：溶解度、對抗蛋白水解攻擊的能力、熱失活(thermal inactivation)、免疫力、半生期、生物活性、生物可及性(bioavailability)及因子VII的穩定性。
這些經常隨不同的血漿因子VII而異之轉譯後修飾似乎導致存在於因子VII之醫藥物組成物中的一些分子的異質性(heterogeneity)，這種異質性，考量到用以治療病人的醫藥組成物的製備，特別是具有使配製因子VII的步驟複雜化的缺點。確實地，在配製步驟期間，經常有很大一部分比例經純化的因子VII分子沉澱，此結果為活性原始材料的損失，以及在用以治療處理的醫藥組成物中已變為失活的因子VII的存在。
由於使用人類血漿作為醫藥產品的來源有許多的缺點(病毒污染的風險、純化及供給的困難...等))，現今較喜歡在重組的(recombinant)或基因轉殖(transgenic)系統製造因子VII。然而，糖化作用是一種複雜的轉譯後修飾，其直接依賴於所使用之細胞系統，大規模地於異質細胞中生產蛋白質，通常會造成所生產的多胜肽具有相同的一級結構，但卻具有多變的寡糖結構。
例如NovoSeven®的案例，NovoSeven®是一種由丹麥公司NovoNordordisk所製造的藥物，從1996年起於歐洲市場取得授權、從1999年起於美國市場取得授權，此藥物的活性成分是eptacog alpha(藉由來自新生倉鼠的BKH腎臟細胞的基因工程所產生的人類重組的活化凝血因子VII)。
在LFB Biotechnologies於2007年5月31日申請之專利案EP2 037 955 A中所敘述的重組的基因轉殖FVII也是一個例子。
從而，對這些重組的因子VII來說，由因子VII分子具有的轉錄後修飾的異質性，藉由促進沉澱的因子VII分子的 存在干擾了配製步驟，以及造成最終醫藥產品的穩定性及/或專一活性降低。此結果為，對於管理製備具有均勻性及預先確定的臨床效率之藥學上可接受之而言，具有許多困難。
因此，對於在室溫下具有經改善之化學及物理穩定性且具有促進與改善用以製備醫藥組成物之配製步驟之產量之能力的因子VII而言，存在持續增加的需求，而上述醫藥組成物係用來治療罹患因抑制子之血友病或先天性因子VII缺失的病患。
申請人意外地發現，具有實質上同質的等電點的因子VII分子之因子VII組成物，於理想的pH下，較佳為pH6.0±0.2促進醫藥組成物的配製步驟且避免了因子VII的沉澱。
因此，本發明是關於具有實質上同質的等電點的因子VII分子之因子VII組成物。
在一特定的實施例中，本發明是關於因子VII組成物，於其中，在上述組成物之因子VII的所有N-多糖(N-glycan)形式之中，至少60%的N-多糖形式為單荷載(monocharged)，及在組成物的因子VII分子之中，至少80%的分子在谷胺酸(glutamic acid)的9個殘基上具有γ-羧基化。
在一特定的實施例中，組成物的因子VII之N-多糖形式的至少65%，較佳至少70%，或較佳至少80%為單荷載。
在一特定的實施例中，至少85%，較佳85%至100%，或較佳90%至100%，或較佳95%至100%之組成物的因 子VII分子，在谷胺酸的9個殘基上具有γ-羧基化
在一特定的實施例中，本發明的因子VII組成物在谷胺酸35(Glu35，相較於血漿因子VII的序列)的殘基上之γ-羧基化程度小於20%，或較佳小於15%，或更佳小於10%，較佳小於5%。
在一特定實施例中，本發明是關於一種因子VII組成物，上述組成物的因子VII之N-多糖形式的至少60%為單唾液酸化(monosialylated)複合物。
在一特定實施例中，組成物的因子VII之N-多糖形式的至少10%，較佳至少15%，或較佳至少20%，或較佳至少25%為高甘露糖(mannose)/混合型(hybrid)。
在一特定實施例中，至少90%，較佳至少95%的組成物之因子VII分子，具有被包括在小於1.2之一pH單位間隔中的等電點。
在一特定實施例中，至少50%，較佳至少55%，較佳至少60%的組成物的因子VII分子，具有被包括在小於1；較佳，小於0.5；或較佳小於0.4之一pH單位間隔內的等電點。
在另一特定實施例中，本發明的因子VII為重組的或基因轉殖的因子VII。較佳的是，組成物的因子VII是由基因轉殖兔所製造。在一實施例中，組成物的因子VII是一經活化的因子VII。
本發明的另一個目標是關於因子VII組成物用於出血事件(bleeding episodes)的治療及預防下述病人於外科手術或侵入式手術期間發生之溢血(hemorrhages)的用途： - 患有起因於針對凝血因子VIII或凝血因子IX之抑制子(inhobitor)之先天性血友病(A型血友病或B型血友病)的病人；- 患有於其中對於因子VIII或因子IX投予之一強烈記憶性反應是可預期之先天性血友病的病人；- 患有後天性血友病的病人；- 及/或有先天性FVII缺失的病人。
本發明的另一個目標是有關獲得因子VII組成物的方法，根據本發明，包括以下步驟：(a)插入包括編碼出因子VII的基因之去氧核醣核酸(DNA)序列於一非人類的哺乳動物胚胎(embryonic non-human mammal)中，且上述基因是受β-酪蛋白啟動子(beta-casein promoter)之轉錄調控；(b)將步驟(a)獲得之胚胎轉移至一雌性的非人類哺乳動物的輸卵管之中，使該胚胎發育為一成體哺乳動物；(c)誘導步驟(b)獲得之該非人類成體哺乳動物的雌性類型或誘導非人類的哺乳動物之一雌性後代進入哺乳期，其中該基因與該啟動子存在於其基因體中；(d)收集上述非人類的哺乳動物的乳汁，以及；(e)純化於所收集的乳汁之中的因子VII。
本發明的另一個目標是關於一種配製因子VII組成物的方法，包括：混合根據本發明之因子VII組成物及一緩衝溶液，若需要的話調整pH值，過濾，且之後若需要的話進行乾燥以取得固態形式。
本發明的其它特色及優點將藉由閱讀接下來的詳 細描述變得顯著，以及本發明較佳的實施例之特色及優點將以例子及所附圖是作為參考。
第1圖：本發明之因子VII的方法純化及萃取方法。
第2圖：本發明之因子VII的N端胜肽[Ala1-Arg36]及[Ala1-Lys32]的質量圖譜。
第3圖：本發明之因子VII的N-多糖形式的電荷圖，其是藉由具有陰離子交換樹脂的超高效液相層析結合螢光偵測(<<AEX-UPLC/FD>>)所得到。
第4圖：藉由等電聚焦(<<IEF>>)方法所獲得之本發明的因子VII及重組的因子VII(NovoSeven®)之等電點的比較。
第5圖：本發明之因子VII、來自WO2007/138199的因子VII以及重組的因子VII(NovoSeven®)的N-多糖形式之電荷圖，其是藉由具有陰離子交換樹脂的超高效液相層析結合螢光偵測(<<AEX-UPLC/FD>>)所得到。
第6圖：用以產生表現根據本發明的人類重組FVII的非人類哺乳動物的表現載體(expression vector)。
根據本發明之在常溫下為化學地及物理地穩定，且易於配製的因子VII組成物，其特色在於組成其之因子VII分子具有實質上同質的等電點。
有利的是，根據本發明之因子VII組成物包括因子VII分子，其為具有實質上同質的等電點之因子VII分子。
<<因子VII>>或<<FVII>>，意指包括野生型(wild type)的人類因子VII的序列1-406之多胜肽(例如，於ZymoGenetics Inc.的專利US 4,784,950 A中所述)，或是由其他物種(例如，牛、豬、兔子、山羊或鼠類物種)取得之因子VII的序列1-406之多胜肽。其更進一步包括可能存在之因子VII的自然等位變異(allelic variation)。用詞<<因子VII>>也包括相較於野生型之活性具有相同活性或更高的生物活性(biological activity)之FVII的變異體(variant)，這些變異體特別地包括：藉由插入、刪除或取代一或數個胺基酸而與野生型FVII不同之多胜肽。
<<因子VII>>或<<FVII>>之用詞也包括未切割的(non-cleaved)因子VII(酵素原，zymogen)及活化的因子VII(<<因子VIIa>>或<<FVIIa>>)，在本發明一較佳的實施例中，根據本發明之組成物中使用的因子VII較佳為活化的。
<<因子VIIa的生物活性>>的表達可理解為FVIIa製造凝血酵素(thrombim)的能力，例如，在活化的血小板的表面。於根據本發明之組成物中的因子VII的活性可藉由不同方法被評定。
FVIIa的生物活性可藉由，例如，如在美國專利號US 5,997,864中所述，藉由使用FVII-及凝血酶缺失的血漿來測量FVII組成物促進血液凝結的能力被量化。在此測試中，生物活性是相對於對照組被評估，且藉由與含有一單位每毫升(unit/ml)因子VII活性的混合標準人體血漿(pooled standard human serum)比較，轉換為<<FVII單位>>。或者，因子VII的 生物活性可被量化，(i)藉由測量在包括被包含於脂質膜中之組織因子(tissue factor,TF)及一些因子X(factor X)的系統中，因子VIIa產生因子Xa的能力(Persson et al.J.Biol.Chem.272：19919-19924,1997)；(ii)藉由測量因子X在水性系統中之水解(請參見下述之<<一般方法>>)；(iii)藉由測量FVIIa藉由表面電漿共振(surface plasmon resonance)對組織因子的物理鍵結(Persson,FEBS letts,413：359-363,1997)；(iv)藉由測量合成基質的水解；以及(v)藉由測量不受組織因子支配的in vitro系統中凝血酵素的產生。
在一特定的實施例中，本發明之因子VII為重組的因子VII。<<重組的因子VII>>，是指任何因子VII，其源自基因工程及來自在任一微生物、植物、基因轉殖的植物、動物或基因轉殖的動物之相應基因的表現。而微生物，是指任一細菌、真菌、病毒或細胞系統。重組的因子VII也可由於培養中之真核細胞製造，例如，植物或哺乳動物細胞，例如動物或人類細胞。
因此，本發明之因子VII是藉由於宿主細胞中編碼出FVII的DNA分子之轉錄及轉譯而取得。可利用本領域技藝人士習知的標準技術讓蛋白質表現於生物系統中，以獲得本發明之重組的FVII。
更精確地，用詞“重組的FVII”是指藉由基因重組及表現在培養的細胞株中的任一FVII。例子可為下述的細胞株：BHK(Baby,Hamster Kidney)特別是BHK tk”tsl3(CRL 10314,Waechter and Baserga,Proc Natl Acad Sci USA 79：1106-1110, 1982....)、CHO(ATCC CCL 61)、COS-I(ATCC CRL 1650)、HEK293(ATCC CRL 1573.Graham et al,J.Gen.Virol 36：59-72,Gen 1977)、Rat Hep I(Rat hepatoma；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II(Rat hepatoma；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人類肺臟(Human lung)(ATCC HB 8055)、NCTC 1469(ACTT CCL 9.1)及DUKX細胞(CHO細胞株)(Urlaub and Chasin,Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220,1980)、3T3細胞、Namalwa細胞、或是適應於無血漿培養的BHK細胞(美國專利US 6,903,069)。
在一特定的實施例中，細胞株被修飾用以產生根據本發明之組成物，例如，藉由調整糖基轉移酶(glycosyltransferase)的表現，特別是過量表現唾液酸轉移酶(sialyltransferase)。
在一特定的實施例中，本發明之因子VII為基因轉殖的因子VII，而<<基因轉殖的因子VII>>，是指任一從轉殖基因的動物所取得之重組的因子VII。
<<基因轉殖的動物>>，是指任一非人類的動物為了能夠表現根據本發明之因子VII而具有修改之基因體。基因體的修飾有利地是產生自一基因的更改、修飾或插入。這種修改可能是由於傳統的更改劑(altering agent)、突變劑(mutagen)的作用或其他藉由執行定向突變(directed mutagenesis)而產生。基因體的修改也可能是由在野生型或突變型中基因之插入或基因之取代而產生。在一較佳實施例中，本發明之因子VII是由基因轉殖的動物的乳汁取得。根據本發明的基因轉殖的動 物可擇自兔子、山羊、牛、駱駝、倉鼠、小鼠、大鼠、馬、母豬、單峰駱駝、母羊、羊駝，但不限於此。較佳的是，本發明的因子VII是取自基因轉殖兔之乳汁。因子VII藉由乳腺(mammary gland)分泌，允許其分泌於基因轉殖的哺乳動物的乳汁中，其涉及以組織依賴性(tissue-dependent)方法控制因子VII的表現。這種控制方法是本領域技藝人士熟知的。表現的控制是由允許蛋白質於特定組織中表現的序列所實行。特別地，這些是WAP、β-酪蛋白(β-casein)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)啟動子序列及訊號胜肽序列(signal peptide sequence)，但不僅限於此。特別有利的是，兔子的乳腺之表現是由β-酪蛋白啟動子所執行，為本技術領域人士所熟知。
一種於基因轉殖的動物的乳汁產生重組蛋白質的方法可包括以下步驟：一合成之DNA分子包括編碼出人類FVII的基因，此基因是被自然分泌至乳汁中之蛋白質的啟動子所控制，並將合成的DNA分子整合至非人類的哺乳動物的胚胎中。胚胎接著被放置於同物種的雌性哺乳動物之中。一旦由胚胎獲得的哺乳動物已經充分發育，誘導哺乳動物分泌乳汁，接著收集乳汁。乳汁中即含有由基因轉殖動物所分泌感興趣的FVII。
在排除人類的雌性哺乳動物的乳汁中蛋白質之製備的的例子被提供於申請案EP 0 527 063B1(Institute National de la Recherche Agronomique(National Institute for Agronomic Research))中，其之教示可再次利用於產生本發明之因子VII。
在一較佳的實施例中，根據本發明之因子VII是產生在基因轉殖兔的乳汁中。特別的是，藉由引入包括β-酪蛋白 基因之啟動子的一序列以製備含有β-酪蛋白啟動子的一質體(plasmid)，建構之質體用以接受被置於此啟動子控制下的外來基因。編碼出人類FVII的基因被整合且被置於β-酪蛋白啟動子之依屬(dependency)下。包含啟動子及編碼感興趣蛋白質的序列之質體經限制酶(restriction enzyme)切割(digest)以釋放含有β-酪蛋白啟動子及人類FVII的序列之DNA片段。純化後，片段藉由微注射(microinjection)導入至野生型的雄性原核仁(pronucleus)中。胚胎接著被培養在轉移至荷爾蒙預備(hormonally prepared)的野生型雌性之輸卵管中之前。於雌性生產後，後代藉由PCR被評估以判別基因轉殖動物。轉殖基因(transgenes)的複製數量及其完整性是由獲得的基因轉殖幼兔的萃取的DNA，進行南方點墨分析(Southern blotting)而得知。於人類乳汁中之基因轉殖動物FVII的濃度是經由使用特定的放射免疫測試(radioimmunoassay)來測定。
在一特定得實施例中，根據本發明之因子VII的組成物是藉由包括下述步驟之方法獲得：(a)插入包括編碼出因子VII的基因之DNA序列於一非人類的哺乳動物胚胎(embryonic non-human mammal)中，且上述基因是受β-酪蛋白啟動子之轉錄調控；(b)將步驟(a)獲得之胚胎轉移至一雌性的非人類哺乳動物的輸卵管之中，使該胚胎發育為一成體哺乳動物；(c)誘導步驟(b)獲得之成體非人類哺乳動物的雌性類型或該非人類的哺乳動物之一雌性後代進入哺乳期，其中上述基因中及啟動子存在於其基因體中； (d)收集上述非人類的哺乳動物的乳汁，以及；(e)純化於所收集的乳汁之中的因子VII。
在一特定實施例中，成體非人類哺乳動物或非人類哺乳動物的雌性後代，特別是，由其產生根據本發明之因子VII組成物的能力被選擇。基因轉殖的動物也可根據其他準則被選擇，例如只有一個整合位(integration site)的出現及/或產物的完整性。
在一特定的實施例中，包括在非人類的哺乳動物胚胎中編碼出因子VII的基因之DNA序列的插入是藉由微注射，更特定地，至兔子胚胎的雄性原核仁中，所述基因是受β-酪蛋白啟動子的轉錄調控。
“胚胎”，是指一非人類哺乳動物，更特定地，受精的兔子的一胚胎之雄性或雌性的原核仁。
<<等電點>>或<<pI>>，是指因子VII或因子VIIa分子的淨基本電荷(elementary charge)為零的pH值，即，分子是電中性(兩性離子形式，zwitterionic form)時的pH值。根據本發明的因子VII的等電點可藉提供由本領域技藝人士熟知的技術來測量，像是等電聚焦(isoelectric focusing,<<IEF>>)。此種電泳技術使蛋白質的分離是依據它們的等電點。其存在於由均一電流誘發pH梯度(pH gradient)中的蛋白質移動，直到它們達到具有與其特定的等電點相同的pH時，此時它們便停止移動因其靜電荷為零。IEF膠被用以測定給定的蛋白質之等電點及用以偵測後者由於轉譯後(post-translational)修飾，例如，γ-羧基化、磷酸化或糖化作用的微小改變。
<<實質上同質的>>，是指至少90%，較佳至少95%的組成物之因子VII分子，具有被包括在小於或等於1.2之一pH單位間隔(pH unit interval)中的等電點。在本發明的另一實施例中，至少50%，較佳至少55%，較佳60%的組成物之因子VII分子，具有被包括在小於1，較佳小於0.5之一pH單位間隔中的等電點。在另一較佳的實施例中，至少50%，較佳至少55%，較佳60%的組成物之因子VII分子，具有被包括在0.4之一pH單位間隔中的等電點。
<<N-多糖形式>>，是指存在於本發明之因子VII之兩個N-糖化作用位置上所有N-多糖形式。若N-多糖形式的總荷載(charge)等於1，則稱作單荷載，在本發明中的判斷，<<荷載>>，是指磷酸基團、硫酸基團或唾液酸(sialic acid)分子。因此，若N-多糖形式僅含有一個磷酸基團、一個硫酸基團或一個唾液酸分子，則上述N-多糖形式被稱為單荷載。相對於<<單荷載>>一詞，<<雙荷載>>一詞是指N-多糖形式所具有的總荷載等於2，即，它們具有擇自磷酸基團、硫酸基團及/或唾液酸分子的兩個荷載，換言之，N-多糖雙荷載的形式具有一個唾液酸分子及一個磷酸基團、或一個唾液酸分子及一個硫酸基團、或兩個唾液酸分子、或兩個磷酸基團、或兩個硫酸基團、或是一個磷酸基團及一個硫酸基團。而<<中性的>>的意思是指N-多糖形式不含有任何荷載。
根據本發明的因子VII的多糖形式的荷載可藉由提供本領域技藝人士所熟知的技術來測量，特別地，藉由具有陰離子交換樹脂的超高效液相層析結合上螢光偵測(ultra-high performance liquid chromatography with an anion exchanger resin coupled with detection by fluorescence,AEX-UPLC/FD)，利用此方法，可能可根據它們顯而易見的荷載而分離不同的N-多糖形式(參見特別是Hermentin et al.,Glycobiology,Vol.6,No.2,1996)。在陰離子交換層析部分，帶正電的樹脂被使用作為固定相(stationary phase)。這些帶正電的樹脂通常由交聯的(cross-linked)高分子或膠體所組成，在其上接枝有(grafted)帶正電的基團。在本發明一較佳的實施例中，使用的是氨基丙基(amino propyl)型的低陰離子交換管柱(low anion exchange chromatography)。
申請人更特別地證明了根據本發明之因子VII之組成物的實質上同質之等電點，是源自因子VII分子之糖化作用及γ-羧基化的特性之結合所產生。
形成根據本發明的組成物的因子VII分子包括，相似於人類血漿因子VII，兩個N-糖化位置，在位置145及332，以及兩個O-糖化作用位置，在位置52及60。這些位置的任一個可接受<<多糖>>、<<糖鏈>>或<<寡糖鏈>>。組成物的每個因子VII分子所具有的N-糖化及/或O-糖化寡糖鏈可能一分子中會與另一個不同。但是，可能可藉由本領域技藝人士熟知的技術來測量於根據因子VII組成物中每一種單元的分佈。
對於根據本發明的因子VII組成物而言，其顯示在組成物的因子VII的所有N-多糖形式之中，至少60%的N-多糖形式，較佳至少65%，較佳至少70%，較佳至少75%，較佳至少80%，較佳至少85%，較佳至少90%，較佳至少95%為單荷載。 在一較佳實施例中，組成物的因子VII分子具有單荷載N-多糖形式顯示為組成物的因子VII的60%至90%之間，較佳為組成物的因子VII的65%至90%之間，較佳為組成物的因子VII的70%至85%之間，較佳為組成物的因子VII的70%至80%之間，較佳為組成物的因子VII的74%至77%之間。
在本發明的因子VII組成物的情況中，似乎在組成物的因子VII的所有N-多糖形式之中，3%至10%之間，較佳3%至7%之間的N-多糖形式為中性的。
在本發明的因子VII組成物的情況中，似乎在組成物的因子VII的所有N-多糖形式之中，15%至25%之間，較佳18%至22%之間的N-多糖形式為雙荷載的。
在本發明的因子VII組成物的情況中，似乎在組成物的因子VII的所有N-多糖形式之中，小於5%，較佳小於2%，較佳小於1%的N-多糖形式為三荷載(tricharged)的。
在本發明的因子VII組成物的情況中，似乎在組成物的因子VII的所有N-多糖形式之中，小於5%，較佳小於2%，較佳小於1%的N-多糖形式為四荷載(tetracharged)的。
由於本發明的目的，應理解的是，上述之百分比並不因此考慮到涉及O-糖化作用的多糖形式。
此外，形成本發明組成物的因子VII分子僅包括藉由α2-6鏈結型式鍵結之唾液酸，申請人也注意到因子VII的海藻糖(fucose)含量並不會影響組成物的因子VII之等電點。
在根據本發明的因子VII組成物的情況中，似乎至少60%，較佳至少65%，較佳至少70%的組成物的因子VII的N- 多糖形式為單唾液酸化(monosialylated)的複合物。
複合(complex)的N-多糖形式是本領域技藝人士所熟知的形式(參見特別是Kornfeld R et al,Annual Review of Biochemistry.1985；54：631-64.Assembly of asparagine-linked oligosaccharides.)
在一特定實施例中，至少10%，較佳至少15%，較佳至少20%，較佳至少25%的組成物的因子VII的N-多糖形式為高甘露糖/混合型(high mannose/hybrid)。
<<γ-羧基化>>，是指一種生化反應的產物，目的在於將存在於因子VII的多胜肽序列中的複數個谷胺酸殘基轉化為羧基-谷胺酸或“GLA”殘基。
有利地，形成根據本發明的組成物的因子VII分子，至少80%的它們，在谷胺酸的九個殘基上具有γ-羧基化。在另一實施例中，至少85%的上述分子在谷胺酸的九個殘基上具有γ-羧基化。在另一實施例中，85%至100%之間，較佳90%至100%之間，較佳95%至100%之間的上述分子，在谷胺酸的9個殘基上具有γ-羧基化。有利地，組成物的因子VII分子之谷胺酸35(Glu35)的殘基之γ-羧基化程度小於20%。在另一實施例中，Glu35的殘基之γ-羧基化程度小於15%，較佳小於10%，較佳小於5%。
申請人意外地發現正是單荷載的N-多糖形式程度及γ-羧基化程度的特定結合，造成形成根據本發明組成物的因子VII分子之實質上同質的等電點。
本發明的FVII組成物可有利地於不造成組成其之 FVII分子沉澱的情況下配製。確實地，已知在分子的等電點，分子會聚集且沉澱。形成根據本發明組成物的因子VII分子具有被包括在pH介於6.6至7.0之等電點。此之結果是根據本發明的因子VII組成物具有較佳的穩定性，特別是在低於等電點的pH下製備因子VII組成物，且特別是在pH為6。根據本發明的因子VII組成物的穩定性之改善，給予避免造成可溶型及非可溶型的沉澱及聚集現象之靜電反應的可能性，且也可避免活性原始材料的損失及因此降低產量，導致活性成分的含量損失且可能因而損失活性。
本發明的另一個目的是關於根據本發明之活化的因子VII的一種純化方法。
基因轉殖兔的乳汁是從基因轉殖兔品系R69所獲得，經冷凍的基因轉殖兔的乳汁經解凍且被濃縮成來自基因轉殖兔的乳汁池(milk pool)的形式。
由此得到之基因轉殖兔的乳汁池接著進行澄清步驟，利用具有孔洞深度0.2μm的濾器，用以移除脂質及非可溶化合物。由此得到的澄清乳汁接著進行病毒去活化(viral inactivation)步驟，藉由與洗滌劑(detergent)型的溶劑，例如，聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)或磷酸三正丁酯(Tri-n-Butyl Phosphate)在25℃±2℃處理至少兩個小時。這樣的處理顯著地給予有效地去活化病毒之可能性，且特別是不具外套膜(non-enveloped)的病毒種類之病毒。經澄清及病毒去活化的乳汁接著進行親和性層析步驟，其利用因子VII/因子VIIa的特定的親和性配體(ligand)。將於此層析步驟結束時所獲得的因子 VII之洗出液(eluate)接著進行超過濾(ultra-filtration)及配製步驟，由此給予了得到具有95%純度之因子VII的濃縮中間產物的可能性。
因子VII的濃縮中間產物接著進行過濾步驟，利用具有0.2μm至0.2μm孔洞的濾器，接續為一奈米過濾步驟，其利用具有20nm孔洞及15nm孔洞的濾器。由此獲得之含有因子VII的產物接著進行Q-Sepharose XL膠體型的層析步驟及接續的CHT-I型層析步驟，接續為SEC Superdex 200型之層析，由此取得之因子VII的濃縮物接著進行穩定化(stabilization)步驟及接著過濾步驟，其使用具有0.2μm孔洞的濾器。
由上述方法所獲得之因子VII濃縮物可能可具有約99.9995%之純度。
在一較佳的實施例中，因子VII的純化及萃取的方法為於歐洲專利EP12305882中所述的一個。
本發明的另一個目的是關於一種配製根據本發明之活化的因子VII組成物的方法。
有利地，所使用的配製方法為申請案WO2010/149907中所述的一個。
此方法特別地包括，將根據本發明之活化的因子VII組成物與緩衝溶液混合，若需要的話調整pH值，過濾，且之後若需要的話進行乾燥以取得固態形式。
在一較佳的實施例中，混合活化的因子VII組成物及緩衝溶液之步驟是被用於膠體滲透(gel permeation)型的層析中。<<緩衝溶液>>之用詞包括至少一種親水性胺基酸或具有 帶正電的支鏈、鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或過渡金屬鹽。可能特別地提到三鈉檸檬酸鹽(trisodium citrate)、氯化鈣或氯化鋅。使用的鹽較佳為檸檬酸鈉鹽或氯化鈣。有利地，緩衝溶液也可包含至少一種疏水性胺基酸。
有利地，緩衝溶液包括以下之一或數種成分擇自：- 一鹽類，較佳為檸檬酸鹽，較佳為三鈉檸檬酸鹽；- 一氨基酸或親水性胺基酸鹽，較佳為一親水性胺基酸鹽，較佳為精胺酸鹽酸鹽(arginine hydrochloride)及/或賴胺酸鹽酸鹽(lysine hydrochloride)；- 一胺基酸或疏水性胺基酸鹽，較佳為一疏水性胺基酸，較佳為異白胺酸及/或甘胺酸。
最後，本發明之組成物可包括一或數種非離子(non-ionic)型的洗滌劑，例如：聚山梨醇酯(polysorbates)、泊洛沙姆(polyoxamers)、聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ethers)、乙酯/聚丙烯嵌段聚合物(ethyl/polypropylene block polymer)、聚乙二醇(polyethylene glycol)。有利地，較佳的洗滌劑為聚山梨醇酯80(polysorbate 80)及聚山梨醇酯20(polysorbate 20)。
有利地，在與緩衝溶液混合的步驟最後所得到之因子VII組成物包括：- 根據本發明的因子VII，較佳處於活化型式；- 10至40g/l的精胺酸，選擇性地為鹽酸鹽型式；- 4.2至6.6g/l的異白胺酸；- 0.6至1.8g/l的賴胺酸； - 0.6至1.8g/l的甘胺酸；- 1至2g/l的脫水三鈉檸檬酸鹽或0至0.2g/l的氯化鈣二水合物；及若需要的話0至0.5g/l的聚山梨醇酯80。
根據一特定實施例，在與緩衝溶液混合的步驟最後所得到之因子組成物包括，一些濃度在0.2至2g/l範圍的因子VII(較佳為因子VIIa型式)、24g/l的精胺酸鹽酸鹽、6g/l的異白胺酸、1.5g/l的脫水三鈉檸檬酸鹽、1.2g/l的甘胺酸、1.2g/l的賴胺酸鹽酸鹽及/或0.07g/l的聚山梨醇酯80。
在一特定的實施例中，在與緩衝溶液混合的步驟之後所得到之因子的組成物包括，0.2至2g/l的因子VII(較佳為因子VIIa型式)、24g/l的精胺酸鹽酸鹽、6g/l的異白胺酸、1.5g/l的脫水三鈉檸檬酸鹽、1.2g/l的甘胺酸、1.2g/l的賴胺酸鹽酸鹽及/或0.09g/l的聚山梨醇酯80。
在另一特定的實施例中，在與緩衝溶液混合的步驟最後所得到之因子VII組成物包括，0.2至2g/l的因子VII(較佳為因子VIIa型式)、34g/l的精胺酸鹽酸鹽、0.15g/l的氯化鈣二水合物、6g/l的異白胺酸。
較佳地，本發明的因子VII組成物是不含有任何糖類、聚醇(polyol)或蛋胺酸(methionine)。應特別地避免之糖類包括，除了蔗糖，還有雙糖類、三糖類及多糖類，例如，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖(trehalose)、環糊精(cyclodextrin)、麥芽糊精(maltodextrin)及六碳糖(dextran)。應特別地避免之聚醇包括，山梨醇(sorbitol)及木糖醇(xylitol)以及甘露醇(mannitol)。
仍較佳為，組成物沒有甘氨醯甘氨酸(glycylglycine)。仍較佳為，組成物沒有甘氨醯甘氨酸(glycylglycine)。
根據一較佳的實施例中，本發明之組成物更不含任何抗氧化劑，抗氧化劑。抗氧化劑之例子，包括一或數種下列化合物：高半胱胺酸(homocysteine)、半胱胺酸(cysteine)、胱胺硫(cystathionine)、蛋胺酸(methionine)、谷胱甘肽(glutathione)。
溶液的pH值在乾燥前，較佳是被包括在4.0至9.0之間，更佳在範圍4.0至8.0；4.0至7.5；4.5至7.5；5.0至7.5；5.5至7.0；6.0至7.5；及6.5至7.5。
乾燥是廣泛地移除水分的方法。此脫水作用目的在於盡可能地移除水分。這個現象可以自然發生或迫使其發生。乾燥可藉由冷凍乾燥、霧化(atomization)及低溫霧化(cryoatomization)技術達成。取得根據本發明作為醫藥用途的組成物之固態形式的較佳方法是冷凍乾燥。冷凍乾燥的方法是本領技藝人士熟知的，例如可參見[Wang et al.,Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals,International Journal of Pharmaceutics,Vol.203,p 1-60,2000]。
其他適合降低組成物的水含量的濕度水平(humidity level)之方法可被考慮。較佳的是，濕度水平小於或等於重量的3%，較佳為小於或等於重量的2.5%，較佳為小於或等於2%，較佳為小於或等於1.5%。
較佳地，配製方法更包括，消除或去活化傳染原 的步驟，例如藉由乾燥加熱冷凍乾燥(lyophilizate)。
較佳地，配製方法更包括，過濾因子VII組成物的步驟及/或冷凍乾燥經配製之因子VII組成物的步驟。
當根據本發明之因子VII組成物根據上述方法配製時，其為更加有利的。確實地，應用至本發明之因子VII組成物之根據本發明的方法配製能夠改善其穩定性。
本發明的另一個目的是關於本發明之因子VII組成物作為藥物，用以治療出血事件(bleeding episodes)的用途。
本發明的另一個目的是關於本發明之因子VII組成物，用以避免外科手術或侵入式手術期間時發生溢血(hemorrhages)的用途。
本發明的另一個目的為一種醫藥組成物，其包括根據本發明之因子VII組成物、賦形劑(excipient)及/或藥學上可接受的載體。
賦形劑可為藥物用途相容性且為此技藝人士熟知的的任意溶液，例如，生理食鹽水、生理的、等滲的或緩衝的溶液，以及任意懸浮液、膠體或粉末。根據本發明的組成物可更進一步地包括一或數種劑或載體，其擇自分散劑、助溶劑、穩定劑、表面活化劑及防腐劑。另一方面，根據本發明的組成物可包括其他活性劑或成分。
此外，組成物可由不同方式及不同形式投予。可藉由任何用在此類型治療方法的傳統途徑執行投藥，特別地，例如藉由全身途徑(systemic route)，特別是由靜脈內、皮內、腫瘤內、皮下、腹腔內、肌肉內或動脈內注射。可能提到的例 子如，腫瘤內注射、注射在接近腫瘤的區域或沖洗(irrigating)腫瘤。
劑量會根據投藥的次數、其他活性成分的結合、及病理的發展階段等而有所不同。
當然，本發明並不僅限於所述及說明的例子、實施例，而是採取此技藝人士可理解的許多選擇。
實施例
實施例1、於其乳汁中製造人類FVII蛋白質之基因轉殖兔的製造。
在SuperCos架構中製備一表現載體，其包括雞的β-血球蛋白絕緣序列(β-globin insulating sequence)、山羊的β-酪蛋白在5’端的控制區域、編碼人類FVII的用於表現於哺乳動物細胞中之優化的cDNA序列以及的β-酪蛋白在3’端的未轉譯區域。於第6圖中之裝配物(assembly)代表構築載體(construction vector)。
從藉由NotI內切限制酶之構築載體的切割來製備轉殖基以釋放SuperCos架構與線性化表現載體。產生之片段藉由膠體電泳而分離，從膠體上被純化，且接著被使用於微注射。
為了產生基因轉殖兔，執行轉殖基因至收集自野生型的兔子之雄性受精的胚胎細胞原核仁(pronuclei)微注射。在經過數小時之in vitro培養的期間後，將經微注射之雄性胚胎之原核仁轉移至荷爾蒙預備完成之雌性非基因轉殖兔的輸卵管中。在懷孕後，獲得後代。藉由使用專一於人類FVII序列的引子(primer)之PCR分析，基因分析提供人類FVII轉殖基因之存 在的評估。轉殖基因的存在及其完整性，已被來自從所獲得之基因轉殖幼兔萃取之DNA的南方點墨分析(Southern blotting)所顯示。表現型(phenotypic)分析提供表現於基因轉殖雌兔之乳汁中之人類因子VII濃度的評估。此測定藉由使用商業試劑(Diagnostica Stago)由酵素免疫分析法(enzyme immunoassay,ELISA)所測定實現。簡單地說，待測定的因子VII會被固定在固相(solid phase)上的人類抗因子VII(anti-factor VII)抗體捕捉。被固定的因子VII接著由已知的免疫-過氧化氫酶共軛(immuno-peroxidase conjugate)所辨識。被結合的過氧化氫酶的比例由在過氧化氫存在的情況下，其對於鄰苯二胺(ortho-phenylenediamine)基質的活性來測定。在使用強酸停止反應後，染色(coloration)的強度為最初在樣品中的因子VII的量之函數。
實施例2、純化及萃取獲得之因子VII
此實施例中所使用的純化及萃取因子VII的方法如下所述。
基因轉殖兔的乳汁是從基因轉殖兔品系R69所獲得，經冷凍的基因轉殖兔的乳汁經解凍及被濃縮成基因轉殖兔的乳汁池(milk pool)的形式。
由此得到之基因轉殖兔的乳汁池接著進行澄清步驟，利用具有孔洞深度0.2μm的濾器，用以移除脂質及非可溶化合物。由此得到的澄清乳汁接著進行病毒去活化(viral inactivation)步驟，藉由與洗滌劑(detergent)型的溶劑，例如，聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)或磷酸三正丁酯(Tri-n-Butyl Phosphate)在25℃±2℃處理至少兩個小時。這樣的處理顯著地給予有效地去活化病毒之可能性，且特別是不具外套膜(non-enveloped)的病毒種類之病毒。經澄清及病毒去活化的乳汁接著進行親和性層析步驟，其利用因子VII/因子VIIa的特定的親和性配體(ligand)。將於此層析步驟結束時所獲得的因子VII之洗出液(eluate)接著進行超過濾(ultra-filtration)及配製步驟，由此給予了得到具有95%純度之因子VII的濃縮中間產物的可能性。
因子VII的濃縮中間產物接著進行過濾步驟，利用具有0.2μm至0.2μm孔洞的濾器，接續為一奈米過濾步驟，其利用具有20nm孔洞及15nm孔洞的濾器。由此獲得之含有因子VII的產物接著進行Q-Sepharose XL膠體型的層析步驟及接續的CHT-I型層析步驟，接續為SEC Superdex 200型之層析，由此取得之因子VII的濃縮物接著進行穩定化(stabilization)步驟及接著過濾步驟，其使用具有0.2μm孔洞的濾器。
上述方法提供獲得具有約99.9995%之純度之因子VII濃縮物的可能性。
萃取與純化因子VII的方法於歐洲申請案EP12305882中被更細部描述。
在本發明的實施例中，重組的經活化的因子VII(Novoseven®)可於市面上取得，其由新生的倉鼠的BKH腎臟細胞經基因工程而成，稱作<<FVII-rec>>。
實施例3、N-多糖的荷載剖析(profiling)的研究
A/辨識及量化N端連接(N-bound)的寡糖，藉由高 效液相層析以HILIC模式之中的正相極性，結合螢光偵測(HILIC-HPLC/FD)，稱作<<HILIC>>方法。
親水性相互作用層析方法(HILIC或Hydrophilic Interaction Chromatography)是正相(normal phase,NP)層析以外的選擇，藉由避免因使用不可混溶於水的溶劑而產生之缺點，可使得極性物質能夠充分分離。固相(stationary phase)為極性材料，其通常以接枝上官能基，例如，氰基、胺基、二醇、醯胺基等的二氧化矽或聚合物的支持體為基礎，而移動相為有機的且含有水作為一強烈的洗提液(eluent)。
首先，因子VII全受到利用PNGase F的酵素切割以特定地釋放N-多糖的衍生物。
N-多糖的衍生物藉由在固相萃取(extraction on solid phase,SPE)上分離且接著依據Bigge et al.以螢光：2-氨基苯甲醯胺(2-aminobenzamide,2-AB)(Bigge,J.C.,et al.,Non-selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranikic acid,Anal.Biochem.,230,229-238(1995))標記。N-多糖的衍生物的分析最後由根據Guile et al.之HILIC-HPLC/FD執行(Guile,G.R.,et al.,A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycans mixtures and analyzing oligosaccharide profiles,Anal.Biochem.,240,210-226(1996))。偵測是藉由在螢光於λ激發之波長=300nm及λ放射之波長=420nm時確認。
對於本發明之因子VII以及對於FVII-rec所獲得結 果如下表所示。
藉由HILIC方法所得到的結果顯示，本發明的因子VII具有被包括在3.6%至4.3%之間的中性N-多糖形式、被包括在74.6%至75.5%之間的單荷載N-多糖形式以及被包括在20.6%至21.2%之間的雙荷載N-多糖形式的程度。
藉由HILIC方法所得到的結果顯示，因子VII-rec的中性的N-多糖形式佔VII-rec的N-多糖形式的11.3%，因子VII-rec的單荷載N-多糖形式佔VII-rec的N-多糖形式的25.1%，因子VII-rec的雙荷載N-多糖形式佔VII-rec的N-多糖形式的55.1%，又，因子VII-rec具有不可忽略的三荷載及四荷載 型式的量。
藉由HILIC方法所獲得的結果因此與顯示於Klausen et al之發表的那些是相符的。
B/藉由AEX/UPLC/FD方法，辨識及量化N端連接的寡糖
N-多糖根據其荷載量而分離是藉由標示2-AB之衍生的N-多糖之AEX-UPLC/FD分析實行。製備標示2-AB之衍生的N-多糖物的操作程序與先前敘述藉由HILIC-HPLC/FD分析N-多糖相同。
利用AEX-UPLC/FD分析FVII的N-多糖之荷載量，是藉由胺基丙基(aminopropyl)型的低陰離子交換管柱為工具達成，藉由提供一甲酸銨(ammonium formate)之增加的梯度使多糖依據它們的荷載量而分離。衍生物的偵測在下述波長進行：激發波長：330nm及放射波長：420nm。藉由AEX-UPLC/FD得到之FVII(批次1)的分析圖如第3圖所示。
得到之結果顯示於下列表3。
觀察到根據本發明之因子VII的三個批次的單荷載N-多糖形式的百分比被包括在76%至78%之間。
這兩種正交(orthogonal)的方法(HILIC及AEX)都顯示本發明之因子VII的N-多糖形式至少74.6%為單荷載，無論使用哪種測量方法。
C/藉由AEX/UPLC/FD方法，辨識、量化及比較本發明之因子VII、來自申請案WO2007/138199的因子VII、因子VII-rec之N端連接的寡糖。
使用的步驟與實施例3所述相同。對於來自本發明的因子VII、由申請案WO2007/138199所取得之因子VII以及因子VII-rec執行藉由AEX-UPLC/FD之N-多糖荷載量的分析。N-多糖分析圖如第5圖所示。第5A圖顯示由申請案WO2007/138199產生之FVII的多糖分析圖，第5B圖顯示本發明之FVII的多糖分析圖，以及第5C圖顯示FVII-rec的多糖分析圖。
關於由申請案WO2007/138199產生之FVII，藉由AEX-UPLC/FD方法所得到的結果顯示：- 由申請案WO2007/138199產生的FVII之中性的N-多糖形式為此FVII之N-多糖形式的3%；- 單荷載N-多糖形式為此FVII之N-多糖形式的51%； - 雙荷載N-多糖形式為此FVII之N-多糖形式的39%；- 不可忽略之量的三荷載形式。
藉由AEX/UPLC/FD方法所得到的結果顯示，FVII-rec的中性的N-多糖形式相當於FVII-rec的N-多糖形式的7.0%，FVII-rec的單荷載N-多糖形式相當於FVII-rec的N-多糖形式的29.0%，與FVII-rec的雙荷載N-多糖形式相當於FVII-rec的N-多糖形式的54.0%。此外，因子VII-rec具有不可忽略之量的三荷載及四荷載型式。
實施例4、辨識、量化及比較本發明之因子VII及PCT專利WO2007/138199藉由HILIC方法得到的因子VII之N多糖形式
A/藉由使用HILIC方法，量化根據本發明之因子VII的N-多糖形式。
藉由如實施例3所述之HILIC方法，量化根據本發明之因子VU的N-多糖形式。藉此得到的結果如表5所示。
不同的多糖結構之量化分析(表5)顯示組成物的因子VII之N-多糖形式大多數為單唾液酸化複合物(約60%)。高-甘露糖/混合型的N-多糖形式顯示最少為25%。
B/藉由使用HILIC方法，執行量化由申請案WO2007/138199產生之因子VII的N-多糖形式。
藉由使用如實施例3所述之HILIC方法，執行量化由申請案WO2007/138199產生之因子VII的N-多糖形式。得到的結果如表6所示。
不同的多糖結構之量化分析(表6)顯示，由由申請 案WO2007/138199產生之因子VII的N-多糖形式大多數為單唾液酸化複合物型(約45%)。高-甘露糖/混合型的N-多糖形式顯示約為18%。
實施例5、γ-羧基化的量化
人類的因子VIIa具有其他轉譯後修飾，例如：N端GLA域的γ-羧基化。對於血漿因子VII而言，前十個谷胺酸皆為γ-羧基化的(Jurlander B.et al.,Recombinant activated factor VII(rFVIIa)：characterization,manufacturing,and clinical development.Semin.Thromb.Hemost.27.4(2001)：373-84)，然而，NovoSeven®的第十個谷胺酸僅為部分γ-羧基化的(Thim L.et al.,Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells.Biochemistry.27.20(1988)：7785-93)。
本發明的因子VII的γ-羧基化之研究是利用液相層析方法結合質譜分析(LC-MS)進行如下所述。
因子VII已事先經還原及烷基化，接著接受藉由胰蛋白酶(trypsin)型的專一酵素之方式的酵素切割。由此產生的胜肽在藉由C18型的反相液相層析(Yates,J.R.,Ruse,C.I.,Nakorchevsky,A.,(2009)Proteomics by mass spectrometry：approaches,advances,and applications.Annu Rev Biomed Eng.11,49-79.)分離後，以電噴灑式(electrospray)質譜進行分析。此方法給予測量因子VII的γ-羧基化N端肽肽的準確質量，並可藉此推斷其γ-羧基化的程度之可能性。
第2圖顯示N端胜肽[Ala1-Arg36]的質譜。測量到的 平均質量為4,768.0Da，其與理論的質量4,768.0Da(經還原及烷基化的半胱胺酸)一致，其對應於9個γ-羧基化。本發明的因子VII因此具有9個γ-羧基化。第2圖也包含N端胜肽[Ala1-Lys32]的質譜，其在相似的停留時間被洗出。胜肽的分子量也與9個γ-羧基存在於胜肽上一致。因此，結論可被描述為本發明之因子VII在10個可能的位置具有9個γ-羧基化的谷胺酸殘基，以及相對於人類因子VII的序列(Glu35)，位在位置35的谷胺酸殘基並未被γ-羧基化。
此外，胜肽[Asp33-Gly47]是藉由胜肽圖譜(peptide mapping)被分離。此胜肽包含之胺基酸Glu35被發現大多數具有質量1,786.9Da。此胜肽較少數的型式被發現為質量1,830.9Da，其對應於經修飾的Glu35。由MS訊號，此種形式被估計少於5%。上述結果確認了本發明的因子VII之前9個谷胺酸上之γ-羧基化的存在，然而第10個谷胺酸大多數未被γ-羧基化。
本發明的因子VII的許多同型異構物(isoform)之分布，也經離子交換層析進行研究，其步驟如下所述。相同的研究也在FVII-rec實施。
簡言之，因子VII的同型異構物在強烈的陰子交換管柱(strong anion exchange column,SAX)中分離。首先，因子VII的樣本被裝載於事先以20mM Tris緩衝液平衡至pH9的管柱(Mono Q5/50 GL,GE Healthcare)中。接著藉由提供一增加梯度之20mM Tris/1M NaCl型的洗提緩衝液於pH9以洗出樣本。
表7、量化本發明的因子VII之同型異構物以及FVII-rec之同型異構物-於<<IEX>>層析中觀察到之波峰的積
由表5的結果可知，本發明的因子VII主要的同型異構物為具有9個γ-羧基化(95%)的形式。在FVII-rec的同型異構物中，76%的同型異構物具有9個γ-羧基化，以及24%的同型異構物具有10個γ-羧基化。
實施例6、等電點的研究
藉由等電聚焦(isoelectric focusing,<<IEF>>)可依據等電點的不同，而分離因子VII不同的同型異構物。電泳移動是在膠體Focusgel 3-10(Serva)上進行。
因子VII批次的品質之評估，是產物之不同的同型異構物在pH梯度為3至10的天然(非還原及非變性(non-denaturing))的情況下在膠體上移動之後進行分析，上述方法是根據經由Mutiphor system(GE Healthcare)之IEF的一般分析步驟。
IEF分析是在沒有任何SERVA井(SERVA well)的 Focusgel 3-10上進行。在將產物於超高速離心膜(隔絕閾(cut-off threshold)：10kDa)上脫鹽(desalting)後，藉由測量280nm(ε=1.36g-1.L.cm-1)的OD進行濃度的估計。
移動是根據以下的參數(梯度模式)發生：
利用Coomassie Blue CCB-G250染色使蛋白質顯現。在膠體數位化及使用Quantity One(Bio-Rad)軟體分析後，即可完成同型異構物的pI之判定。
本發明的因子VII的批次及FVII-rec之<<IEF>>圖如第4圖所示。
色帶(band)的pI之判定是以pI被包括在5.20至8.15之間的的標準品來實行，本發明的因子VII之等電點被包括在6.1至7.3之間。本發明的因子VII的同型異構物的圖，包括兩條主要的色帶介於6.6至7.0間，以及包含在pI 6.1之較酸性的痕跡和包含在pI 7.3之較鹼性的痕跡。兩種主要的同型異構物約為組成物之因子VII之全部的60%。
因子VII-rec之等電點被包括在5.5至7.5之間。因子VII-rec的同型異構物的圖中，包括兩條主要的色帶介於6.4至6.8之間，以及包含在pI 5.5至pI 6.4之間較酸性的痕跡和包含在pI 6.8至pI 7.5之間較鹼性的痕跡。兩種主要的同型異構物為因子VII-rec之組成物之因子VII的約45%。
因此，此結果可知本發明的因子VII之等電點為實質上較同質，相較於FVII-rec所觀察得到。
實施例7、本發明的因子VII之活性
FVII的劑量是藉由醯胺基水解(amidolytic)方法(FVII：am)測量FVII的生物活性而實行，即，因子VIIa/組織因子複合物活化因子X的能力，在鈣離子及磷脂質的存在下。
此方法為具有動力學的產色(chromogenic)反應，包括兩步驟：在FVIIa的作用下活化FX，且反應混合物中包含凝血酶(thromboplastin)及鈣離子；及接著藉由FXa對一特定的產色基質進行酵素切割，以釋放可由分光光度計進行量化的色基(chromophore)。
動力學讀出在405nm實行，相對於參考濾片在490nm。
因而得到的結果如表6所示。
本發明之因子VII的醯胺基水解活性被包括在3,067IU/ml至3,777IU/ml之間。

Claims (20)

  1. 一種因子VII組成物，其中該因子VII分子具有一實質上同質之等電點。
  2. 一種因子VII組成物，其中，在該組成物的該因子VII的所有N-多糖(N-glycan)形式之中，至少60%的N-多糖形式係單荷載(monocharged)，及至少80%的該分子在谷胺酸(glutamic acid)的9個殘基上具有γ-羧基化。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之因子VII組成物，其中，該組成物的該因子VII之N-多糖形式的至少65%，較佳至少70%，較佳至少80%係單荷載。
  4. 如申請專利範圍第2或3項所述之因子VII組成物，其中，在該組成物之所有該因子VII分子之中，至少85%，較佳85%至100%，較佳90%至100%，較佳95%至100%之該分子，在谷胺酸的9個殘基上具有γ-羧基化。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之因子VII組成物，其中，呈現於谷胺酸35(Glu35)的殘基上之γ-羧基化程度係小於20%，較佳係小於15%，較佳係小於10%。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之因子VII組成物，其中，該組成物的該因子VII之N-多糖形式的至少60%係單唾液酸化(monosialylated)複合物。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之因子VII組成物，其中，該組成物的該因子VII之N-多糖形式的至少10%，較佳至少15%，較佳至少20%，較佳至少25%係高甘露糖(mannose)/混合型(hybrid)。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之因子VII組成物，其中，至少90%，較佳至少95%的該組成物之該因子VII分子，具有被包括在小於1.2之一pH單位間隔中的等電點。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之因子VII組成物，其中，至少50%，較佳至少55%，較佳至少60%的該組成物的該因子VII分子，具有被包括在小於1pH單位間隔；較佳小於0.5；較佳小於0.4之一pH單位間隔中的等電點。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之因子VII組成物，其中，該因子VII係重組的或基因轉殖的。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之因子VII組成物，其中，該組成物的該因子VII係藉由基因轉殖兔製造。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之因子VII組成物，其中，該因子VII係一活化之因子VII。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之因子VII組成物，用於出血事件(bleeding episodes)的治療。
  14. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之因子VII組成物，用於避免在外科手術或侵入式手術期間發生的溢血(hemorrhages)。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之因子VII組成物，係藉由一方法獲得，該方法包括下述步驟：(a)插入包括一編碼出因子VII的基因之DNA序列於一非人類的哺乳動物胚胎(embryonic non-human mammal)中，且該基因係受β-酪蛋白啟動子(beta-casein promoter)之轉錄調控； (b)將步驟(a)獲得之胚胎轉移至一雌性的非人類哺乳動物的輸卵管之中，使該胚胎發育為一成體哺乳動物；(c)誘導步驟(b)獲得之該成體非人類哺乳動物的雌性類型或該非人類的哺乳動物之一雌性後代進入哺乳期，其中該基因與該啟動子存在於其基因體中；(d)收集上述非人類的哺乳動物的乳汁，以及；(e)純化於所收集的該乳汁之中的因子VII。
  16. 一種配製如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之一經活化之因子VII組成物的方法，該方法包括：混合經活化之該因子VII組成物及一緩衝溶液，若需要的話調整pH值，過濾，且之後若需要的話進行乾燥以取得固態形式。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之因子VII組成物的配製方法，其中，混合該活化之因子VII之該組成物及該緩衝溶液的步驟係提供於膠體過濾型的色層分析中。
  18. 如申請專利範圍第16或17項所述之因子VII組成物的配製方法，其中，該緩衝溶液包括擇自以下之一或數種成分：- 一鹽類，較佳係一檸檬酸鹽，較佳係三鈉檸檬酸鹽；- 一氨基酸或一親水之氨基酸鹽，較佳係一親水之氨基酸鹽，較佳係精胺酸鹽酸鹽(arginine hydrochloride)及/或賴氨酸鹽酸鹽(lysine hydrochloride)；- 一氨基酸或一疏水之氨基酸鹽，較佳係一疏水之氨基酸，較佳係異白氨酸及/或甘氨酸。
  19. 如申請專利範圍第16至18項中任一項所述之因子VII組成物的配製方法，該方法更包括一過濾該配製之因子VII組成物 的步驟。
  20. 如申請專利範圍第16至18項中任一項所述之因子VII組成物的製備方法，該方法更包括一冷凍乾燥該配製之因子VII組成物的步驟。
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