TWI386221B - 重組或基因轉殖因子vii組成物,因子vii之每一分子呈現兩具有已界定聚醣部分之n-糖化作用位置 - Google Patents
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Description
本發明是關於以因子VII之組成物形式獲得之重組或基因轉殖因子VII,因子VII之每一分子具有兩個帶有已界定聚醣部分之N-糖化作用位置,及其作為藥劑之用途。
因子VII(FVII)是一維生素K依賴性糖蛋白,以其已活化型(FVIIa)在鈣及組織因子存在下參與凝血過程活化因子X及因子IX。FVII以具有分子量約50 kDa之406個殘基的單一胜肽鏈形式分泌。FVII含有四個具特色結構區域(structural domains):N-端γ-羧基區域(Gla),兩“類上皮細胞生長因子(EGF-like)”區域,以及絲胺酸蛋白酶區域。活化FVII為FVIIa的特徵是Arg152
-Ile153
區域(精胺酸152-異白胺酸153)連接之切開。因此,FVIIa為一化合物具有一152個胺基酸之輕鏈(分子量約20 kDa)以及一254個胺基酸之重鏈(分子量約30 kDa),以單一二硫橋(Cys135
-Cys262
)連接一者至另一者。
血漿FVIIa含有數個轉譯後修飾:前10個麩胺酸是γ-羧酸化,Asp63
是部分羥基化,Ser52
(絲胺酸52)及Ser60
(絲胺酸60)是O-糖化並分別攜帶葡萄糖(木糖)0-2
及炭藻糖(Fucose)型態,Asn145
(天冬醯胺酸145)及Asn322
(天冬醯胺酸322)是主要以雙觸唾液酸化複合結構(biantennary bisialylated complex structures)之N-糖化作用。
FVII是用於治療罹患血友病的病人,其顯示缺乏因子
VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病),與顯示其他凝血因子缺乏,例如先天缺乏FVII之病人。因此有需要可獲得能注射FVIIa之濃縮物。
獲得FVIIa濃縮物之最古老方法是經由分級分餾從血漿蛋白質純化FVIIa。
為此目的,文獻EP 0 346 241敘述富含FVIIa分劃(FVIIa-enriched fraction)之製備,獲自吸附作用後溶析血漿蛋白質分級分餾之第二產物,該血漿蛋白質含有FVII及FVIIa與其他蛋白質如因子IX(FIX)、X(FX)和II(FII),特別是預溶析物PPSB(P=凝血酶原或FII,P=血清凝血酶原(proconvertin)或FVII,S=司徒氏因子(Stuart factor)或FX以及B=抗血友病因子B或FIX)。此方法之缺點為所得FVII仍含有某些微量的其他凝血因子。
同樣地,文獻EP 0 547 932說明高純度之實質上無維生素K-依賴性因子之FVIIa濃縮物以及FVIII的製造方法。以此方法獲得之FVII,不論其純度,顯示殘留的血栓形成活性。
因此,這些方法主要之一缺點為他們僅產生小量產物。此外,仍難以得到一產物完全不含其他存於血漿的蛋白質。最後,雖然在製備血漿凝血因子的每一階段已執行一些預防措施以確保他們的病毒及細菌安全性(後續隨訪血液捐贈者,已知病毒及細菌污染之偵測試驗,嚴厲純化及病毒去活性處理以盡可能降低來自血液致病劑傳播的危害),僅管如此,含有致病劑污染的全部風險並未排除。此外,庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)新變異種之出現引起對血液產
品非常規致病劑傳播的恐懼。再者,收集自捐贈者的血漿量依然是有限的。
因此,自1980年代開始單離編碼人類因子VII之DNA(Hagenet al
.(1986);Proc.Natl.Acad.Sci.USA;Apr 83(8):2412-6)並表現於哺乳動物BHK細胞(幼倉鼠腎)(文獻EP 0 200 421)。縱使此FVII製造方法具有控制產生所欲蛋白質用培養基之優點,但已知倉鼠細胞賦予蛋白質表現Gal α 1,3Gal部分(Gal α 1,3Gal moieties)(Spiro RGet al
,J.Biol.Chem,1984,vol.259,N° 15,9858以及Furukawa K.et al
.,J.Biol.Chem,1992,vol.267,N° 12,8012),已證明其免疫原性。
已發現1%之循環的人類B淋巴細胞會引起對抗抗原決定基Gal α 1,3Gal之抗體(Galiliet al
,Blood,1993,vol.82,2485)。然後該抗原決定基與抗體形成一複合體,活化補體並造成嚴重的免疫反應,例如異種移植後之急性移植排斥。已顯示15至20%的血友病患者處以倉鼠細胞產生之FVII會發展出免疫反應(Prowse C.Vet al
,Blood Reviews,1998,vol.12,99)。此種免疫反應在血友病患者是悲劇性的,因為FVII及FVIII已轉為具有免疫原性將引起非常難以處理的出血。
因此仍有需要獲得具有降低免疫原性(盡可能的低)之重組或基因轉殖FVIIa組成物,以及增加病毒安全性為佳。
因此本案申請人帶領研究致力發展FVII之組成物,以具有增加病毒安全性、展現非常低的免疫原性為佳。
因此本發明是關於一種重組或基因轉殖因子VII之組
成物,組成物之每一因子VII分子展現兩個N-糖化作用位置,特徵為組成物之FVII全部分子間Gal α 1,3Gal聚醣部分的比例介於0及4%之間。
令人訝異的是申請人已發現當用於治療病人時,本發明如此聚醣部分Gal α 1,3Gal於FVII組成物之比例不具免疫原性。
本發明之FVII是組成物形式。的確,任何FVII不論是細胞質的、重組或基因轉殖是以FVII之數種蛋白質混合物取得,這些蛋白質特別差異於他們不展現相同的轉譯後修飾。此轉譯後處理是隨FVII蛋白質轉移於不同細胞間隔(cellular compartments)內而由胞器(cellular organites)執行。這些生化修飾以終蛋白質相當不同於直接由該基因編碼之分子的方式巧妙地修飾此蛋白質。這些化學修飾提供蛋白質活性的調節以及定位。故本發明為此,“FVII”以及“FVII之組成物”之表達是同意義的。
“重組或基因轉殖FVII”是指遺傳工程產生之任何FVII並具有轉譯後修飾特徵,特別是上述的糖化作用,亦即兩個N-糖化作用位置具有零或極低比例Gal α 1,3Gal於FVII之組成物,或足夠低以致不具免疫原性。相較之下,本發明之FVII不是血漿FVII,亦即並非純化自人類或動物血漿之產物。
更特別為經活化FVII是指遺傳工程產生之任何經活化FVII,具有上述之轉譯後修飾特徵以及兩個已界定聚醣部分之O-糖化作用位置,γ-羧基化及專一二硫橋。
Gal α 1,3Gal部分是由兩個α 1,3-連接之半乳糖組成的結構。其位於N-連接之結構的寡醣觸角末端。此部分已知具有免疫原性。的確,此聚醣部分在人類及某些猴子中是缺乏的,因為其誘發合成酵素(α 1,3半乳糖基轉移酶)之編碼基因是去活化的。因此,對人類投與展現此類部分的蛋白質會誘發提高對抗此糖化蛋白質的抗體出現。
因此高度希望此類免疫原性部分不存在於醫藥蛋白質中。
較佳為組成物特徵是全部存在的因子VII分子中缺乏聚醣部分Galα 1,3Gal。
已瞭解此處提及FVII,其中結構Gal α 1,3Gal之比例是零或極低以致不能與使用目前可得分析裝置測量之背景區分,或特別是其比例不能藉由凝集素法點墨(lectin-blot)偵測法在4-氯-1-萘酚存在下染色被偵測到。此定量法敘述在“實施例”部分。此表達以同樣態度提及任何重組或基因轉殖FVII,其中Gal α 1,3Gal比例接近血漿FVII。儘管如此,本發明FVII之組成物中Gal α 1,3Gal的比例對人類不具免疫原性。
相反地,市售重組FVII顯現可偵測比例的Gal α 1,3Gal且因此能與使用分析裝置之背景干擾區分。
如此隨所使用之定量方法,Gal α 1,3Gal部分可能完全缺乏,或存在量少於4%或少於3.5%,或量少於3%,此量不可能從背景干擾區分出。有利為存在之Gal α 1,3Gal部分比例相同於或幾近相同於血漿FVII。
此外,本發明之FVII呈現優點特徵為其全部唾液酸包含α 2,6鍵。
本發明之FVII為一多肽,其胜肽序列可為天然的人類FVII,其為存在於人類但未顯出與FVII有關係之疾病的序列。如此序列例如能經由敘述於文獻EP 0 200 421之序列1b所編碼。
有助益地,本發明FVII的序列為序列SEQ ID NO:1。
在另一具體例中,本發明之FVII能為天然人類FVII之變異體,在此範圍內其免疫原性不會大於天然FVII。如此,此變異體之胜肽序列能展現至少70%相同性,以及有助益地至少80%或90%,以及更有助益為至少99%相同性於天然人類FVII的序列,如此變異體具有實質相同於天然FVII的生物活性。
再者,本發明之FVII也關於任何FVII,相較於天然FVII時,其生物活性經修飾或降低。經由實施例,能提及用於治療或預防血栓形成之重組人類去活性FVII、FFR-FVIIa(Holstet al
,Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.,1998 Jun,15(6):515-520)。如此FVII是一具有胺基酸序列經由插入、刪除或置換一個或一個以上胺基酸之多肽,其不同於天然FVII的序列。
最終,於另一具體例中,本發明之FVII能經活化(FVIIa)。當後者用於並代表前者與組織因子(TF)交互作用時,該FVIIa展現比FVII大25至100倍之凝血活性。FVII活化發生自經由不同蛋白酶(FIXa,FXa,FVIIa)切割酶原為以二硫橋聯結之兩鏈。舉例而言,FVII a為凝血因子與血液
循環抗體負責血友病患者的止血。特別有助益方面為本發明之FVII是完全經活化。
本發明之FVIIa能包括數種轉譯後修飾:前九個或十個N-端麩胺酸是γ-羧酸化,Asp63
為部分羥基化,Ser52
和Ser60
是O-糖化及分別攜帶葡萄糖(木糖)0-2
及炭藻糖部分,Asn145
和Asn322
是主要以雙觸唾液酸化複合結構之N-糖化。
本發明FVII之生物活性的定量,能經由使用FVII-缺乏血漿及促凝血酶原激酶(thromboplastin)來測量FVII之組成物引起血液凝固之能力,例如美國專利第5,997,864號所述。此專利說明之分析法中,生物活性是以相較於對照樣品之凝血時間降低來表達,並經由與含有1單位/ml之FVII活性的人類血清(庫)標準相比轉換為“FVII單位”。
本發明之重組FVII之獲得能經由利用熟悉該項技藝者已知的標準技術,使蛋白質表現於生物系統。
本發明之FVII能表現於賦予上述糖化作用特徵之任何微生物、植物或動物內,亦即FVII之組成物中Gal α 1,3Gal的比例非常低或零。微生物是指任何細菌、真菌、病毒或細胞系統,該細胞可能是植物或哺乳動物細胞。哺乳動物細胞能為動物或人類細胞。亦可使用任何為α 1,3半乳糖基轉移酶製作之剔除細胞(knockOut cell)。
本發明之FVII亦能產生於基因轉殖動物或植物中,至此這些動物或植物賦予FVII或FVII之組成物上述提及之糖化作用特徵,亦即缺乏或非常低比例之Gal α 1,3Gal於FVII之組成物。動物能為兔子、豬、綿羊、山羊、牛、雞、或任
何α 1,3半乳糖基轉移酶之剔除動物,但不限所列者。
本發明之FVII包含類似人類FVII,兩個N-糖化作用位置在位置145及322,以及兩個O-糖化作用位置在位置52及60。在一N-糖化作用位置,寡醣鏈是連接到天冬醯胺酸(N-連接)。在O-糖化作用位置,寡醣鏈是連接到絲胺酸。連接到這些胺基酸之部分,對每一組成物之蛋白質將不同。然而對於整個組成物,定量每一聚醣部分的量或每一糖的量是可行的。
本申請案中所給不同聚醣的百分比未考慮到O-糖化作用。
較佳為FVII之組成物特徵為FVII組成物之全部聚醣部分中,至少40%是雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。又於一具體例中,單一唾液酸化形式存在至少50%。又在一具體例中,單一唾液酸化形式存在至少60%。
有助益地,FVII之聚醣形式大多數為雙觸單一唾液酸化聚醣形式。
FVII之組成物特徵為因子VII之至少某些唾液酸包含α 2-6連接。
有助益地,FVII之至少65%的唾液酸包含α 2-6連接。更有助益地,FVII之至少70%或80%,且更特別至少90%的唾液酸包含α 2-6連接。
根據本發明之一具體例,因子VII的全部唾液酸包含α 2-6連接,亦即全部唾液酸以α 2-6連接鍵結於半乳糖。本發明之FVII組成物能進一步包括包含α 2-3連接之唾液
酸。
事實上FVII組成物之至少65%的唾液酸包含α 2,6分枝,是本發明FVII之一優點。就事實論之,市售重組FVII的唾液酸只包含α 2,3連接。而血漿FVII為這兩種異構物之混合物。然而後者含有較多α 2,6連接,導製本發明之FVII更接近血漿FVII。根據本發明,FVII的唾液酸中65%到100%包含α 2,6連接。在一些具體例中,FVII的唾液酸中70%或80%至100%包含α 2,6連接。
有助益地,FVII的雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大多數為非炭藻糖化。
較佳為這些雙觸、單一唾液酸化、非炭藻糖化之聚醣形式以大於20%比例存在於本發明之FVII組成物。有助益地,此比例高於25%,或高於40%。
在一特別有益方面,本發明之FVII組成物的炭藻糖化比例由介於20%及50%之間所組成。在本發明之一具體例中,此比例能少於15%。
此特徵為本發明FVII的優點之一。的確,市售重組FVII顯示100%的炭藻糖化比例,而血漿FVII具有約16%的炭藻糖化比例。如此,本發明之FVII的炭藻糖化接近血漿FVII的炭藻糖化,對本發明之FVII在免疫原性方面給予優點。
有助益地,本發明之FVII為基因轉殖FVII。因此,本發明之FVII有助異為基因轉殖產生之重組FVII產物。
在本發明一特別具體例中,本發明之基因轉殖FVII是在基因轉殖動物的乳汁中製造。
此等蛋白質之製造能經由移植編碼感興趣蛋白質之基因至負責乳汁蛋白質合成的基因之一的調節區域來進行,其將主導專一合成於乳腺,然後分泌到乳汁中。
在一特別有助益方面,本發明之FVII是由基因轉殖雌兔產生。
此物種特別有利,因為兔子對普利子蛋白(prions)不受影響,特別是主要公共衛生議題之傳染性亞急性海棉狀腦病變。
再者,兔子與人之間的物種障礙是重要的。相反地,人與倉鼠(其為製造市售重組FVII之生物系統)之間的物種障礙較不重要。
因此在兔子製造FVII,就有關致病劑傳染之安全性方面是有利的。
在本發明之一較佳具體例中,本發明之FVII是在雌兔乳腺中製造。
對熟悉該項技藝者而言,從乳腺分泌感興趣之蛋白質並使該分泌進入基因轉殖哺乳動物的乳汁是熟知的技術,包含以組織依賴性方式控制重組蛋白質的表現。
表現之組織控制的進行係因序列主導蛋白質表現朝向動物的特定組織。這些序列即為啟動子序列以及胜肽訊息序列。
在乳腺驅動感興趣之蛋白質表現的啟動子實例是WAP啟動子(乳清酸性蛋白質),酪蛋白啟動子(例如β-酪蛋白啟動子),β-乳球蛋白啟動子,但不限於所列者。
重組蛋白質於基因轉殖動物乳汁之製造方法能包括下列步驟:將含有編碼人類FVII之基因的合成性DNA分子(此基因是在天然分泌於乳汁之蛋白質的啟動子控制下)接合到(integrated)非人類之哺乳動物的胚胎。之後將胚胎置入相同物種之雌性哺乳動物。一旦從胚胎得到之哺乳動物充分的成長,然後誘發此哺乳動物分泌乳汁並收集乳汁。然後該乳汁含感興趣之基因轉殖FVII。
於雌性哺乳動物(人類除外)乳汁製備蛋白質之方法實例敘述於文獻EP 0 527 063,其教示能作為本發明感興趣之蛋白質製造的參考,但不限於此實例。
含有WAP啟動子之質體是經由導入包括WAP基因啟動子之序列來製備,此質體製備為某種程度上能接收置於依賴WAP啟動子控制下的外來基因。接合編碼人類FVII之基因,並置於WAP啟動子依賴性之控制下。使用含有該啟動子之質體及編碼感興趣蛋白質之基因,經由顯微注射到兔子雄原核(male pronucleus)以得到基因轉殖雌兔。之後將胚胎移到經荷爾蒙調製之雌兔的輸卵管。從萃取自所得基因轉殖幼兔的DNA,經由南方點墨法(Southern blot)揭露轉殖基因的存在。動物乳汁中之濃度物經由專一放射線免疫分析法評估。
經由雌兔於其乳汁所產生基因轉殖FVII是以組成物之形式獲得,其中因子VII組成物之每一分子顯示兩個N-糖化作用位置,其特徵為FVII組成物之全部分子中Gal α 1,3Gal聚醣部分的比例少於4%或甚至零。如此有助益地,由雌兔製造之基因轉殖FVII不包含Gal α 1,3Gal聚醣部分。
較佳為本發明之雌兔基因轉殖FVII之組成物特徵為組成物之全部聚醣部分中,至少40%是雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。又於一具體例中,單一唾液酸化形式至少有50%。又一具體例中,單一唾液酸化形式至少有60%。
有助益地,大部分聚醣形式為雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。
FVII組成物之特徵為因子VII之至少某些唾液酸包含α 2-6連接。
有助益地,FVII之至少65%的唾液酸包含α 2-6連接。更有助益地,FVII之至少70%或80%以及更特別為至少90%的唾液酸包含α 2-6連接。
根據本發明之一具體例,因子VII之全部唾液酸包含α 2-6連接,亦即全部唾液酸經由α 2-6連接鍵結於半乳糖。本發明之FVII組成物能進一步包括含有α 2-3連接之唾液酸。
較佳為雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大部分的聚醣形式是非炭藻糖化。有助益地,這些雙觸、單一唾液酸化非炭藻糖化聚醣形式以高於20%的比例存在於此FVII組成物。有助益地,此比例高於25%或高於40%。
較佳為本發明之此FVII組成物的炭藻糖化比例是介於20%及50%之間。
在本發明之一具體例中,此比例能少於15%。
本發明之基因轉殖FVIIa能包括數種轉譯後修飾:前九個或十個N-端麩胺酸是γ-羧酸化,Asp63
(天冬醯胺酸63)
是部分羥基化,Ser52
(絲胺酸52)和Ser60
(絲胺酸60)是O-糖化且分別攜帶葡萄糖(木糖)0-2
和炭藻糖部分,Asn145
及Asn322
為大部分以雙觸單一唾液酸化複合結構之N-糖化。
本發明之FVII能以熟悉該項技藝者已知的技術從乳汁純化。舉例而言,從乳汁純化感興趣蛋白質之方法,例如敘述於美國專利第6,268,487號,能包括下列所組成之步驟:a)將乳汁置於具有足以形成濃縮液(retentate)及濾液(permeate)之多孔膜上進行正切過濾(tangential filtration),該濾液(permeate)含有外源性蛋白質;b)將濾液(permeate)置於捕獲裝置,經由色層分析以置換外源性蛋白質並獲得流出物;c)合併流出物及濃縮液(retentate);d)重複步驟a)至c)直到FVII從脂質、酪蛋白微胞(casein micelles)分開且回收至少75%的FVII。
有助益地,本發明之FVII是經活化的。FVIIa產生自活體內以不同蛋白酶(FIXa,FXa,FVIIa)切割該酶原為經由二硫橋連接之兩鏈。FVIIa本身具有非常低的酵素活性,但與其輔因子:組織因子(TF)複合則能經由活化FX及FIX而引發凝血過程。
因此本發明之FVIIa是一化合物,經由單一二硫橋(Cys135
-Cys262
)連接一具有分子量約20 kDa之152個胺基酸之輕鏈以及一具有分子量約30 kDa之254個胺基酸之重鏈所組成。
因此,本發明之FVII是一具有活性及結構接近血漿FVII之經活化FVII。
隨FVIIa、FVII與組織因子(TF)之交互作用,FVIIa展現比FVII高25至100倍的凝血活性。
在本發明一具體例中,FVII能在活體外經由因子Xa,VIIa,IIa,IXa及XIIa活化。
本發明之FVII亦能於其純化過程中活化。
令人訝異地,本案申請人已察覺縱使將FVII置於天然產於抗乳血清之蛋白質的啟動子(例如WAP啟動子)控制下,FVII仍易於結合乳汁的鈣離子,故此與酪蛋白微粒結合。
因此,研發FVII的萃取及純化方法,展現具乳汁鈣離子親和力之FVII,將非常有助易於捕獲此蛋白質不論是結合於抗乳血清複合體中或包含於酪蛋白微粒中。
舉例而言,含於基因轉殖動物乳汁之基因轉殖FVII的萃取及純化方法,包括由下列所組成之步驟:a)從乳汁萃取FVII(此因子VII已結合於有機及/或無機鹽及/或該乳汁鈣之複合體),其係沉澱經由添加乳汁可溶性鹽所得之鈣化合物,其中乳汁可溶性鹽的陰離子是選擇能形成該不溶性鈣化合物者,以於此法中使因子VII從該鹽及/或複合體釋放,然後該因子VII出現於液相;b)從鈣化合物之沉澱物分離出富含蛋白質之液相,該液相進一步分離為脂肪相及水性含有蛋白質之非脂肪相;c)使用預定濃度磷酸鹽為主要成分之溶析緩衝液,將水性非脂肪相進行親和力色層分析步驟;以及d)使用適用於連續溶析留於該管柱之因子VII之緩衝液,將根據步驟c)所得因子VII之溶析液,於弱鹼型陰離子
交換管柱進行二或三次色層分析步驟。
令人訝異的是申請人已發現如此製法利用FVII結合該乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體之萃取步驟,其係沉澱經由添加可溶性鹽至乳汁所得不溶性鈣化合物,可溶性鹽之陰離子是選擇能形成鈣化合物沉澱者,而FVII則從該乳汁鈣之此等有機及/或無機鹽及/或複合體及/或有機及/或無機複合體釋出並再次出現於液相溶液中。
FVII結合到該乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體,此表示FVII對這些鈣的鹽類及/或複合體展現親和力。因此,FVII展現足夠數量的固定位置給這些將要全部或部分結合的鹽類及/或複合體。
根據本發明之製法,基因轉殖FVII代表以各種糖化作用特徵且有助益地為如前述之本發明FVII為佳之基因轉殖FVII。
乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體代表與膠體酪蛋白微粒交互作用之磷質鈣鹽(phosphocalcic salts)。不同的酪蛋白與存在之磷質鈣鹽形成一膠體微粒複合體,能達到直徑約0.5 μm,例如磷酸三鈣凝集形式(“簇”),亦即Ca9
(PO4
)6
。此等微粒是形成自酪蛋白次單元,其係由圍繞厭水核之富含酪蛋白-κ的親水層所構成,磷質鈣鹽是經由親水層上的靜電作用結合。這些磷質鈣鹽也能未結合酪蛋白而存在於微粒的內部。這些鹽及/或複合體也以磷酸一鈣及/或磷酸二鈣形式存在於乳汁中,其視實施之化學及生化反應而與其他離子形式的鈣達成平衡。這些鈣鹽及/或複合體能存
在於酪蛋白微粒內部。
FVII對鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體的此等親和力能產生自未修飾或活體內或活體外經修飾蛋白質(例如經由轉譯後修飾)之交互作用。
不溶性鈣化合物是指溶解度少於0.5%於乳汁之鈣鹽或複合體。
大部分FVII是與酪蛋白微粒的磷質鈣鹽結合。該FVII展現強親和力於鈣,以及高親和常數,亦即至少70%至90%的FVII陷入酪蛋白微粒。剩下的FVII展現親和力於上述其他形式之鈣的有機及/或無機鹽及/或複合體。
不受限於所知機制之任何解釋,本案申請人假定添加可溶性鹽來取代微粒之磷質鈣鹽平衡,因而造成他們的解構作用及酪蛋白次單元凝集的沉澱。陷入及/或落在微粒上已結合磷質鈣鹽之FVII,則隨此解構作用釋出到介質中。此外,在此時,FVII也從磷質鈣鹽釋出或解離,因為在本發明製法所用可溶性鹽的作用下他們以不溶性鈣化合物的形式沉澱。同樣地,結合鈣之可溶性有機及/或無機鹽及/或複合體之FVII亦將以相同反應型態解離(參閱第9圖)。
在本發明之範圍中,可溶性鹽為能得到所欲效果之任何鹽。
本發明製法使用之可溶性鹽,能以熟悉該項技藝者選擇之濃度存在於乳汁,以成功從鈣的鹽及/或複合體分離FVII。事實上,此濃度足以使至少20%、或有利地至少30%至50%的FVII分離。特優方式為濃度足以使至少60%至
80%、或至少90%的FVII分離。
本發明之製法特別使酪蛋白次單元之凝集沉澱。此沉澱是由於上述之酪蛋白微粒解構。應用本發明製法能經由沉澱使乳汁的膠體狀態不穩定。
因此,本發明之製法是使乳汁從膠體狀態移到液體狀態之製法,對應於膠體/液體之直接萃取。
本發明製法也能得到比開始乳汁著色較淡的抗乳血清。事實上,這是酪蛋白賦予他們的白色於乳汁。一旦沉澱,他們不再賦予他們的顏色於乳汁。
根據本發明之可溶性鹽是指一鹽具有乳汁溶解度為每份乳汁(w/w)含有至少0.5份的鹽。
有助益地,本製法使用之可溶性鹽是磷酸鹽。該鹽能為水溶液,隨後被添加於乳汁,或能直接添加到乳汁的粉末形式。
較佳為磷酸鹽是選自由磷酸鈉,磷酸鋰,磷酸鉀,磷酸銣及磷酸銫所組成之群組,且特別是磷酸鈉。
另外,本製法使用之可溶性鹽能為鹼金屬草酸鹽,特別是草酸鈉或鉀,或鹼金屬碳酸鹽,特別是碳酸鈉或鉀,或其混合物。
有助益地,製備以進行該製法之可溶性鹽於水溶液的濃度為介於100 mM及3 M之間,更佳為介於200 mM及500 mM之間,特別是介於200 mM及300 mM之間。
含有將萃取之FVII的乳汁能為生全脂乳汁或脫脂乳汁。應用本發明製法於脫脂乳汁之優點在於其脂肪含量較低
之事實。該製法亦能應用於新鮮或冷凍乳汁。
該製法包括在脂肪相及含有蛋白質之水性非脂肪相中分離液相之步驟b),其經由離心進行為佳。非脂肪性水相實際為抗乳血清。此分離步驟也提供酪蛋白微粒次單元之凝集物和鈣化合物沉澱物的單離。
該製法於分離步驟後能進一步包括非脂肪性水相的過濾步驟,其係以減少多孔性之濾器連續地進行,較佳為1 μm,然後0.45 μm。使用這些濾器,例如使用玻璃纖維系,能降低天然存於乳汁之脂質、脂肪小球及磷脂質含量。濾器多孔性小於0.5 μm能保持非脂肪性水相及稍後實施之純化撐體的細菌學上的品質(超過濾器、色層分析管柱等等)(參閱後文)。脂肪相較佳透過這些濾器過濾,濾器仍完整保留乳汁的脂肪小球,且濾液是透明的。
此步驟後能接著經由超過濾之濃縮/透析步驟。
濃縮作用能減少非脂肪性水相的體積以保存它。超過濾膜是由熟悉該項技藝者依據感興趣蛋白質之特徵來選擇。通常以孔尺寸小於或等於FVII分子量之多孔性限制能濃縮產物卻沒有顯著的流失。例如具有孔大小為50 kDa的膜能濃縮但未流失分子量為50 kDa的FVII。
透析是為於含有FVII之非脂肪性水相的作用條件下,為後續純化步驟(亦即經由色層分析)作準備。透析也能移除小分子尺寸的成分,例如乳糖,鹽類,胜肽,小胜肽(proteoses)-腖及任何易損害產物保存的試劑。為此目的,優先使用具有50 kDa保留限制之膜,以致FVII未透過膜過濾。
較佳為透析緩衝液是0.025 M-0.050 M之磷酸鈉溶液,pH 7.5-8.5。
步驟b)後所得,或若有例如過濾及/或濃縮/透析步驟情形發生後所得之非脂肪性水相,在進行後續純化步驟之前能經冷凍及保存在-30℃的溫度。
之後,將根據步驟b)得到之非脂肪性水相置於含有羥基磷灰石凝膠(hydroxyapatite gel)(Ca10
(PO4
)6
(OH)2
)或氟磷灰石(Ca10
(PO4
)6
F2
)凝膠撐體之色層分析管柱,使用慣用含UV偵測器之色層分析裝置有利地進行步驟c)之親和力色層分析。如此則水相的FVII會保留在撐體上,而排除大部分未被留住的乳汁蛋白質。
較佳使用經水性緩衝液(主要成分0.025 M-0.035 M磷酸鈉,pH 7.5-8.5)平衡之色層分析管柱。注射富含FVII之水相於管柱,其能保留FVII。未保留之分劃經由緩衝液A的滲出作用移除直到返回基線(RBL)以確保不想要的化合物(例如乳汁蛋白質)真正的移除。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
根據步驟c)的FVII之溶析是以磷酸鹽為主的緩衝液來進行,例如以預定濃度之磷酸鈉或磷酸鉀或其混合物,較佳以緩衝液(主要成分0.25 M-0.35 M磷酸鈉,pH 7.5-8.5)為代表。收集溶析之分劃直至RBL。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
由於此步驟,移除超過90%的全部乳汁蛋白質以及回收超過90%的FVII。此階段中FVII溶析分劃的純度為約5%。
純度之定義為存在於所考慮樣品(分劃或溶析液)之FVII和總蛋白質間的重量比例。
有助益地,由於FVII對色層分析撐體之親和力使FVII的專一活性增加10至25倍。
之後將步驟c)產生之FVII溶析液有利地進行正切過濾(tangential filtration)。
正切過濾(tangential filtration)膜是由熟悉該項技藝者依據FVII的特徵來選擇。一般而言,孔的大小比FVII分子量大兩倍之多孔性限制容許其過濾。因此,具有孔大小為100 kDa的膜容許FVII過濾具有極佳產量。
此過濾步驟之目的是為減少,尤其是分子量高於FVII之蛋白質的載量,特別是移除非典型形式之FVII(例如FVII於聚合形式)以及在某種耽擱時間內易於降解它之蛋白酶。對此目的,使用具有100 kDa化合物之多孔性限制之膜是有利的。
有助益地,所得FVII之經過濾溶析液進一步經由超過濾透過具有50 kDa保留限制之膜濃縮及透析。透析緩衝液較佳為0.15 M-0.20 M氯化鈉溶液。
在步驟c)結束所得FVII之溶析液,可經過濾、濃縮及透析,然後進入兩次或三次色層分析步驟(步驟d)),在弱鹼型陰離子交換管柱使用適當緩衝液對保留在該管柱之因子VII的後續溶析。這些步驟提供額外的FVII純化。
視下列優先操作條件,有利地使用Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐體(其能保留因子VII)來進行第一次陰離子
交換色層分析步驟。以0.05 M Tris,pH 7.0-7.5之緩衝液清洗此撐體。以清洗緩衝液移除未保留之分劃直到返回基線。以0.05 M Tris及0.020 M-0.05 M氯化鈣(較佳為0.05 M),pH 7.0-8.0為主之水性緩衝液進行FVII溶析,以得到因子VII的第一溶析液。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
此步驟中FVII的回收為至少70%且此使能移除約80%的結合蛋白質,特別是乳汁蛋白質。
之後能將FVII之溶析液進行如前所述之透析步驟,使用0.15-0.20 M氯化鈉溶液作為緩衝液。
視下列優先操作條件,在Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐體上有利地進行第二次色層分析步驟,其係在撐體上注射第一次色層分析步驟在陰離子交換所得之因子VII的第一溶析液。以0.05 M,pH 7.0-7.5 Tris緩衝液清洗撐體。以清洗緩衝液疑除未保留之分劃直到返回基線。
以0.05 M Tris及0.005 M氯化鈣,pH 7.0-8.0為主之水性緩衝液進行保留於撐體上之FVII的溶析,以得到高純度因子VII的第二溶析液,其純度高於90%。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
第二次色層分析步驟意於限制可能的蛋白質之蛋白分解性降解。
在此階段,溶析液之純度為約90%,以及消除超過95%的剩餘結合蛋白質。之後,將溶析液進行如前所述之透析步驟,使用0.15-0.20 M氯化鈉溶液作為緩衝液。
根據本發明之極佳實施,製法包括三次在弱鹼型陰離子
交換管柱之色層分析步驟,使用適當緩衝液從該管柱後續溶析因子VII。因此在上述兩次陰離子交換色層分析後,進行第三次陰離子交換色層分析步驟。此步驟使能調製富含蛋白質之組成物為醫藥使用可接受之程度。
視下列優先操作條件,在Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐體有利地進行第三次色層分析步驟,其係在撐體上注射第二次色層分析步驟在陰離子交換所得之FVII之第二溶析液。
第二次陰離子交換色層分析步驟得到之第二溶析液,較佳於經1至5體積量注射用純水(WFI)稀釋後注射到裝入Q-Sepharose® FF型撐體之管柱,該撐體能保留因子VII。以緩衝液0.05 M Tris,pH 7.0-7.5清洗此撐體。以清洗緩衝液消除未保留之分劃直至RLB。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
以0.02 M Tris及0.20-0.30 M氯化鈉(較佳為0.28 M),pH 6.5-7.5為主要成分之水性緩衝液,進行保留在撐體上之FVII溶析。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
如此所得基因轉殖FVII組成物之純度大於95%。非常有助益地,組成物以FVII之濃縮物形式出現。
本製法之實施導致20至25%的累積產量,使至少20 mg的FVII/經處理乳汁(L)純化。
結果三次在陰離子交換凝膠之色層分析步驟提供FVII的進一步純化。再者,他們使能濃縮及調製為FVII之組成物。
FVII的活化發生在製造期間,大部分可能性是在陰離子交換色層分析之第一步驟期間。
一旦回收溶析液(第三色層分析之陰離子交換溶析液),該溶析液可在0.22 μm濾器進行過濾步驟,分配於容器內之步驟,然後冷凍至-30℃並保存在此溫度。
本發明之製法也能包括至少一種下列調製步驟,病毒去活性及安定化作用。大體而言,該製法在親和力色層分析步驟前能包括抗病毒處理步驟,其能經由溶劑/洗潔劑有利地進行,特別在Tween® 80(1% w/v)和TnBP(三正丁基磷酸)(0.3% v/v)混合物存在下導致被膜病毒的去活性。再者,在陰離子交換得自第二次色層分析步驟之FVII溶析液,較佳進行奈米過濾步驟以有效消除病毒,特別是無被膜病毒,例如微小病毒B19(parvovirus B19)。使用ASAHI PLANOVATM
15濾器留住尺寸大於15 nm之病毒是可行的。
本發明之另一目的是使用本發明之FVII組成物作為藥劑。
本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備治療罹患血友病病患用藥劑之用途。
本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備治療多發性出血性創傷(multiple hemorrhagic trauma)用藥劑之用途。
本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備治療因手術止血之大量控制不住出血用藥劑之用途。
本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備
治療因服用過量抗凝血劑所致之流血或出血用藥劑之用途。
本發明之另一目的是一種醫藥組成物,含有根據本發明之因子FVII以及醫藥可接受賦形劑及/或載劑。
賦形劑能為任何溶液,例如生理食鹽水,生理性、等滲壓性或經緩衝溶液,以及任何懸浮液,凝膠或粉末,同樣地相容於醫藥用途且為熟悉該項技藝者已知。根據本發明之組成物能含有一種或一種以上選自分散劑、助溶劑、安定劑、界面活性劑以及保存劑之試劑或載劑。另一方面,根據本發明之組成物能含有另外試劑或活性構造。
再者,組成物能以不同方式及不同形式投與。投與能以用於此型治療方法之任何典型路徑提供,尤其例如經由全身性路徑,特別是經由靜脈內、皮內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內或動脈內注射。舉例而言,能提及為腫瘤內注射或注射於接近腫瘤的地區或沖洗腫瘤。
劑量能隨投與次數,結合其他活性構造,病變進展程度等等變化。
本發明之其他方面及優點將以下列實施例說明,此等是為舉例說明之用且不因此限制本發明範圍。
FVII-tg=FVIIa-tg:根據本發明之經活化基因轉殖FVII
FVII-rec=FVIIa-rec:市售之重組經活化FVII
FVII-pd=FVIIa-pd:血漿由來之經活化FVII,亦即純化自人類血漿
MALDI-TOF:基質輔助雷射脫附游離法-飛行時間
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)
HPCE-LIF:高效毛細管電泳-雷射誘發螢光
ESI-MS:質譜儀-電噴霧離子化法
LC-ESIMS:液相色層分析-質譜儀-電噴霧離子化法
NP-HPLC:正相高效液相色層分析
PNGase F:胜肽:N-糖苷酶F(N-glycosidase F)
LC-MS:液相色層分析-質譜儀
首先,經由導入WAP基因之序列Bam H1-Hind III(6.3 Kb片段)(敘述於文獻Devinoyet al
,Nucleic Acids Research,vol.16,no.16,25August 1988,p.8180)於p-poly III-I載體之多連接子(敘述於文獻Latheet al
,Gene
(1987)57,193-201)的序列Bam H1及Hind III之間以製備質體p1。
在此選殖過程中,Bam H1位置被封鎖並以存在於載體p1之Cla I位置取代之。因此載體p1是一質體能接收外來基因置於依賴6.3 Kb WAP啟動子之下。外來基因的導入,例如能進入多連接子的Sal I位置。在切開位於p-poly III-I質體之多連接子末端的兩個Not 1位置之後,能從質體單離出含有全部啟動子及外來基因之插入物。
得自質體p1之質體p2含有兔子WAP基因的啟動子(6.3
Kb)及人類FVII基因。用於得到該基因轉殖雌兔之片段是含於兩個Not 1位置之間。
經由特定位突變將Hind III位置導入基因的前導序列以用於作為選殖位置。
經由標準顯微注射技術得到基因轉殖雌兔(Brinsteret al
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,4438-4442)。將含有500個此基因副本之1-2 p1注射到老鼠胚胎的雄原核(male pronucleus)。此構築是在p-poly III-I載體中進行(Latheet al
,Gene(1987)57,193-201)。顯微注射含有重組基因之該載體的Not 1-Not 1片段。之後,將胚胎轉移到採用荷爾蒙調製之雌兔輸卵管。經操作之胚胎約10%生出幼兔以及經操作之胚胎有2-5%生出基因轉殖幼兔。從兔子尾巴萃取DNA,經由南方(Southern)轉移技術揭露轉殖基因的存在。經由專一放射免疫分析法評價動物血液及乳汁中的FVII濃度。
經由添加乳汁到細胞或兔子哺乳動物外植物培養基來評價FVII的生物活性。
用於得到產生本發明之FVII於其乳汁之基因轉殖雌兔之技術,更詳細說明於文獻EP 0 527 063。
a)FVII之萃取
取500 ml生全脂乳汁並以9體積的0.25 M磷酸鈉緩衝液,pH 8.2稀釋。在室溫攪拌30分鐘後,在15℃以10000g離心富含FVII之水相1小時(離心機Sorvall Evolution RC-6700 rpm-rotor SLC-6000)。6瓶約835 ml是必需
的。
離心後呈現三相:一脂肪相於表面上(乳脂),一非脂質水性透明富含FVII之相(多數相)以及一固體白相小丸(不溶性酪蛋白及鈣化合物之沉澱)。
使用蠕動式幫浦(persistaltic pump)於靠近乳脂相收集含有FVII之非脂肪性水相。分開回收乳脂相。移除固相(沉澱)。
然而仍含有非常少量脂質之非脂質水相於一連串濾器過濾(Pall SLK7002U010ZP-具有孔大小為1 μm之玻璃纖維預濾器-然後Pall SLK7002NXP-具有孔大小為0.45 μm之Nylon 66)。過濾終了時,脂肪相通過此過濾順序,其能完全保留住乳汁的脂肪小球,且濾液是透明的。
然後在超過濾膜(Millipore Biomax 50 kDa-0.1 m2
)透析已過濾之非脂肪性水相以使其適用於色層分析相。具有分子量約50 kDa之FVII不會濾過此膜,不同於乳汁的鹽類、糖類及胜肽。第一次濃縮溶液(約5,000 ml)至500 ml,然後經由超過濾透析維持固定體積,使能移除電解質及使此生物材料適應色層分析步驟。透析緩衝液為0.025M磷酸鈉緩衝液,pH 8.2。
含有FVII之非脂肪性水相能將之比作為富含FVII-tg-之抗乳血清。在繼續處理之前,將此製備物保存在-30℃。
此步驟回收FVII之總產量另人非常滿意:90%(91%以磷酸萃取+99%透析/透析)。
在此步驟結束時,含有FVII之非脂肪性水相較佳為透
明的且適用於後續的色層分析步驟。
在此階段萃取約93 000 IU的FVII-tg。此製備物的FVII純度為0.2%等級。
b)FVII之純化
1.羥基磷灰石凝膠之色層分析
以BioRad陶性羥基磷灰石第I型(CHT-I)凝膠裝入Amicon 90(9 cm直徑-64 cm2
截面)管柱。
以含有0.025 M磷酸鈉及0.04 M氯化鈉、pH 8.0混合物之水性緩衝液A平衡凝膠。貯存在-30℃的整個製備物在37℃水浴中解凍,直到冰團完全融化,然後注射於凝膠(線形流速100 cm/小時,亦即105 ml/分鐘)。經由通過含有0.025 M磷酸鈉及0.04 M氯化鈉、pH 8.2之緩衝液移除未保留之分劃,直到返回基線(RBL)。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
以含有0.25 M磷酸鈉及0.4 M氯化鈉、pH 8.0之緩衝液B進行含有FVII-tg之分劃的溶析。收集溶析之分劃直到返回基線。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
此色層分析能回收超過90%的FVII-tg,並消除超過95%的乳汁蛋白質。將專一活性(S.A.)乘以25。在此階段可得到約85,000 IU具有純度4%的FVII-tg。
2. 100 kDa正切過濾(tangential filtration)及50 kDa濃縮/透析
先前步驟的整個溶析液經由正切模式在100 kDa超過濾膜(Pall OMEGA SC 100K-0.1 m2
)上過濾。通過100 kDa
膜來過濾FVII,而分子量高於100 kDa的蛋白質無法濾過。
之後濃縮已過濾之分劃至約500 ml,然後在如前已述之50 kDa超濾器透析。透析緩衝液是0.15 M氯化鈉。
在此製法階段,產物要通過離子交換色層分析之前保存在-30℃。
此階段能降低分子量高於100 kDa之蛋白質的載量,特別是酵素原。以100 kDa膜之處理能保留約50%的蛋白質,其為高分子量蛋白質,而過濾95%的FVII-tg,亦即82,000 IU的FVII-tg。
此處理能降低下游步驟期間蛋白質水解的風險。
3. Q-Sepharose® FF凝膠之色層分析
在離子交換凝膠Q-Sepharose® Fast Flow(QSFF)進行的這3次連續色層分析是為了純化活性構造,使FVII活化為活化FVII(FVIIa)且最終濃縮及調製FVII之組成物。
3.1 Q-Sepharose® FF 1步驟-溶析“高鈣”
以100 ml的Q-Sepharose®FF凝膠(GE Healthcare)填入2.6 cm直徑(5.3 cm2
截面)管柱。
以0.05 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。
貯存在-30℃的整個分劃在37℃水浴中解凍,直到冰團完全融化。注射到凝膠(流速13 ml/分鐘,亦即線形流速150 cm/小時)之前,以平衡緩衝液稀釋分劃為½[v/v],然後經由通過緩衝液移除未保留之分劃直到RBL。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
使用0.05 M Tris及0.15 M氯化鈉緩衝液、pH 7.5,以
9 ml/分鐘(亦即100 cm/小時)溶析具有低含量FVII之第一蛋白質分劃,然後移除。
使用0.05 M Tris和0.05 M氯化鈉及0.05 M氯化鈣緩衝液、pH 7.5,以9 ml/分鐘(亦即100 cm/小時)溶析第二富含FVII之蛋白質分劃。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
此第二分劃在如前已述之50 kDa超濾器透析。透析緩衝液是0.15 M氯化鈉。第二次通過陰離子交換色層分析之前一晚將此分劃保存在+4℃。
此階段能回收73%的FVII(亦即60000 IU的FVII-tg),並消除80%的結合蛋白質。其亦使FVII活化為FVIIa。
3.2 Q-Sepharose® FF 2步驟-溶析“低鈣”
以30 ml的Q-Sepharose® FF(GE Healthcare)凝膠填入2.5 cm直徑(4.9 cm2
截面)管柱。
以0.05 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。
保存在+4℃之先前已溶析分劃(第二分劃)於注射到凝膠(流速9 ml/分鐘,亦即線形流速100 cm/小時)之前經稀釋。
注射第二分劃後,以平衡緩衝液清洗凝膠以移除未保留分劃直到RLB。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
含有非常高純度FVII之分劃以4.5 ml/分鐘(亦即50 cm/小時)溶析於0.05 M Tris,0.05 M氯化鈉及0.005 M氯化鈣緩衝液,pH 7.5。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
純化約23,000 IU的FVII-tg,亦即12 mg的FVII-tg。
此步驟能消除超過95%的結合蛋白質(兔子乳汁蛋白
質)。
此溶析液具有純度高於90%,展現接近天然人類FVII分子之結構及功能特徵。其於第三次通過離子交換色層分析時濃縮及調製。
3.3 Q-Sepharose® FF 3步驟-“鈉”溶析
以10 ml of Q-Sepharose® FF凝膠(GE Healthcare)填入2,5 cm直徑(4.9 cm2
截面)管柱。
以0.05 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。
溶析液,即先前步驟已純化之分劃注射到凝膠(流速4,5 ml/分鐘,亦即線形流速50 cm/小時)之前以注射用純水(PWI)稀釋五次。
注射該分劃後,以平衡緩衝液清洗凝膠以移除未保留分劃直到RLB。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
之後以流速3 ml/分鐘(亦即36 cm/小時)使用0.02 M Tris及0.28 M氯化鈉緩衝液、pH 7.0溶析FVII-tg。在280 nm波長(λ)進行吸光率的測量。
所製備濃縮物形式之FVII-tg組成物的純度高於95%。該產物適用於靜脈內注射。此製法造成22%的累積產量,能純化至少20 mg的FVII/所用每公升乳汁。
再者,將FVII-tg之組成物進行不同的結構分析,例如下列實施例所進展者。
1.胜肽圖譜
FVII-pd、FVII-rec及FVII-tg樣品經胰蛋白酶及Asp-N
分解後(數據未示)得到LC-MS及UV偵測層析圖。
胰蛋白酶分解後所得之胜肽圖譜分析顯示他們的滯留時間少於65分鐘是類似的。此外,對應於重鏈胜肽片段之種類可見於FVII-rec及FVII-tg,但FVII-pd則無。這些具有高質量(4500 Da至8000 Da)之胜肽對應於不完全的切割。這些胜肽可見於其他FVII-pd批次,因此他們的存在不可能涉及不同的胰蛋白酶靈敏度。
Asp-N分解後得到之胜肽圖譜類似於從FVII至另一所得者,且此沿著整個連續的滯留時間。觀察到之強度差異只因注射量變化所致,且無關於結構差異。
2.包含之序列
從經MS及/或MS/MS鑑定之胜肽計算序列的重疊。表1摘要不同樣品所得結果。考慮胰蛋白酶及Asp-N分解,超過95%的一級序列能經證實,所得結果是根據文獻所述者(Thim L.et al
,Biochemistry,1988,27,7785-7793)。
為確認胜肽的同一性,經由MALDI及Edman定序分析HPLC分劃。
經由Edman定序分析的全部HPLC分劃能得到80%的序
列重疊。進行於FVII-tg及FVII-rec於LC-MS之序列確認產生一級序列>95%的重疊。
經由LC-ESIMS(/MS)鑑定FVII-tg的N-糖化作用位置,經由MALDI-TOFMS確認,以及經由LC-ESIMS決定微觀不均一性。
第2圖描述含有兩個糖化Asn殘基之糖胜肽的去迴旋ESI質譜圖。經由MALDI-TOF(/TOF)確認糖化作用位置之方位並經Edman定序。
血漿FVII(FVII-pd)具有N-糖化作用位置Asn145
及Asn322
的分別糖胜肽質譜[D123
-R152
]及[K31.6
-R353
]分析,顯現存在雙觸、唾液酸化、非炭藻糖化結構(A2)(糖胜肽之觀察質量:5563.8 Da)以及炭藻糖化(A2F)(觀察之質量:5709.8Da)。也注意到存在三觸、三唾液酸化、非炭藻糖化寡醣(A3)(觀察之質量;6220.0 Da)以及炭藻糖化(A3F)(觀察之質量:6366.1 Da)。對於基因轉殖FVII(FVII-tg),位於Asn145
之大部分寡醣是雙觸、單一唾液酸化、非炭藻糖化或炭藻糖化(A1,AIF)以及A2,A2F型。三觸形式極少出現。
關於大部分的Asn322
糖形式,觀察到相同聚醣結構有不同比例。第2圖顯現存有比在Asn145
上較少處理形式(較少觸角及唾液酸化)。例如,對於血漿產物三觸結構在Asn322
上比Asn145
少出現,且FVII-tg是缺乏的。亦需注意,Asn 145及322是100%糖化。雖然是半定量,但這些結果與HPCE-LIF及NP-HPLC所得定量值是一致的。
寡醣N-連接的鑑定及定量是在以PNGase F去糖化作用後進行HPCE-LIF。FVII樣品處以外糖苷酶(唾液酸酶(酵素/受質比例(FVII)1 mIU/10 μg)、半乳糖苷酶、窘曲酶(hexnacase)(Prozyme套組)、炭藻糖酶(E/S比例:1 mIU/10μg))以確保每一單離結構的鑑定及定量。所得聚醣以螢光染料(fluorochrome)標識並依據他們的質量及電荷分離。兩種標準(葡萄糖同聚物及寡糖)能鑑定結構。經由接合關於整個定量寡糖的每一峰來進行定量。
在此實施例中,使用毛細管電泳ProteoLab PA800裝置(Beckman-Coulter)。也使用稱為“凝膠緩衝液-N”(Beckman-Coulter)之分離緩衝液。在20℃以25 kV進行此實驗20分鐘。使用雷射進行偵測(激發λ=488 nm;放射λ=520 nm)。
以唾液酸酶、半乳糖苷酶及窘曲酶同時去糖化作用後計算炭藻糖化比例,以對應於“核心”及炭藻糖化“核心”間之峰區域比例。
FVII-pd的大部分聚醣是雙觸、雙唾液酸化(A2)以及雙觸、雙唾液酸化、炭藻糖化(A2F)類型。FVII-tg之此聚醣形狀(參閱第3圖)顯示存在雙觸、單一唾液酸化、炭藻糖化或非炭藻糖化類型(A1F,A1)之結構,以及雙觸、雙唾液酸化、非炭藻糖化或炭藻糖化類型(A2,A2F)之結構。FVII-rec之形狀顯示非典型遷移時間於不同之所觀察結構(A1F,A2F)。
不同聚醣結構的定量分析(表2)顯示FVII-pd具有約51%雙唾液酸化聚醣(A2及A2F)及30%三觸、唾液酸化、非炭藻糖化或炭藻糖化形式(G3及G3F)之唾液酸化結構優勢。FVII-tg(批次A及B)具有35%雙觸、雙唾液酸化形式及只有6%三觸、唾液酸化形式,比FVII-pd有較少的唾液酸化。大部分形式為具有50%結構A1及A1F之單一唾液酸化。FVII-rec也比具有45% A2F結構及只有6%三觸、唾液酸化、聚醣之FVII-pd有較少唾液酸化(結果未示)。
對於FVII-rec,需注意低比例之非炭藻糖化結構。
定量分析顯示FVII-pd低比例之炭藻糖化(16%),對於FVII-tg的炭藻糖化比例從24至42%,以及對於FVII-rec的炭藻糖化為100%。
FVII-pd及FVII-tg之N-糖化作用的定性及定量分析是經由NP-HPLC檢驗。蛋白質經除垢及乾燥後,此蛋白質被變性還原。然後經由酵素路徑釋放聚醣(內糖苷酶PNGase F)並經由乙醇沉澱純化。如此所得聚醣經由螢光物質fluorophore:2-胺基苯甲醯胺(2-AB)標識。使用NP-HPLC(醯胺-80管柱-4,6/250 mm-Tosohaas)根據他們的親水性分離經標識之聚醣。注射之前,以80%乙腈平衡管柱。使用增加梯度之甲酸銨50 mM、pH 4.5溶析寡醣。以螢光測定法(激發λ=330 nm;放射λ=420 nm)進行偵測。
FVII-pd的層析圖概廓(第4圖)顯示大部分聚醣是具有比例至39%之雙觸、雙唾液酸化類型(A2)。也觀察到較低量之雙觸、雙唾液酸化、炭藻糖化(A2F),單一唾液酸化(A1)以及三唾液酸化、炭藻糖化及非炭藻糖化(A3F及A3)形式。
對FVII-tg進行NP-HPLC分析確認存有類型A1之大部分寡醣,至多比例27%。較少出現結構A1F、A2及A2F,以及存由微量三觸形式。此顯露出FVII-pd及較少唾液酸化因
子FVII-tg間之唾液酸化差異。
為鑑定存在於FVII-tg之聚醣結構,於以製備型NP-HPLC所得溶析分劃進行MALDI-TOF MS分析(第5圖)。使用熟悉該項技藝者已知的典型裝置及方法進行MALDI-TOF分析。亦即使用Bruker Autoflex 2儀器,以TOF及TOF/TOF模式(激發λ:330 nm;放射λ:420 nm)。
FVII-tg之MALDI-TOF分析能確認鑑定經由NP-HPLC分離之聚醣,亦即多數的單一唾液酸化A1結構及少數形式之A1F、A2F及A2類型。
此研究也能鑑定三觸、雙唾液酸化及三唾液酸化少數形式、混合形式以及Man5及Man6-P-HexNAc類型之寡甘露糖。
為進一步鑑定聚醣結構,去唾液酸化後進行因子FVII-tg的MALDI-TOF MS分析。
去唾液酸化後,觀察到存在分別具有比例35%及28%之兩主要形式G2及G2F(經由NP-HPLC定量)。這些結果是依據“天然”產物(未去唾液酸化之產物)的結構鑑定。
其他被鑑定之形式只出現少量且實質上為寡甘露糖,Man6-P-HexNAc及Man7-P-HexNAc類型,以及混合類型。注意存有雙炭藻糖化形式。
關於唾液酸-半乳糖連接(“分枝”)研究的實驗步驟類似於已說明於實施例5者。以PNGase F去糖化作用後,以專一外唾液酸酶處理寡醣來確定每一單離結構的鑑定及定
量。所用來自肺炎雙球菌(S.pneumoniae
)(α 2-3連接專一性,0.02 IU,E/S=0.4 w/w),產氣莢膜桿菌(C.perfringens
)(α 2-3及α 2-6連接專一性,0.04 IU,E/S=0.1 w/w)以及節桿菌株(A.urefaciens
)(能水解α 2-3,α 2-6,α 2-8及α 2-9連接,0.01 IU,E/S=0.05 w/w)之唾液酸酶是重組酵素。
經由分析顯示FVII-rec具有大部分A2F之雙觸、唾液酸化、炭藻糖化聚醣結構,以及雙觸、單一唾液酸化、炭藻糖化(A1F)形式。當與這些結構常遇之遷移時間比較時,需注意這些結構A2F及A1F之非典型遷移時間。意即,相較於那些FVII-tg,這些寡醣的唾液酸化結構展現非典型遷移時間於HPCE-LIF及NP-HPLC。另一方面,組成物於單醣類之分析未展現不同於Neu5Ac之任何特別唾液酸,且質譜儀方法展現具有依據雙唾液酸化類型質量之聚醣。最終,FVII-rec的聚醣去唾液酸化能再次發現相當於FVII-tg及FVII-pd的那些寡醣的層析圖及電泳反應。
因此這些電泳及層析圖反應的差異能解釋為唾液酸的不同分枝。經由HPCE-LIF及MS不同方法評估此假設。
結果摘要於以下表4。
結果顯示這三種FVII在唾液酸水平之特殊異構物。的
確,FVII-rec的唾液酸包含α 2-3連接,而FVII-tg展現分枝α 2-6,以及FVII-pd為這兩異構物之混合物。
相對於FVII-tg及FVII-pd之FVII-rec的聚醣所觀察之HPCE-LIF及NP-HPLC反應差異,是關係於這些在唾液酸水平之異構性差異。
FVII存在兩個O-糖化作用位置位於Ser52
及Ser60
水平。這些殘基分別含有葡萄糖-(木糖)0-2
及炭藻糖部分。在此研究架構中,經由LC-ESIMS(/MS)以及類似方法經由MALDI-TOF(/TOF)研究O-糖化作用(結果未示)。
第10圖舉例說明樣品FVII-pd、FVII-rec及FVII-tg的O-聚醣結構。在m/z 3297.4之峰對應於含有葡萄糖-(木糖)2
部分於Ser52
及炭藻糖於Ser60
之胜肽[Leu39
-Lys62
]。在m/z 3165.4及3033.3之峰分別對應於減少1及2個木糖於此糖胜肽。這三類型之FVII一律地炭藻糖化及糖化,但木糖殘基的數目及對應的糖形式比例不同。如此具有0、1及2個木糖之形式以幾乎相同比例存在於FVII-pd,而FVII-rec及FVII-tg只含有具有0及2個木糖之形式。
MS分析顯示在m/z
1516.6之二價離子,對應於帶有Fuc及Glc(Xyl)0
結構之胜肽[Leu39
-Lys62
]。以MS/MS得到之相繼質量的減少對應於不同單醣類,確認Ser52
及Ser60
的修飾分別具有葡萄糖及炭藻糖殘基。就修飾位置而論,Edman定序能支持這些結果。
在同樣程度上,在m/z
1648.7之二價離子對應於帶有
Fuc及Glc(Xyl)2
結構之胜肽[Leu39
-Lys62
]。MS/MS所得之不同離子片段確認木糖部分鍵結於葡萄糖。
FVII-pd的前10個麩胺酸是γ-羧酸化,而FVII-rec的第10個麩胺酸只是部分γ-羧酸化。為研究基因轉殖FVII的γ-羧基化及其比較部分,經由LC-MS分析Asp-N及胰蛋白酶分解後所得胜肽。這兩酵素的結論是類似的,但只顯示於Asp-N分解有關之數據。
在這些實驗條件中,包含γ-羧基化之三種胜肽[Ala1
-Lys32
]、[Asp33
-Ser45
]及[Asp33
-Gly47
]經鑑定。胜肽[Ala1
-Lys32
]含有前9個γ-羧酸(Gla)而其他兩胜肽[Asp33
-Ser45
]及[Asp33
-Gly47
]只含有第10個Gla殘基。因此,更容易專一研究第10個Gla殘基的部分修飾。
FVII-pd的質譜分析(第11圖)顯示存在主峰(~90%)於4296.8 Da,對應於前9個麩胺酸(Glu)上完全γ-羧酸化之胜肽[Ala1
-Lys32
],以及在1658.8 Da有一峰特徵為在第10個Glu35
上完整地γ-羧酸化之胜肽[Asp33
-Ser45
]。根據文獻(Jurlander B.et al
,Semin.Thromb.Hemost.,2001,27,373-384),這些結果顯示FVII-pd的前10個Glu殘基是γ-羧酸化。
由於在相同實驗條件下得到不同數據,可能是不同批次FVII的比較研究(表5)。
第11圖顯示FVII-rec及FVII-tg在4296.8 Da之峰,對應於完整γ-羧酸化之胜肽[Ala1
-Lys32
]佔大多數。另一方面,對於兩FVII發現存在主峰於1614.9,代表在Gla35未
γ-羧酸化之胜肽[Asp33
-Ser45
]特徵。此結果指出第10個Gla的部分γ-羧基化估計約有35-40%於FVII-rec之情形,其為依據已發表之值~50%(Thim L.et al
,Biochemistry,1988,27,7785-7793及Jurlander B.et al
,Semin.Thromb.Hemost.,2001,27,373-383)。亦需報告為存在一具有8個Gla有一非無關緊要強度於此胜肽[Ala1
-Lys32
]之形式。此最後觀點指出一個或一個以上Gla於此胜肽之部分γ-羧基化,存在“微量”具有7個Gla形式應相當強調涉及單一殘基。
FVII之二硫橋研究是從無還原劑條件下得到之胰蛋白酶水解物來進行,亦即仍保留二硫橋。
包括與碘乙醯胺之反應步驟以阻斷可能的游離半胱胺酸,且如此以避免在鹼性pH進行步驟期間二硫橋的交換。
在這些條件下,能確認存在有12個二硫橋及配對10個半胱胺酸(表6)。然而,需強調為相對於此FVII序列部分所得結果是依照理論配對。這些結論可應用於兩被研究樣品:FVII-pd及FVII-tg。
使用之實驗策略可應用於無任何轉譯後修飾(MPT)之雙胜肽[Gly354
-Ser379
]/[Asp338
-Lys341
](結果未示)。此策略包含四個互補方法:i)經由ESI-MS及MALDI-MS於實驗及觀察質量間之質量的雙重“配對”來鑑定含有二硫橋之雙胜肽,ii)經由化學還原S-S橋來確認結構,以及從雙胜肽所產生之兩個胜肽的MS鑑定,以及iii)經由MS/MS及自動Edman顯微定序來定序雙胜肽。
結果顯示經由“配對”實驗質量(3264.6 Da)與理論質量(3264.5 Da)之第一次鑑定包含二硫橋Cys340
-Cys368
之雙胜肽[Gly354
-Ser379
]/[Asp338
-Lys341
]。
還原後,對應於含有Cys340
-Cys368
橋之此雙胜肽[Gly354
-Ser379
]/[Asp338
-Lys341
]的消失峰,被發現於含有Cys368
之胜肽[Gly354
-Ser379
](理論質量:2816.3 Da)在m/z 2816.3特徵之較佳峰。經由MS/MS及Edman化學之定序確認雙胜肽[Gly354
-Ser379
]/[Asp338
-Lys341
]及二硫橋Cys340
-Cys368
之鑑定。
胜肽分析是從蛋白質之胰蛋白酶“分解”來進行。經由MALDI-MS分析胜肽。羥基化胜肽的鑑定是經由相較於理論質量之觀察質量的測量來進行。使用之儀器為Bruker Autoflex 2根據TOF模式運行。
不同結果呈現於表7。需強調為文獻報導FVII-pd及FVII-rec缺乏β-羥基化(Thim L.et al
,Biochemistry,1988,27,7785-7793),而能觀察到這兩樣品之部分修飾,但比不同FVII-tg批次以較不充足的方式。
為研究可能存在Gal α 1,3Gal結構於FVII-tg,使用牛甲狀腺球蛋白作為Gal α 1,3Gal結構的正對照組。
以PNGase F去糖化作用後,產物處以Gal α 1,3Gal分枝-專一唾液酸酶、炭藻糖酶及α-半乳糖苷酶。
第6圖舉例說明在含有天然形狀(“天然”)之超級位置,去唾液酸化、去炭藻糖化及α-去半乳糖化形狀之超級
位置(Dsial+Dfuc+Dgal α(1,3,4,6))之牛甲狀腺球蛋白進行之研究。α-去半乳糖化後得到之聚醣形狀顯示在處以酵素之後此結構完全消失,因此證明所用α-半乳糖苷酶具有絕對活性。所得17.8%之Gal α 1,3Gal結構之比例與預期的比例一致。
第7舉例說明超級位置,去唾液酸化及去炭藻糖化FVII-tg產物(Dsial+Dfuc)與去唾液酸化、去炭藻糖化及α-去半乳糖化產物(Dsial+Dfuc+Dgal α(1,3,4,6))之電泳圖。
需注意兩形狀為完全地可疊合(superposable)。這些結果暗示FVII-tg缺乏Gal α 1,3Gal結構。應注意存在對應於聚醣炭藻糖之少數結構(*)並非在近側位置。
10 μg人類重組及基因轉殖FVII根據二硫橋還原條件處理,沉積於電泳凝膠並於還原之SDS-PAGE中分離後轉移到硝化纖維膜。使用牛甲狀腺球蛋白之樣品(Sigma,T1001,來自牛甲狀腺之甲狀腺球蛋白)作為正對照組,因為其高抗原決定基α(1,3)半乳糖基含量。α-Gal部分(半乳糖-α-3半乳糖-(3)4GlcNAc-R)之存在以經硬柄小皮傘菌(Marasmius oreades
)凝集素過氧化酶標識且α-Gal α-Gal抗原決定基專一之純化外源凝集素(lectin)(EY Laboratories,H-9001,MOA-HRP)來顯露。之後,以產色受質(Fluka,4-氯-1-萘酚)偵測過氧化酶活性並以訊號數位化來定量(Bio-Rad,Quantity-one)。一同樣膜處以α-半乳糖苷酶(Prozyme,綠咖啡豆)以確認訊號專一性。在此同時,也經由染色同樣的
SDS-PAGE凝膠,以考馬氏藍(Coomassie blue)染色評估蛋白質總量。
由於觀察到牛甲狀腺球蛋白之強烈訊號及其處以α-半乳糖苷酶後消失,因此結果顯示硬柄小皮傘菌(Marasmius oreades
)(MOA)外源凝集素之專一性。結果以關於MOA訊號強度除以對應於所分析蛋白質量之訊號強度來表示,證明FVII-tg樣品的殘留α-Gal訊號(2,3 à 3,7)程度,而重組FVII展現較高值。
這些結果(參閱第8圖)證明表現於兔子之基因轉殖FVII上缺乏α-Gal抗原決定基或出現程度非常弱(例如相較於倉鼠細胞之重組FVII產物)。
表A摘要為提供本發明之FVII組成物根據本發明較佳具體例之製法步驟,以及提供每一步驟所得之不同產量,純度及專一活性
第1圖:根據本發明製造於雌兔乳汁之基因轉殖FVII的萃取及純化/活化方法之一實施例概述。
第2圖:帶有N-糖化作用位置之胜肽之去迴旋質譜圖ESI(Deconvoluted mass spectra ESI)。
第3圖:FVII經PNGase F去糖化作用後之電泳圖HPCE-LIF;圖例說明:兩中心電泳圖:FVII-tg;()炭藻糖,(■)GlcNAc(N-乙醯葡萄胺),(●)甘露糖,(●)半乳糖,(▲)唾液酸。
上方電泳圖:FVII-pd
中心電泳圖(2):FVII-tg
下方電泳圖:FVII-rec
第4圖:FVII-tg(中心之層析圖)、FVII-pd(上方之層析圖)及FVII-rec(下方之層析圖)經由NP-HPLC之特性分析。糖殘基之圖例說明:參閱第3圖。
第5圖:經由MALDI-TOFMS鑑定FVII-tg之主要聚醣形式。糖殘基之圖例說明:參閱第3圖。
第6圖:經由HPCE-LIF分析甲狀腺球蛋白之寡醣。糖殘基之圖例說明:參閱第3圖。
第7圖:經由HPCE-LIF分析基因轉殖FVII之寡醣。糖殘基之圖例說明:參閱第3圖。
第8圖:Gal α 1,3Gal結構之定量。
第9圖:FVII之萃取機制之實施例。
第10圖:帶有O-糖化作用位置之胜肽的去迴旋質譜圖ESI。這些胜肽得自以胰蛋白酶分解及LC-ESIMS分析之後。Fuc:炭藻糖,Glc:葡萄糖,Xyl:木糖。
第11圖:帶有γ-羧基化位置之胜肽的去迴旋質譜圖ESI。這些胜肽得自以Asp-N分解及LC-ESIMS分析之後。所得結果於不同批次FVII-tg是非常類似的。不同胜肽的質量是單一同位素質量(monoisotopic masses)。Gla:γ-羧酸。
<110> 法國化學暨生物科技實驗室(LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES) <120> 重組或基因轉殖因子VII組成物,因子VII之每一分子呈現兩具有已界定聚醣部分之N-糖化作用位置<130> LFB <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> 人類(Homo sapiens) <400> 1
Claims (15)
- 一種重組或基因轉殖因子VII(FVII)之組成物,組成物之每一因子VII分子展現兩個N-糖化作用位置,特徵為組成物之FVII全部分子間Gal α 1,3Gal聚醣部分的比例介於0及4%之間,其中FVII之至少65%的唾液酸包含α 2-6連接。
- 如申請專利範圍第1項之組成物,其中FVII之全部唾液酸包含α 2-6連接。
- 如申請專利範圍第1項之組成物,其中FVII包括包含α2-3連接之唾液酸。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物,其中FVII組成物之全部聚醣部分中,至少40%是雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。
- 如申請專利範圍第4項之組成物,其中FVII之雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大於50%鍵結至FVII之N-糖化作用位置之聚醣形式係FVII之雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。
- 如申請專利範圍第5項之組成物,其中FVII的雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大於50%之聚醣形式為非炭藻糖化。
- 如申請專利範圍第6項之組成物,其中炭藻糖化比例由介於20%及50%之間所組成。
- 如申請專利範圍第1項之組成物,其特徵為其由基因轉殖 雌兔產生。
- 如申請專利範圍第1項之組成物,其中因子VII是經活化的。
- 如申請專利範圍第1項之組成物,其係用於作為藥劑。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之因子VII之組成物之用途,其係於製備治療罹患血友病病患用之藥劑。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之因子VII之組成物之用途,其係於製備治療多發性出血性創傷(multiple hemorrhagic traumas)用之藥劑。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之因子VII之組成物之用途,其係於製備治療因手術止血之大量控制不住出血用之藥劑。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之因子VII之組成物之用途,其係於製備治療因服用過量抗凝血劑所致之流血或出血用之藥劑。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項之因子VII以及醫藥可接受賦形劑及/或載劑。
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