KR101312390B1 - 각 인자 ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 조성물 - Google Patents

각 인자 ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101312390B1
KR101312390B1 KR1020087029099A KR20087029099A KR101312390B1 KR 101312390 B1 KR101312390 B1 KR 101312390B1 KR 1020087029099 A KR1020087029099 A KR 1020087029099A KR 20087029099 A KR20087029099 A KR 20087029099A KR 101312390 B1 KR101312390 B1 KR 101312390B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fviii
composition
delete delete
factor vii
fvii
Prior art date
Application number
KR1020087029099A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090031676A (ko
Inventor
압데사타르 사미 츠토우로우
엠마누엘 노니
니콜라스 비호레아우
Original Assignee
엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37714417&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101312390(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 엘에프비 바이오테크놀로지스 filed Critical 엘에프비 바이오테크놀로지스
Publication of KR20090031676A publication Critical patent/KR20090031676A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101312390B1 publication Critical patent/KR101312390B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 조성물의 각 인자 Ⅶ 분자가 두 개의 N-당화 자리를 나타내는, 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ(FⅦ)의 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물의 모든 FⅦ분자 중에 Galα1, 3 Gal 글리칸 모이어티의 비율이 0 내지 4%이다. 또한, 본 발명은 FⅦ의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

각 인자 Ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물{RECOMBINANT OR TRANSGENIC FACTOR Ⅶ COMPOSITION, EACH FACTOR Ⅶ MOLECULE HAVING TWO N-GLYCOSYLATION SITES WITH DEFINED GLYCAN UNITS}
본 발명은 인자 Ⅶ 조성물의 형태로 얻어진 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 및 그것의 의약품으로서의 사용에 관한 것으로, 각 인자 Ⅶ 분자는 특정 글리칸 모어어티(defined glycan moieties)를 가지는 2개의 N-당화(N-glycosylation) 자리를 가진다.
인자 Ⅶ(FⅦ)는 비타민 K에 의존적인 당단백질(vitamin K dependent glycoprotein)로서, 그것의 활성화된 형태(FⅦa)는 칼슘 및 조직 인자가 존재하는 경우 인자 Ⅹ 및 인자 Ⅸ를 활성화시키는 응고 과정에 참여한다. FⅦ는 약 50kDa의 분자량을 가지는 406 잔기의 단일 펩티드 사슬 형태로 분비된다. FⅦ는 4개의 특유한 구조상 도메인을 포함한다: N-터미널 γ-카르복실 도메인(N-terminal ν-carboxylic domain(Gla)), 두 개의 "상피세포성장인자-유사" 도메인("epidermal growth factor(EGF)-like" domains) 및 세린 프로테아제 도메인(serine protease domain). FⅦa로 FⅦ가 활성화되는 것은 Arg152-Ile153 도메인(아르기닌 152-이소류신 153) 결합이 끊어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, FⅦa는 약 20kDa의 분자량을 가진 152 아미노산의 경쇄 및 약 30kDa의 분자량을 가진 254 아미노산의 중연쇄를 가진 화합물이며, 서로 하나의 이황화 결합(disulfide bridge)(Cys135-Cys262)에 의해 연결되어 있다.
혈장(plasma) FⅦa는 몇몇 번역-후 변형을 포함한다: 첫 번째 10개의 글루탐산이 γ-카르복식화되고(γ-carboxylated); Asp63는 부분적으로 수산화되며(hydroxylated); Ser52(세린 52)와 Ser60(세린 60)는 O-당화되고(O-glycosylated), 각각 글루코오즈(크실로오스)0-2, 퓨코오즈(Fucose) 패턴을 전하고; Asn145(아스파라긴 145) 및 Asn322(아스파라긴 322)는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조(biantennary bisialylated complex structures)에 의하여 N-당화된다.
예를 들면 FⅦ가 선천적으로 결핍된 또는 다른 응고 인자가 결핍된, 예를 들면 인자 Ⅷ(유형 A 혈우병(hemophilia)) 또는 인자 Ⅸ(유형 B 혈우병)가 결핍된, 혈우병 환자를 치료하기 위해 FⅦ를 사용한다. 따라서, 주사 가능한 FⅦa 농축물을 사용할 수 있어야 한다.
FⅦa 농축물을 얻기를 위한 가장 오래된 방법은 분별법에 의해 얻어진 혈장 단백질에서 FⅦa를 정화하는 단계를 포함한다.
그 목적을 위해, 유럽특허 EP 0 346 241에서 FⅦa가 풍부한 단편을 제조하는 방법을 기술하며, 상세하게 상기 FⅦa가 풍부한 단편은 흡착 단계 및 FⅦ 및 FⅦa, 인자 Ⅸ(FⅨ), 인자 X(FX) 및 인자 Ⅱ(FⅡ)와 같은 다른 단백질을 포함하는 혈장 단백질, 특히 PPSB의 용출하기 전의 생성물을 분별하는 두 번째 생성물의 용출에 의해 얻어진다(P=프로트롬빈(prothrombin) 또는 FⅡ, P=프로콘버틴(proconvertin) 또는 FⅦ, S=스튜어트 인자(Stuart Factor) 또는 FX 및 B=항혈우병인자 B (antihemophilic Factor B) 또는 FⅨ). 이 공정의 결점은 얻어진 FⅦ에서 여전히 다른 응고 인자의 자취를 찾을 수 있다는 것이다.
마찬가지로, 유럽특허 EP 0 547 932에서 실질적으로 비타민- K-의존 인자(vitamin-K-dependent factor)와 FⅧ가 존재하지 않는 고순도의 FⅦa 농축물을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다. 그 순도에도 불구하고, 이 공정에 의해 얻어진 FⅦ는 잔류 트롬보겐 활성(thrombogenic activity)을 나타낸다.
또한, 이 공정의 중요한 결점 중 하나는 소량의 생성물을 산출한다는 것이다. 게다가, 혈장에 존재하는 다른 단백질이 전혀 없는 생성물을 얻는 것은 여전히 어렵다. 바이러스 및 균에 대한 보호를 보장하기 위해 혈장 응고 인자(plasma coagulation factor)를 제조하는 모든 단계에서 많은 주의를 하고 있음에도(헌혈자의 추적, 혈액매개 병원균(blood-born pathogenic agent)이 전달될 위험을 가능한 줄이기 위해 알려져 있는 바이러스성 및 균성 오염물질을 탐지하는 테스트, 엄격한 정화 및 바이러스 불활성화 처리), 병원균에 오염될 모든 위험을 배제할 수 없다. 또한, 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob disease)의 새로운 변형이 나타나서, 혈액 제품으로 새로운 병원균이 전달될 수도 있다는 공포를 초래했다. 게다가, 헌혈자에게서 모은 혈장의 양은 한정된다.
그러므로 1980년 대부터, 인간의 인자 Ⅶ를 인코딩하는 DNA를 분리하여(Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83(8):2412-6), 포유동물의 BHK세포(아기 햄스터 신장)에서 발현시켰다(document EP 0 200 421). 비록 이 FⅦ 제조방법이 관심대상 단백질을 생성하는 매체를 제어하는 이점이 있더라도, 햄스터 세포가 면역원성(immunogenicity)이 증명된, Galα1, 3 Gal 모이어티를 나타내는 단백질을 제공한다는 것(Spiro RG et al, J. Biol. Chem, 1984, vol. 259, N° 15, 9858 and Furukawa K. et al., J. Biol. Chem, 1992, vol. 267, N° 12, 8012)은 공지되어 있다.
1%의 인간 B 림프구(human B lymphocytes)가 순환하면 에피토프(epitope) Galα1, 3 Gal에 대한 항체가 상승한다는 것이 공지되어 있다(Galili et al, Blood, 1993, vol. 82, 2485). 에피토프 및 항체는 보체(complement)를 활성화시키고 이종이식(xenotransplantation)에 따르는 심각한 이식 거부반응과 같은, 가혹한 면역 반응을 유도하는 복합물을 형성한다. 햄스터 세포에서 생성된 FⅦ로 치료한 혈우병 환자의 15 내지 20%가 면역 반응이 발전함이 보고되었다(Prowse C.V et al, Blood Reviews, 1998, vol. 12, 99). 변형된 면역성을 가진, FⅦ 및 FⅧ가 치료하기 매우 어려운 출혈을 유발하기 때문에, 이런 유형의 면역 반응은 혈우병 환자의 경우 비극이다.
따라서 바람직하게 바이러스에 대한 보호가 향상된, 그리고 가능한 감소된 면역성을 가진 재조합 또는 형질전환 FⅦa 조성물을 얻는 것은 필요하다.
그러므로 본 출원인은 매우 감소된 면역성을 나타내고, 바람직하게 바이러스에 대한 보호가 향상된, FⅦ 조성물을 발전시킬 목적을 가진 조사를 하였다.
따라서, 본 발명은 조성물의 각 인자 Ⅶ 분자가 두 개의 N-당화 자리를 나타내는, 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물에 관한 것으로, 조성물의 모든 FⅦ분자 중에 Galα1, 3 Gal 글리칸 모이어티의 비율이 0 내지 4%인 것을 특징으로 한다.
의외로, 본 출원인은 환자를 치료하기 위해 FⅦ 조성물을 사용할 때, 본 발명의 조성물의 FⅦ에 있는 상기 Galα1, 3Gal 글리칸 모이어티의 비율은 면역성을 나타내지 않는 것을 발견했다.
본 발명의 FⅦ는 조성물 형태이다. 실제로, 혈장 FⅦ, 재조합 FⅦ 또는 형질전환 FⅦ이든, 모든 FⅦ은 FⅦ의 몇가지 단백질의 혼합물의 형태를 취하며, 이들 단백질은 동일한 번역-후 변형을 나타내지 않기 때문에 이들 단백질은 다르다고 할 수 있다. 다른 세포 구획(cellular compartment) 안으로 FⅦ 단백질이 이동할 때 세포 소기관에 의해 번역-후 가공이 실행된다. 이런 생화학적 변형을 통해 최종 단백질은 유전자에 의해 직접 인코딩되는 분자와 다른 단백질로 변형된다. 또한, 이런 화학적인 변형을 통해 단백질 활성을 조절할 수 있고 선택적 집중(localisation)이 일어날 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, "FⅦ" 발현 및 "FⅦ 조성물"은 동등하다.
"재조합 또는 형질전환 FⅦ"는 유전공학기술에서 유래하고, 특히 상기에서 기술한 N-당화, 즉 FⅦ 조성물에서의 0 또는 매우 낮은 비율의, 또는 면역적이라고 할 수 없을 정도로, 충분히 낮은 비율의 Galα1, 3 Gal를 가지는 두 개의 N-당화 자리를 가지는, 번역-후 변형 특성을 가진 모든 FⅦ를 의미한다. 반대로, 본 발명의 FⅦ는 혈장 FⅦ, 즉 인간 또는 동물의 혈장에서 정제된 생성물이 아니다.
특히, 활성화된 FⅦ는 특정 글리칸 모이어티를 가지는 O-당화 자리, γ 카르복시화 및 특정한 이황화 결합뿐만 아니라 상기에서 언급한 번역-후 변형 특성을 가진 유전공학기술에서 유래한 모든 활성화된 FⅦ를 의미한다.
Galα1, 3 Gal 모이어티는 두 개의 α1,3-연결 갈락토오스(α1,3-linked galactoses)로 구성된 구조이다. 그것은 N-연결 구조의 올리고당 안테나(oligosaccharidic antennas)의 말단에 위치한다. 이 모이어티는 면역성으로 알려져 있다. 실제로, 그 합성을 유도하는 효소(α1,3-galactosyltransferase)를 인코딩하는 유전자가 불활성화되어 있기 때문에, 인간 및 몇몇 원숭이에는 없다. 그러므로 그런 모이어티를 나타내는 단백질을 투약하면 이렇게 당화된 단백질에 대하여 향상된 항체 형성이 유도된다.
그러므로 약제 단백질에서 이런 면역성 모이어티가 발견되지 않는 것이 매우 바람직하다.
바람직하게, 조성물은 모든 인자 Ⅶ의 모든 분자에서 글리칸 모이어티 Galα1,3 Gal이 존재하지 않는 것을 특징으로 한다.
이는 인자 Ⅶ의 구조 Galα1,3 Gal의 비율이 0 또는 매우 낮아서 현재 사용할 수 있는 분석 장치를 사용하여 측정된 잡음으로부터 구별할 수 없거나, 또는 인자 Ⅶ의 구조 Galα1,3 Gal의 비율을 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol)의 존재하에 착색(coloration)으로 락틴-블랏 탐지법(lectin-blot detection method)에 의해 특히 검출될 수 없는, FⅦ을 의미한다. 이 정량화 방법을 실시예에서 개시한다. 또한 FⅦ은 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ의 구조 Galα1,3 Gal의 비율이 혈장 FⅦ와 근접한, 어떤 재조합 또는 형질전환 FⅦ를 의미한다. 어떤 경우라도, 본 발명의 FⅦ 조성물에서 Galα1,3 Gal의 비율은 인간에게 면역성을 나타내지 않는다.
반대로, 상업적으로 이용 가능한 재조합 FⅦ는 탐지가능한 비율의 Galα1,3 Gal 비율을 나타내므로 분석적인 장치를 사용하여 잡음(background noise)으로부터 구별할 수 있다.
따라서, 사용된 정량화 방법에 따라서, Galα1,3 Gal 모이어티를 완전히 없애거나, 또는 잡음으로부터 구별할 수 없을 정도인 4% 이하, 또는 3.5% 이하, 또는 3% 이하의 양으로 존재하게 할 수 있다. 유리하게, Galα1,3 Gal 모이어티는 혈장 FⅦ의 그것에 동일하거나 거의 같은 비율로 존재한다.
본 발명의 FⅦ는 폴리펩티드의 펩티드 서열은 선천적인 인간 FⅦ의 펩티드 서열일 수 있다. 즉 인간에 존재하는 서열이 FⅦ에 관련된 병(disorders)을 나타내지 않는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 그런 서열은 유럽특허 EP 0 200 421에서 기술된 서열 1b에 의해 인코딩될 수 있다.
유리하게, 본 발명의 FⅦ 서열은 서열번호 1(SEQ ID NO : 1)의 서열이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 FⅦ의 면역성이 선천적인 FⅦ의 면역성보다 크지 않는 한, 본 발명의 FⅦ는 선천적인 인간 FⅦ의 변이체일 수 있다. 따라서, 이 변이체의 펩티드 서열은 선천적인 인간 FⅦ의 서열과 적어도 70%의 동일성, 및 유리하게 80% 또는 90%, 및 더욱 유리하게 적어도 99%의 동일성을 나타낼 수 있고, 그런 변이체는 선천적인 FⅦ와 실질적으로 동일한 생물 활성도를 가진다.
게다가, 본 발명의 FⅦ는 선천적인 FⅦ의 생물 활성도를 비교해 보면, FⅦ의 생물 활성도가 변형되거나 감소한 모든 FⅦ를 의미한다. 예로, 혈전증(thromboses)의 치료에 사용되는, 활성화되지 않은 재조합 인간 FⅦ, FFR FⅦa(Holst et al, Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg., 1998 Jun, 15(6) : 515-520)를 언급할 수 있다. 그런 FⅦ는 하나 이상의 아미노산이 삽입, 결실 또는 대체되어 선천적인 FⅦ의 서열과 다른 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 가진다.
마지막으로, 다른 구체예에서, 본 발명의 FⅦ는 활성화될 수 있다(FⅦa). FⅦa가 FⅦ를 대신하여 조직 인자(tissue factor; TF)와 상호작용할 때 FⅦa는 FⅦ보다 25 내지 100배 더 큰 응고 활성을 나타낸다. 이황화 결합에 의해 연결된 두 사슬이 다른 프로테아제(FⅨa, FXa, FⅦa)에 의하여 효소원(zymogen)이 끊어지면 FⅦ이 활성화된다. 예를 들면, FⅦa는 순환 항체(circulating antibody)를 가진 혈우병 환자의 지혈(hemostasis)을 책임지는 응고 인자이다. 특히 유리한 방법에서, 본 발명의 FⅦ는 완전히 활성화된다.
본 발명의 FⅦa는 몇몇 번역-후 변형을 포함할 수 있다: 첫 번째 9개 또는 10개의 N-터미널 글루탐산이 γ-카르복식화되고; Asp63는 부분적으로 수산화되며, Ser52와 Ser60는 O-당화되고, 각각 글루코오즈(크실로오스)0-2, 퓨코오즈(Fucose) 모이어티를 전하고; Asn145 및 Asn322는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조(biantennary bisialylated complex structures)에 의하여 N-당화된다.
예를 들면, 미국 특허 5,997,864에서 기술하는 것처럼, FⅦ-결핍 혈장 및 트롬보플라스틴(thromboplastin)에 의한 혈액 응고를 촉진하기 위해, FⅦ 조성물의 능력을 측정해서 본 발명의 FⅦ의 생물 활성도를 정량화할 수 있다. 이 특허에서 기술된 분석실험에서는, 대조구와 비교한 응고 시간이 감소한 것으로 생물 활성도를 표현하고, FⅦ의 1 유닛/㎖을 포함하는 인간 세럼(풀(pool))의 표준과 비교하여 "FⅦ 유닛"으로 생물 활성도를 전환한다.
본 발명의 재조합 FⅦ는 생물계에서 단백질을 발현시키는, 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된, 표준 기술을 이용해서 얻을 수 있다.
본 발명의 FⅦ는 상술한 당화 특성, 즉 FⅦ 조성물에서 매우 낮거나 0의 Galα1,3 Gal 비율을 부여하는 모든 미생물, 식물 또는 동물에서 발현될 수 있다. 미생물은 모든 박테리아계, 균계, 바이러스계 또는 세포계를 의미하고, 세포는 식물 또는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있다. α1,3-갈락토오스 전이효소(α1,3 galactosyltransferase)를 위한 어떤 녹아웃 세포(KnockOut cell)도 사용할 수 있다.
형질전환 동물 또는 식물이 상기 당화 특성, 즉 FⅦ 조성물에서 매우 낮거나 0의 Galα1,3 Gal 비율을 부여할 수 있는 한, 본 발명의 FⅦ는 형질전환 동물 또는 식물에서도 생성될 수 있다. 동물에는 토끼, 돼지, 양, 산양, 소, 닭 또는 α1,3-갈락토오스 전이효소(galactosyltransferase)를 위한 어떤 녹아웃 동물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
인간 FⅦ처럼, 본 발명의 FⅦ는 자리 145 및 322에 두 개의 N-당화 자리 및 자리 52와 60에 두 개의 O-당화 자리를 포함한다. 한 N-당화 자리에서, 올리고당 사슬이 아스파라긴에 연결된다(N-연결). O-당화 자리에서는, 올리고당 사슬이 세린에 연결된다. 이 아미노산에 연결된 모이어티는 조성물의 각각의 단백질과 다를 것이다. 그러나 전체 조성물에 있어서, 모든 글리칸 모이어티의 양 또는 모든 당의 양을 정량화할 수 있다.
본 출원에서 주어진 다른 글리칸의 백분율은 O-당화를 고려하지 않는다.
바람직하게, FⅦ 조성물은 FⅦ 조성물의 모든 글리칸 모이어티 중에서, 적어도 40%는 바이안테너리(biantennary), 모노시알릴화된(monosialylated), 글리칸 형태이다. 다른 구체예에서, 모노시알릴화(monosialylated) 형태는 적어도 50% 존재한다. 다른 구체예에서는, 모노시알릴화(monosialylated) 형태는 적어도 60% 존재한다.
유리하게, FⅦ의 글리칸 형태는 대부분 바이안테너리 모노시알릴화((biantennary monosialylated) 글리칸 형태이다.
FⅦ 조성물은 적어도 몇 인자 Ⅶ의 시알산(sialic acid)은 α2-6 연결을 포함한다.
유리하게, FⅦ의 시알산의 적어도 65%는 α2-6 연결을 포함한다. 더 유리하게, FⅦ의 시알산의 적어도 70% 또는 80% 및 특히, 적어도 90%는 α2-6 연결을 포함한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 인자 Ⅶ의 모든 시알산은 α2-6 연결을 포함한다. 즉, 모든 시알산은 α2-6 연결에 의해 갈락토오즈에 결합된다. 본 발명의 FⅦ 조성물은 α2-3 연결을 포함하는 시알산을 더 포함할 수 있다.
FⅦ 조성물의 시알산의 적어도 65%가 α2,6 분기(ramification)를 포함한다는 사실은 본 발명의 FⅦ의 장점 중 하나이다. 사실, 상업적으로 이용 가능한 재조합 FⅦ의 시알산은 α2,3 연결만 포함한다. 반면에, 혈장 FⅦ는 이러한 두 이성체의 혼합물이다. 그러나 후자는 본 발명의 FⅦ이 혈장 FⅦ에 더 근접하게 될지라도, α2,6 연결을 더 포함한다. 본 발명에 따르면, FⅦ의 시알산의 65% 내지 100%는 α2,6 연결을 포함한다. 몇몇 구체예에서는, 70% 내지 100% 또는 80% 내지 100%의 FⅦ의 시알산이 α2,6 연결을 포함한다.
유리하게, FⅦ의 바이안테너리 모노시알릴화 글리칸 형태 중에서, 대부분은 푸코실화되지 않는다(non-fucosylated).
바람직하게, 이 바이안테너리, 모노시알릴화, 비-푸코실화, 글리칸 형태는 20% 이상의 비율로 본 발명의 FⅦ 조성물에 존재한다. 유리하게, 이 비율은 25%, 또는 40% 이상이다.
특히 유리한 방법에서, 본 발명의 FⅦ 조성물의 푸코실화(fucosylation)의 비율은 20% 내지 50%이다. 본 발명의 구체예에서, 이 비율은 15% 이하일 수 있다.
이 특징은 본 발명의 FⅦ의 이점 중에 하나이다. 실제로, 상업적으로 이용 가능한 재조합 FⅦ는 100%의 푸코실화 비율(fucosylation rate)을 가지는 반면 혈장 FⅦ는 약 16%의 푸코실화 비율을 가진다. 따라서, 본 발명의 FⅦ의 푸코실화는 혈장 FⅦ와 유사하며, 이는 면역성의 측면에서 본 발명의 FⅦ에 있어 장점을 제공한다.
유리하게, 본 발명의 FⅦ는 형질전환 FⅦ이다. 따라서, 본 발명의 FⅦ는 유리하게 형질전환적으로 생성된 재조합 FⅦ 생성물이다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 형질전환 FⅦ는 형질전환 동물의 우유에서 생성된다.
우유 단백질을 합성하는 유전자 중 조절 부위에 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 융합시켜서 그런 단백질을 생성할 수 있으며, 이때 상기 단백질은 유선에서 특이적으로 합성되고 우유로 분비될 것이다.
특히 유리한 방법에서, 본 발명의 FⅦ는 형질전환 암컷 토끼에 의해 생성된다.
토끼가 프리온, 특히 공중보건문제인, 전파성 아급성 해면양 뇌병증(transmissible subacute spongiform encephalopathy)에 과민성을 보이기 않기 때문에, 이 종이 특히 유리하다.
게다가, 토끼와 인간 사이의 종간 장벽(species barrier)은 중요하다. 반대로, 인간과, 상업적으로 이용가능한 재조합 FⅦ가 생성되는 생물계인 햄스터 사이의 종간 장벽은 덜 중요하다.
따라서, 토끼에서 FⅦ를 생성하는 것은 병원균 전염에 대한 안전성의 측면에서 유리하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 FⅦ는 암컷 토끼의 유선에서 생성된다.
형질전환 포유동물이 우유를 분비하는, 유선에서 관심대상 단백질을 분비하는 것은 조직-의존적 방법(tissue-dependent manner)으로 재조합 단백질의 발현을 제어하는 것을 포함하는 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 기술이다.
동물의 특정 조직으로 단백질 발현을 지시하게 하는 서열 때문에 발현의 조직 제어를 실행한다. 이런 서열은 또한 프로모터 서열 및 펩티드 신호 서열이다.
유선에서 관심대상 단백질을 발현시키는 프로모터의 예로는 WAP 프로모터(유장 산성 단백질(whey acidic protein)), β-카세인 프로모터 등과 같은 카세인 프로모터, β-락토글로불린 프로모터(β-lactoglobulin promoter)가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 동물의 우유에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: 선천적으로 우유로 분비되는 단백질의 프로모터의 제어하에 있는, 인간 FⅦ를 인코딩하는 유전자를 포함하는 합성 DNA 분자를 인간이 아닌 포유동물의 배(embryo)에 통합시킨다. 이후에, 배를 동종의 암컷 포유동물로 이식한다. 일단 배에서 얻은 포유동물이 충분히 발육하면, 포유동물의 젖 분비(lactation)를 유도하고, 우유를 모은다. 그러면 우유는 관심대상 형질전환 FⅦ를 포함한다.
인간 이외에 포유동물 암컷의 우유에서 단백질을 제조하는 방법의 예는 유럽특허 EP 0 527 063에 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 관심대상 단백질을 생성하기 위해 참조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
WAP 유전자의 프로모터를 포함하는 서열을 도입하여 WAP 프로모터를 포함하는 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드는 WAP 프로모터에 의존하는 외래 유전자를 수용할 수 있는 방법으로 제조된다. 인간 FⅦ를 인코딩하는 유전자를 통합시켜서 WAP 프로모터에 의존적이게 한다. 프로모터 및 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드는 토끼의 수(male) 생식핵(pronucleus)에 미량으로 주입되어(microinjection) 형질전환 암컷 토끼를 얻을 수 있다. 이후에, 배를 호르몬상으로 준비된 암컷의 수란관(oviduct)으로 옮긴다. 서던블랏 기술에 의해 얻어진 형질전환된 어린 토끼에서 추출한 DNA에서 형질전환 유전자(transgene)의 존재가 밝혀진다. 동물 우유의 농도는 특정 방사선면역학적 분석법(radioimmunologic assay)에 의해 평가된다.
토끼 우유로 암컷 토끼에 의해 생성된 형질전환 FⅦ는 인자 Ⅶ 조성물의 모든 분자가 두 개의 N-당화 자리를 나타내는 조성물의 형태로 얻어지며, FⅦ 조성물의 모든 분자 중에서, Galα1,3 Gal 글리칸 모이어티의 비율은 4% 이하 또는 0인 것을 특징으로 한다. 따라서, 유리하게, 암컷 토끼에 의해 생성된 형질전환 FⅦ는 Galα1,3Gal 글리칸 모이어티를 포함하지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 암컷 토끼의 형질전환 FⅦ 조성물은 조성물의 모든 글리칸 모이어티 중에서, 적어도 40%는 바이안테너리 모노시알릴화 글리칸 형태이다. 다른 구체예에서, 모노시알릴화 형태가 적어도 50% 존재한다. 다른 구체예에서는, 모노시알릴화 형태가 적어도 60% 존재한다.
유리하게, 글리칸 형태의 대부분은 바이안테너리 모노시알릴화 글리칸 형태이다.
FⅦ 조성물은 인자 Ⅶ의 적어도 몇몇 시알산은 α2-6 연결을 포함한다.
유리하게, FⅦ의 시알산의 적어도 65%는 α2-6 연결을 포함한다. 더 유리하게, FⅦ의 시알산의 적어도 70% 또는 80% 및 특히, 적어도 90%는 α2-6 연결을 포함한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 인자 Ⅶ의 모든 시알산은 α2-6 연결을 포함하고, 즉 모든 시알산이 α2-6 연결에 의해 갈락토오즈에 결합된다. 본 발명의 FⅦ 조성물은 α2-3 연결을 포함하는 시알산을 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 바이안테너리 모노시알릴화 글리칸 형태 중에서, 글리칸 형태의 대부분은 푸코실화되지 않는다. 유리하게, 이 바이안테너리 모노시알릴화 글리칸 형태는 20% 이상의 비율로 이 FⅦ 조성물에 존재한다. 유리하게, 이 비율은 25% 또는, 40% 이상이다.
바람직하게, 본 발명의 이 FⅦ 조성물의 푸코실화(fucosylation) 비율은 20% 내지 50%이다. 본 발명의 구체예에서, 이 비율은 15% 이하 일 수도 있다. 본 발명의 형질전환 FⅦa는 몇몇 번역-후 번형을 포함할 수 있다: 첫 번째 9개 또는 10개의 N-터미널 글루탐산이 γ-카르복식화되고; Asp63(Asparagine 63)는 부분적으로 수산화되;, Ser52(세린 52)와 Ser60(세린 60)는 O-당화되고, 각각 글루코오즈(크실로오스)0-2, 퓨코오즈(Fucose) 모이어티를 전달하고; Asn145 및 Asn322는 주로 바이안테너리 바이시알릴화 복합 구조에 의하여 N-당화된다.
본 발명의 FⅦ는 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 기술로 우유에서 정제될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 6,268,487에서 기술된 것처럼, 우유로부터 관심대상 단백질을 정제하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 미투과물(retentate)과 외래 단백질을 포함하는 투과액(permeate)을 형성하기에 충분한 공극률을 가지는 막에 우유를 접선 여과시키는 단계; b) 외래 단백질을 대체하고 용출액(effluent)을 얻기 위해, 크로마토그래피에 의해 포획 장치(capture apparatus)로 상기 투과액을 통과시키는 단계, c) 용출액 및 미투과물을 조합하는 단계, d) 지질, 카세인 미셸로부터 FⅦ가 분리될 때까지 단계 a)에서 c)를 반복하는 단계. FⅦ는 적어도 75%까지 회수된다.
유리하게, 본 발명의 FⅦ는 활성화된다. FⅦa는 FⅦ의 활성화는 생체 내에서(in vivo), 다른 프로테아제(FⅨa, FXa, FⅦa)에 의하여 이황화 결합에 의해 연결된 두 사슬에서 효소원(zymogen)이 끊어져서 일어난다. FⅦa 자체는 매우 낮은 효소 활성을 가지만, 공동인자, 조직 인자(TF)에 복합되면, FⅩ 및 FⅨ를 활성화시킴으로서 응고 과정을 촉진한다.
그러므로 본 발명의 FⅦa는 하나의 이황화 결합(Cys135-Cys262)에 의해 연결된 약 20kDa의 분자량을 가진 152 아미노산의 경쇄와 약 30kDa의 분자량을 가진 254 아미노산의 중연쇄로 이루어져 있는 화합물이다.
따라서, 본 발명의 FⅦ는 혈장 FⅦ에 유사한 활성 및 구조를 가지는 활성화된 FⅦ이다.
FⅦa는 조직 인자(TF)와의 상호작용에 따라 FⅦ보다 25 내지 100배 더 큰 응고 활성을 나타낸다.
본 발명의 구체예에서, FⅦ는 인자 Xa, VⅡa, Ⅱa, Ⅸa 및 XⅡa에 의해 생체외에서(in vitro) 활성화될 수 있다.
본 발명의 FⅦ는 또한 그 정제 과정 중에 활성화될 수 있다.
본 출원인은 WAP 프로모터 등과 같은, 락토세럼(lactoserum)에서 선천적으로 생성되는 단백질의 프로모터의 제어하에 있을 때조차, FⅦ가 우유의 칼슘 이온과 결합할 수 있고, 따라서 카세인 미셸과 결합할 수 있다는 것을 알아냈다.
따라서 락토세럼 복합물에 결합되거나 카세인 미셀에 연결되든지 이 단백질을 포획할 수 있는, 우유의 칼슘 이온에 친화력을 나타내는, FⅦ를 추출하고 정제하는 방법은 매우 유리할 것이다.
예를 들면, 형질전환 동물의 우유에 포함된 형질전환 FⅦ의 추출 및 정제 과정은 다음의 단계를 포함한다:
a) 우유에, 가용성 염의 음이온이 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에서, 액체상(liquid phase)에 존재하는, FⅦ를 분리하기 위해 불용성 칼슘 화합물을 형성할 수 있도록 선택된, 가용성 염을 첨가하여 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 우유에서 상기 우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 결합하는 FⅦ를 추출하는 단계,
b) 칼슘 화합물의 침전물에서 단백질이 풍부한, 지질상과 단백질을 포함하는 수성 비-지질상(aqueous nonlipidic phase)으로 더 분리되는 액체상을 분리하는 단계,
c) 미리 결정된 농도로 인산염에 기반을 둔 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여, 수성 비-지질상을 친화성 크로마토그래피를 하는 단계, 및
d) 약 염기 유형 음이온 교환기 컬럼에 투과되지 않는 인자 Ⅶ의 연속적인 용출액에 적절한 버퍼를 이용하여 약 염기 유형 음이온 교환기 컬럼에서 두 번 또는 세 번의 크로마토그래피 단계를 통해 상기 c) 단계에 따라 얻어진, 인자 Ⅶ을 용출시키는 단계.
본 출원인은 우유에, 가용성 염의 음이온이 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에서, 액체상(liquid phase)에 존재하는, FⅦ를 분리하기 위해 불용성 칼슘 화합물을 형성할 수 있도록 선택된, 가용성 염을 첨가하여 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 우유에서 상기 우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 결합하는 FⅦ를 추출하는 단계가 사용되고, 반면에 FⅦ가 유기 및/또는 무기염 및 또는 복합물 및/또는 상기 우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물칼슘에서 분리되고 다시 액상의 수용액에서 발견된다는 사실에 주목하였다.
FⅦ는 상기 우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 결합되며, 이는 FⅦ가 이들 칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 대한 친화력을 나타냄을 의미한다. 그러므로 FⅦ는 이 염 및/또는 복합물에, 완전히 또는 부분적으로 결합할 충분한 수의 고정 자리를 나타낸다.
우유의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물은 콜로이드 카세인 미셸(colloidal casein micelle)과 상호 작용하는 인산칼슘염(phosphocalcic salt)를 의미한다. 다른 카세인은 삼인산칼슘(tricalcium phosphate)의 집합체(집단(cluster))의 형태, 즉 Ca9(PO4)6 등으로 나타나는, 인산칼슘염과 함께 콜로이드 미셸 복합물(colloidal micellary complex)을 형성하며, 그 지름은 약 0.5㎛에 이를 수 있다. 인산칼슘염이 친수성 층에 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 결합하면, 그런 미셸(micelle)은 소수성 핵을 둘러싼 카세인-κ가 풍부한(casein-κ-rich) 친수성 층으로 이루어진 카세인 소단위(sub-unit) 안에서 형성된다. 이 인산칼슘염은 또한 카세인에 결합되지 않고 미셸의 내부 공간에 존재할 수도 있다. 이들 염 및/또는 복합물은 또한 실행된 화학 및 생화학반응에 따라, 칼슘의 다른 이온 형태와 균형 상태에 있는, 단인산칼슘(monocalcic phosphate) 및/또는 2인산칼슘(dicalcic phosphate)의 형태로 우유에 존재한다. 이 칼슘염 및/또는 복합물은 카세인 미셸의 내부 공간에 존재할 수도 있다.
유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에 대한 FⅦ의 그런 친화력은 변형되지 않은 단백질 또는 예를 들면, 번역-후 변형에 의해 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 변형된 단백질의 상호작용에서 유래할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 형질전환 FⅦ는 다양한 특성, 특히 당화에 관한 특성을 나타내는 모든 형질전환 FⅦ를 의미한다. 유리하게, 상기에서 정의한 것처럼, 형질전환 FⅦ는 본 발명의 FⅦ 이다.
불용성 칼슘 화합물은 우유에 0.5% 이하의 용해도를 가지는 칼슘염 또는 복합물을 의미한다.
FⅦ의 대부분은 카세인 미셸의 인산칼슘염에 결합한다. 카세인 미셸에 적어도 70% 내지 90%의 FⅦ가 포획되는, 큰 친화성 상수를 가지면서, FⅦ는 칼슘에 대한 강한 친화력을 나타낸다. 나머지 FⅦ도 상기의 유기칼슘염 및/또는 무기칼슘염 및/또는 칼슘 복합물의 다른 형태에 대해 친화성을 나타낸다.
관찰된 메커니즘의 어떤 해석에 연관시키지 않으면서, 본 출원인은 가용성 염을 추가하여 미셸의 인산칼슘염의 균형을 바꾸어 놓고, 따라서 카세인 소단위의 집합체의 구조를 파괴하고 집합체를 침전시키게 한다고 가정한다. 미셸 안에 및/또는 미셸에 포획된 인산칼슘염과 결합된 관심대상 단백질은 미셸의 구조파괴가 되면 액체 속으로 분리된다. 게다가, 본 발명의 방법에서 사용된 가용성 염의 영향에 의해 불용성 칼슘 화합물로서 상기 인산칼슘염이 침전하기 때문에, FⅦ은 또한 인산칼슘염에서 분리 또는 해리된다. 마찬가지로, 가용성 유기 및/또는 무기 칼슘염 또는 복합물과 또한 결합할 수 있는 FⅦ은 같은 유형의 반응에 의해, 해리될 것이다( 도 9 참조)
본 발명의 범위에서, 가용성 염은 원하는 효과를 얻을 수 있는 모든 염이다.
본 발명의 방법에서 이용된 가용성 염은 칼슘염 및/또는 칼슘 복합물에서 FⅦ를 분리하기 위해, 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의해 선택된 농도로 우유에 존재할 수 있다. 사실, 농도는 적어도 20%의, 또는 유리하게 30 내지 50%의 FⅦ을 분리하기에 충분한 농도를 말한다. 특히 유리한 방법에서, 농도는 적어도 60 내지 80%, 또는 적어도 90%의 FⅦ을 분리하기에 충분한 농도이다.
본 발명의 방법에 의해 카세인 소단위 집합체가 침전된다. 상기에서 언급한 것처럼, 카세인 미셸의 구조파괴 때문에 이런 침전이 일어난다. 본 발명의 방법을 실시하면 침전에 의해, 우유의 콜로이드 상태가 불안정해진다.
따라서, 본 발명의 방법은 콜로이드/액체 직접 추출에 대응하는, 콜로이드 상태에서 액체상태로의 우유가 전이되는 방법이다.
본 발명의 방법을 통해 처음의 우유 색보다 더 엷은 색을 가진, 락토세럼(lactoserum) 및 액체상을 얻을 수 있다. 사실, 이들은 우유에 흰색을 부여하는 칼슘이온-결합 카세인이다. 일단 침전되면, 그들은 더 이상 우유에 그들의 색을 부여할 수 없다. 본 발명에 따른 가용성 염은 우유 1중량부 당 0.5중량부의 염(w/w)의 우유에 녹을 수 있는 염을 말한다.
유리하게, 방법에서 이용된 가용성 염은 인산염이다. 염은 우유에 첨가되는 수용액에 있을 수 있고, 또는 분말 형태로 우유에 직접 첨가될 수 있다.
바람직하게, 인산염은 인산나트륨(sodium phosphate), 인산리튬(lithium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 인산루비듐(rubidium phosphate) 및 인산세슘(cesium phosphate)으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 특히 인산염은 인산나트륨이다.
또는, 본 발명의 방법에서 사용된 가용성 염은 알칼리 옥살산 금속염(alkali metal oxalate), 특히 옥살산나트륨(sodium oxalate) 또는 옥살산칼륨(potassium oxalate), 또는 알칼리 탄산 금속염(alkali metal carbonate), 특히 탄산나트륨(sodium carbonate) 또는 탄산칼륨(potassium carbonate), 또는 그들의 혼합물이다.
유리하게, 방법의 실시를 위해 준비되는, 수용액에서 가용성 염의 농도는 100mM 내지 3M, 바람직하게 200mM 내지 500mM, 특히, 200mM 내지 300mM이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 가용성 염은 나트륨인산염이며, 수용액에서의 농도는 100mM 내지 3M, 바람직하게 200mM 내지 500mM, 특히 200mM 내지 300mM이다.
추출될 FⅦ을 포함하는 우유는 탈지우유가 아닌 원유(raw non skimmed milk) 또는 탈지우유(skimmed milk)일 수 있다. 본 발명의 방법을 탈지우유에 적용할 때의 이점은 탈지우유의 지질 함량이 낮다는데 있다. 방법은 또한 생우유(fresh milk) 또는 냉동유(frozen milk)에도 적용될 수 있다.
바람직하게 원심 분리에 의해 수행되는, 단계 b)에 의해 지질상 및 단백질을 포함하는 수성 비-지질상으로 액체상을 분리한다. 비-지질 수상(nonlipidic aqueous phase)은 사실 락토세럼이다. 이 분리 단계를 통해 카세인 미셸 소단위의 집합체 및 칼슘 화합물의 침전물을 분리한다.
방법은 분리 단계 후에, 1㎛ 내지 0.45㎛의 줄어든 공극률(porosity)을 가지는 필터에서 연속적으로 수행되는 비-지질 수상(aqueous-phase)을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 유리 섬유 등이 사용된 이 여과기의 사용을 통해 우유에 선천적으로 존재하는 지질(lipid), 지방구(fat globule) 및 인지질(phospholipid)을 감소시킨다. 필터의 0.5㎛ 미만의 공극률에 의해 비-지질 수상(aqueous-phase)의 세균학적 품질(bacteriological quality)을 유지하고, 후에 실시된 정제를 지원한다(울트라필터(ultrafilter), 크로마토그래피 컬럼(chromatographic columns) 등)(이후 참조). 지질상은 바람직하게 우유의 지방구를 완전하게 잔류시키는 필터를 통해 여과되고, 여과액은 투명하다.
이 단계는 울트라 필터 장치(ultrafiltration)에 의한 농축(concentration)/투석(dialysis) 단계가 이어질 수 있다.
그것을 보존하기 위해 농축을 통해 비-지질 수상(aqueous-phase)의 부피를 줄일 수 있다. 울트라 필터용 막은 관심대상 단백질의 특성에 따라 기술분야의 숙련자에 의해 선택된다. 일반적으로, 관심대상 단백질의 분자량보다 작은 또는 같은 세공 사이즈를 가지는 공극한계를 통해 큰 손실 없이 생성물을 농축할 수 있다. 예를 들면, 50kDa의 세공 사이즈를 가지는 막을 통해 손실 없이 50kDa의 분자량을 가지는 FⅦ을 농축할 수 있다.
투석은 특히 크로마토그래피에 의해, 정제 단계를 더 가능하게 하는 단백질의 수상(aqueous-phase)을 결정하는 것을 의도한다. 이를 통해 락토오스(lactose), 염, 펩티드, 프로테아제 펩톤(proteoses peptone) 및 생성물의 보존에 해를 끼칠 수 있는 어떤 병원체(agent) 등과 같은 작은 분자량의 구성요소를 제거할 수 있다.
바람직하게, 투석 버퍼는 0.025M~0.050M의 인산나트륨 용액으로, pH는 7.5~8.5이다.
단계 b) 또는 경우에 따라 여과 및/또는 농축/투석 단계 이후에 얻어진 비-지질 수상(aqueous-phase)은 다음의 정제 단계를 실시할 때까지 -30℃에서 냉동 및 저장할 수 있다.
이후에, 단계 b)에 따라 얻어진 비-지질 수상을 하이드록시아파타이트 젤(hydroxyapatite gel; Ca10(PO4)6(OH)2) 또는 플루오르아파타이트 젤(fluoroa-patite gel; Ca10(PO4)6F2) 고정상을 가지는 크로마토그래피 컬럼에서 수행되는 표준 크로마토그래피 장치를 이용하여, 단계 c)인 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행한다. 따라서, 수상의 FⅦ은 고정상에 잔류하고, 잔류하지 않는 락틴 단백질이 제거된다.
크로마토그래피 컬럼은 바람직하게 pH 7.5~8.5인, 0.025M~0.035M의 인산나트륨에 기반을 둔 수성 버퍼 A로 평형을 유지한다. FⅦ를 잔류시키는, 컬럼으로 FⅦ가 풍부한 수상을 주입한다. 락틴 단백질과 같은, 원하지 않는 화합물을 제거하기 위해, 기준선(RBL)로 복귀할 때까지, 버퍼 A의 삼투(percolation)에 의해 잔류되지 않는 단편을 제거한다. 280㎚의 파장(λ)에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 실시한다.
미리 결정된 농도로, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 그 혼합물과 같은 인산염에 기반을 둔 버퍼로 단계 c)에 따른 FⅦ을 용출(elution)시키며, 바람직하게, pH 7.5~8.5인 0.25~0.35M 인산나트륨에 기반을 둔 버퍼 B를 의미한다. 용출된 단편을 기준선에 복귀할 때까지 모은다. 280㎚의 파장(λ)에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 실시한다.
이 단계 때문에, 전체 락틴 단백질의 90% 이상이 제거되고, FⅦ의 90% 이상이 회수된다. FⅦ의 용출된 단편의 순도는 이 단계에서 약 5%이다.
순도는 고려된 샘플, 단편 또는 용출액(eluate)에 존재하는 FⅦ 및 전체 단백질 사이의 질량비로서 정의된다.
유리하게, FⅦ의 고유 활성은 크로마토그래피 고정상(chromato-graphic support)에 대한 FⅦ의 친화력의 결과로서 인자 10 내지 25에 의해 증가된다.
단계 c)의 결과로 얻어진 FⅦ 용출액은 유리하게 접선 여과(tangential filtration)를 거친다.
접선 여과용(tangential filtration) 막은 FⅦ의 특성에 따라서 기술분야의 숙련자에 의해 선택된다. 일반적으로, FⅦ의 분자량보다 2배 큰 구멍 크기를 가진 공극률 제한을 통해 FⅦ을 유리하게 여과할 수 있다. 그러므로, 100kDa의 구멍 크기를 가진 막을 통해 좋은 수확량으로 FⅦ를 여과할 수 있다.
이 여과 단계의 목표는 FⅦ보다 큰 분자량을 가진 단백질의 하중을 줄이는 것이며, 특히, FⅦ의 불규칙한 형태 (예를 들면, 중합된 형태의 FⅦ) 및 특정 지연(delay) 내에서 관심대상 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제를 제거하는 것이다. 이 때문에, 100 kDa의 화합물의 공극률 제한을 가지는 막이 유리하게 사용된다.
유리하게, 50kDa의 미투과 제한(retention limit)을 가진 막을 통과시키는 울트라 필터 장치(ultrafiltration)에 의해 얻어진 FⅦ 여과된 용출액을 더 농축하고 투석한다. 투석 버퍼는 바람직하게 0.15 M-0.20 M의 염화나트륨 용액이다.
단계 c)에서 얻어진, 선택적으로 여과되고, 농축 및 투석된, FⅦ 용출액은 약 염기 유형 음이온 교환 컬럼에서 상기 컬럼에 잔류되어 있는 인자 Ⅶ의 연속적인 용출액에 대해 적절한 버퍼를 사용하여 두 번 또는 세 번의 크로마토그래피 단계(단계 d))를 수행한다. 이 단계에 의해 특히 락틴 단백질에 관하여 FⅦ를 추가로 정제할 수 있다. 이 단계는 표준 크로마토그래피 장치로 실행된다.
첫 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 다음의 바람직한 작동 조건에 따라서, 인자 Ⅶ를 잔류시키는 Q-Sepharose® FF 젤 유형 크로마토그래피 고정상을 사용하여 수행된다. 이 고정상은 pH 7.0~7.5인 0.05M 트리스(Tris) 버퍼로 세척된다. 잔류되지 않은 단편을 기준선에 복귀할 때까지 세척 버퍼로 제거한다. 인자 Ⅶ의 제1 용출액을 얻기 위해, 바람직하게 pH 7.0~8.0인 0.05M의 트리스(Tris) 및 0.020M~0.05M, 바람직하게는 0.05M의 염화칼슘에 기반을 둔 수성 용출 버퍼로 FⅦ을 용출시킨다. 280㎚의 파장(λ)에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 실시한다.
이 단계에서 FⅦ의 회수량은 적어도 70%이고 이것은 결합 단백질, 특히 우유 단백질의 약 80%를 제거하는 것을 허용한다.
이후에, FⅦ 용출액을 버퍼로서 0.15-0.20M 염화나트륨 용액을 사용하여, 상술한 대로, 투석 단계를 거치게 한다.
두 번째 크로마토그래피 단계는 다음의 바람직한 작동 조건에 따라서, 첫 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서, 얻어진 FⅦ의 제1 용출액이 주입되는, Q-Sepharose® FF 젤 유형 크로마토그래피 고정상에서 수행된다. 고정상은 0.05M, pH 7.0-7.5 트리스 버퍼로 세척된다. 잔류되지 않은 단편을 기준선에 복귀할 때까지 세척 버퍼로 제거한다. λ=280㎚에서의 흡수도를 통해 탐지한다.
90% 이상의 순도를 가지는, 고순도의 인자 Ⅶ의 제2 용출액을 얻기 위해, pH 7.0~8.0인, 0.05M 트리스 및 0.005M 염화칼슘에 기반을 둔 수성 버퍼로 고정상에 잔류되어 있는 FⅦ를 용출시킨다. 280㎚의 파장(λ)에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 실시한다.
두 번째 크로마토그래피 단계는 단백질의 가능한 단백질 가수 분해를 제한할 목적이다.
이 단계에서는, 용출액의 순도는 약 90%이고 95%의 나머지 결합 단백질이 제거된다. 이후에, 버퍼로서 0.15M~0.20M의 염화나트륨 용액을 사용하여, 상술한 대로, 용출액은 투석 단계를 거친다.
본 발명의 바람직한 실시에 따르면, 방법은 약 염기 유형 음이온 교환기 컬럼에서 상기 컬럼에서 인자 Ⅶ를 연속적으로 용출시키기에 적당한 버퍼를 사용한, 3번의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 따라서, 2번의 상술하는 음이온 교환 크로마토그래피 후에, 세 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 실행된다. 이 단계를 통해 의학 사용에 적용할 수 있도록, 단백질이 풍부한 조성물의 성분 배합을 할 수 있다.
세 번째 크로마토그래피 단계는 다음의 바람직한 작동 조건에 따라서, 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서, 얻어진 FⅦ의 제2 용출액이 주입되는, Q-Sepharose® FF 젤 유형 크로마토그래피 고정상에서 수행된다.
주사용 정제수(purified water for injection; WFI)의 1 내지 5배로 희석한 후에, 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 얻어진 두 번째 용출액을 인자 Ⅶ를 잔류시킨 Q-Sepharose® FF 젤 유형 고정상으로 채워진 컬럼으로 주입한다. 이 고정상은 0.05M, pH 7.0-7.5 트리스 버퍼로 세척된다. 잔류되지 않은 단편을 기준선에 복귀할 때까지 세척 버퍼로 제거한다. λ=280㎚에서의 흡수도를 통해 탐지한다.
고정상에 잔류되어 있는, FⅦ를 0.02M 트리스, 0.20-0.30M, 바람직하게는 0.28M의 염화나트륨, pH 6.5-7.5에 기반을 둔 수성 버퍼로 용출시킨다. 280㎚의 파장(λ)에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 실시한다.
따라서 얻어진 형질전환 FⅦ 조성물의 순도는 95% 이상이다. 아주 유리하게, 조성물은 FⅦ 농축물의 형태이다.
방법을 실시하여 적어도 처리된 우유의 리터당 20㎎의 FⅦ를 정제할 수 있는 수확량이 20-25%로 축적된다.
따라서, 음이온 교환기 젤에서의 세 번의 크로마토그래피 단계에 의해 FⅦ를 더 정제할 수 있다. 게다가, 그들은 FⅦ 조성물을 농축하고 성분 배합을 허용한다.
FⅦ의 활성화는 방법을 실시하는 동안에 일어나며, 아마도 음이온 교환 크로마토그래피의 첫 단계 동안 일어날 것이다.
일단 마지막 용출액이 회수되면, 상기 용출액은 0.22㎛의 필터에서의 여과단계, 용기에서의 분산단계를 거친 후, -30℃에서 냉동 및 저장된다.
본 발명의 방법은 또한 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 성분 배합(formulation), 바이러스 비활성화 및 살균. 일반적으로, 방법은, 친화성 크로마토그래피 단계 전에, 유리하게, 특히 Tween® 80(1% w/v) 및 TnBP(tri-n-butylphosphate)(0.3% v/v)의 혼합물이 존재할 때, 용매/세제(solvent /detergent)로 수행하여 외피 바이러스(enveloped viruse)를 불활성화시키는, 안티바이러스 처리 단계를 포함할 수 있다. 게다가, 음이온 교환기에서의 두 번째 크로마토그래피 단계에서 유래하는 FⅦ 용출액은 바이러스, 특히 파보바이러스 B19 (Parvovirus B19)와 같은 비-외피 바이러스(nonenveloped viruse)를 효과적으로 제거하기 위해, 나노 필터(nanofiltration)의 단계를 거친다. 15㎚ 이상의 크기를 가지는 바이러스가 남아있는 필터 아사히(ASAHI) PLANOVA™15를 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 의약품으로 사용을 위한 본 발명의 FⅦ 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 혈우병(haemophilia) 환자의 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다발성 출혈성 외상(multiple hemorrhagic trauma)의 치료에 사용할 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 외과적 지혈법(surgical hemostasis)에 의한 다량의 제어할 수 없는 출혈의 치료에 사용될 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항응고제(anticoagulant)의 과량 복용에 의한 출혈(bleedings or hemorrages)의 치료에 사용될 의약품을 제조하기 위해 본 발명에 따른 FⅦ 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 인자 Ⅶ 및 약제로 허용될 수 있는 첨가제(excipient) 및/또는 캐리어(carrier)를 포함하는 약제 조성물이다.
첨가제는 약제 사용에 친화성이 있고 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된, 염분, 생리 용액(physiologic solution), 등장액(isotonic solution) 또는 버퍼액(buffered solution)과 같은 모든 용액 및 모든 현탁액, 젤 또는 분말일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 작용제(agent) 또는 분산기(disperser), 가용화제(solubilizer), 안정제(stabilizer), 계면활성제(surfactant) 및 보존제(conserver) 중 선택된 캐리어를 더 포함할 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 조성물은 다른 작용제 또는 유효성분(active principle)을 더 포함할 수 있다.
게다가, 조성물은 다른 방법 및 다른 형태로 투여될 수 있다. 특이적인 시스템적 루트 등에 의한, 특히 정맥 주사(intravenous injection), 피내 주사(intradermal injection), 종양내 주사(intra-tumor injection), 피하 주사(subcutaneous injection) 복강내 주사(intra-peritoneal injection), 근육내 주사(intramuscular injection), 동맥 주사(intra-arterial injection)에 의한 이런 유형의 치료적 접근을 위한 모든 고전적인 루트에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 종양 내 주사 또는 종양에 가까운 또는 종양을 관주하는(irrigating) 영역에의 주사를 언급할 수 있다.
투약의 수, 다른 유효성분과의 결합, 병원균의 진화 정도 등에 따라 복용량은 변할 수 있다.
도 1: 암컷 토끼 우유에서 생성된 본 발명에 따른 형질전환 FⅦ의 추출 및 정제/활성화 단계의 예의 아웃라인
도 2: N-당화 자리를 나르는 펩티드의 탈회선된(deconvoluted) 질량 스펙트럼 ESI.
도 3: PNGase F의 FⅦ의 당쇄 제거(deglycosylation) 후의 전기영동상(Electropherograms) HPCE-LIF;
리간드: 중앙에 있는 전기영동상(electropherograms): FⅦ-tg; (
Figure 112008081974898-pct00001
)푸코오즈(fucose), (
Figure 112008081974898-pct00002
) GlcNAc(N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)), (
Figure 112008081974898-pct00003
)만노오스, (
Figure 112008081974898-pct00004
)갈락토오스, (
Figure 112008081974898-pct00005
)시알산.
상부의 전기영동상: FⅦ-pd
중앙(2)의 전기영동상: FⅦ-tg
하부의 전기영동상: FⅦ-rec
도 4: NP-HPLC에 의한 FⅦ-tg(중앙의 크로마토그램(chromatogram)), FⅦ-pd(상부의 크로마토그램) 및 FⅦ-rec(하부의 크로마토그램)의 특성. 당 잔기의 리간드: 도 3 참조
도 5: MALDI-TOFMS에 의한 FⅦ-tg의 대부분의 글리칸 형태의 확인. 당 잔기의 리간드: 도 3 참조
도 6: HPCE-LIF에 의한 사이로글로불린(thyroglobulin)의 올리고당 분석. 당 잔기의 리간드: 도 3 참조
도 7: HPCE-LIF에 의한 형질전환 FⅦ의 올리고당 분석. 당 잔기의 리간드: 도 3 참조
도 8: Galα1,3 Gal 구조의 정량화
도 9: FⅦ의 추출 메커니즘의 예
도 10: O-당화 자리를 전달하는 펩티드의 탈회선된(deconvoluted) 질량 스펙트럼 ESI. 이 펩티드는 트립신으로의 분해(digestion) 후 LC-ESIMS 분석에 의하여 얻어졌다. Fuc: 푸코오즈(fucose), Glc: 포도당, Xyl: 크실로오스
도 11: γ 카르복시화 자리를 전달하는 펩티드의 탈회선된(deconvoluted) 질량 스펙트럼 ESI. 이 펩티드는 Asp N으로의 분해(digestion) 후 LC-ESIMS 분석에 의하여 얻어졌다. 얻어진 결과는 다른 군의 FⅦ-tg와 매우 유사하다. 다른 펩티드의 질량은 모노아이소토픽(Monoisotopic) 질량이다. Gla: γ 카르복시산
본 발명의 다른 측면 및 장점은 설명할 목적으로 본 발명의 범위를 제한하지 않는 다음의 실시예에 의해 기술될 것이다.
실시예에서 사용되는 약어
FⅦ-tg = FⅦa-tg: 본 발명에 따라 활성화된 형질전환 FⅦ
FⅦ-rec= FⅦa rec: 상업적으로 이용 가능한 재조합 활성화 FⅦ
FⅦ-pd= FⅦa pd: 혈장 유래의 활성화된 FⅦ으로, 인간 혈장에서 정제됨
MALDI-TOF: 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)-비행시간(Time of Flight)
HPCE-LIF: 고성능 모세관 전기 이동법-레이저 유도 형광(High Performance Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence)
ESI-MS: 질량 분석-전자 분사 이온화법(Mass spectrometry-Electrospray Ionisation)
LC-ESIMS: 액체 크로마토그래피-질량분석-전자 분사 이온화법(Liquid chromatography-Mass spectrometry- Electrospray Ionisation)
NP-HPLC: 정상 고성능 액체 크로마토그래피(Normal Phase High Performance Liquid Chromatography)
PNGase F: 펩티드: N-글리코시다아제 F(Peptide : N-glycosidase F)
LC-MS: 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법(Liquid Chromatography-Mass spectrometry)
[실시예 1] 우유에서 인간 FⅦ 단백질을 생성하는 형질전환 암컷 토끼의 생성
먼저, 서열 Bam H1 및 Hind Ⅲ 사이의, p-poly Ⅲ-I 벡터(described in the document Lathe et al, Gene (1987) 57, 193-201)에 WAP 유전자의 서열 H1-Hind Ⅲ(6.3Kb 단편)을 도입하여(described in the document Devinoy et al, Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16, 25 August 1988, p. 8180) 플라스미드 p1를 제조한다.
이 클로닝의 과정에서, 위치 Bam H1는 억제되고 벡터 p1에 존재하는 Cla I 자리로 대체되었다. 그러므로 벡터 p1는 6.3Kb WAP 프로모터에 의존하게 된 외래 유전자를 수용할 수 있는 플라스미드이다. 예를 들면, 외래 유전자는 폴리링 커(polylinker)의 위치 Sal I로 도입될 수 있다. 프로모터 전체와 외래 유전자 전체를 포함한 삽입 부위는 p-poly Ⅲ-I의 폴리링커 말단에 있는 두 자리 Not 1을 자른 후에 플라스미드에서 분리될 수 있다.
플라스미드 p1에서 얻어진, 플라스미드 p2는 토끼 WAP 유전자의 프로모터(6.3Kb) 및 인간 FⅦ 유전자를 포함한다. 형질전환 암컷 토끼를 얻기 위해 이용된 단편은 2개 자리 Not1 사이에 포함된다.
클로닝 자리로 사용될 수 있도록 특이 돌연변이 생성 자리에 의해 유전자의 선도 서열(leader sequence)로 자리 Hind Ⅲ를 도입하였다.
전통적인 미량주사(microinjection) 기술로 형질전환 암컷 토끼를 생산하였다(Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442). 500 카피의 유전자를 포함하는 1-2 pl을 쥐 배(embryo)의 수 생식핵(pronucleus)으로 주입하였다. p-poly Ⅲ-I 벡터에서 제조되었다(Lathe et al, Gene (1987) 57, 193-201). 재조합 유전자를 포함하는 이 벡터의 단편 Not 1-Not 1을 미량주입하였다. 이후, 배를 호르몬적으로 준비된 암컷(adoptive female)의 수란관(oviduct)에 이식하였다. 조작된 배의 약 10%가 어린 토끼를 낳았고 조작된 배의 2~5%가 형질전환 어린 토끼를 낳았다. 형질전환 유전자(transgene)의 존재는 토끼 꼬리에서 추출된 DNA에서 서던 트랜스퍼 기술(Southern transfer technique)에 의해 밝혀졌다. 동물의 혈액과 우유에서의 FⅦ 농도는 특이 방사선면역분석법(Radioimmunological assay)에 의해 평가되었다.
세포 배양액 또는 토끼 포유동물 외식 배양액(rabbbit mammal explants culture medium)에 우유를 첨가하여 FⅦ의 생물 활성도를 평가하였다.
우유에서 본 발명의 FⅦ를 생산하는 형질전환 암컷 토끼를 얻기 위해 채택된 기술은 유럽특허 EP 0 527 063에 상세히 기술되어 있다.
[실시예 2] 얻은 FⅦ의 추출 및 정제
a) FⅦ의 추출
500㎖의 원유를 취하여 pH 8.2인, 0.25M 인산나트륨 버퍼의 9배 양으로 희석하였다. 상온에서 30분동안 교반한 후, FⅦ가 풍부한 수상을 15℃에서 1시간 동안 10,000g에서 원심분리하였다(centrifuge Sorvall Evolution RC - 6700rpm - rotor SLC-6000). 약 835㎖의 6개 포트가 필요하다.
원심분리 후, 3개의 상이 존재한다: 표면의 지질상(크림), (대부분의 상인) FⅦ가 풍부한 투명한 비-지질 수상 및 펠릿에서의 흰 고체상(불용성 카세인 및 칼슘 화합물의 침전물).
연동펌프(peristaltic pump)에 의해 크림상 및 FⅦ을 포함하는 비-지질 수상을 모으고 나서, 크림상을 따로 모은다. 고체상(침전물)을 제거한다.
그러나 여전히 소량의 지질을 포함하는 비-지질 수상을 일련의 필터(Pall SLK7002U010ZP-1㎛의 세공을 가지는 유리섬유의 프리필터(prefilter)- Pall SLK7002NXP-0.45㎛의 세공을 가지는 나일론 66(Nylon 66))로 여과한다. 여과가 끝난 후에, 우유의 지방구가 잔류되어 있는 상기 일련의 필터 장치를 지질상이 통과하여, 여과액이 투명해진다.
크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)을 가지도록 하기 위해, 여과된 비-지질 수상을 울트라 필터용 막(Millipore Biomax 50kDa - 0.1㎡)에서 더 투석시킨다. 우유의 염, 당 및 펩티드와 달리, 약 50kDa의 고 분자량을 가진 FⅦ는 막을 통해 여과되지 않는다. 처음에, 수용액(약 5,000㎖)을 500㎖으로 농축시키고 나서, 일정한 양을 유지하는 울트라 필터 장치에 의한 투석에 의해 전해질(electrolyte)을 제거하고 크로마토그래피 단계를 위한 생물학적 물질로 조절한다. 투석 버퍼는 pH 8.2의 0.025M 인산나트륨 버퍼이다.
FⅦ를 포함하는 이 비-지질 수상은 FⅦ-tg가 풍부한 락토세럼에 동화될 수 있다. 방법을 계속하기 전에 -30℃에서 이 제조물을 저장한다.
이 단계에 의하여 FⅦ의 전체적인 회수량이 만족할 정도가 된다: 90%(인산염을 가진 91%의 추출물 + 99% 투석/농축).
이 단계에서 유래하는 FⅦ를 포함하는 비-지질 수상은 완전히 투명하고 다른 크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)이 있다.
약 93,000IU의 FⅦ-tg가 이 단계에서 추출된다. FⅦ에서 이 제조물의 순도는 약 0.2%이다.
b) FⅦ의 정제
1. 하이드록시아파타이트 젤 크로마토그래피
Amicon 90(지름 9㎝-단면 64㎠) 컬럼을 BioRad 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 젤(CHT-I)로 채운다. λ=280㎚에서의 흡수도 측정을 통해 탐지한다.
젤은 pH 8.0의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨의 혼합물로 이루어진 수성 버퍼 A로 평형을 유지된다. -30℃에서 보존된 전체 제조물을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃에서 중탕냄비(water bath)에서 해동하고 나서, 젤에 주입한다(선형 유속 100㎝/h, 즉, 105㎖/min). pH 8.2의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨으로 이루어진 버퍼를 통과시켜, 기준선(RBL)으로 복귀할 때까지, 잔류되지 않는 단편을 제거한다.
FⅦ-tg를 포함하는 단편을 pH 8.0인 0.25M의 인산나트륨 및 0.4M의 염화나트륨으로 구성된 버퍼 B로 용출시킨다. 용출된 단편을 기준선에 복귀할 때까지 모은다.
95% 이상의 락틴 단백질을 제거하면서, 이 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 FⅦ-tg를 회수한다. 고유 활성도(S.A.)를 25로 곱한다. 4%의 순도를 가지는 약 85,000IU의 FⅦ-tg를 이 단계에서 이용할 수 있다.
2. 100kDa 접선 여과 및 50kDa 농축/투석
이전 단계의 전체 용출액을 100kDa 울트라 필터용 막(Pall OMEGA SC 100K-0.1㎡)에서 접선 형태로 여과시킨다. FⅦ는 100kDa 막을 통해서 여과되는 반면, 100kDa이상의 분자량을 가진 단백질은 여과되지 않는다.
게다가, 실시예 1에서 이미 언급한 것처럼, 여과된 단편을 약 500㎖로 농축하고 나서 50kDa 울트라 필터에서 투석한다. 투석 버퍼는 0.15M 염화나트륨이다.
이 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피를 시행하기 전에 생성물을 -30℃에 서 저장한다.
이 단계를 통해 100kDa 이상의 분자량을 가진 단백질과 특히 프로-효소(pro-enzyme)의 부하를 감소시킨다. 100kDa 막 처리를 통해 분자량이 높은 단백질 중에, 단백질의 약 50%가 유지되는 반면 95%의 FⅦ-tg, 즉 82,000IU의 FⅦ-tg가 여과된다.
이 처리를 통해 이후 단계(downstream step)의 단백질 가수분해(proteolytic hydrolysis)의 위험을 감소시킬 수 있다.
3. Q-Sepharose® FF 젤에서의 크로마토그래피
유효성분(active principle)을 정제하고, 활성화된 FⅦ(FⅦa)로 FⅦ를 활성화하며, 마지막으로 FⅦ의 구성을 농축하고 성분배합을 하기 위해 이온 교환기 젤 Q-Sepharose® Fast Flow(QSFF)에서 3번의 연속 크로마토그래피를 실시한다. λ=280㎚에서 흡수도 측정을 통해 화합물을 탐지한다.
3.1 Q-Sepharose® FF 1단계 - 용출 "고 칼슘"
2.6㎝의 지름(단면 5.3㎠)의 컬럼을 100㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.
젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지한다.
-30℃에 보존된 전체 단편을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃로 중탕냄비에서 해동시킨다. 젤로 주입하기 전에(유속 13㎖/min, 즉 선형 유속 150㎝/h) 평 형 버퍼에 의해 단편을 ½[v/v]로 희석하고 나서, 잔류되지 않는 단편을 RLB까지 버퍼를 통과시켜 제거한다.
pH 7.5인 0.05M의 트리스 및 0.15M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 소량의 FⅦ를 가지는 첫 번째 단백질 단편을 용출시켜서, 계속 제거한다.
pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.05M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 두 번째 FⅦ가 풍부한 단백질 단편을 용출시킨다. λ= 280㎚에서 탐지한다.
이 두 번째 단편을 이미 실시예 1에서 기술된 50kDa 울트라 필터로 투석시킨다. 투석 버퍼는 0.15M의 염화나트륨이다. 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피를 통과하기 전에 이 단편을 +4℃에서 밤 사이에 보존한다.
이 단계를 통해 80%의 결합 단백질을 제거하면서 73%의 FⅦ(즉, 60,000IU의 FⅦ-tg)를 회수한다. 또한, 이 단계에 의해 FⅦ가 FⅦa로 활성화된다.
3.2 Q-Sepharose® FF 2 단계 - 용출 "저 칼슘"
2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 30㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.
젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.
젤로 주입(유속 9㎖/min, 즉 선형 유속 100㎝/h)하기 전에, +4℃에서 저장된 이전에 용출된 단편(두 번째 단편)을 희석시킨다.
주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해 평형 버퍼로 젤을 세척한다.
pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.005M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 4.5㎖/min(즉, 50㎝/h)의 속도로, 높은 순도의 FⅦ를 포함하는 단편을 용출시킨다.
약 23,000IU의 FⅦ-tg, 즉 12㎎의 FⅦ-tg를 정제하였다.
이 단계를 통해 95% 이상의 결합 단백질(암컷 토끼의 우유 단백질)을 제거한다.
90% 이상의 순도를 가진 이 용출액은 선천적으로 존재하는 인간 FⅦ 분자에 가까운 구조적 특징 및 기능성 특징으로 나타낸다. 그것은 음이온 교환 크로마토그래피에서의 세 번째 통과에 의해 농축되고 성분 배합된다.
3.3 Q-Sepharose® FF 3 단계 - 용출 "나트륨"
2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 10㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.
젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.
젤로 주입(유속 4.5㎖/min, 즉 선형 유속 50㎝/h)하기 전에, 이전 단계에서 정제한 단편을 주사용 정제수(purified water for injection; PWI)로 5배로 희석시킨다.
주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해 평형 버퍼로 젤을 세척한 다.
이후에, pH 7.0인 0.02M의 트리스, 0.28M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 3㎖/min(즉, 36㎝/h)의 속도로, FⅦ-tg을 용출시킨다.
95% 이상의 순도로 FⅦ-tg의 농축물을 제조하였다. 생성물은 정맥 주사와 친화성이 있다. 방법은 사용된 우유의 리터당 적어도 20㎎의 FⅦ로 정제되어, 22%의 축적량을 가진다.
[실시예 3]: 1차 서열의 연구
1. 펩티드 지도(peptide map)
FⅦ-pd, FⅦ-rec 및 FⅦ-tg의 샘플을 트립신(trypsin) 및 Asp N으로의 분해(데이터 미제시) 후에 LC-MS 및 UV 탐지 크로마토그램를 얻었다.
트립신 분해 후에 얻어진 펩티드 지도의 분석 결과 65분 이하의 정체시간(retention time)으로 그들이 유사함을 나타난다. 그밖에, 중연쇄의 펩티드 단편에 대응하는 종은 FⅦ-rec 및 FⅦ-tg이며 FⅦ-pd는 아님을 알 수 있다. 고질량(4500Da~8000Da)을 가진 이런 펩티드는 불발 분열(abortive cleavage)에 일치한다. 이들 펩티드를 다른 FⅦ-pd 배치에서 찾아냈으므로, 그들의 존재는 다른 트리신 민감성에 관련있을 수 없다.
Asp N 분해 후에 얻어진 펩티드 지도는 한 FⅦ과 다른 것과 매우 유사하고, 정체시간의 전체 시리즈를 따라서도 유사하다. 강도(intensity)에서 관찰된 차이는 단지 주입된 양의 변화량에 기인한 것이고 구조적 차이에 관련된 것이 아니다.
2. 서열의 커버링(Covering of sequence)
MS 및/또는 MS/MS에 의해 확인된 펩티드에서 서열의 오버랩핑을 계산한다. 표 1은 다른 샘플에서 얻어진 결과를 요약한다. 트립신 및 Asp N 분해를 고려해서, 1차 서열의 95% 이상을 확인할 수 있고, 얻어진 결과는 논문에 기술된 결과와 일치한다(Thim L. et al, Biochemistry, 1988, 27, 7785-7793).
[표 1] LC-ESIMS(/MS)에 의해 분석된 다른 샘플에서 얻어진 서열의 오버랩
오버랩 트립신
(Overlap trypsin)(%)		 오버랩 Asp-N
(Overlap Asp-N)(%)		 전체 오버랩
(Global Overlap)(%)
FⅦ-pd 79.3 97.3 97.3
FⅦ-rec 97.5 95.8 100.0
FⅦ-tg - 97.0 97.0
FⅦ-tg 96.6 91.1 100.0
FⅦ-tg 95.3 91.1 99.0
펩티드의 동일성(identity)을 확인하기 위하여, HPLC 단편을 MALDI와 Edman 시퀀싱에 의해 분석하였다.
Edman 시퀀싱에 의해 분석된 HPLC 단편 전부를 통해 80%의 서열 오버랩을 얻을 수 있다. LC-MS에서 FⅦ-tg 및 FⅦ-rec의 서열을 검정하였고, 그 결과 >95%의 1차 서열 오버랩을 얻었다.
[실시예 4] 당화 자리의 특성 및 ESI-MS에 의한 당펩티드의 특성
FⅦ-tg의 N-당화 자리를 LC-ESIMS(/MS)로 동정하고, MALDI-TOFMS로 확인하 며, 된 되고, 미시적 구조(microheterogeneity)를 LC-ESIMS로 결정하였다.
도 2는 두 개의 당화된 Asn 잔기를 포함하는 당펩티드의 탈회선된(deconvoluted) ESI 스펙트럼을 도시한다. 당화 자리의 위치를 MALDI-TOF(/TOF) 및 Edman 시퀀싱에 의해 또한 확인하였다.
각각 N-당화 자리 Asn145와 Asn322를 가지는, 혈장 FⅦ(FⅦ-pd)의 당펩티드 질량 스펙트럼[D123-R152]와 [K31.6-R353]의 분석을 통해 바이안테너리, 바이시알릴화, 비-푸코실화된 구조(A2)(당펩티드의 관찰된 질량: 5563.8Da) 및 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화된 구조(A2F)(당펩티드의 관찰된 질량: 5709.8Da)가 존재함이 밝혀졌다. 또한, 트리안테너리, 트리시일릴화, 비-푸코실화된 올리고당(triantennary, trisialylated, non-fucosylated oligosaccharide)(A3)(관찰된 질량: 6220.0Da) 및 트리안테너리, 트리시일릴화, 푸코실화(A3F)(관찰된 질량 6366.1Da)가 존재함이 밝혀졌다. 형질전환 FⅦ(FⅦ-tg)에 있어, Asn145에 위치한 올리고당의 대부분은 바이안테너리, 모노시알릴화, 비-푸코실화된 올리고당 또는 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화된 올리고당(A1, A1F) 및 A2, A2F 유형이다. 트리안테너리 형태는 불충분하게 나타난다.
Asn322 당형태(glycoform)의 대부분에 관하여, 동일한 글리칸 구조가 다른 비율로 관찰된다. 도 2는 Asn145보다 덜 가공된(덜 안테너리하고 덜 시알릴화된) 형태가 존재함을 나타낸다. 예를 들면, 트리안테너리 구조는 혈장 FⅦ에서의 Asn145보다 Asn322에 덜 나타나고 FⅦ-tg에는 없다. Asn 145 및 322가 100% 당화되었음을 주목해야 한다. 반정량적(semi-quantitative)임에도 불구하고, 이 결과는 HPCE-LIF와 NP-HPLC에 의해 얻어진 정량과 일치하다.
[실시예 5] HPCE-LIF에 의한 N-글리칸의 정량화
PNGase F로 탈당화(deglycosylation)를 한 후 HPCE-LIF에 의해 N 연결된 올리고당의 동정 및 정량화를 실시하였다. 각 분리된 구조를 동정하고 정량화하기 위해 엑소글리코시다아제(exoglycosidases)(시알리다아제(sialidase)(비율 효소/기질(FⅦ):1mIU/10㎍), 갈락토시다아제, HexNAcase(프로자임 키트), 푸코시다제(fucosidase) (비율 E/S:1mIU/10㎍)로 FⅦ 샘플을 처리하였다. 얻어진 글리칸을 형광색소(fluorochrome)로 라벨링하고, 질량 및 전하량에 따라 분리한다. 2 기준(포도당 호모폴리머(glucose homopolymer) 및 올리고당)을 통해 구조를 동정하였다. 전체 정량화된 올리고당에 대한 각 피크를 통합하여 정량화를 하였다.
본 실시예에서, 그 모세관이 50㎝×50㎛의 내부 지름을 가지는 N-CHO(Beckman-Coulter)으로 코팅된, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) ProteoLab PA800(Beckman-Coulter)를 사용한다. "젤-버퍼-N"(Beckman-Coulter)이라는 분리 버퍼를 사용한다. 25㎸, 20℃에서 20분 동안 실험을 한다. 레이저를 이용하여 탐지한다(여기(excitation) λ= 488㎚ ; 방출(emission) λ=520㎚).
시알리다아제, 갈락토시다아제 및 HexNAcase에 의한 동시 탈당화 후에, "코 어(core)"에 대응하는 피크 영역과 푸코실화된 "코어" 사이의 비율에 의해 푸코실화(fucosylation) 비율을 계산한다.
FⅦ-pd의 글리칸의 대부분은 바이안테너리, 바이시알릴화(A2) 유형 및 바이안테너리 바이시알릴화, 푸코실화(A2F) 유형이다. FⅦ-tg의 글리칸 모양(도 3 참조)은 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화 유형 또는 바이안테너리, 모노시알릴화, 비-푸코실화 유형(A1F, A1)인 구조 및 바이안테너리, 바이시알릴화, 비-푸코실화 유형 또는 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화 유형(A2, A2F)인 구조가 존재함을 밝힌다. FⅦ-rec의 모양은 다른 관찰된 구조(A1F, A2F)에 대한 불규칙한 이동 시간(migration time)을 보여준다.
[표 2] 천연(native) 샘플(탈시알릴화)에서 유래한 시알릴화 구조 및 FⅦ:FⅦ-pd 및 FⅦ:FⅦ-tg의 다른 배치의 탈시알릴화 견본에서 유래하는 시알릴화 구조의 백분율의 개요
백분율 FⅦ-pd FⅦ-tg 배치 A FⅦ-tg 배치 B
천연
A2
41.9
19.3
13.9
A2F 8.9 14.8 21.5
A1 2.6 38.4 25.2
A1F - 11.7 22.2
전체 A2+A2F 50.8 34.1 35.4
전체 A1+A1F 2.6 50.1 47.4
탈시알릴화
G2		 44.5 57.5 37.2
G2F 8.9 18 38.1
G3 25 4.6 3.0
G3F 5.1 1.3 3.0
다른 비푸코실화 종 12.6 2.9 3.0
다른 푸코실화 종 2.2 3.6 7.5 *
G2FB - - -
*비푸코실화 종
G2, G2F: 바이안테너리, 바이갈락토실화, 비-푸코실화 또는 푸코실화 형태
G2FB: 바이안테너리, 바이갈락토실화, 2등분(bisected)된 푸코실화 형태
다른 글리칸 구조의 정량 분석(표 2)은 51%의 바이시알릴화 글리칸(A2 및 A2F)과 30%의 트리안테너리, 시알릴화, 비-푸코실화 또는 푸코실화 형태(G3와 G3F)를 가지는 FⅦ-pd에 대한 시알릴화 구조의 우세를 나타낸다. FⅦ-tg(배치 A와 B)는 35%의 바이안테너리, 바이시알릴화 유형 및 단지 6%의 트리안테너리, 시알릴화 형태를 가지는 FⅦ-pd보다 덜 시알릴화된다. 형태의 대부분은 50%의 구조 A1와 A1F가 모노시알릴화된다. FⅦ-rec는 또한 45%의 A2F 구조 및 단지 6%의 트리안테너리, 시알릴화된 글리칸를 가진 FⅦ-pd보다 덜 시알릴화된다(결과 미제시).
FⅦ-rec에 있어서, 낮은 비율의 비-푸코실화 구조가 주목된다.
[표 3] 다른 FⅦ의 푸코실화 비율
FⅦ-pd FⅦ-tg
배치 A		 FⅦ-tg
배치 B		 FⅦ-rec
푸코실화 비율(%) 16.2 23.6 41.8 100
정량 분석은 FⅦ-pd에서의 낮은 비율의 푸코실화(16%), FⅦ-tg에서의 24 내지 42%의 푸코실화 비율, FⅦ-rec에서의 100%의 푸코실화 비율을 나타낸다.
[실시예 6] NP-HPLC에 의한 N-글리칸의 정량화
NP-HPLC에 의해 FⅦ-pd 및 FⅦ-tg의 N-당화에 대한 정성분석 및 정량분석을 하였다. 단백질을 탈염 처리(desalization) 및 건조한 후, 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 절차에 따라 이 단백질을 변성하고 환원한다. 글리칸은 효소 노선(엔도글리코시다아제(endoglycosidase) PNGase F)에 의해 분리되고 에탄올 침전에 의해 정제된다. 따라서, 얻어진 글리칸을 형광원(fluorophore) : 2-아미노벤조아마이드(aminobenzamide)(2-AB)로 라벨링한다. NP-HPLC(Amide-80 column-4,6/250mm-Tosohaas)를 사용하여 라벨링된 글리칸을 친수성(hydrophilicity)에 따라 분리한다. 주입 전에, 컬럼을 80%의 아세토니트릴(acetonitrile)로 평형을 맞춘다. 포름산 암모늄(Ammonium formate) 50mM, pH4.5의 증가 구배(increasing gradient)를 이용하여 140분 이상 동안 올리고당을 용출시킨다. 형광측정법(fluorometry)으로 탐지한다(여기(excitation) λ= 488㎚ ; 방출(emission) λ=520㎚).
FⅦ-pd의 크로마토그래피 프로파일(profile)(도 4)은 대부분의 글리칸이 39%의 비율로, 바이안테너리, 바이시알릴화 유형(A2)임을 보여준다. 또한, 소량으로, 바이안테너리, 바이시알릴화, 푸코실화 유형(A2F), 모노시알릴화(A1) 및 트리시알릴화, 푸코실화 및 비-푸코실화(A3F 및 A3) 형태도 관찰된다.
FⅦ-tg에 실행된 NP-HPLC에 의한 분석을 통해 대부분의 올리고당이, 27%의 비율까지 유형 A1으로 존재함을 확인한다. 구조 A1F, A2 및 A2F는 덜 나타나고, 트리안테너리 형태는 자취로 존재한다. 이것은 FⅦ-pd과 덜 시알릴화된 인자 FⅦ-tg 사이의 시알릴화의 차이를 나타낸다.
[실시예 7] MALDI-TOFMS에 의한 동정
질량 분석기(Mass Spectrometry) MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser DEsorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry)는 펩티드, 단백질, 글리칸, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 이온화 가능한 중합체(ionisable polymer)의 분자량을 높은 정밀도로 측정하는 기술이다.
분석될 펩티드, 단백질 및 글리칸을 사용될 레이저의 파장에 흡수하는 매트릭스(matrix)로 혼합한다. 주요 매트릭스로는 펩티드 분석에 있어 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), 단백질 분석에 있어 시나피닌산 (sinapinic acid; SA), 올리고당에 있어 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)이다.
방법은 매트릭스 및 분석물 분자의 일반 탈착(desorption)의 결과로, 매트릭스/분석물 공동-결정체(co-crystal)를 펄스 레이저로 조사하는 것을 포함한다. 기체상 이온화(gas phase ionisation) 후에, 분석물 분자는 비행시간검출기(Time Of Flight detector)를 교차할 것이다. 질량과 비행시간이 직접 연관된 것을 고려하여, 후자를 측정하는 것을 통해 대상 분석물 질량을 결정할 수 있다. 이론적 질량과 비교함으로써, 관찰된 질량 측량을 통해 동정을 한다. MS/MS 모드에서, 얻어진 이온 단편을 근거로, 시퀀싱을 실시할 수 있다. 사용된 기구는 Bruker Autoflex 2이며, TOF와 TOF/TOF 모드에서 기능화한다.
FⅦ-tg에 존재하는 글리칸 구조를 동정하기 위하여, 예비 NP-HPLC에 의해 얻어진 용출된 단편에 MALDI-TOF MS 분석을 실시한다(도 5).
FⅦ-tg의 MALDI-TOF 분석에 의해, NP-HPLC로 분리된 글리칸의 동정, 즉 대부 분 모노시알릴화 A1 구조 및 소수 형태의 A1F, A2F 및 A2 유형으로, 확인할 수 있다.
이 연구는 또한 트리안테너리, 바이시알릴화 형태, 및 트리시알릴화 소수 형태, 혼성(hybrid) 형태 및 유형 Man5 및 Man6-P-HexNAc의 올리고만노스(oligomannose)를 동정할 수 있다.
다른 글리칸 구조를 동정하기 위하여, 탈시알릴화(desialylation) 후에 인자 FⅦ-tg의 MALDI-TOF MS 분석을 실행한다.
탈시알릴화(desialylation) 후에, 각각 35% 및 28%의 비율을 가진 (NP-HPLC에 의하여 정량화) 두 개의 다수 형태 G2 및 G2F가 관찰된다. 이 결과는 "천연(native)" 생성물(탈시알릴화되지 않은 생성물)의 구조의 동정과 일치한다.
다른 동정된 형태는 소량으로 존재하고 실질적으로 올리고만노스, Man6-P-HexNAc와 Man7-P-HexNAc 유형 및 혼성 형태이다. 바이푸코실화 형태의 존재가 주목된다.
[실시예 8] 시알산의 HPCE-LIF 분석 - 갈락토스 연결
시알산-갈락토스 연결("분기(branching)")의 연구와 관련된 실험 방법은 실시예 5에 기술된 것과 유사하다. PNGase F에 의한 탈당화 후에, 각 분리된 구조를 동정하고 정량화하기 위해 올리고당을 특정한 엑소시알리다아제(exosialidase)로 처리한다. 사용한 시알리다아제는 S. pneumoniae(α2-3 연결의 특성, 0.02IU, E/S=0.4w/w), C. perfringens(α2-3와 α2-6 연결의 특성, 0.04IU, E/S=0.1w/w) 및 A. urefaciens(α2-3, α2-6, α2-8 및 α2-9 연결을 가수분해하도록, 0.01IU, E/S=0.05w/w)에서 유래한 재조합 효소이다.
FⅦ-rec는 다수의 A2F를 가진 바이안테너리, 시알릴화, 푸코실화 글리칸 구조 및 바이안테너리, 모노시알릴화, 푸코실화(A1F) 형태를 가진다는 것을 분석에 의해 알게 되었다. 이 구조에 대한 일반적인 이동 시간과 비교하여, 이 구조 A2F와 A1F에 대한 불규칙한 이동 시간이 주목된다. 즉, 이 올리고당 시알릴화 구조는 FⅦ-tg의 이동 시간에 비교된 HPCE-LIF와 NP-HPLC에서 불규칙한 이동 시간을 나타낸다. 반면에, 단당류에서 조성물 분석은 Neu5Ac와 다른 어떤 특정 시알산도 나타나지 않으며 질량 분석기는 바이시알릴화 유형과 일치하는 질량을 가진 글리칸을 나타낸다. 마지막으로, FⅦ-rec의 글리칸이 탈시알릴화되면 FⅦ-tg 및 FⅦ-pd의 올리고당의 탈시알릴화와 동등한 크로마토그래피 거동 및 전기영동 거동을 다시 발견할 수 있다.
그러므로 전기영동 및 크로마토그래피 거동에서의 이런 차이는 시알산의 분기의 차이로서 설명할 수 있다. 이 가설은 HPCE-LIF와 MS의 다른 접근에 의해 평가되었다.
결과를 이하의 도 4에 요약한다.
[표 4] FⅦ의 다른 배치에서 시알산의 분기(ramification)
시알릴화(%) α2-3 (%) α2-6 (%) α2-8 (%)
FⅦ-pd 100 41 59 0
FⅦ-rec 91 100 0 0
FⅦ-tg 배치 C 96 0 100 0
결과는 세 FⅦ의 시알산 수준에서 특유한 이성질체가 존재함을 밝힌다. 실제로, FⅦ-rec의 시알산은 α2-3 연결을 포함하고, 반면 FⅦ-tg는 분기(ramification) α2-6를, FⅦ-pd는 이러한 두 종류 이성체의 혼합물을 나타낸다,
FⅦ-tg 및 FⅦ-pd에 대한 FⅦ-rec의 글리칸에서 관찰된 HPCE-LIF와 NP-HPLC에서의 거동 차이는 시알산에 이 이성질체의 차이와 연결된다.
[실시예 9] O-당화의 연구
FⅦ는 Ser52와 Ser60 수준에 있는 2 O-당화 자리가 존재한다. 이 잔기는 포도당-(크실로오스)0-2 및 푸코오즈 모이어티를 각각 포함한다. 이 연구의 구조에서, O-당화는 LC-ESIMS(/MS)에 의해 연구되며, MALDI-TOF(/TOF)에 의해 유사한 방식으로 연구된다(결과 미제시).
도 10는 샘플 FⅦ-pd, FⅦ-rec 및 FⅦ-tg의 O-글리칸의 구조를 설명한다. m/z 3297.4에서의 피크는 Ser52에서의 포도당(크실로오스)2 모이어티 및 Ser60에서의 푸코오즈를 포함하는 펩티드[Leu39-Lys62]에 대응한다. m/z 3165.4와 3033.3에서의 피크는 이 당펩티드에 각각 1개의 및 2개의 크실로오스의 손실에 대응한다. FⅦ의 3가지 유형은 획일적으로, 푸코실화 및 당화되지만, 크실로오스 잔기의 수 및 대응하는 당형태의 비율이 다르다. 따라서, 0개, 1개 및 2개의 크실로오스를 가진 형태는 FⅦ-pd에서와 거의 동등한 비율로 존재하며, 반면에 FⅦ-rec 및 FⅦ-tg는 0 개 및 2개의 크실로오스를 가진 형태만 포함한다.
MS 분석은 구조 Fuc 및 Glc(Xyl)0을 전달하는 펩티드[Leu39-Lys62]에 일치하는 m/z 1516.6에 두 배 대전된 이온을 보여준다. 다른 단당류에 대응하는, MS/MS에 의해 얻어진 연속적인 질량의 손실은 포도당 잔기와 푸코오즈 잔기를 각각 가지는 Ser52 및 Ser60의 변형을 확인한다. Edman 시퀀싱은 변형 자리의 측면에서 이런 결과를 보완하는 것을 허용했다.
같은 방식으로, m/z 1648.7에서의 두 배 대전된 이온은 구조 Fuc 및 Glc(Xyl)2를 나르는 펩티드[Leu39-Lys62]에 대응한다. MS/MS에서 얻어진 다른 이온 단편은 크실로오스 모이어티가 포도당에 결합하였다는 것을 확인한다.
[실시예 10] γ 카르복시화의 연구
FⅦ-pd의 첫 번째 10 글루탐산은 γ 카르복시화되고, 반면에 FⅦ-rec의 10번째 글루탐산은 부분적으로만 γ-카르복실화된다. 형질전환 FⅦ와 그것의 비교자의 γ 카르복시화를 연구하기 위하여, Asp N 및 트립신 분해 후에 얻어진 펩티드를 LC-MS로 분석하였다. 두 종류의 효소에서 유사한 결과가 나왔고, Asp N 분해에 관련된 자료만 도시한다.
이 실험 조건에서, γ-카르복실화를 포함하는 3개의 펩티드[Ala1-Lys32], [Asp33-Ser45] 및 [Asp33-Gly47]를 동정하였다. 펩티드[Ala1-Lys32]는 처음 9개의 γ- 카르복시산(Gla)을 포함하고 반면 2개의 다른 펩티드[Asp33-Ser45]와 [Asp33-Gly47]은 10번째 Gla 잔기만 포함한다. 따라서, 10번째 Gla 잔기의 부분적 변형을 특이적으로 연구하는 것이 쉽다.
FⅦ-pd의 질량 스펙트럼의 분석(도 11)은 처음 9개의 글루탐산(Glu)에 완전히 γ-카르복실화된 펩티드[Ala1-Lys32]에 대응하는, 4296.8Da에서의 주요 피크(~90%) 및 10번째 Glu35의 수준에서 완전하게 γ-카르복실화된 펩티드[Asp33-Ser45]에 특이한, 1658.8Da에서의 피크가 존재함이 밝혀진다. FⅦ-pd의 처음 10개의 Glu 잔기가 카르복실화된다는 이 결과는 문헌(Jurlander B. et al, Semin.Thromb.Hemost., 2001, 27, 373-384)과 일치함을 보여준다.
다른 자료를 동일한 실험 조건하에서 얻었기 때문에, FⅦ의 다른 배치의 비교 연구도 가능하다 (표 5).
도 11은 FⅦ-rec 및 FⅦ-tg에 있어서, 완전하게 γ-카르복실화된 펩티드 [Ala1-Lys32]에 일치하는 4296.8Da에서의 피크가 대부분이라는 것을 보여준다. 반면, 두 FⅦ에 있어서, Gla35에 γ-카르복실화되지 않은 펩티드[Asp33-Ser45]의 특성을 나타내는 1614.9에서의 주요 피크가 존재한다. 이 결과는 ~50%의 공개된 값(Thim L. et al, Biochemistry, 1988, 27, 7785-7793 and Jurlander B. et al, Semin.Thromb.Hemost., 2001, 27, 373-383)과 일치하는, FⅦ-rec의 경우에 약 35-40%로 평가된 10번째 Gla의 부분 γ 카르복시화를 나타낸다. 펩티드 [Ala1-Lys32]에 사소하지 않은 강도를 가지는 8개의 Gla를 가진 형태도 보고된다. 이 마지막 점은 한 개 이상의 Gla의 부분 γ 카르복시화를 지시하며, 7개의 Gla를 가진 형태의 "자취(trace)"가 존재하는 것은 하나의 잔기를 포함하는 것을 강조한다.
[표 5] Glu의 γ 카르복시화에 관하여 데이터의 요약
이 데이터는 LC-ESIMS 분석에서 유래한다. Gla:γ 카르복시산
Gla 잔기의 수 주요 형태 (n Gla)
FⅦ-pd 8-10 10
FⅦ-rec 7-10 9
FⅦ-tg 7-10 9
FⅦ-tg 7-10 9
[실시예 11] 이황화 결합의 연구
FⅦ의 이황화 결합에 대한 연구는 미환원 상태, 즉 이황화 결합이 유지된 상태에서 얻어진 트립신 가수분해 산물에서 실행되었다.
가능한 유리 시스테인을 억제하고, 따라서 염기의 pH에서 시행되는 단계 동안 이황화 결합의 교환을 억제하기 위해 iodacetamid로 실시하는 반응 단계가 포함된다.
이런 조건에서, 12개의 이황화 결합이 존재하고 10개의 시스테인이 쌍을 이루는 것을 확인할 수 있었다(표 6). 그러나 FⅦ 서열의 이 부분에 대해 얻어진 결과는 이론적인 쌍 이루기(pairing)에 일치한다. 이 결론은 조사된 샘플 전부에 적용할 수 있다: FⅦ-pd와 FⅦ-tg.
[표 6] 이황화 결합 연구에서 얻어진 결과의 요약
FⅦ-pd FⅦ-tg
확인된 이황화결합 12 12
쌍을 이룬 시스테인 Cys17 - Cys22
Cys114 - Cys127
Cys135 - Cys262
Cys159 - Cys164
Cys178 - Cys194
Cys310 - Cys329
Cys340 - Cys368 		Cys17 - Cys22
Cys114 - Cys127
Cys135 - Cys262
Cys159 - Cys164
Cys178 - Cys194
Cys310 - Cys329
Cys340 - Cys368
어떤 번역-후 변형도 일어나지 않은 다이펩티드(dipeptide) [Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]에 사용된 실험 전략을 적용한다(결과 미제시). 이 전략은 4 개의 보완적인 접근을 함축한다: ⅰ) 실험적 질량 및 관찰된 질량 사이에 ESI-MS 및 MALDI-MS에 의해 질량을 이중으로 "일치(matching)"함으로서 이황화 결합을 포함하는 다이펩타이드(dipeptides)의 동정, ⅱ) S-S 결합의 화학적 환원에 의한 구조 확인 및 다이펩티드에서 생성된 두 펩티드의 MS 동정, ⅲ) MS/MS 및 자동 Edman 마이크로 시퀀싱에 의해 다이펩티드의 시퀀싱.
결과는 다이펩티드 실험적 질량(3264.6Da)과 이론적 질량(3264.5Da)을 "일치"에 의한 이황화결합 Cys340-Cys368을 포함하는 [Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]의 첫 번째 동정을 나타낸다.
화원 후, Cys368을 포함하는 펩티드 [Gly354-Ser379]의 특성인 m/z 2816.3에서 피크의 우세에서, 이황화 결합 Cys340-Cys368을 포함하는 이 다이펩티드 [Gly354- Ser379]/[Asp338-Lys341]에 대응하는 피크가 사라진 것이 주목된다. MS/MS에 의한 및 Edman 화학법에 의한 시퀀싱은 다이펩티드 [Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341] 및 이황화 결합 Cys340-Cys368의 동정을 확인한다.
[실시예 12] 아스파르트산 63의 β-히드록시화의 연구
펩티드 분석은 단백질의 트립신 "분해"에서 실행된다. 펩티드는 MALDI-MS에 의해 분석된다. 히드록시화된 펩티드의 동정은 이론적 질량과 비교된 관찰된 질량의 측량에 의해 실행된다. 사용된 기구는 TOF 모드에 따라 작동하는 Bruker Autoflex 2이다.
다른 결과는 표 7에 제공된다. 문헌에서는 FⅦ-pd와 FⅦ-rec의 β-히드록시화가 없다고 보고하고(Thim L. et al, Biochemistry, 1988, 27, 7785-7793), 반면 이들 샘플 모두의 부분적 변형이 다른 FⅦ-tg 배치보다 덜 풍부한 양식으로 관찰됨은 강조되어야 한다.
[표 7] Asp63의 히드록시화에 관한 데이터 요약
이들 데이터는 트립신으로 분해된 펩티드의 LC-ESIMS 분석 결과이다.
(*) FⅦ-tg보다 덜 "풍부한' β-히드록시화
(**) 문헌(Thim L. et al, Biochemistry, 1988, 27, 7785-7793)에서 인용된 값
Asp63d의 히드록시화
FⅦ-pd 부분 *
FⅦ-rec 없음 **
FⅦ-tg 부분
FⅦ-tg 부분
FⅦ-tg 부분
[실시예 13] Galα1,3 Gal 구조의 존재 연구
FⅦ-tg에서 Galα1,3 Gal 구조가 존재할 수 있는지를 연구하기 위해서, 소(bovine) 사이로글로불린(thyroglobulin)을 Galα1,3 Gal 구조의 양대조구로서 사용한다.
PNGase F로 탈당화한 후에 생성물을 Galα1,3Gal 분기-특이 시알리다아제, 푸코시다아제 및 α-갈락토시다아제로 처리한다.
도 6은 천형 형태("Natif ")와 탈시알릴화, 탈푸코실화, 및 α-탈갈락토실화 형태(Dsial+Dfuc+Dgalα1,3,4,6))의 중첩을 가진 소의 사이로글로불린에 대한 연구결과이다. α-탈갈락토실화 후에 얻어진 글리칸 모양은 이 구조가 효소로 처리한 후 완전하게 사라져서, 사용된 α-갈락토시다아제가 온전하게 활성을 가짐을 증명함을 나타낸다. 17.8%의 얻어진 Galα1,3 Gal 구조의 비율은 예상한 비율에 일치한다.
도 7은 탈시알릴화, 탈푸코실화 및 α-탈갈락토실화 생성물(Dsial+Dfuc+Dgalα(1,3,4,6))과 탈시알릴화 및 탈푸코실화 FⅦ-tg 생성물(Dsial+Dfuc)의 전기영동의 중첩을 나타낸다.
두 형태 모두 완벽하게 중첩될 수 있음이 주목된다. 이 결과에 의해 FⅦ-tg 에 Galα1,3 Gal 구조가 결핍되어 있다고 추측한다. 근접 위치에 없는 글리칸 푸코오즈에 일치하는 소량 구조(*)가 존재함을 주목해야 한다.
[실시예 14] Galα1,3 Gal 당류 모이어티의 정량화
10㎍의 인간 재조합 FⅦ과 형질전환 FⅦ을 이황화 결합 환원 조건에 따라 처리하고 전기영도 젤에 두고 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 높은 에피토프(epitope) 알파(1, 3의) 갈락토실 함량 때문에 소의 사이로글로불린 샘플(Sigma, T1001, Thyroglobulin from bovin thyroid)을 양(+) 대조구로 사용한다. α-Gal 모이어티(Galactose-alpha1-3Galactose-(3)4GlcNAc-R)가 존재하는 것을 정제된 락틴 Marasmius oreades 응집소(agglutinin) 퍼옥시데이즈(peroxydase)-라벨링 및 α-Gal 에피토프-특이성(EY Laboratories, H-9001, MOA-HRP)으로 밝혀진다. 이후에, 퍼옥시데이즈 활성을 색원체 기질(chromogenic substrate)(Fluka, 4-chloro-1-naphthol)로 탐지하고 신호 디지털 리스요법(signal digitalisation)(Bio-Rad, Quantity-one)에 의해 정량화한다. 신호 특이성을 확인하기 위해 동일한 막을 알파 갈락토시다아제(Prozyme, Green coffee bean)로 처리한다. 동시에, 전체 단백질 양을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색된, 동일한 SDS-PAGE 젤의 얼룩으로 평가한다.
결과는 소의 사이로글로불린에 대해 관찰된 강한 신호의 결과로서 락틴 Marasmius oreades(MOA)의 특이성 및 알파 갈락토시다아제로 처리한 후 없어지는 특이성을 보인다. 분석된 단백질 양에 일치하는 신호의 강도로 나눈 MOA 신호의 강 도에 관하여 표현된 결과는 FⅦ-tg 샘플에 대한 나머지 α-Gal 신호의 수준(2.3 내지 3.7)을 증명하며 반면에 재조합 FⅦ는 높은 값을 나타낸다.
이 결과(도 8 참조)는 햄스터 세포에 있는 재조합 FⅦ 생성물과 비교하여, 토끼의 형질전환 FⅦ에 α-Gal 에피토프가 없거나 매우 적은 양이 발현됨을 증명한다.
표 A은 본 발명의 바람직한 구체예에 다른 단계를 요약한 것으로, 각 단계에서 얻어진 다른 수확량, 순도 및 고유 활성도를 나타낸다.
[표 A]
배치번호
479030		 부피
(㎖)		 단백질
함량(㎎)		 FⅦ:Ag(IU) 함량 FⅦ 수확량
/단계(%)		 FⅦ 수확
량/농축된%		 SA
(IU/㎎)		 FⅦ 순도(%)
원유 500 42750 103450 100% 100% 2.4 0.12%
인산염 추출 4785 ND 93650 91% 91% - -
농축/투석
(50DKa UF)		 667 29610 93233 99% 90% 3.1 0.20%
하이드록시아파타이트 용출액(CHT-I) 2644 1071 85692 92% 79% 80.0 4.0%
접선 여과
(100Ka UF)		 459 518 81684 95% 72% 157.6 7.9%
용출액 QSFF1
(고Ca2+)		 402 105 59757 73% 58% 572 28.6%
용출액 QSFF2
(저Ca2+)		 157 12.8 22447 38% 22% 1749 87%
용출액 QSFF3
(나트륨)		 42.5 12.7 21929 98% 21% 1727 86%
최종 생성물
(살균 0.2㎛)		 50 12.4 23197 106% 22% 1878 94%

Claims (35)

  1. 조성물의 각 인자 Ⅶ 분자가 두 개의 N-당화 자리를 나타내는, 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ(FⅦ) 조성물에 관한 것으로,
    상기 조성물의 모든 FⅦ분자 중에 Galα1, 3 Gal 글리칸 모이어티의 비율이 0 내지 4%이며,
    상기 FⅦ의 시알산의 적어도 65%는 α2-6 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 FⅦ의 모든 시알산은 α2-6 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물의 상기 FⅦ는 α2-3 연결을 포함하는 시알산을 더 포함하는 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물의 상기 FⅦ의 모든 상기 글리칸 모이어티 중에서 적어도 40%는 바이안테너리, 모노시알릴화, 글리칸 형태인 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 FⅦ의 상기 바이안테너리, 모노시알릴화, 글리칸 형태가 다수인 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 FⅦ의 상기 바이안테너리, 모노시알릴화, 글리칸 형태 중에서, 다수의 글리칸 형태는 비-푸코실화인 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 FⅦ의 푸코실화 비율은 20~50%인 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 형질전환 암컷 토끼에서 생성되는 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 FⅦ는 활성화된 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 의약품으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 재조합 또는 형질전환 인자 Ⅶ 조성물.
  11. 유효성분으로서 제1항에 따른 인자 Ⅶ를 포함하는 혈우병(haemophilia) 환자의 치료용 약학 조성물.
  12. 유효성분으로서 제1항에 따른 인자 Ⅶ를 포함하는 다발성 출혈성 외상(multiple hemorrhagic trauma) 치료용 약학 조성물.
  13. 유효성분으로서 제1항에 따른 인자 Ⅶ를 포함하는 외과적 지혈법(surgical hemostasis)에 의해 제어할 수 없는 다량 출혈의 치료용 약학 조성물.
  14. 유효성분으로서 제1항에 따른 인자 Ⅶ를 포함하는 항응고제(anticoagulant)의 과량 복용에 의한 출혈(bleedings or hemorrages) 치료용 약학 조성물.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 허용될 수 있는 첨가제(excipient) 및 캐리어(carrier) 중 적어도 하나를 더 포함하는 약학 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
KR1020087029099A 2006-05-31 2007-05-31 각 인자 ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 조성물 KR101312390B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0604872A FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2006-05-31 Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
FR0604872 2006-05-31
PCT/FR2007/000909 WO2007138199A2 (fr) 2006-05-31 2007-05-31 Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090031676A KR20090031676A (ko) 2009-03-27
KR101312390B1 true KR101312390B1 (ko) 2013-10-10

Family

ID=37714417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087029099A KR101312390B1 (ko) 2006-05-31 2007-05-31 각 인자 ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 조성물

Country Status (15)

Country Link
US (2) US10344272B2 (ko)
EP (1) EP2037955B1 (ko)
JP (3) JP5943536B2 (ko)
KR (1) KR101312390B1 (ko)
CN (2) CN103408655B (ko)
AR (1) AR061430A1 (ko)
AU (1) AU2007266952B2 (ko)
BR (1) BRPI0710706A2 (ko)
CA (2) CA2652496C (ko)
ES (1) ES2725081T3 (ko)
FR (1) FR2901707B1 (ko)
IL (3) IL195184A (ko)
TR (1) TR201906038T4 (ko)
TW (1) TWI386221B (ko)
WO (1) WO2007138199A2 (ko)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1711513E (pt) 2003-12-01 2014-10-02 Novo Nordisk Healthcare Ag Nanofiltração de soluções de fator vii para remover vírus
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
JP2011517562A (ja) * 2008-03-25 2011-06-16 バイオプロテイン テクノロジーズ エスエー ヒト第ｖｉｉ因子を産生するトランスジェニックウサギ
WO2009141384A2 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Novo Nordisk A/S Process for the purification of factor vii polypeptides using affinity resins comprising specific ligands
FR2933496B1 (fr) * 2008-07-02 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de mesure du taux de facteur vii active dans un echantillon
FR2958496A1 (fr) * 2010-04-09 2011-10-14 Bioprotein Technologies Sa Preparation de proteine plasmatique de transfert des phospholipides (pltp) humaine recombinante a partir du lait d'animaux transgeniques.
BR112012027793B1 (pt) 2010-04-29 2022-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Método para a purificação de uma proteína de ligação de cátion divalente
CA2821711C (en) 2010-12-15 2017-10-10 Baxter International Inc. Eluate collection using conductivity gradient
CN103429272A (zh) 2010-12-30 2013-12-04 法国化学与生物科技实验室 作为病原体灭活剂的二元醇
US20140087395A1 (en) * 2011-03-31 2014-03-27 Hiroshima University Method for distinguishing between species within the genus staphilococcus
WO2013017555A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Lfb-Biotechnologies Factor vii compositions with specific glycosylation for controlled half-life
EP2554161A1 (en) 2011-08-02 2013-02-06 LFB Biotechnologies Pharmaceutical composition comprising factor VII encapsulated in micelles
ES2700933T3 (es) 2011-10-14 2019-02-20 Baxalta GmbH Purificación de proteínas mediante cromatografía de intercambio aniónico
PL2748179T3 (pl) 2011-10-14 2022-04-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Oczyszczanie białka metodą anionowej chromatografii jonowymiennej
EP2687595B1 (en) 2012-07-19 2018-05-30 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Method for purifying transgenic factor VII
PE20211303A1 (es) 2012-12-24 2021-07-20 Coagulant Therapeutics Corp Polipeptidos del factor vii de accion corta
MX2015010427A (es) 2013-02-13 2016-03-17 Lab Francais Du Fractionnement Anticuerpos anti-tnf-alfa altamente galactosilados y sus usos.
EP2956484B1 (en) * 2013-02-13 2018-11-14 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Cetuximab with modified glycosylation and uses thereof
PL2970376T3 (pl) 2013-03-15 2018-10-31 Baxalta Incorporated Sposób oczyszczania białek zależnych od witaminy k za pomocą chromatografii anionowymiennej
FR3006591B1 (fr) 2013-06-11 2016-05-06 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene
WO2020053661A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Methods of purifying antibodies from the milk of transgenic non-human mammals comprising the use of chitosan
US20230133641A1 (en) * 2021-10-25 2023-05-04 Fios Therapeutics, Llc Viable galactosyltransferase knock-out sheep and related methods

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS504587A (ko) 1973-04-03 1975-01-17
US4229342A (en) 1977-05-18 1980-10-21 Rhone-Poulenc Industries Process for extracting proteins from milk using silica and anion exchange resins
NL8204923A (nl) 1982-12-21 1984-07-16 Stichting Nl I Zuivelonderzoek Werkwijze voor het bereiden van een precipitaat van caseine en wei-eiwit alsmede aldus bereid precipitaat.
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
FR2632524B1 (fr) 1988-06-09 1992-03-13 Fondation Nale Transfusion San Procede de preparation d'une fraction concentree en facteur viia et son application a titre de medicament
DE4028800A1 (de) 1990-09-11 1992-03-12 Behringwerke Ag Gentechnische sialylierung von glykoproteinen
US6984772B1 (en) 1994-02-18 2006-01-10 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Transgenic non-human mammals producing fibrinogen in their milk
US5997864A (en) * 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
FR2677652B1 (fr) 1991-06-12 2005-05-27 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation d'une proteine d'interet dans le lait d'un animal transgenique, produit obtenu et cellule eucaryote utilisee.
FR2684999A1 (fr) * 1991-12-16 1993-06-18 Aquitaine Dev Transf Sanguine Procede de fabrication d'un concentre de facteur vii active de haute purete essentiellement depourvu des facteurs vitamine k dependants et des facteurs viiic et viiicag.
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9408717D0 (en) 1994-05-03 1994-06-22 Biotech & Biolog Scien Res DNA sequences
US6713662B1 (en) 1994-07-27 2004-03-30 Pharming Intellectual Property B.V. Production of collagen in the milk of transgenic mammals
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US6268487B1 (en) * 1996-05-13 2001-07-31 Genzyme Transgenics Corporation Purification of biologically active peptides from milk
JP2001507215A (ja) * 1997-01-16 2001-06-05 サイテル コーポレイション 組換え糖タンパク質のインビトロでの実用的なシアリル化
US6183803B1 (en) 1999-06-11 2001-02-06 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method for processing milk
EP1252184B1 (en) 2000-01-31 2008-01-02 Pharming Intellectual Property B.V. Human c1 inhibitor produced in the milk of transgenic mammals
US7067713B2 (en) * 2000-01-31 2006-06-27 Pharming Intellectual Property B.V. C1 Inhibitor produced in the milk of transgenic non-human mammals
ES2325877T3 (es) 2000-02-11 2009-09-23 Bayer Healthcare Llc Moleculas de tipo factor vii o viia.
DE60141908D1 (de) 2000-10-02 2010-06-02 Novo Nordisk Healthcare Ag Glykoformen von faktor vii
DK1409538T3 (da) 2001-07-20 2009-04-14 Campina Bv Fremgangsmåde til opnåelse af vækstfaktor- (TGF-beta og IGF-1), lactoperoxidase- og immunoglobulinpræparater fra mælkeprodukter med lav indbyrdes krydskontaminering
US20040117862A1 (en) 2002-03-11 2004-06-17 Cooper Julian D. Production of high levels of transgenic factor VII with engineered stability and its therapeutic uses
FR2841747B1 (fr) 2002-07-02 2004-08-20 Cie Laitiere Europeenne Isolat de proteines de lait et procede pour sa preparation
US20040167320A1 (en) 2003-02-24 2004-08-26 Couto Daniel E. Methods of tangential flow filtration and an apparatus therefore
WO2005024006A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
WO2005089040A2 (en) 2004-03-23 2005-09-29 Chr. Hansen A/S Method of producing chymosin c and uses thereof
WO2005113604A2 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Hematech, Llc Methods for immunoglobulin purification
US20070292490A1 (en) 2004-06-25 2007-12-20 Valentin Negrouk Production of tissue factor in plants
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
FR2901796A1 (fr) 2006-05-31 2007-12-07 Lab Francais Du Fractionnement Procede d'extraction d'une ou de plusieurs proteines presentes dans du lait
FR2904558B1 (fr) 2006-08-01 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees"
FR2910786B1 (fr) 2006-12-29 2017-08-11 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies (Lfb) "procede d'extraction d'une proteine presente dans du lait"

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Glycoconjugate Vol.16:81-97 (1999) *
Glycoconjugate Vol.16:81-97 (1999)*
Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol.27(4):373-384 (2001) *
Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol.27(4):373-384 (2001)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20090311239A1 (en) 2009-12-17
CN103408655A (zh) 2013-11-27
KR20090031676A (ko) 2009-03-27
TW200817032A (en) 2008-04-16
CN101460189B (zh) 2013-10-30
EP2037955A2 (fr) 2009-03-25
AR061430A1 (es) 2008-08-27
TWI386221B (zh) 2013-02-21
US20140093491A1 (en) 2014-04-03
AU2007266952B2 (en) 2012-10-18
EP2037955B1 (fr) 2019-03-06
JP2009538885A (ja) 2009-11-12
FR2901707B1 (fr) 2017-09-29
ES2725081T3 (es) 2019-09-19
JP5943536B2 (ja) 2016-07-05
IL195184A (en) 2017-03-30
AU2007266952A1 (en) 2007-12-06
JP2015143247A (ja) 2015-08-06
US10364425B2 (en) 2019-07-30
US10344272B2 (en) 2019-07-09
IL240318A0 (en) 2015-09-24
FR2901707A1 (fr) 2007-12-07
IL225748A0 (en) 2013-06-27
WO2007138199A2 (fr) 2007-12-06
CN103408655B (zh) 2016-10-05
WO2007138199A3 (fr) 2008-01-17
CN101460189A (zh) 2009-06-17
JP2013177440A (ja) 2013-09-09
BRPI0710706A2 (pt) 2011-08-16
CA2820391A1 (en) 2007-12-06
IL195184A0 (en) 2011-08-01
TR201906038T4 (tr) 2019-05-21
JP6006823B2 (ja) 2016-10-12
CA2652496A1 (en) 2007-12-06
CA2652496C (en) 2017-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101312390B1 (ko) 각 인자 ⅶ 분자가 특정 글리칸 유닛을 가지는 두 개의 엔-당화 자리를 가지는, 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 조성물
KR101593494B1 (ko) 우유에 존재하는 하나 이상의 단백질을 추출하는 방법
KR101233630B1 (ko) 바이안테너리 비아시알릴화 및 비푸코실화된 형태의 다수의글리칸을 가지는 재조합 또는 형질전환 인자 ⅶ 화합물
FI3806891T3 (fi) Hyytymistekijä vii:n ja antifaktorien ix ja x bispesifisen vasta-aineen yhdistelmä

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant