CA2719459A1

CA2719459A1 - Lapins transgeniques producteurs de facteur vii humain

Info

Publication number: CA2719459A1
Application number: CA2719459A
Authority: CA
Inventors: Pierre-Jean Ripoll
Original assignee: Bioprotein Technologies SA
Current assignee: Bioprotein Technologies SA
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2009-10-01
Also published as: BRPI0822557A2; EP2271206A1; US20110059510A1; JP2011517562A; WO2009118460A1

Abstract

L'invention est relative à des lapins transgéniques, produisant du facteur VII humain dans leurs glandes mammaires. Le lait de ces lapins transgéniques est utilisable comme matière première pour la production de facteur VII humain recombinant.

Description

LAPINS TRANSGENIQUES PRODUCTEURS DE FACTEUR VII HUMAIN
La présente invention se rapporte à la production de facteur VII humain recombinant dans le lait de lapines transgéniques.
Le facteur VII est une protéine plasmatique impliquée dans le processus de la coagulation sanguine, et notamment dans l'initiation de la voie extrinsèque de coagulation. Le facteur VII, qui est une glycoprotéine vitamine K-dépendante, est synthétisé dans le foie sous forme d'un précurseur de 466 acides aminés comprenant un peptide signal (résidus 1-20) et un propeptide (résidus 21-60). Le facteur VII
circulant dans le plasma sanguin est un zymogène (ou proenzyme) constitué d'une chaîne peptidique de 53kDa contenant 406 résidus. Il résulte de plusieurs modifications post-traductionnelles :
le clivage du peptide signal et du propeptide, la gamma-carboxylation des dix premiers acides glutamiques N-terminaux en position 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 et 35, la (3-hydroxylation partielle de l'acide aspartique en position 63, la 0-glycosylation des sérines en position 52 et 60, respectivement par un motif glucose(xylose)0_2 et par un motif fucose, et la N-glycosylation des asparagines en position 145 et 322 par des structures complexes, majoritairement bi-antennées et sialylées. Le facteur VII est activé en facteur Vila par clivage protéolytique entre l'arginine en position 152 et l'isoleucine en position 153 : le facteur Vila est composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés dérivée de l'extrémité
N-terminale d'une masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de acides aminés dérivée de l'extrémité C-terminale d'une masse moléculaire d'environ 30 kDa, qui sont liées entre elles de manière covalente par un pont disulfure entre les cystéines en position 135 et 262.
Le facteur VII circulant peut se complexer avec le facteur tissulaire (FT) produit par les fibroblastes sous-endothéliaux, lorsque celui-ci est libéré à
l'occasion d'une brèche dans l'endothélium vasculaire. La formation de ce complexe s'accompagne de l'activation du facteur VII en facteur VIla. Le complexe TF-VIIa active les facteurs IX et X, entraînant la formation des facteurs IXa et Xa, qui activent à leur tour la conversion de la prothrombine en thrombine, qui permet la conversion du fibrinogène en fibrine, aboutissant à la formation du caillot.
Le facteur VIT/VIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour traiter des patients présentant différents troubles de l'hémostase (à titre d'exemple on citera l'hémophilie de type A qui correspond à un déficit en facteur VIII, l'hémophilie de type B
qui correspond à un déficit en facteur IX, ou des déficits héréditaires en facteur VII/VIIa),

2 ainsi que des accidents hémorragiques d'origines diverses comme par exemple les accidents vasculaires cérébraux, ou les traumatismes hémorragiques.
Initialement, les préparations de facteur VII utilisées ont été obtenues à
partir de plasmas humains. Cependant, du fait des difficultés de purification, des risques sanitaires associés à l'utilisation de produits dérivés du sang, et de la limitation des approvisionnements en plasma humain on leur préfère actuellement des préparations de facteur VII recombinant, produit par des cellules de mammifères transformées pour exprimer le facteur VII humain, comme décrit par exemple dans la Demande EP
0 200 421.
Une alternative à la production de protéines d'intérêt thérapeutique par des cultures de cellules transformées, est leur production par des animaux transgéniques, et notamment dans le lait de ceux-ci. Cette approche présente théoriquement de nombreux avantages, et notamment un rendement plus élevé, un coût de production plus faible que la production en cultures de cellules, et une montée en puissance de la production plus aisée et plus flexible au niveau industriel. Cependant, bien que la possibilité de produire dans du lait de souris transgénique une protéine recombinante, l'inhibiteur de plasininogène (tPA), possédant des propriétés biologiques similaires à celles de la protéine humaine native ait été démontrée il y a de nombreuses années (Gordon et al. Bio Technol, 5, 1183-7, 1987), le nombre de protéines qui ont pu être produites avec succès dans le lait d'animaux transgéniques dans des conditions compatibles avec le développement et la production industrielle d'un médicament à usage humain demeure encore très limité. En effet, de nombreux facteurs, propres d'une part à la protéine d'intérêt à exprimer, et d'autre part à
l'espèce hôte chez laquelle on souhaite l'exprimer, peuvent conditionner le succès ou l'échec pour une combinaison protéine d'intérêt/espèce hôte déterminée.
Parmi ces facteurs figure notamment la capacité de l'espèce hôte à
produire en quantité industrialisable, des protéines présentant des modifications post-traductionnelles similaires à celles de la protéine humaine native. Ce facteur est particulièrement critique si l'on envisage de produire sous forme recombinante dans le lait des protéines comme le facteur VII, dont les modifications post-traductionnelles sont multiples et variées (clivage du peptide signal et du propeptide, y-carboxylation, (3-hydroxylation, 0-glycosylation et N-glycosylation), et qui sont naturellement produites dans le foie. En effet, les cellules de la glande mammaire ont des capacités de modifications post-traductionnelles différentes de celles des cellules hépatiques.

3 Il a par exemple été observé que des souris transgéniques exprimant la protéine C humaine dans leurs glandes mammaires ne pouvaient pas effectuer correctement le clivage du propeptide et la y-carboxylation (Drohan et al.., Transgenic Res., 355-64, 1994). Des observations similaires ont été effectués chez des porcs transgéniques, pour la protéine C et pour le facteur IX (Lee et al., J
Biochem., 118, 81-7, 1995 ; Van Cott et al., Genet Anal., 15, 155-60, 1999).
D'autre part, la O-glycosylation et la N-glycosylation des protéines peut varier, qualitativement et quantitativement selon l'espèce de mammifères concernée. Ainsi, les protéines humaines ne comportent pas de motif galactosyl galactose a(1-3) galactose (motif Galal-3Gal), du fait que le gène codant pour l'alpha 1,3 galactosyltransférase, responsable de la synthèse de ce motif, est inactivé chez l'homme et les singes de l'Ancien Monde (Europe, Asie) alors qu'il est présent chez les autres mammifères.
Ce motif (également dénommé épitope a-Gal) est en conséquence très immunogène chez l'homme (GALILI et al., Blood, 82(8) : 2485-2493, 1993). Une protéine humaine glycosylée produite sous forme recombinante chez des mammifères possédant une alpha 1,3 galactosyltransférase active est donc susceptible de porter une quantité
importante de motifs Galal-3Gal et risque d'entrainer d'importantes réactions immunitaires indésirables.
Or, les Inventeurs ont maintenant trouvé que, de façon surprenante, des lapines transgéniques exprimant dans leurs glandes mammaires une séquence codant pour du facteur VII humain produisaient dans leur lait un facteur VII recombinant correctement clivé, et en outre ne contenant pas ou ne contenant que très peu de motifs Galal-3 Gal.
La présente invention a en conséquence pour objet un lapin transgénique exprimant un facteur VII humain dans son lait.
Un lapin transgénique conforme à l'invention contient dans son génome une ou plusieurs copies d'un transgène comprenant un polynucléotide codant pour un facteur VII humain, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur permettant son expression spécifique dans les cellules des glandes mammaires dudit lapin.
On entend par transgène une construction d'acide nucléique insérée de façon stable dans le génome d'un organisme hôte, qui se transmet à sa descendance de génération en génération. Dans le cas présent, le transgène permet l'expression d'une protéine d'intérêt (le facteur VII) dans le lait de l'animal-hôte transgénique.
Des promoteurs permettant l'expression spécifique dans les cellules de la glande mammaire du lapin sont connus en eux-mêmes. Il peut s'agir par exemple des

4 promoteurs de gènes de caséines ou de protéines sériques du lait : on citera notamment les promoteurs des caséines a, P, ou x, le promoteur de la (3-lactoglobine, le promoteur de l'a-lactalbumine, celui de la WAP (whey acidic protein), ou celui de la lactoferrine. Il peut s'agir d'un promoteur provenant du lapin, comme par exemple le promoteur de la WAP
décrit dans la Demande EP0527063, ou d'un promoteur provenant d'une autre espèce de mammifère.
Le polynucléotide codant pour le facteur VII humain est de préférence un ADNc, ou la portion codante (ORF) de celui-ci. Il peut s'agir de l'ADNc naturel du facteur VII, dont la séquence est connue en elle-même, et disponible sur les bases de données, par exemple sous le numéro d'accès M13232, ou d'une séquence codant pour un variant de facteur VII humain modifié notamment pour augmenter son activité et/ou supprimer ses effets indésirables ; à titre d'exemples on peut citer les variants décrits dans la Demande 2008/0010693 ou celui décrit dans la publication de Sorensen et al. (Br. J.
Haematol., 137(2) : 158-65, 2007).
On peut avantageusement utiliser une séquence d'ADN optimisée pour l'expression dans les glandes mammaires de lapines. Une telle séquence peut être obtenue in silico par des techniques bien connues par l'homme de l'art, afin d'éliminer les sites cryptiques d'épissage, les séquences riches en A/T, déstabilisatrices des ARNm, les sites de polyadenylation ainsi que les boites TATA potentiellement parasites, et les ilots CpG, et d'optimiser les codons pour refléter les préférences des cellules de la glande mammaire des lapines pour produire les protéines du lait.
Avantageusement le transgène contient, outre le promoteur et la séquence codant pour le facteur VII, d'autres éléments destinés à optimiser la transcription et/ou la traduction de la protéine recombinante. De tels éléments sont connus en eux-mêmes de l'homme de l'art (cf par exemple Houdebine et al., in: Carl A. Pinkert (ed), Vector Design for Transgene Expression Transgenic Animal Technology, 2nd edn, New York:
Academic Press., 419-458, 2002).
Il peut s'agir notamment :
- d'un isolateur fort, placé en 5' du promoteur, garantissant un niveau d'expression de la protéine dépendant du nombre de copies de transgène intégrées et indépendant du site d'intégration du transgène dans le génome de l'animal : on citera par exemple la région 5'HS4 du gène de la béta-globine de poulet (Taboit-Dameron et al., Transgenic. Res., 8 : 223-235, 1999; Rival-Gervier et al., Transgenic.
Res., 12 : 723-730, 2003).

- d'un ou plusieurs couples exon/intron pouvant contenir un /ou plusieurs amplificateurs (enhancer) de transcription ou de traduction : à titre d'exemples on peut citer : les introns des gènes tardif et précoce du génome du virus SV40, le premier intron d'un gène de beta-globine, les introns du gène EF1 alpha, les introns du gène de l'alpha-sl

5 caséine, les introns du gène WAP, les introns des gènes de l'hormone de croissance humaine et bovine ; les séquences enhancer peuvent notamment être choisies parmi celles présentes dans les séquences LTR du virus HTLV, ou du virus MMTV (virus de la tumeur mammaire murine), la séquence enhancer du gène des immunoglobines, la séquence enhancer du gène de l'alpha s-1 caséine, la séquence enhancer de la béta-globine. La séquence enhancer peut également être la région distale en amont (jusqu'à
140 kpb) du gène WAP ou la région distale en aval (au moins 10 kpb) du gène WAP, telles qu'elles sont décrites par Rival-Gervier et al. (Mol. Reprod. Develop., 63 :
161-167, 2002), dans la Demande EP 1 217 071 - un terminateur fort garantissant une terminaison efficace de la transcription : à titre d'exemples, on citera les terminateurs des gènes précoce ou tardif du virus SV40, ceux des gènes de béta-globine, des gènes WAP, des gènes de l'hormone de croissance humaine ou bovine.
La transgénèse peut s'effectuer par les méthodes classiques connues en elles-mêmes. Avantageusement, le transgène est introduit par microinjection dans les pronucléi d'embryons fécondés qui sont ensuite réimplantés chez des femelles porteuses.
L'obtention des animaux transgéniques est également possible par clonage par transfert de noyau suivi par transfert d'embryon dans des femelles receveuses.

La présente invention a également pour objet le lait produit par les lapines transgéniques conformes à l'invention, et l'utilisation de ce lait en tant que matière première pour la purification de facteur VII humain recombinant.
Le facteur VII humain recombinant peut être purifié à partir de ce lait par des méthodes connues en elles-mêmes, par exemple comme décrit dans le Brevet US
6268487.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant l'obtention de lapines transgéniques exprimant le facteur VII dans leur lait.
EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UN VECTEUR DE TRANSGENESE
CONTENANT LA SEQUENCE CODANT POUR LE FACTEUR VII HUMAIN.

6 Clonage de l'ADNc du facteur VII par PCR dans un vecteur intermédiaire Une séquence d'ADN codant pour le facteur VII humain, bordée des sites de restrictions uniques Mlul en position 5' et NheI en position 3', a été synthétisée et clonée dans un vecteur plasmidique dérivé du plasmide pUc, contenant le gène de résistance à l'ampicilline ainsi que l'origine de réplication bactérienne Col El.

Vecteur de transgénèse Le vecteur de transgénèse utilisé pour le clonage est dérivé du plasmide pPolyllI, possédant un gène de résistance à l'ampicilline ainsi que l'origine de réplication bactérienne Col El. Ce vecteur de transgénèse contient une cassette d'expression comprenant : un dimère de la séquence de l'isolateur 5'HS4 du gène de la béta-globine de poulet (Genbank U78775) (Recillas-Targa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 10 :
6883-6888, 2002) en amont du promoteur WAP (whey acidic protein ; Genbank X52564) de lapin de 6,3 kpb (Rival-Gervier et al., Transgenic Res., 6 :723-730, 2003), le premier intron du gène de beta-globine de lapin (Genbank V00882) contenant un amplificateur de transcription ; un second amplificateur de transcription (SUR 1.2.3) contenant la séquence 5'UTR des gènes précoces de SV40 fusionnée avec la région R et le début de la région U5 de HTLV-1 (Attal et al.. FEBS Lett. , 392, 220-224, 1996); un troisième amplificateur de transcription (Ig 2), dérivé de la région mu de la chaîne lourde d'IgG de souris (Genbank J00440) (Gillies et al.. Cell 33, 717-728, 1983) et le terminateur de transcription de l'hormone de croissance humaine (Genbank M13438). Cette cassette contient un site MluI
et un site NheI localisés entre le second et le troisième amplificateur de transcription ; elle est flanquée de part et d'autres de sites Notl permettant l'excision des séquences du plasmide pPolyllI.
L'insert d'ADN codant pour le facteur VII, récupéré par digestion Mlul/NheI à partir du vecteur intermédiaire a été inséré entre les sites Mlul et NheI de la cassette d'expression.
Le vecteur de transgénèse résultant est représenté sur la Figure 1. Il contient un insert qui est constitué dans son orientation 5' vers 3' par i) le dimère de la séquence de l'isolateur 5'HS4 du gène de la béta-globine de poulet, ii) le promoteur WAP
(whey acidic protein) de lapin de 6,3 kpb, iii) l'intron contenant le premier amplificateur de transcription, iv) le second amplificateur de transcription, v) l'ADNc du facteur VII
humain, vi) le troisième amplificateur de transcription, et vii) le terminateur de transcription.

7 Comme précédemment, les colonies contenant le vecteur recombinant sont sélectionnées sur la base de leur résistance à l'ampicilline, puis la présence de l'insert est contrôlée par analyse des fragments de restrictions, puis par séquençage.
EXEMPLE 2: PRODUCTION DE LAPINES TRANSGENIQUES EXPRIMANT LE
FACTEUR VII HUMAIN DANS LEURS GLANDES MAMMAIRES
Les lapines transgéniques ont été obtenues par la technique classique de micro-injection (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82 : 4438-4442, 1985).
Préparation des inserts pour la transgenèse Le vecteur de transgènese contenant la séquence codant pour le facteur VII recombinant a été digéré par l'enzyme de restriction Notl et l'insert contenant le transgène a été isolé sur gel d'agarose puis purifié sur ElutipD (Schleicher-Schuell, Ecquevilly, France) conformément aux instructions du fabricant, précipité à
l'éthanol puis repris dans un tampon 10 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.4.
Préparation des lapines donneuses et receveuses Des lapines Néo-zélandaises donneuses d'embryons, âgées de 16-30 semaines, sont traitées de manière sous-cutanée pendant 3 jours par de la FSH
porcine (Follicular Stimulating Hormone) pour stimuler le développement folliculaire.
Au troisième jour, les lapines reçoivent une injection intraveineuse d'hormone hCG (human Choroidic Hormone), puis les femelles sont accouplées.
Les lapines receveuses sont âgées de 18-20 semaines. Une pseudogestation synchronisée est induite soit en gardant les femelles une semaine en cycle de jours longs (16 h de lumière) avant de les accoupler avec des mâles vasectomisés, soit par un traitement hormonal (superovulation FSH/LH).
Micro-injection des oocytes prélevés et implantation Au 4ème jour, 18-19h après l'accouplement, les embryons sont prélevés sur les lapines donneuses pour procéder à la micro-injection d'ADN : la micro-injection d'ADN se déroule juste après les prélèvements (15-25 h après l'accouplement).
Les embryons au stade une cellule sont placés dans une micro-goutte de milieu sous un microscope inversé équipé d'objectifs Normarsky et de micro-manipulateurs. Des embryons individuels sont positionnés et sécurisés en utilisant une pipette.
Le transgène dilué à une concentration pouvant varier de ing/ l à 6ng/ l, dans du tampon 10 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 est micro-injecté préférentiellement dans le pronucléus mâle de l'embryon à l'aide d'une pipette d'injection.

8 Suite à la micro-injection, les embryons sont maintenus en culture in vitro pendant 1 à 5 h (35 à 40 C, 3 à 7% C02 dans l'air). La qualité des embryons micro-injectés est alors rapidement évaluée sous stéréomicroscope. Les embryons unicellulaires intacts sont alors réimplantés sous anesthésie générale dans le lumen des oviductes des lapines receveuses synchronisées (10 embryons dans chaque oviducte), en utilisant une procédure chirurgicale (les oviductes sont extériorisés par laparotomie). La parturition peut intervenir naturellement 29-31 jours après le transfert d'embryons. Si nécessaire, on procède au déclenchement par injection d'ocytocine le 31ème jour. Le nombre de lapereaux nés par rapport au nombre d'embryons réimplantés est de l'ordre 5 à
20%.
EXEMPLE 3: SELECTION ET CARACTERISATION DES LAPINS
TRANSGENIQUES
Pendant le processus d'embryogenèse, l'ADN recombinant micro-injecté
intègre le génome de manière aléatoire. Les lapins nouveau-nés (10 jours) sont testés pour la présence du transgène par une biopsie de l'oreille. L'ADN génomique est extrait et une analyse PCR (Polymerase Chain Reaction) est réalisée en utilisant des amorces spécifiques de l'insert recombinant.
Les lapins pour lesquels le transgène a été mis en évidence sont appelés "Fondateurs F0".
Les lignées des fondateurs FO ont été en outre caractérisées par i) analyse du nombre de copies de transgène intégrées dans leur génome, et ii) détermination du nombre de sites d'intégration.
Le nombre de copies du transgène intégrées dans le génome de chaque lignée de fondateur FO a été déterminé par PCR quantitative et par transfert de Southern.
Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 copie par cellule à plus de 200 copies par cellule Le nombre de sites d'intégration a également été déterminé par transfert de Southern. Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 à plus de 5 sites par génome.
EXEMPLE 4: EVALUATION DE L'EXPRESSION DE FACTEUR VII HUMAIN
RECOMBINANT DANS LE LAIT DES LAPINES TRANSGENIQUES
Les lapins FO matures sexuellement (4 mois pour les femelles, 5 mois pour les mâles) ont été croisés avec des animaux non-transgéniques par insémination artificielle afin d'obtenir des descendants F1 hémizygotes, et le niveau d'expression du facteur VII humain dans le lait a été évalué pour différentes lignées de fondateurs FO et de descendants F1.

9 Pour ce faire, un échantillon de lait provenant de chacune des femelles FO et F1 sélectionnées a été centrifugé à 5000 x g pendant 20 minutes à 4 C
afin de séparer les composés du lait des matières grasses. Un échantillon de lait écrémé a été
dilué dans un tampon Laemmli, porté à ébullition pendant 5 minutes, puis séparé par électrophorèse en gel SDS-PAGE. Les protéines ont alors été transférées sur membranes PVDF, puis une analyse par Western blot a été réalisée en utilisant un anticorps anti-facteur VII humain. La détection a été effectuée par chimioluminescence (Amersham Biosciences) afin de déterminer la concentration en facteur VII humain pour chacun des laits obtenus. Un niveau d'expression du facteur VII variant entre 90 gg/ml et 11 mg/ml a été
observé.
L'influence du nombre de copies du transgène sur le niveau d'expression a également été recherchée. Les résultats sont illustrés par la Figure 2, et montrent une corrélation entre le nombre de copies de transgène et le niveau d'expression du facteur VII
dans le lait des animaux transgéniques

Claims

1) Lapin transgénique, caractérisé en ce qu'il contient dans son génome une ou plusieurs copies d'un transgène comprenant un polynucléotide codant pour le facteur VII humain, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur permettant son expression spécifique dans les cellules des glandes mammaires dudit lapin.

2) Lait d'un lapin transgénique selon la revendication 1.

3) Utilisation de lait de lapin transgénique selon la revendication 2 comme matière première pour la production de facteur VII humain recombinant.