TWI394534B - 萃取存在於乳汁中一或多種蛋白質之方法 - Google Patents

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Description

萃取存在於乳汁中一或多種蛋白質之方法
本發明係有關一種萃取存在於乳汁中之至少一種蛋白質之方法，該蛋白質對該乳汁之經錯合之鈣離子或未經錯合之鈣離子具有親和力。
於本發明之內文中，經錯合或未經錯合之鈣離子係指結合至酪蛋白俾便形成酪蛋白之膠束膠體結構之磷酸鈣鹽，或係有關未結合至酪蛋白因此為自由態之磷酸鈣鹽。此種經錯合或未經錯合之鈣離子也可為可溶於乳汁中，與前文說明不同之鈣鹽及/或有機鈣錯合物及/或無機鈣錯合物。對乳汁之鈣離子具有親和力之蛋白質表示天然存在之蛋白質，諸如乳白蛋白類、乳球蛋白類及免疫球蛋白類。此等蛋白質也表示存在於基因轉殖動物之乳汁中之重組蛋白質，例如凝血因子特別為第VII因子、第VIII因子及第IX因子。
市售藥劑的主要部分係與合成所得之化學物質相當。實際上，至目前為止，近代醫藥高度仰賴藉化學合成所製造的藥劑來治療疾病或診斷疾病。
但蛋白質表示載有生物資訊之分子的相當大部分。多種奇數類、生長因子類、凝血因子類或抗體類尤為如此。
大致上，蛋白質為基於胺基酸之聚合物，大部分具有高分子量，蛋白質無法以一般可接受的成本藉化學合成獲得。此種治療用蛋白質通常係有例如活有機體、人類或動物的組織或血液分離及純化。以萃取自豬胰臟之胰島素、萃取自血漿之凝血因子諸如第VIII因子或第IX因子或免疫球蛋白尤為如此。
雖然前述蛋白質之製造方法目前大量使用，但皆有其缺點。萃取自血小板之若干蛋白質諸如紅血球生成素之含量低無法以充分數量分離來滿足目前不斷增加的治療需求。此外，於人類血漿中存在有病毒、普利子(prions)或其它病原劑，於血漿蛋白的製造步驟中，需要含括額外的病毒去活化步驟及/或病毒去除步驟，來獲得治療上有用的產品。
為了克服此等缺點，使用基因工程技術，基因工程技術也大量用於從離體基因合成蛋白質，基因轉移入細胞內，細胞負責該感興趣之蛋白質的分泌。此種由原先細胞系統外側所得的蛋白質稱作為「重組體」。
根據此項技術，可使用不同的細胞系統。
大半使用細菌系統例如大腸桿菌(E.coli)且有效。細菌系統允許以低成本製造重組蛋白質。但細菌系統限於製備單純未經糖化之蛋白質，無需繁複的摺疊程序。
真菌系統同等可用於製造分泌的蛋白質。真菌系統之缺點在於真菌系統於轉譯後修改的起點，例如包含接枝聚糖部分及硫酸根，高度影響所製造之蛋白質之藥力學性質，特別藉加入多個甘露糖衍生物之基團而影響藥力學。
使用棒狀病毒(baculovirus)之系統也允許製造極為不同的蛋白質，諸如疫苗蛋白質和生長激素，但棒狀病毒應用於工業規模並未最佳化。
也曾經使用哺乳動物細胞培養來製備重組複體蛋白質，諸如單株抗體。細胞表現系統可獲得正確摺疊及經修改之重組蛋白質。比較製造成本，此種方法之產率低為其重大缺點。
此等細胞系統之變化法包含進行基因轉殖植物來大量獲得蛋白質。但此種系統產生植物特異性轉譯後修改，特別對所製造的蛋白質加入具有高度免疫原性木糖殘基，因而限制其用於治療用途。
前述細胞系統之替代之道包含使用基因轉殖動物來製造重組疫苗或複體治療蛋白質。如此所得蛋白質具有接近於人類的糖化作用，且摺疊正確。此等複體蛋白質不僅包含一個簡單多胜肽鏈，諸如生長激素，同時於胺基酸組裝之後也以不同方式修改，特別藉特殊裂解、糖化、及羧甲基化而修改。大部分情況下，修改無法藉細菌細胞或酵母菌進行。另一方面，基因轉殖動物允許將細菌細胞系統所遭遇的表現程度與利用細胞培養所得之轉譯後修改組合，同時比較細胞表現系統的使用可降低成本。
於得自基因轉殖動物之生物材料中，乳汁為硏究主題，結果將乳汁視為極為令人滿意之重組蛋白質之分泌來源。
由基因轉殖動物之乳汁所製造之重組蛋白質容易經由將感興趣的蛋白質編碼基因接枝至負責乳蛋白的合成的基因之一之調節區獲得，該調節區將特別指導於乳腺中的合成結果導致分泌入乳汁內。
舉例言之，申請案EP 0 527 063說明於基因轉殖動物之乳汁製造感興趣之蛋白質，該感興趣之蛋白質之編碼基因的表現係由乳清蛋白之啓動子控制。
其它專利申請案或專利案說明於基因轉殖哺乳動物之乳汁製備抗體(EP 0 741 515)、膠原蛋白(WO 96/03051)或人第IX因子(US 6 046 380)及第VIII因子/因子凡威樂班(von Willebrand)複體(EP 0 807 170)。
儘管此等方法就蛋白質之表現而言可獲得滿意的結果，但使用乳汁作為重組蛋白質之來源有其缺點。主要缺點一方面在於以滿意的產率由牛奶中之萃取困難，另一方面在於隨後的純化困難。
確實，乳汁是一種主要由90%水所組成之混合物，包含多項成分，可分成三大類。第一類稱作為乳血清(或稱作為乳清)係由葡萄糖苷、可溶性蛋白質、礦物質及水溶性維生素所組成。第二類別稱作為脂相(或乳酪)含有呈乳液形式之脂肪。第三類別稱作為蛋白質相係由約80%酪蛋白所組成，該蛋白質相於pH 4.6或於凝乳酶、酵素催化劑的作用之下，於鈣存在下整體形成可沈澱之蛋白質。不同的酪蛋白形成膠體膠束複體，可達到約0.5微米直徑，具有磷酸鈣鹽例如出現呈磷酸三鈣聚積體(「簇狀物」)形式，亦即Ca9 (PO4 )6 。此等膠束係由酪蛋白亞單位所形成，酪蛋白亞單位包含酪蛋白－－豐富親水層環繞一個疏水孕核，磷酸鈣鹽藉靜電交互作用而結合至親水層上。此等磷酸鈣鹽也存在於膠束內部，而未結合至酪蛋白。此等蛋白相也含有可溶性蛋白，諸如乳白蛋白類及乳球蛋白類及由血液所得之白蛋白類及免疫球蛋白類。
依據分泌入基因轉殖動物的乳汁中之重組分泌蛋白質的本質而定，蛋白質可存在於乳清或存在於蛋白質相，甚至同時存在於二者。各類別乳汁成分的豐富性及複雜程度因而造成更難以萃取此種蛋白質，特別當此種蛋白質被捕陷於酪蛋白的膠束內部時特別難以萃取。另一項困難在於此種蛋白質是否存在有二相中之任一相無法確切預知。
重組蛋白質也對呈鹽形式及/或多種複體形式可在於乳汁中之鈣離子，或酪蛋白膠束之磷酸鈣鹽的鈣離子具有親和力。此等親和力係由蛋白質與二價鈣陽離子間之靜電鏈結表現。蛋白質/鈣離子親和力允許定義親和常數，親和常數依據數值而定可決定結合強度。一般而言，對鈣離子具有親和力之大部分蛋白質係結合至膠束的磷酸鈣鹽。其萃取需要進行複雜的步驟充滿了實際執行及/或產量上的問題。
酪農業傳統用來分離蛋白質的解決之道，包括巴氏滅菌法，接著為酵素凝結或酸性沈澱(pH 4.6)，此等傳統解決辦法無法應用於此種情況，原因在於於溫度及pH的組合影響之下，重組蛋白質經常變性。此外，蛋白質捕陷於酪蛋白膠束，結果導致萃取產率低。額外解決之道包含藉過濾、離心及/或澱積或沈澱技術進行乳汁之物理萃取方法，此種解決之道也導致萃取產率無法為人所接受，以及導致所萃取的重組蛋白質之純度差。
文件EP 0 264 166說明期望之蛋白質分泌物基因轉殖動物的乳汁。此種蛋白質由乳汁中之純化步驟並未於該文件中作說明。
美國專利案4 519 945說明一種重組蛋白質之萃取方法，經由由乳汁製備酪蛋白沈澱及乳清沈澱，如前述進行酸化步驟及加熱步驟。此種方法造成感興趣蛋白質活性的顯著損耗且萃取產率低。
美國專利案6 984 772揭示一種由基因轉殖哺乳動物的乳汁純化重組纖維蛋白原之方法。此種方法包括藉連續離心分離得自酪蛋白丸粒之乳清及蛋白質相之步驟。乳清當儲存供隨後之加工處理時，乳清分離，獲得經純化之纖維蛋白原溶液。
但該方法無法應用於捕陷於酪蛋白膠束內及/或酪蛋白膠束上之重組蛋白質的製造，讓血漿凝血因子諸如第VII因子、第VIII因子及第IX因子獲得滿意的產率。
專利申請案WO 2004/076695說明由基因轉殖動物乳汁過濾重組蛋白質之方法。本方法包括澄清乳汁之第一步驟，該步驟包含去除乳汁成分，獲得容易通過具有孔徑0.2微米直徑之過濾膜過濾之溶液。此步驟結果導致酪蛋白膠束的去除。結果若酪蛋白膠束傾向於含有感興趣之蛋白質捕陷於其結構內部，則就產率而言禁止進行本步驟。
美國專利案6 183 803說明一種由乳汁分離自然存在於乳汁中之蛋白質諸如乳白蛋白類、及重組蛋白質例如人白蛋白或α1－抗胰蛋白酯之方法。此種方法包含包含感興趣蛋白質之乳汁與螯合劑接觸之第一步驟。如此產生酪蛋白膠束的破壞，導致澄清的乳清，包含酪蛋白、乳清蛋白及感興趣之蛋白。該方法進一步包含經由於液體介質(經過澄清的乳清)添加二價陽離子之不溶性鹽來重新結構化酪蛋白膠束之步驟。此等膠束沈澱，結果導致包含未被捕捉於膠束內之感興趣之蛋白質之液相，原因在於鹽飽和酪蛋白之靜電鍵聯位置。根據此種方法，感興趣之蛋白質之分離最終係經由膠束之再度結構化及沈澱進行。
此種方法進行上複雜，無法應用於對鈣離子有相對高度親和力之蛋白質。凝結蛋白質，特別以置於維生素K作用之下所合成的蛋白質歸屬此類。
始於以下兩項觀察，分泌入基因轉殖動物乳汁中之若干類別重組蛋白質存在於乳清，該蛋白質之分離及純化方法產率極低，以及觀察到其它被捕陷於酪蛋白膠束內之蛋白質類別之分離及純化方法之進行上複雜，本案申請人致力於提供一種由乳汁中萃取乳汁組成蛋白，包括天然蛋白或非天然蛋白諸如重組第VII因子、第VIII因子及第IX因子之方法，該方法對乳汁之鈣離子形式有親和力，實際實施簡單，此外獲得滿意的製造產率，同時仍然保有蛋白質之生物活性。
如此本發明係有關一種萃取存在於乳汁中之至少一種蛋白質之方法，該蛋白質對該乳汁之經錯合之鈣離子或未經錯合之鈣離子具有親和力，該方法包含下列步驟：a)經由該乳汁與可溶性鹽接觸獲得鈣化合物之沈澱來釋放出蛋白質，該可溶性鹽之陰離子係就其於此種介質中可形成不溶性鈣化合物之能力作選擇，俾便藉此方式獲得蛋白質豐富之液相，b)由該鈣化合物沈澱中分離該蛋白質豐富之液相，此外該液相進一步分離成脂相及包含蛋白質之非油脂水相，以及c)回收該包含蛋白質之非油脂水相。
申請人出乎意外地發現添加可溶性鹽(該鹽之陰離子經選擇而可於含有蛋白質特別為重組蛋白質之乳汁中形成鈣化合物沈澱)其對經錯合之鈣離子或未經錯合之鈣離子具有親和力，具有鈣離子之固定位置，允許沈澱鈣化合物；而感興趣之蛋白質則由此等經錯合之離子或未經錯合之離子釋放，再度出現於液相的溶液中。
如前文說明，經錯合的鈣離子或未經錯合的鈣離子表示可溶解於乳汁之不同的有機及/或無機鈣鹽及/或鈣錯合物。此等鹽或錯合物可存在於酪蛋白膠束之內部容積(參考後文有關第1圖之說明)。
此等鈣離子也表示磷酸鈣鹽與酪蛋白膠束交互作用，特別呈聚積體(「簇狀物」)形式。此等鹽類也以磷酸一鈣及/或磷酸二鈣形式存在於組織，依據化學反應及生化反應而定，磷酸一鈣及磷酸二鈣係與其它鈣離子形式平衡。
最後，此等鈣離子表示鈣/酪蛋白錯合物，換言之，表示藉靜電交互作用與磷酸鈣鹽連結之酪蛋白之亞單位。此等鈣/酪蛋白錯合物也係指與磷酸鈣鹽及與可溶性鈣鹽及/或有機及/或無機鈣錯合物相關聯之酪蛋白膠束。
不溶性鈣化合物係指鈣鹽或鈣錯合物，其於乳汁之溶解度係低於0.5%。
大部分情況下，感興趣之蛋白質大部分係與酪蛋白膠束之磷酸鈣鹽結合。
如此，對經錯合或未經錯合鈣離子具有親和力之蛋白質係指對鈣離子有足夠的固定位置數目俾便與鈣離子全部或部分結合，或與酪蛋白膠束之磷酸鈣鹽全部或部分結合之任一種蛋白質。
舉例言之，於感興趣蛋白質具有多個鈣離子固定位置例如8至10個GLA部位區域(GLA部位區域為富含γ－羧基麩胺酸，允許固定鈣鹽之領域)之情況下，至少70%至90%感興趣之蛋白質被捕捉於酪蛋白膠束內及/或上。對其它具有較少個鈣離子之固定位置例如2至8個GLA部位區域之其它蛋白質，至少30%至60%被捕陷於酪蛋白膠束內及/或膠束上。最後，即使極少有鈣離子固定位置例如0至2個GLA部位區域之蛋白質，也可能被捕陷於酪蛋白膠束內及/或上，例如以至少5%至高達20%之比率被捕陷。此種蛋白質之捕陷量對於以產業規模來實作該方法時無法忽略，暗示所能達到的最高可能產率。未捕陷於膠束內及/或膠束上之其餘感興趣之蛋白質對前述乳汁中的其它鈣離子形式具有親和力。
結果，本發明方法可應用於其中至少2%至10%，或至少40%至60%，或特別至少90%蛋白質係與此等鈣離子結合之蛋白質的萃取。
此種蛋白質對鈣離子之親和力係來自於未經改性蛋白質的交互作用，或於活體內或試管內經改性蛋白質例如藉後轉譯修改之蛋白質的交互作用。
如此，蛋白質有多個經錯合或未經錯合之鈣離子之固定位置的可與存在於乳汁中之不同形式之鈣結合。
不欲受觀察得之機轉之任何解譯所限，申請人假設添加可溶性鹽可異位膠束之磷酸鈣鹽的平衡，特別為異位鈣/磷比，如此造成其摧毀以及酪蛋白亞單位聚集體的沈澱。與捕陷於膠束內及/或膠束上之磷酸鈣鹽相結合之感興趣的蛋白質於摧毀期間釋放入介質內。此外，由於此等沈澱於本發明方法所使用之可溶性鹽的影響之下，呈不溶性鈣化合物沈澱，故感興趣之蛋白質也由磷酸鈣鹽中釋放或解離。同理，感興趣之蛋白質也與可溶性有機鈣及/或無機鈣鹽或錯合物結合，蛋白質也藉同類型反應解離。
此種機轉之實例舉例說明於第1圖。
於本發明之架構中，可溶性鹽表示任一種可獲得期望的效果之鹽。
本發明方法所使用之可溶性鹽可以熟諳技藝人士所選用之濃度添加至乳汁，來達成與鈣離子交互作用之蛋白質的釋放。如此濃度需要足夠允許釋放至少20%，或較佳至少30%至50%感興趣之蛋白質。於特佳方式要求濃度足夠允許分離至少60%至80%或至少90%感興趣之蛋白質。
此外，本發明方法也可應用於蛋白質，該蛋白質其中只有部分具有鈣離子之固定位置。例如，本發明方法可應用於萃取乳汁所含之蛋白質，其中1%係與鈣離子結合。此等方法也可應用於其中至少2%至10%或至少40%至60%，或特別至少90%係與此等鈣離子相結合之蛋白質。
本發明方法特別允許酪蛋白亞單位之聚積體沈澱。如前文說明，沈澱係由於酪蛋白膠束的摧毀。本發明方法之實作藉沈澱造成乳汁膠體狀態的介穩化。
結果，本發明方法為允許乳汁由膠體態轉成液態之程序，係與直接萃取膠體/液體相對應。
本發明方法也允許獲得乳清及脂相，著色比起始乳汁的著色更淺。實際上此等為將其白色提供予乳汁之酪蛋白。一旦沈澱時，則不再能將其色彩提供予乳汁。
因此本發明方法有數項優點：第一，極為容易實作，由於利用簡化實作而允許感興趣之蛋白質的分離。此外允許以極佳產率回收非油脂水相中之感興趣的蛋白質。較佳，本發明之萃取方法可獲得至少50%或至少60%或至少80%產率。於特佳方式中，產率至少為90%。
本方法也將允許以進一步純化步驟，特別藉層析術，獲得包含呈可相容形式之感興趣之蛋白質之非油脂水相。
最後，感興趣之蛋白質仍然具有生物活性，原因在於本發明之方法之步驟係於不會變更蛋白質之生物活性之pH進行。pH較佳為鹼性，例如約8。
根據本發明之可溶性鹽係指於乳汁之溶解度至少為每份乳汁至少0.5份鹽(w/w)之鹽。
較佳，該方法所使用之可溶性鹽為磷酸鹽。鹽可呈水性溶液添加至乳汁，或可呈粉末形式直接添加至乳汁。
較佳，磷酸鹽係選自於由磷酸鈉、磷酸鋰、磷酸鉀、磷酸銣及磷酸銫所組成之組群，特別為磷酸鈉。
另外，用於實作本發明方法之可溶性鹽可為鹼金屬草酸鹽，特別草酸鈉或草酸鉀或鹼金屬碳酸鹽特別為碳酸鈉或碳酸鉀或其混合物。
較佳於實作本發明所製備之水溶液中之可溶性鹽濃度為100 mM至3 M，更佳為200 mM至500 mM，及特別為200 mM至300 mM。
如此，根據本發明之較佳實施例，本發明之可溶性鹽為磷酸鈉，其於水溶液之濃度係於100 mM至3 M，更佳為200 mM至500 mM，及特別為200 mM至300 mM。
含有欲萃取之感興趣之蛋白質之乳汁可為生非脫脂乳或脫脂乳。本發明方法應用於脫脂乳之優點在於其脂質含量低。該方法也可應用鮮乳或冷凍乳。
步驟b)允許於脂相中之液相及包含蛋白質之非脂液相的分離，分離較佳係藉離心進行。非脂水相同化成為乳清。此分離步驟也允許分離酪蛋白膠束亞單位之聚積體與鈣化合物沈澱。
包含蛋白質之非脂水相係由脂相分離。
此步驟更優異地允許獲得澄清非脂水相。
此外，於步驟c)之後，該方法包含於具有遞減孔隙度(較佳為1微米接著為0.45微米)之過濾器上連續進行非脂水相之過濾步驟。此等過濾器之使用，諸如基於玻璃纖維之過濾器之使用，允許自然存在於乳汁中之仍然存在的脂質、脂肪小球及磷脂的含量降低。小於0.5微米之孔隙度允許維持非脂水相之細菌學品質，以及後來實作之純化撐體(超濾器、層析管柱等)(參見後文)。脂相較佳經此等過濾器過濾，該等過濾器可完全保留乳汁之脂肪小球，濾液為澄清。
此步驟接著為濃縮/藉超濾透析之步驟。
濃縮允許縮小非脂水相的體積來保藏非脂水相。超濾膜係由熟諳技藝人士依據感興趣之蛋白質之特性選擇。大致上，孔徑係小於或等於感興趣之蛋白質之分子量之孔隙度極限，允許濃縮產物而未造成顯著損耗。舉例言之，孔徑為50 kDa之過濾膜允許濃縮而不損失具有分子量為50 kDa之FVII。
透析意圖調理蛋白質水相供可能之進一步純化步驟，特別為藉層析純化。透析也可去除小分子量成分諸如乳糖類、鹽類、胜肽類、蛋白朊類蛋白腖類及可能有害產品的保藏之任一種作用劑。
較佳透析緩衝液為0.025 M－0.050 M磷酸鈉溶液pH 7.5－8.5。
於步驟c)之後所得之非脂水相，或視情況而定於過濾及/或濃縮/透析步驟後所得之水相可於－30℃溫度冷凍及儲存至進一步純化步驟。
本發明方法允許藉此方式萃取，視情況而定，可由蛋白質透過靜電交互作用所結合之乳汁之鈣離子中，分離一種或多種感興趣之蛋白質。
蛋白質可為天然存在於乳汁之蛋白質，例如表示β－乳球蛋白、乳鐵蛋白、α－乳白蛋白、免疫球蛋白類或蛋白朊類蛋白腖類或其混合物。
蛋白質也可為非天然存在於乳汁之蛋白質。例如第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、α－1－抗胰蛋白酶、抗－凝血酶III、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓磷脂鹼性蛋白、前胰島素、胞質素原組織活化因子及抗體。
如此，根據本發明之較佳實施例，含有感興趣之蛋白質之乳汁為基因轉殖乳。
實際上，非自然存在於乳汁之蛋白質可藉非人基因轉殖哺乳動物，利用重組DNA技術及基因轉殖而於該非人基因轉殖動物體內合成。
此等技術為熟諳技藝人士眾所周知，允許於基因轉殖動物乳汁合成任一種感興趣之蛋白質。
此種蛋白質為重組蛋白或基因轉殖蛋白，此二術語於本案須視為同義字，重組蛋白或基因轉殖蛋白係藉重組DNA技術合成。
「基因轉殖動物」係指其基因體內接合外源性DNA片段，特別為編碼感興趣之蛋白質之DNA片段之任何非人動物，此種動物可表現外源DNA編碼之蛋白質，且可傳遞外源DNA予其子代。
如此，任一種非人哺乳類適合製造此種乳汁。
較佳可使用雌兔、綿羊、山羊、牛、豬及小鼠，但此表列並非限制性。
乳腺分泌感興趣之蛋白質，允許將該蛋白質分泌入基因轉殖哺乳類的乳汁，暗示可以組織相依性方式控制重組蛋白質的表現。
此種控制方法為熟諳技藝人士眾所周知。由於其序列允許朝向動物的特定組織表現蛋白質，故可進行表現的控制。此等序列特別為啓動子序列及胜肽信號序列。
熟諳技藝人士已知之啓動子為WAP啓動子(乳清酸性蛋白)、酪蛋白啓動子、β－酪蛋白啓動子、β－乳球蛋白啓動子，本表列並非限制性。
一種於基因轉殖動物乳汁中製造重組蛋白質之方法包括下列步驟：合成DNA分子包含編碼感興趣之蛋白質之基因。此基因係於自然分泌於乳汁中之蛋白質之啓動子的控制之下，此基因整合於非人哺乳類之胚胎。隨後胚胎置於同種雌性哺乳動物體內，長成基因轉殖動物。一旦本主題經過充分開發，則可誘導哺乳動物泌乳，其次收集乳汁。乳汁含有該感興趣之重組蛋白質。
於人以外之雌性哺乳動物乳汁中之蛋白質之製法之實例係說明於文件EP 0 527 063，其教示係述及本發明之感興趣之蛋白質之製造。
含有WAP啟動子植體係經由將包含WAP基因之啓動子之序列導入而製備，該植體係以於WAP啓動子作用之下可接受所安置之外來基因之方式而製備。依賴WAP啓動子，編碼感興趣之蛋白質之基因經整合與定位。含有該啓動子及基因編碼感興趣之蛋白質之基因的植體係用來經由注射入兔胚胎的雄原核內部，用來獲得基因轉殖動物例如雌兔。隨後，胚胎被傳送至藉著激素作準備之雌兔的輸卵管內。轉殖基因的存在係由萃取自基因轉殖幼兔DNA，藉南方技術顯示。於動物乳汁中的濃度係藉特異性放射性免疫檢定分析評估。
較佳於乳汁中製造的蛋白質且根據本發明方法萃取的蛋白質為凝血蛋白質或凝血因子。確實已知此種蛋白質對鈣離子有強力親和力(Hibbard等人，(1980)，J.Biol.Chem.1980,Jan 25；255(2)：638－645)。根據本發明之特定態樣，凝血因子係於本發明之萃取方法期間經活化。於「維生素K相依性」蛋白質尤為如此，該種蛋白質為血液凝固所必須的因子。
較佳，於乳汁中製造且根據本發明方法萃取的蛋白質為含有「GLA部位區域」的蛋白質，GLA部位區域可固定鈣離子；或為含有「EGF部位區域」(上皮生長因子)之蛋白質，或額外含有被識別為可固定鈣離子之部位區域，諸如「主EF」之結構(允許固定鈣離子之螺旋－回路－螺旋)之蛋白質。
此外，鈣相依性蛋白質也可為容易藉本發明方法識別之蛋白質，特別為抗體或單株抗體。
較佳本發明之蛋白質係選自於由第II因子(FII)、第VII因子(FVII)、第IX因子(FIX)及第X因子(FX)，及其活化形式、C蛋白、活化C蛋白、S蛋白及Z蛋白或其混合物所組成之組群。
以特佳方式，本發明之蛋白質為FVII或活化FVII(FVIIa)。
就此方面而言，FVII或FVIIa可根據EP 0 527 063之教示製造，該方法摘要說明如前。DNA片段，其序列為人類FVII之序列係置於WAP啓動子的控制之下。例如此種DNA序列係列舉於文件EP 0 200 421所述之序列號碼1b之下。
較佳本發明之FVII經活化。於活體內以不同蛋白酶(FIXa、FXa、FVIIa)將酶原裂解成為由雙硫橋所鍵聯的兩個鏈，獲得FVIIa。單獨FVIIa具有極差的酶催化活性，但當FVIIa與其輔因子，亦即組織因子(TF)複合時，經由活化FX及FIX而觸發凝血過程。
FVIIa當與組織因子(TF)交互作用時，凝血活性比FVII之凝血活性高25倍至100倍。
於本發明之實施例中，於試管內FVII可藉Xa、VIIa、IIa、IXa及XIIa因子活化。
本發明之FVII也可於其純化過程中活化。
申請人出乎意外地發現感興趣的蛋白質即使係於乳清中天然產生的蛋白質之啓動子，諸如WAP啓動子的控制之下，雖言如此容易與鈣離子結合，如此與酪蛋白膠束結合。如此，本發明方法可用於分離於乳清蛋白之啓動子控制之下所製造的重組蛋白質。
此外，本發明方法特別適合分離於酪蛋白啓動子之控制之下所製造之重組蛋白質。
蛋白質也係選自於由第VIII因子、α－1－抗胰蛋白酶、抗－凝血酶III、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓磷脂鹼性蛋白、前胰島素、胞質素原組織活化因子及抗體或其混合物所組成之組群。
本發明方法也可用於製備重組乳蛋白。此種情況下，可為於不同種動物的乳腺內所合成的乳蛋白(simons等人，(1987)，Aug 6－12；328(6130)：530－532)。其中值得一提者為基因轉殖乳鐵蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、及/或乳白蛋白。
本發明之又一實例係有關包含至少一種易藉本發明方法獲得之蛋白質之乳汁之非脂水相。較佳，水相為超鹽性、鹼性、且含有可溶性酪蛋白及至少另一種感興趣之蛋白質。超鹽性較佳係指濃度至少7克/升之鈉離子或至少18克/升之氯化鈉，或至少0.3莫耳氯化鈉。較佳此濃度約為8克/升鈉離子或約20克/升氯化鈉。鹼性係指8至9之pH且較佳高於7.8。可溶性酪蛋白較佳係占總酪蛋白之至少25%，更佳占總酪蛋白之至少50%。
此種水相比較未接受加工處理步驟之乳汁，前者包含感興趣之欲純化的總蛋白至少50%，或較佳由至少60%至80%。特佳，非脂水相包含於萃取前乳汁中所存在之感興趣的總蛋白至少90%。
根據本發明之較佳實施例，存在於非脂水相中之感興趣蛋白質為第VII因子(FVII)或活化之第VII因子(FVIIa)。
本發明之非脂水相即使不再含有酪蛋白膠束及不溶性鈣化合物，但仍然包含大部分的雜質。結果視個別情況而定，需要進行水相中之蛋白質純化。
此外，本發明方法包括於步驟c)之後獲得的，或可能於此步驟c)之後進行過濾及濃縮/透析步驟獲得的，包含感興趣之蛋白質之非脂水相隨後之純化步驟。
如此，步驟c)之後接著為親和層析步驟d)，親和層析術較佳係於層析管柱上使用羥磷灰石凝膠(Ca10 (PO4 )6 (OH)2 )撐體或氟磷灰石凝膠(Ca10 (PO4 )6 F2 )撐體進行。如此非脂水相之蛋白質固定於撐體上，未被固定的乳蛋白大部分被去除。
層析管柱較佳係使用基於水相A之0.025 M-0.035 M磷酸鈉，pH 7.5-8.5平衡。非脂水相注入管柱上，管柱允許保留感興趣之蛋白質。未被保留的部分藉緩衝液A洗提去除，直到回到基準線(RBL)，確保非期望之化合物例如乳蛋白的良好去除。檢測係於λ=280 nm進行。
蛋白質之洗提係使用基於磷酸鹽之緩衝液諸如磷酸鈉或磷酸鉀或其混合物於預定濃度進行，較佳表示基於0.25 M-0.35 M磷酸鈉之緩衝液B，pH 7.5-8.5。析出液收集至返回基準線。
由於此步驟，大於90%總乳蛋白被去除，回收大於90%感興趣之蛋白質。本析出液之純度於此步驟約為5%。
純度係定義為於所考慮之樣本、部分或析出液中感興趣之蛋白質及存在的總蛋白質間之重量比。
較佳，由於感興趣蛋白質對層析術撐體的親和結果，蛋白質比重增高10至25之因數。
步驟d)結果所得之析出液隨後較佳接受正切方向過濾。正切方向過濾膜係由熟諳技藝人士依據感興趣之蛋白質的特性選用。大致上，孔徑比感興趣蛋白質分子量大兩倍之孔隙度極限可有利地允許過濾產物。例如，孔徑100 kDa之膜允許以良好產率過濾FVII。
本過濾步驟之目的係降低負載，特別降低分子量比感興趣之蛋白質之分子量更高之蛋白質之負載，且特別係去除非典型之感興趣蛋白質(例如呈聚合物形式之蛋白質)，蛋白質也容易於某個延遲以內分解。
極為較佳，所得經過過濾的析出液進一步經濃縮及透析。已經說明藉超濾濃縮/透析步驟用之適當系統。
根據本發明之較佳實施例，該方法包含至少一個離子交換層析步驟來純化感興趣之蛋白質，特別包含於離子交換器上的兩次連續層析步驟。如此較佳允許去除其餘乳蛋白。
離子交換器以及平衡緩衝液、洗滌緩衝液及洗提緩衝液之選擇係依據欲純化之蛋白質本質決定。
本步驟可於步驟c)之後直接進行，或視需要可於親和 層析術步驟及/或正切方向過濾步驟之後進行。
較佳，該至少一個步驟及兩個層析步驟為陰離子交換層析術。更佳該陰離子交換層析術係使用弱鹼性層析撐體進行。
第二層析步驟意圖限制蛋白質可能之分解。
舉例言之，於由非脂水相純化第VII因子的第一層析步驟中，使用其上可保有第VII因子之Q-希法羅斯FF凝膠型層析撐體。使用之水性洗提緩衝液係基於較佳0.05 M Tris及較佳0.025 M-0.05 M氯化鈣，pH 7.0-8.0，來獲得具有中等純度，亦即25%至75%純度之第VII因子析出液。檢測係於λ=280 nm進行。
如前文說明，FVII之析出液進一步接受透析步驟，透析步驟之緩衝液為0.15 M氯化鈉溶液。
於第二層析步驟中，例如其用途係用來純化於前一步驟所得之第VII因子之析出液，視需要可將其稀釋來允許第VII因子再度被吸附，該第二層析步驟係使用其上可保有第VII因子之Q-希法羅斯FF凝膠型層析撐體。使用較佳係基於0.05 M Tris及較佳0.005 M氯化鈉，pH 7.0-8.0之水性洗提緩衝液，用來洗提高純度第VII因子析出液，其純度係高於90%。
根據本發明之較佳實施例，於兩次陰離子交換層析術步驟後，該方法包含第三陰離子交換層析術步驟。此步驟允許調配蛋白質豐富組成物，來讓其適合醫療用途。此外，該第三層析步驟係使用弱鹼性層析撐體進行。
舉例言之，藉第二陰離子交換層析步驟所得之析出液，於稀釋後，注入以Q-希法羅斯FF凝膠型層析撐體(其上可保有第VII因子)所填充的管柱上。撐體上所保有的第VII因子係使用較佳由0.02 M Tris及0.20-0.30 M氯化鈉pH 6.5-7.5所組成之水性緩衝液洗提。檢測係於λ=280 nm進行。
結果，於陰離子交換劑凝膠上所進行的三次層析步驟允許進一步純化感興趣之蛋白質。此外，其允許濃縮及調配感興趣之蛋白質組成物。
根據本發明之較佳實施例，當欲純化之感興趣之蛋白質為凝血因子時，於陰離子交換劑撐體上的三次層析步驟中的至少一個步驟，允許活化全部或部分凝血因子。較佳，第一層析術允許活化凝血因子。
一旦欲回收析出液(第三陰離子交換劑層析術析出液)，該析出液於0.22微米過濾器上接受過濾步驟，於容器內進行分散步驟，然後冷凍至-30℃且於此溫度儲存。
本發明方法也包含下列步驟中之至少一者：調配、病毒鈍化及滅菌。大致上，該方法包含於親和層析步驟前，抗病毒處理步驟，該步驟較佳係使用溶劑/清潔劑進行，特別係於吞恩(Tween)80(1% w/v)及TnBP(磷酸三正丁酯)(0.3% v/v)之混合物存在下進行，該混合物允許讓套膜病毒失活化。此外，由陰離子交換劑之第二層析步驟所得之析出液較佳接受奈米過濾步驟，來有效去除病毒，特別為套膜病毒例如小病毒(parvovirus)B19。可使用可截留大 小大於15奈米尺寸之病毒之過濾器旭公司(ASAHI)普諾華(PLANOVA)15。
本發明之額外態樣及優點將於下列實例做說明，下列實例須視為舉例說明而非限制本發明之範圍。
實例
下列實例舉例說明本發明之萃取方法及純化方法應用於由基因轉殖雌兔之乳汁製備活化第VII因子(FVIIa)濃縮物(FVII-tg：基因轉殖FVII)。
生乳係得自於5頭雌兔F1(初始繼代培養的第二代)之初次泌乳。雌兔係基於乳汁中分泌FVII抗基因(FVII：Ag)之速率為基準作選擇。史代格(STAGO)(亞塞拉康(ASSERACHROM)VII)套件組允許追蹤初次泌乳所得之人FVII D04至D25(D：擠乳日)之含量。此種泌乳依據雌兔及收集日數而定相對穩定(188 IU/毫升至844 IU/毫升FVII)。
所選用之純化法允許由500毫升生乳匯集物中例如純化12毫克FVII-tg。通常純化產率為22%。
此濃縮物於非還原條件下，換言之，維持雙硫橋的條件下，藉SDS-PAGE電泳根據分析為純質，呈現重鏈和輕鏈於還原條件下的完全裂解，結果導致處理過程中完全轉換成為活化FVII(FVIIa)。
實例1：由乳汁萃取FVII
500毫升生全乳以9倍量之0.25 M磷酸鈉緩衝液pH 8.2稀釋。於室溫攪拌30分鐘後，富含FVII之水相於15℃於10000 g離心1小時(離心機索沃公司(Sorvall)伊佛盧森 (Evolution)RC-6700 rpm-轉子SLC-6000)。需要6盆每盆約835毫升。
離心後存在有三相：於表面的液相(乳酪)、澄清富含FVII之非脂水相(此相占大部分)、及丸粒狀之白色固相(不溶性酪蛋白及鈣化合物沈澱)。
包含FVII之非脂水相藉利用蠕動幫浦收集至乳酪相。乳酪相分開收集。去除固相(沈澱)。
但仍然包含極低量脂質的非脂水相於一系列過濾器(波爾(Pall)SLK7002U010ZP-具有孔徑1微米之玻璃纖維之前置過濾器，然後為波爾(Pall)SLK7002NXP-具有孔徑0.45微米之尼龍66)上過濾。過濾結束時，脂相通過此系列過濾，完全截留乳汁中的脂肪小球，而濾液變澄清。
經過過濾後的非脂水相進一步於超濾膜(迷里波(Millipore)公司，百歐麥士(Biomax)50 kDa，0.1平方米)上透析來讓其變成於層析步驟可相容。與乳汁中之鹽類、糖類及胜肽相反，具有分子量約50 kDa之FVII不會過濾通過過濾膜。首先溶液(約5000毫升)濃縮至500毫升，然後藉維持恆定量的超濾透析，允許去除電解質，調理生物材料用於隨後層析步驟。透析緩衝液為0.025 M磷酸鈉緩衝液，pH 8.2。
包含FVII之非脂水相可同化至富含FVII-tg之乳清。此種製品於-30℃儲存至繼續處理為止。
通常藉此步驟之FVII之產率極為令人滿意：90%(91%使用磷酸鹽萃取+99%透析/濃縮)。
由此步驟所得之包含FVII之非脂水相滿意地透明澄清，且與進一步之層析步驟可相容。
於此步驟萃取約93000 IU FVII-tg。此製品中FVII之純度約為0.2%。
實例2：FVIIa之純化方法 1.羥磷灰石凝膠層析術
阿米康(Amicon)90(直徑9厘米-截面積64平方厘米)管柱以拜雷公司(BioRad)陶瓷水磷灰石I型凝膠(CHT-I)填充。
凝膠以水性緩衝液A平衡，水性緩衝液A包含0.025 M磷酸鈉及0.04 M氯化鈉，pH 8.0之混合物。整體製劑保藏於-30℃，於37℃水浴中解凍，至冰塊完全溶解為止，然後注入凝膠內(線性流速100厘米/小時，亦即105毫升/分鐘)。未被截留的部分係藉緩衝液沖洗來去除，該緩衝液包含0.025 M磷酸鈉及0.04 M氯化鈉，pH 8.2，直到返回基準線(RBL)為止。檢測係於λ=280 nm進行。
含有FVII-tg之部分之洗提係使用包含0.25 M磷酸鈉及0.4 M氯化鈉，pH 8.0之緩衝液B進行。經過洗提部分收集至返回基準線。
層析允許回收大於90% FVII-tg，同時去除大於95%乳蛋白。比重(S.A.)乘以25。於此步驟可獲得具有純度為4%之約85 000 IU FVII-tg。
2. 100 kDa正切方向過濾及50 kDa濃縮/透析
前一步驟的全部析出液於100 kDa超濾膜(波爾 OMEGA SC 100K-0.1平方米)上以正切模式過濾。FVII通過100 kDa膜過濾，具有分子量高於100 kDa之蛋白質無法被過濾。
進一步，過濾後之部分濃縮至約500毫升，然後於50 kDa超濾器(已經於實例1說明)上透析。透析緩衝液為0.15 M氯化鈉。
於此處理階段，於通過離子交換層析術之前，產物係儲存於-30℃。
此步驟允許減少具有分子量高於100 kDa之蛋白質之負載量，特別可減少酶原的負載量。100 kDa膜處理，允許截留約50%蛋白質，包括高分子量蛋白質，而95% FVII-tg被過濾，該FVII-tg為82000 IU FVII-tg。
本處理允許降低於下游步驟之蛋白質水解風險。
3.於Q-希法羅斯FF凝膠上層析術
進行於離子交換劑凝膠Q-希法羅斯快速流(QSFF)上之三次連續層析術，來純化活性成分，允許FVII活化成為活化FVII(FVIIa)，及最終濃縮及調配FVII組成物。
3.1 Q-希法羅斯FF 1步驟-洗提「高鈣」
2.6厘米直徑(截面積5.3平方厘米管柱)填充以100毫升Q-希法羅斯FF凝膠(GE健康照護公司(GE Healthcare))。
凝膠以0.05 M Tris緩衝液，pH 7.5平衡。
保藏於-30℃之整個析出液於37℃水浴解凍，至冰塊完全溶解。析出液使用平衡緩衝液稀釋為1/2 [v/v]，隨後注入至凝膠上(流速13毫升/分鐘，亦即線性流速150厘米/小 時)，然後未被截留的部分藉緩衝液的沖洗而去除直到RLB為止。檢測係於λ=280 nm進行。
具有FVII低含量之第一蛋白質部分係以0.05 M Tris及0.15 M氯化鈉，pH 7.5緩衝液，以9毫升/分鐘(亦即100厘米/小時)洗提，隨後去除。
第二富含FVII之蛋白質部分係使用0.05 M Tris，0.05 M氯化鈉及0.05 M氯化鈣，pH 7.5之緩衝液，以9毫升/分鐘(亦即100厘米/小時)洗提。檢測係於λ=280 nm進行。
此第二部分係於實例1所述之50 kDa超濾器上透析。透析緩衝液為0.15 M氯化鈉。此部分於夜間保藏於+4℃，隨後第二次通過離子交換層析術。
此步驟允許回收73% FVII(換言之60000 IU FVII-tg)，同時去除80%結合蛋白質。也允許活化於FVIIa中之FVII。
3.2 Q-希法羅斯FF 2步驟-洗提「低鈣」
2.5厘米直徑(4.9平方厘米截面積)管柱內填充30毫升Q-希法羅斯FF凝膠(GE健康照護公司)。
凝膠以緩衝液0.05 M Tris，pH 7.5平衡。
前一經洗提之析出液(第二析出液)儲存於+4℃，係於注入凝膠上之前稀釋(流速9毫升/分鐘，亦即線性流速100厘米/小時)。
注入第二析出液後，凝膠以平衡緩衝液洗滌來去除未被截留的部分，直到達到RLB。檢測係於λ=280 nm進行。
含有極高純度FVII之部分於0.05 M Tris、0.05 M氯 化鈉及0.05 M氯化鈣，pH 7.5之緩衝液中以4.5毫升/分鐘(亦即50厘米/小時)洗提。
純化約23000 IU FVII-tg，亦即12毫克FVII-tg。
此步驟允許去除大於95%結合蛋白質(雌兔乳汁之蛋白質)。
具有純度高於90%之本析出液，具有接近天然人FVII分子之結構特徵及功能特徵。藉第三次通過陰離子交換層析術濃縮及調配。
3.3 Q-希法羅斯FF 3步驟-洗提「鈉」
2.5厘米直徑(4.9平方厘米截面積管柱)內填充10毫升Q-希法羅斯FF凝膠(GE健康照護公司)。
凝膠以緩衝液0.05 M Tris，pH 7.5平衡。
前一步驟之經過洗提且經純化之析出液以注射用純水(PWI)稀釋5倍，隨後注入至凝膠上(流速4.5毫升/分鐘，亦即線性流速50厘米/小時)。
於該析出液注入後，凝膠以平衡緩衝液洗滌來去除未被截留的部分，直到達到RLB。檢測係於λ=280 nm進行。
隨後FVII-tg以0.02 M Tris及0.28 M氯化鈉pH 7.0緩衝液以3毫升/分鐘(亦即36厘米/小時)之流速洗提。
製備純度高於95%之FVII-tg濃縮產物。該產物可供靜脈注射用。該方法之累進產率為22%，每升使用的乳汁允許純化至少20毫克FVII。
表A顯示根據本發明之較佳實施例之各方法步驟，列舉於各步驟所得之不同產率、純度及比活性。
第1圖說明鈣鹽或錯合物與酪蛋白膠束之機轉。

Claims (33)

  1. 一種萃取存在於乳汁中之至少一種蛋白質之方法，該蛋白質對該乳汁之經錯合之鈣離子或未經錯合之鈣離子具有親和力，該方法包含下列步驟：a)經由該乳汁與可溶性鹽接觸獲得鈣化合物之沈澱來釋放出蛋白質，該可溶性鹽之陰離子係就其於此種介質中可形成不溶性鈣化合物之能力作選擇，俾便藉此方式獲得蛋白質豐富之液相，b)由該鈣化合物沈澱中分離該蛋白質豐富之液相，此外該液相係被分離成油脂相及包含蛋白質之非油脂水相，以及c)回收該包含蛋白質之非油脂水相。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該可溶性鹽為磷酸鹽。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該磷酸鹽係選自於由磷酸鈉、磷酸鋰、磷酸鉀、磷酸銣及磷酸銫所組成之組群。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該磷酸鹽為磷酸鈉。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該可溶性鹽為鹼金屬草酸鹽、或鹼金屬碳酸鹽、或其混合物。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該鹼金屬草酸鹽為草酸鈉或草酸鉀。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該鹼金屬碳酸鹽為 碳酸鈉或碳酸鉀。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該可溶性鹽在水溶液中的濃度為在100 mM至3 M之間。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該可溶性鹽濃度為在200 mM至500 mM之間。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該可溶性鹽濃度為在200 mM至300 mM之間。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟b)係藉由轉速為10000g且轉速時間為1小時之離心進行。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其包括於步驟c)之後具有遞減的孔隙度為1微米然後為0.45微米之過濾器上進行非脂水相之過濾步驟，接著藉由具有孔徑為50kDa膜之超過濾之濃縮/透析步驟；其中使用於透析步驟的緩衝液為pH 7.5-8.5且0.025 M至0.050 M磷酸鈉緩衝液。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該脂相係通過具有遞減的孔隙度為1微米然後為0.45微米之過濾器過濾。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白質為非天然存在於乳汁中之蛋白質。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該乳汁為轉殖基因非人哺乳動物之乳汁。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該哺乳動物係選自於兔、綿羊、山羊、牛、豬、及小鼠。
  17. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質為凝血蛋白質。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該蛋白質係選自 由第II因子、第VII因子、第IX因子及第X因子及其活化形式以及C蛋白、活性C蛋白、S蛋白及Z蛋白或其混合物所組成之組群。
  19. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質為一包含GLA部位區域、EGF部位區域(上皮生長因子)或具有固定鈣離子能力之額外經識別的部位區域之蛋白質。
  20. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質為維生素K相依性蛋白質。
  21. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質為鈣相依性蛋白質。
  22. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質係選自由第VIII因子、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓磷脂鹼性蛋白、前胰島素(proinsuline)、胞質素原組織活化因子(tissue plasminogen activator)及抗體所組成之組群、或其混合物。
  23. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該蛋白質為基因轉殖乳鐵蛋白、乳球蛋白、溶菌酶及/或乳白蛋白。
  24. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟c)之後接著為親和層析步驟d)，蛋白質之洗提係使用基於濃度為0.25M至0.35M的磷酸鹽之緩衝液進行。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該親和層析術係於層析管柱上進行，該層析管柱之撐體為水羥磷灰石凝 膠(Ca10 (PO4 )6 (OH)2 )或氟磷灰石凝膠(Ca10 (PO4 )6 F2 )。
  26. 如申請專利範圍第24或25項之方法，其中由步驟d)所得之析出液進一步進行正切方向(tangential)過濾。
  27. 如申請專利範圍第1項之方法，其係包含在步驟c)之後直接進行的至少一個步驟的離子交換層析。
  28. 如申請專利範圍第1項之方法，其包含在步驟c)之後直接進行的兩次連續層析步驟。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之方法，其中該至少一個層析步驟及兩個層析步驟為陰離子交換層析。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其包含在該兩次陰離子交換層析步驟後的第三陰離子交換層析步驟。
  31. 如申請專利範圍第24或25項之方法，其包含在該親和層析步驟前的藉溶劑/清潔劑進行的抗病毒處理步驟。
  32. 如申請專利範圍第27或28項之方法，其中由陰離子交換劑上之第二層析步驟所得之析出液進行可截留大小超過15奈米的病毒之奈米過濾步驟。
  33. 一種乳汁之非脂水相，其特徵在於其為高鹽性、鹼性，且其含有可溶性酪蛋白及易於藉由如申請專利範圍第1至23項中任一項之方法所得之至少另一種蛋白質。
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