KR101579811B1

KR101579811B1 - 우유에 존재하는 하나 이상의 단백질을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR101579811B1
Application number: KR1020087029104A
Authority: KR
Inventors: 아레인 레자스; 미쉘 노레; 미쉘 텔리어
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2015-12-24
Also published as: FR2901796A1; IL195183A0; TWI394534B; AR061429A1; CN101501059A; WO2007138198A2; CA2652495C; KR20150008455A; KR20090028694A; JP5279087B2; TW200808188A; CN103910779A; JP2013163689A; AR106315A2; WO2007138198A3; AU2007266951B2; KR101593494B1; EP2038296A2; CA2652495A1; JP2009538884A

Abstract

본 발명은 우유에 존재하는 적어도 하나의 단백질을 추출하는 방법으로, 상기 단백질은 상기 우유의 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대해 친화력을 나타내며, 상기 방법은: a) 단백질이 풍부한 액체상을 얻기 위해 가용성 염의 음이온이 불용성 칼슘 화합물을 형성하도록 선택된, 상기 가용성 염과 상기 우유를 접촉시켜 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 단백질을 분리하는 단계; b) 지질상 및 단백질을 포함하는 비-지질 수상으로 더 분리되는, 단백질이 풍부한 액체상을 상기 칼슘 화합물의 침전물에서 분리하는 단계; 및 c) 상기 단백질을 포함하는 수용성 비-지질 수상을 회수하는 단계; 를 포함한다.

Description

우유에 존재하는 하나 이상의 단백질을 추출하는 방법{METHOD FOR THE EXTRACTION OF ONE OR SEVERAL PROTEINS PRESENT IN MILK}

본 발명은 우유에 존재하는 한 개 이상의 단백질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 상기 우유의 복합 칼슘 이온(complexed calcium ion) 또는 비복합 칼슘 이온(non-complexed calcium ion)에 친화력(affinity)을 나타낸다.

본 발명의 문맥에서, 복합 또는 비복합 칼슘 이온은 미셸(micell) 콜로이드 구조를 형성하기 위한 카세인(casein)에 결합된 인산칼슘염(phosphocalcic salt) 또는 카세인에 결합하지 않은, 즉 카세인이 없는 인산 칼슘염을 말한다. 그런 이온은 또한 상기에서 언급한 것과 다른, 우유에 녹아있는 칼슘염 및/또는 유기 및/또는 무기 칼슘 복합물이다. 선천적으로 존재하는 우유의 칼슘 이온에 친화력을 나타내는 단백질은 락토알부민(lactalbumin), 락토글로불린(lactoglobulin) 및 면역 글로불린(immuno-globulin) 등을 들 수 있다. 이들 단백질은 또한 혈액응고인자(blood clotting factor), 특히 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ 등과 같은 형질전환 동물(transgenic animal)의 우유에 존재하는 재조합 단백질(recombinant protein)을 들 수 있다.

상업적으로 이용가능한 의약품의 대부분은 합성에 의해 얻어진 화학물질과 일치한다. 최근까지, 사실상 현대 의약품은 질병 치료 또는 질병 진단을 위해 화학적인 합성에 의해 생성된 의약에 높게 의지하였다.

그러나 단백질은 생물 정보를 운반하는 분자의 실질적 부분에 해당한다. 특히, 많은 호르몬, 성장 인자, 혈액 응고 인자 또는 항체의 경우가 그러하다.

일반적으로, 단백질은 주로 용인할 수 있는 비용으로 화학적 합성에 의해 얻을 수 없는, 고 분자량의 아미노산을 기초로 한 중합체이다. 치료적 사용을 위해서 그런 단백질을 보통 살아 있는 생물체, 인간 또는 동물 조직 또는 혈액에서 분리하고 정제한다. 대표적인 예가 돼지 췌장에서 추출한 인슐린, 혈장(blood plasma) 또는 면역 글로불린에서 추출한 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ와 같은 혈액 응고 인자 등이다.

상기 단백질의 제조과정이 현재 많이 사용되고 있지만, 그것은 결점이 있다. 혈소판에서 추출된 에리스로포이에틴(erythropoietin)과 같은, 어떤 단백질은 그 함량이 적어서 끊임없이 증가하는 치료적 필요를 충족시키기에 충분한 양으로 분리될 수 없다. 게다가, 인간 혈장(plasma)에 바이러스, 프리온(prion) 또는 다른 병원체(pathogenic agent)가 존재하면 치료에 유용한 제품을 얻기 위해서, 혈장 단백질(plasma protein)의 제조 방법에서 바이러스 비활성화 및/또는 바이러스 제거 단계를 추가하여야 한다.

이런 결점을 극복하기 위하여, 원하는 단백질을 분비할 수 있는 세포로 분리된 유전자를 전달하여 단백질을 합성하는 기술인, 유전공학이 사용된다. 원래의 세포 시스템의 밖에서 얻어진, 그런 단백질을 "재조합형(recombinant)"이라고 한다.

이 기술에 따르면, 다른 세포 시스템을 사용할 수 있다.

대장균(E. coli) 등과 같은, 세균계(Bacterial system)가 주로 사용되고 있으며 또한 효율적이다. 그들은 낮은 비용으로 재조합형 단백질을 생성할 수 있다. 그러나 그런 시스템은, 정교한 폴딩(folding) 과정이 필요없는, 간단한, 비-글리코실화 단백질(non glycosylated protein)의 제조에 한정된다.

균계(fungal system)는 분비 단백질(secreted protein)의 생산을 위해 마찬가지로 이용된다. 균계는 다양한 그룹의 만노오스 유도체를 추가하여, 생성된 단백질의 약물역학적(pharmacokinetic) 성질에 영향을 미치는, 그래프팅 글리칸 모이어티(grafting glycan moieties) 및 황산 작용기(sulfate group) 등을 포함하는, 번역 후 변형(post-translational modification)의 원점(origin)에 있다는 것이 이런 균계의 단점이다.

배큐로바이러스(baculovirus)를 사용하는 시스템에 의해 백신 단백질(vaccinal protein) 또는 성장 호르몬 등과 같은 전혀 다른 단백질을 생성할 수 있지만, 산업적 스케일에 적용하기에 최적화되지 않았다.

단일 클론 항체와 같은 재조합 복합 단백질을 제조하기 위해 포유동물 세포 배양이 사용된다. 세포 발현 시스템은 정확하게 접히고(folded) 변경된(modified) 재조합 단백질을 유도한다. 제조 원가에 비해 낮은 수확량이 중요한 결점이다.

다양한 그런 세포 시스템은 많은 양의 단백질을 얻기 위해 형질전환 식물을 실행하는 것을 포함한다. 그러나 이런 시스템은 특히 생성된 단백질에 많은 면역성 크실로오즈(immunogenic xylose) 잔기가 추가되어, 식물 특이적 번역 후 변형이 일 어나서, 치료에 적용하는데 그 사용이 제한된다.

상기에서 언급한 세포 시스템의 대안으로 재조합 백신 또는 복합 치료 단백질을 생성하기 위한 형질전환 동물이 사용된다. 이렇게 얻어진 단백질은 인간의 단백질과 유사한 글리코실화(glycosylation)를 나타내며 정확하게 접힌다. 이 복합 단백질은 성장 호르몬 등과 같은 단지 1개의 간단한 폴리펩티드 사슬로만 이루어질 뿐만 아니라, 특히 특이 분열(cleavage), 글리코실화(glycosylation) 및 카르복실메틸화(carboxymethylation)에 의해, 아미노산이 모인 후에 다른 방법으로 변형된다. 대다수의 경우에, 세균성 세포(bacterial cell) 또는 효모(yeast)에 의한 변형이 일어날 수 없다. 한편, 형질전환 동물은 세포 발현 시스템을 사용하는 것에 비하여 제조비용이 적으면서도, 세균성 세포 시스템의 발현 수준 및 세포 배양에 의해 얻어진 번역 후 변형을 조합할 수 있다.

형질전환 동물의 생물 물질 중에서, 우유는 재조합 단백질이 매우 만족할 만한 분리원으로 간주되는 학문의 주제이다.

형질전환 동물의 우유에서 생성된, 재조합 단백질은 유선(mammary gland)에서 특이적으로 합성되어, 우유로 분비되는, 우유 단백질의 합성을 담당하는 유전자 중 하나의 조절부위(regulatory region)에 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 접목시켜서 쉽게 얻어질 수 있다.

예로, 유럽출원 EP 0 527 063에 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 락토세럼(lactoserum) 단백질의 프로모터에 의해 제어하면서, 형질전환 포유동물의 우유 내에 관심대상 단백질을 생성하는 것에 대해 기재되어 있다.

또 다른 특허출원 또는 특허는 형질전환 동물의 우유 안에 항체(EP 0 741 515), 콜라겐(WO 96/03051), 인간 인자 Ⅸ(US 6 046 380), 인자 Ⅷ/폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor) 복합체를 제조하는 것에 대해 기술하고 있다.

단백질 발현이라는 측면에서 이들 방법은 만족할 만한 결과를 나타냄에도, 재조합 단백질원으로서 우유의 사용에는 결점이 있다. 주요 결점으로는 만족할 만한 수확량으로 우유에서 재조합 단백질을 추출할 수 없고, 또한 뒤따르는 정제에 어려움이 있다는 것이다.

실제로, 우유는 90%의 물과 3 카테고리로 분류될 수 있는 다양한 성분의 혼합물이다. 락토세럼(lactoserum) (또는 유장(whey))이라고 불리는 첫 번째 카테고리는 글루사이드(glucide), 가용성 단백질, 무기질 및 수용성 비타민으로 이루어져 있다. 지질 상(lipidic phase) (또는 크림)이라고 불리는 두 번째 카테고리는 에멀젼 형상의 지방(fat)을 포함한다. 단백상(proteic phase)이라고 불리는 세 번째 카테고리는 약 80%의 카세인을 포함한다. 카세인은 pH 4.6에서 침전가능하며, 또한 칼슘이 있으면 레닌의 작용으로 응고된다. 다른 카세인은 삼인산칼슘(tricalcium phosphate)의 집합체(집단(cluster))의 형태, 즉 Ca₉(PO₄)₆ 등으로 나타나는, 인산칼슘염과 함께 콜로이드 미셸 복합물(colloidal micellary complex)을 형성하며, 이는 약 0.5㎛의 지름에 도달할 수 있다. 친수성 층에 인산칼슘염이 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 결합하면서, 그런 미셸(micelle)은 소수성 핵을 둘러싼 카세인-κ가 풍부한(casein-κ-rich) 친수성 층으로 이루어진 카세 인 소단위(sub-unit) 안에서 형성된다. 이 인산칼슘염은 또한 카세인에 결합되지 않고 미셸의 내부 공간에 존재할 수도 있다. 이 단백상은 락토알부민 및 락토글로불린, 혈액 유래의 알부민 및 면역 글로불린 등과 같은 가용성 단백질을 또한 포함한다.

형질전환 동물의 우유로 분비된 재조합 단백질의 특성에 따라서, 재조합 단백질은 락토세럼 또는 단백상 또는 둘 다에 존재할 수도 있다. 특히 카세인 미셸에 포획되어 있을 때, 우유 성분의 각 카테고리가 많고 복잡하여 이 단백질을 더 추출하기 어려워진다. 또한, 두 상 중 하나에 이 단백질이 존재한다는 것을 확실을 가지고 예측할 수 없기 때문에 어렵다.

재조합 단백질은 또한 염 및/또는 각종 가용성 복합물의 형태로 존재하는 우유의 칼슘이온에, 또는 카세인 미셸의 인삼칼슘염의 칼슘 이온에 친화력을 나타낼 수 있다. 이 친화력은 단백질과 2가(bivalent) 칼슘 양이온 사이 정전기 결합으로 나타난다. 단백질/칼슘 이온의 친화력을 통해 그들의 수치에 따라, 결합력을 결정하는 친화력 상수를 정의할 수 있다. 일반적으로 말하면, 칼슘 이온에 대한 친화력을 나타내는 단백질의 대부분은 미셸의 인산칼슘 염에 결합된다. 따라서, 그것을 추출하기 위해서는 실행과 수확량의 문제와 결부된, 복잡한 단계를 거쳐야 한다.

재조합 단백질은 종종 온도와 pH의 복합적 영향 하에서 변성(denaturation)되기 때문에, 효소 응고 또는 산 침전(pH 4.6) 후 저온 살균을 통해 단백질을 분리하는 낙농 산업에서 사용되고 있는 종래의 해결책은 재조합 단백질의 분리(추출)에는 적용될 수 없다. 게다가, 카세인 미셸에 단백질이 포획되어 있으므로 그 추출률 이 낮다. 여과, 원심분리 및/또는 침전(sedimentation) 기술에 의하여 우유를 분별하는 물리적인 방법을 포함하는 다른 해결책이 있으나, 그 추출 수확량이 용인할 수 없는 정도이며 추출된 재조합 단백질의 정제가 어렵다.

유럽특허출원 EP 0 264 166에서 유전적으로 변형된 동물의 우유로 원하는 단백질을 분비하는 것에 대해 기술하고 있으나, 우유에서 이 단백질을 정제하는 단계에 대해서는 기재하고 있지 않다.

미국특허 US 4 519 945에는 이전에 언급한 것처럼 산화 및 가열 단계를 수행하는, 우유에서 카세인 및 락토세린의 침전물을 제조하여 재조합 단백질을 추출하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 원하는 단백질의 중요한 활성이 상실되며 그 추출량이 낮다.

미국특허 US 6 984 772에는 형질전환 포유동물의 우유에서 재조합 피브리노겐(fibrinogen)을 정제하는 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 카세인 펠릿에서 락토세럼을 분리하고 연속적인 원심 분리에 의하여 단백상을 분리하는 단계를 포함한다. 락토세럼을 분리하고 연속 가공을 통해 저장하여, 피브리노겐의 정제된 용액을 얻는다.

그러나 이 방법은 예를 들면 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ의 혈장 응고 인자(plasma clotting factor)와 같은, 카세인 미셸 안 및/또는 카세인 미셸에 포획된 재조합 단백질을 만족할 수확량으로 생산하는데 적용할 수 없다.

국제공개특허 WO 2004/076695에는 형질전환 동물의 우유로부터 재조합 단백질을 여과하는 방법에 대해 기술한다. 이 방법은 우유를 정화(clarification)하는 제1 단계, 즉 0.2㎛ 세공(pore)의 여과막을 통해 여과될 수 있는 용액을 얻기 위해 우유 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 그런 단계에서는 결국 카세인 미셸이 제거된다. 따라서, 카세인 미셸이 그 구조 안에 포획된 관심대상의 단백질을 포함하고 있는 경우에, 수확량의 측면에서 이 단계를 실행하는 것은 레드히비토리(redhibitory)할 수 있다.

미국특허 US 6 183 803에는 우유로부터 락토알부민과 같은 우유에서 선천적으로 존재하는 단백질 및 인간 알부민 또는 α1-안티트립신(antitrypsin) 등과 같은 재조합 단백질을 분리하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이 방법은 관심대상 단백질을 포함하는 우유를 킬레이트제(chelating agent)와 접촉시키는 초기 단계를 포함한다. 이는 카세인, 락토세럼 단백질 및 관심대상 단백질을 포함하는 우유 세럼을 정화(clarification)시키는, 카세인 미셸의 구조를 파괴한다. 방법은 2가 양이온의 불용성 염의 액체(정화된 우유 세럼)로, 부가적으로 카세인 미셸의 구조를 재구성하는 단계를 포함한다. 염이 카세인의 정전기 결합 위치를 포화하기 때문에, 미셸에 포획되어 있지 않은 관심대상 단백질을 포함하는 액체상의 결과로서, 이들 미셸이 침전한다. 따라서, 이 방법에 따르면, 관심대상 단백질은 미셸의 재구성 및 그 침전에 의해 최종적으로 분리된다.

이 방법은 실행하기에 복잡하며 칼슘 이온에 대해 상대적으로 높은 친화력을 가진 단백질에는 적용될 수 없다. 비타민 K의 영향을 받아 합성되는 것으로 알려진, 응고 단백질은 이 카테고리에 들어간다.

형질전환 동물의 우유로 분비되고 락토세럼에 존재하는 재조합 단백질 및 카 세인 미셸에 포획된 다른 단백질 카테고리의 재조합 단백질의 특정 카테고리를 분리하고 정제하는 방법은 수확량이 매우 낮고 실행하기 복잡한 것에서 출발하여, 본 출원인은 단백질의 생물적 활성을 유지하면서, 게다가 만족할 만한 생산량을 가지는, 간단한 실행방법으로 선천적으로 존재하는 또는 재조합 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ와 같은 선천적으로 존재하지 않는 우유 성분 단백질을 우유에서 추출하는 방법을 제공하게 되었다.

따라서, 본 발명은 우유에 존재하는 적어도 하나의 단백질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 상기 우유의 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대해 친화력을 나타내며, 상기 방법은 다음을 포함한다;

a) 단백질이 풍부한 액체상을 얻기 위해 가용성 염의 음이온이 불용성 칼슘 화합물을 형성하도록 선택된, 상기 가용성 염과 상기 우유를 접촉시켜 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 단백질을 분리하는 단계;

b) 지질상 및 단백질을 포함하는 비-지질 수상으로 더 분리되는, 단백질이 풍부한 액체상을 상기 칼슘 화합물의 침전물에서 분리하는 단계; 및

c) 상기 단백질을 포함하는 수용성 비-지질 수상을 회수하는 단계.

본 출원인은 가용성 염의 음이온이, 칼슘 이온에 고정 위치를 나타내는, 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대해 친화력을 나타내는, 단백질, 특히 재조합 단백질을 포함하는 우유의 칼슘 화합물의 침전물을 형성할 수 있도록 선택된, 가용성 염을 추가하여, 칼슘 화합물을 침전시키고, 반면에 관심대상 단백질을 이들 복합 또는 비복합 이온에서 분리하고 액체상의 용액에서 다시 발견한다는 사실을 주목하였다.

상기에서 언급한 것처럼, 복합 또는 비복합 칼슘 이온은 우유에 녹을 수 있는, 다른 유기 및/또는 무기 칼슘염 및/또는 복합물을 의미한다. 이들 염 또는 복합물은 카세인 미셸의 내부 공간에 존재할 수 있다(이후 도 1 참조).

이 칼슘 이온은 또한 특히 집합체(aggregate)("집단(cluster)")의 형태로, 카세인 미셸과 상호작용하는 인산칼슘염을 의미한다. 이들 염은 또한 실행된 화학 및 생화학반응에 따라, 칼슘의 다른 이온 형태와 균형 상태에 있는, 단인산칼슘(monocalcic phosphate) 및/또는 2인산칼슘(dicalcic phosphate)의 형태로 우유에 존재한다.

마지막으로, 이 칼슘 이온은 칼슘/카세인 복합물, 즉 전정기적 상호작용에 의해 인산칼슘염과 결합하는 카세인의 소단위(subunit)를 의미한다. 이 칼슘/카세인 복합체는 또한 인산칼슘염, 유기 및/또는 무기 가용성 칼슘염 및/또는 복합체와 결합하는 카세인 미셸을 의미한다.

불용성 칼슘 화합물은 칼슘염 또는 복합체를 의미하며, 우유에서의 칼슘 화합물의 용해도는 0.5% 이하이다.

대부분의 경우에, 관심대상 단백질은 카세인 미셸의 인산칼슘염에 대부분 결합할 것이다.

따라서, 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대한 친화력을 나타내는 단백질은 전체적으로 또는 부분적으로, 칼슘 이온에 결합하도록 또는 카세인 미셸의 인산칼슘에 결합하도록, 칼슘이온을 위한 충분한 양의 고정 위치(fixation site)를 가지는 어떤 단백질을 의미한다.

예로, 칼슘이온을 위한 많은 고정 위치를 나타내는 관심대상의 단백질의 경우에, 칼슘 이온을 고정시키는 γ-카르복시글루탐산(γ-carboxyglutamic acid)에 풍부한 도메인인, GLA 도메인(GLA domain)이 8 내지 10이라면, 적어도 70 내지 90%의 관심대상 단백질이 카세인 미셸 안에 및/또는 카세인 미셸에 포획된다. 칼슘이온을 위한 적은 고정 위치를 나타내는 다른 단백질에 있어서, GLA 도메인이 2 내지 8이라면, 그들의 30 내지 60%가 카세인 미셸 안이 및/또는 카세인 미셸에 포획된다. 마지막으로, 0 내지 2 GLA 도메인 등의 매우 적은 칼슘 이온 고정위치를 나타내는 단백질조차도 5 내지 20%의 비율 등으로, 카세인 미셸 안이 및/또는 카세인 미셸에 포획된다. 포획된 단백질의 그런 양은 산업 스케일에서 방법 실시에 있어 사소한 양이 아니며, 이는 최대 가능한 수확량에 도달한다는 사실을 의미한다. 미셸 안에 및/또는 미셸에 포획되어 있지 않은, 나머지 관심대상 단백질은 상기에서 언급한 대로, 다른 형태의 우유 칼슘이온에 대해 친화력을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 방법은 이들 칼슘이온에 결합된, 적어도 2 내지 10%의, 또는 40 내지 60%의, 특히, 적어도 90%의 단백질을 추출하는데 적용될 수 있다.

칼슘 이온에 대한 단백질의 그런 친화력은 변형되지 않은 단백질 또는 예를 들면, 번역-후 변형에 의해 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 변형된 단백질의 상호작용에서 유래할 수 있다.

따라서, 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대한 많은 고정 위치를 나타내는 단백질은 우유에 존재하는 다른 형태의 칼슘과 결합할 수 있다.

관찰된 메커니즘의 어떤 해석에 연관시키지 않으면서, 본 출원인은 가용성 염을 추가하여 미셸의 인산칼슘염의 균형, 특히 칼슘/인산 비율을 바꾸어 놓고, 따라서 카세인 소단위의 집합체의 구조를 파괴하고 집합체를 침전시키게 한다고 가정한다. 미셸 안에 및/또는 미셸에 포획된 인산칼슘염과 결합된 관심대상 단백질은 미셸의 구조파괴가 되면 액체 속으로 분리된다. 게다가, 본 발명의 방법에서 사용된 가용성 염의 영향에 의해 불용성 칼슘으로서 상기 인산칼슘염이 침전하기 때문에, 관심대상 단백질은 또한 인산칼슘염에서 분리 또는 해리된다. 마찬가지로, 가용성 유기 및/또는 무기 칼슘염 또는 복합물과 또한 결합할 수 있는 관심대상 단백질은 같은 유형의 반응에 의해, 해리될 것이다.

그런 메커니즘의 예를 도 1에 나타낸다.

본 발명의 구조에서, 가용성 염은 원하는 효과를 얻을 수 있는 어떤 염이라도 좋다.

본 발명의 방법에서 이용된 가용성 염은 칼슘 이온과의 상호 작용으로부터 단백질을 분리하기 위해, 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의해 선택된 농도로 우유에 첨가될 수 있다. 따라서, 농도는 적어도 20%의, 또는 유리하게 30 내지 50%의 관심대상 단백질을 분리하기에 충분한 농도이다 특히 유리한 방법에서, 농도는 적어도 60 내지 80%, 또는 적어도 90%의 관심대상 단백질을 분리하기에 충분한 농도이다.

게다가, 본 발명의 방법은 또한 칼슘 이온에 대한 고정 위치만을 나타내는 일부 중에, 단백질에 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 우유에 함유된 칼슘 이온과 결합한 단백질의 전체 중 1%의 단백질의 추출에 적용될 수 있다. 또한, 방법은 이런 칼슘이온이 결합한 단백질의 적어도 2 내지 10%, 또는 적어도 40 내지 60%, 또는 특히 90%의 단백질에 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 카세인 소단위 집합체가 침전된다. 상기에서 언급한 것처럼, 카세인 미셸의 구조파괴 때문에 이런 침전이 일어난다. 본 발명의 방법을 실시하면 침전에 의해, 우유의 콜로이드 상태가 불안정해진다.

따라서, 본 발명의 방법은 콜로이드/액체 직접 추출에 대응하는, 콜로이드 상태에서 액체상태로의 우유가 전이되는 방법이다.

본 발명의 방법을 통해 처음의 우유 색보다 더 엷은 색을 가진, 락토세럼(lactoserum) 및 액체상을 얻을 수 있다. 사실, 이들은 우유에 흰색을 부여하는 칼슘이온-결합 카세인이다. 일단 침전되면, 그들은 더 이상 우유에 그들의 색을 부여할 수 없다.

그러므로 본 발명의 방법은 몇 이점이 있다: 첫째, 본 발명의 방법은 간단화된 실시에 의해 관심대상 단백질을 분리하기 때문에, 본 발명의 방법은 실행하기 매우 용이하다. 게다가, 본 발명의 방법을 통해 매우 양호한 수확량으로 비-지질 수상(aqueous-phase)에서 관심대상 단백질을 회수할 수 있다. 유리하게, 본 발명의 추출 방법을 통해 적어도 50%, 또는 적어도 60% 또는 적어도 80%의 수확량을 얻을 수 있다.

이 방법을 통해 또한 특히 크로마토그래피(chromatography)에 의한, 관심대상 단백질의 정제 단계의 실시와 호환된 형태로 관심대상 단백질을 포함하는 비-지질 수상(aqueous-phase)을 얻을 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 방법단계가 관심대상 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않는 pH에서 실행되기 때문에, 관심대상 단백질은 여전히 생물학적 활성을 가진다. pH는 유리하게 예를 들면 대략 8 정도의 염기성이다.

본 발명에 따른 가용성 염은 우유 1중량부 당 0.5중량부의 염(w/w)의 우유에 녹을 수 있는 염을 말한다.

유리하게, 방법에서 이용된 가용성 염은 인산염이다. 염은 우유에 첨가되는 수용액에 있을 수 있고, 또는 분말 형태로 우유에 직접 첨가될 수 있다.

바람직하게, 인산염은 인산나트륨(sodium phosphate), 인산리튬(lithium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 인산루비듐(rubidium phosphate) 및 인산세슘(cesium phosphate)으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 특히 인산염은 인산나트륨이다.

또는, 본 발명의 방법에서 사용된 가용성 염은 알칼리 옥살산 금속염(alkali metal oxalate), 특히 옥살산나트륨(sodium oxalate) 또는 옥살산칼륨(potassium oxalate), 또는 알칼리 탄산 금속염(alkali metal carbonate), 특히 탄산나트륨(sodium carbonate) 또는 탄산칼륨(potassium carbonate), 또는 그들의 혼합물이다.

유리하게, 방법의 실시를 위해 준비되는, 수용액에서 가용성 염의 농도는 100mM 내지 3M, 바람직하게 200mM 내지 500mM, 특히, 200mM 내지 300mM이다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 가용성 염은 나트륨인산염이며, 수용액에서의 농도는 100mM 내지 3M, 바람직하게 200mM 내지 500mM, 특히 200mM 내지 300mM이다.

추출될 관심대상 단백질을 포함하는 우유는 탈지우유가 아닌 원유(raw non skimmed milk) 또는 탈지우유(skimmed milk)일 수 있다. 본 발명의 방법을 탈지우유에 적용할 때의 이점은 탈지우유의 지질 함량이 낮다는데 있다. 방법은 또한 생우유(fresh milk) 또는 냉동유(frozen milk)에도 적용될 수 있다.

바람직하게 원심 분리에 의해 수행되는, 단계 b)에 의해 지질상 및 단백질을 포함하는 비-지질 수상(aqueous-phase)으로 액체상을 분리한다. 비-지질 수상은 락토세럼에 동화된다. 이 분리 단계를 통해 카세인 미셸 소단위의 집합체 및 칼슘 화합물의 침전물을 분리한다.

단백질을 포함하는 비-지질 수상은 지질상에서 분리된다.

유리하게, 이 단계에 의해 투명한, 비-지질 수상을 얻을 수 있다.

게다가, 방법은 단계 c) 이후에, 1㎛ 내지 0.45㎛의 줄어든 공극률(porosity)을 가지는 필터에서 연속적으로 수행되는 비-지질 수상(aqueous-phase)을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 유리 섬유 등이 사용된 이 여과기의 사용을 통해 여전히 존재할 수 있는 우유에 선천적으로 존재하는 지질(lipid), 지방구(fat globule) 및 인지질(phospholipid)을 감소시킨다. 0.5㎛ 미만의 공극률에 의해 비-지질 수상(aqueous-phase)의 세균학적 품질(bacteriological quality)을 유지하고, 후에 실시된 정제를 지원한다(울트라필터(ultrafilter), 크로마토그래피 컬럼(chromatographic columns) 등)(이후 참조). 지질상은 바람직하게 우유의 지방구를 완전하게 잔류시키는 필터를 통해 여과되고, 여과액은 투명하다.

이 단계는 울트라 필터 장치(ultrafiltration)에 의한 농축(concentration)/투석(dialysis) 단계가 이어질 수 있다.

그것을 보존하기 위해 농축을 통해 비-지질 수상(aqueous-phase)의 부피를 줄일 수 있다. 울트라 필터용 막은 관심대상 단백질의 특성에 따라 기술분야의 숙련자에 의해 선택된다. 일반적으로, 관심대상 단백질의 분자량보다 작은 또는 같은 세공 사이즈를 가지는 공극한계를 통해 큰 손실없이 생성물을 농축할 수 있다. 예를 들면, 50kDa의 세공 사이즈를 가지는 막을 통해 손실없이 50kDa의 분자량을 가지는 FⅦ을 농축할 수 있다.

투석은 특히 크로마토그래피에 의해, 정제 단계를 더 가능하게 하는 단백질의 수상(aqueous-phase)을 결정하는 것을 의도한다. 이를 통해 락토오스(lactose), 염, 펩티드, 프로테아제 펩톤(proteoses peptone) 및 생성물의 보존에 해를 끼칠 수 있는 어떤 병원체(agent) 등과 같은 작은 분자량의 구성요소를 제거할 수 있다.

바람직하게, 투석 버퍼는 0.025M~0.050M의 인산나트륨 용액으로, pH는 7.5~8.5이다.

단계 c) 또는 경우에 따라 여과 및/또는 농축/투석 단계 이후에 얻어진 비-지질 수상(aqueous-phase)은 다음의 정제 단계를 실시할 때까지 -30℃에서 냉동 및 저장할 수 있다.

본 발명의 방법을 통해 전정기적 상호작용에 의해 관심대상 단백질이 결합하는 우유의 칼슘이온으로부터 하나 이상의 관심대상 단백질을 추출 및 경우에 따라 분리할 수 있다.

단백질은 우유에 선천적으로 존재하는 단백질일 수 있고, 예를 들면, β-락토글로불린(β-lactoglobulin), 락토페린(lactoferrin), α-락토알부민(α-lacto-albumin), 면역 글로불린(immunoglobulin) 또는 프로테아제 펩톤(proteoses peptone) 또는 그 혼합물 등이 있다.

단백질은 또한 우유에 선천적으로 존재하지 않는 단백질일 수 있다. 예로, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, α-1-안티트립신(α-1-anti-trypsin), 안티트롬빈 Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ), 알부민(albumin), 피브리노겐(fibrinogen), 인슐린(insulin), 미엘린 염기성 단백질(myeline basic protein), 프로인슐린(proinsulin), 플라스미노겐 조직 활성제(plasminogen tissular activator) 및 항체를 열거할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 관심대상 단백질을 포함하는 우유는 형질전환 우유이다.

사실, 우유에 선천적으로 존재하지 않는 단백질은 재조합 DNA 기술 및 유전자 도입(형질전환; transgenesis) 기술 때문에, 인간이 아닌 형질전환 포유동물에 의해 합성될 수 있다.

기술분야에서의 숙련자에게 공지된, 이 기술들을 통해 형질전환 동물의 우유에서 어떤 관심대상 단백질을 합성될 수 있다.

그런 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 합성되는, 재조합 또는 형질전환 단백질이며, 이들 두 용어는 본 출원에서 동등한 것으로 간주된다.

"형질전환 동물(transgenic animal)"은 인간이 아닌 동물의 게놈에 관심대상 단백질을 인코딩하는 외래 유전자(exogene) DNA 절편이 통합된 인간이 아닌 동물을 말하며, 이 동물은 단백질을 인코딩하는 외래 유전자 DNA를 발현하고 그 자손에 외래 유전자 DNA를 전달할 수 있다.

따라서, 어떤 인간이 아닌 포유동물을 그런 우유를 생산하는데 적용한다.

유리하게, 토끼, 양, 산양, 소, 돼지 및 쥐의 암컷을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환 포유동물의 우유를 분비하게 하는, 관심대상 단백질이 유선(mammary gland)에 의하여 분비되는 것은 조직-의존적인 방법으로 재조합 단백질의 발현을 제어하는 것을 의미한다.

그런 제어 방법은 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 동물의 특정 조직으로 단백질의 발현을 허용하는 서열에 의해 발현을 제어한다. 이런 서열에는 특히 프로모터 서열(promoter sequence) 및 펩티드 신호 서열(peptide signal sequence) 등이 포함된다.

기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 프로모터의 예에는 WAP 프로모터(유장 산성 단백질(whey acidic protein)), 카세인 프로모터, β-락토글로불린(β-lactoglobulin) 프로모터 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환 동물의 우유에서의 재조합 단백질을 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 합성 DNA 분자를 인간이 아닌 포유동물의 배(embryo)에 통합시키며, 단 상기 유전자는 우유로 선천적으로 분비되는 단백질의 프로모터의 제어하에 있다. 그 후, 배를 형질전환 동물을 생산할 수 있는, 동일한 종의 포유동물의 암컷에 이식한다. 객체가 충분히 발달하면, 포유동물의 젖 분비(lactation)를 유도하고 나서, 우유를 모은다. 그러면 상기 우유에는 관심대상 재조합 단백질이 포함되어 있다.

유럽특허 EP 0 527 063에, 인간 이외의 포유동물 암컷의 우유에 단백질을 제조하는 기술의 예가 기재되어 있으며, 상기 개시된 내용은 본 발명의 관심대상 단백질의 생성을 위해 참조될 수 있다.

WAP 유전자의 프로모터를 포함하는 서열을 도입하여 WAP 프로모터를 포함하는 플라스미드를 제조하며, 이 플라스미드를 WAP 프로모터에 의존적인 외래 유전자를 수용할 수 있는 방법으로 제조한다. 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 통합하여 WAP 프로모터에 의존하게 한다. 프로모터 및 관심대상 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 예를 들면 토끼 배(embryo)의 수(male) 생식핵(pronucleus)으로 미량주사법(microinjection)에 의해 형질전환 동물, 즉 토끼 암컷을 얻기 위해 사용한다. 이후에, 배를 호르몬상으로 준비된 암컷의 수란관(oviduct)으로 옮긴다. 서던블랏 기술에 의해 얻어진 형질전환된 어린 토끼에서 추출한 DNA에서 형질전환 유전자(transgene)의 존재가 밝혀진다. 동물 우유의 농도는 특정 방사선면역학적 분석법(radioimmunologic assay)에 의해 평가된다.

유리하게, 우유에서 생성되고 본 발명의 방법에 따라 추출된 단백질은 응고 단백질(clotting protein) 또는 응고 인자(clotting factor)이다. 그런 단백질이 칼슘 이온에 대해 강한 친화력을 나타낸다는 것은 공지되어 있다(Hibbard et al. (1980), J. Biol. Chem. 1980, Jan 25; 255(2):638-645). 본 발명의 특정 측면에 따르면, 응고 인자는 본 발명의 추출의 방법 동안 활성화된다. 그것은 혈액 응고에 필수적인 인자인, "비타민 K에 의존적인(vitamin K dependent)" 단백질에 있어 특히 중요하다.

유리하게, 우유에서 생성되고 본 발명의 방법에 따라 추출된 단백질은 칼슘이온을 고정할 수 있는, "GLA 도메인"을 포함하는 단백질 또는 "EGF 도메인"(상피세포성장인자(epidermal growth factor)) 또는 "주요 EF"(칼슘 이온에 고정될 수 있는 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix allowing to fix the calcium ion))에서 상기 구조와 같이, 칼슘이온을 고정할 수 있는 능력을 가진 것으로 알려진 다른 도메인을 포함하는 단백질이다.

게다가, 칼슘에 의존적인 단백질은, 본 발명에 의해 정제될 수 있는 단백질이며, 특히 항체 또는 단일클론 항체이다.

유리하게, 본 발명의 단백질은 인자 Ⅱ(FⅡ), 인자 Ⅶ(FⅦ), 인자 Ⅸ(FⅨ), 인자 Ⅹ(FⅩ), 상기 인자들의 활성화된 형태, 단백질 C, 활성화된, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 그들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택된다.

특히 유리한 방식에서, 본 발명의 단백질은 FⅦ 또는 활성화된 FⅦ(FⅦa)이다.

이 측면에서, FⅦ 또는 FⅦa는 유럽특허 EP 0 527 063에서 개시된 것에 따라 생성될 수 있고, 그 방법의 개요는 상기에서 기재하였다. 인간 FⅦ의 서열인 DNA 절편을 WAP 프로모터의 제어하에 놓았다. 예를 들면, 그런 DNA 서열은 유럽특허 EP 0 200 421에 기재된 서열번호 1b에 열거된다.

유리하게, 본 발명의 FⅦ는 활성화된다. FⅦa는 다른 프로테아제(FⅨa, FⅩa, FⅦa)로 이황화결합(disulfide bridge)에 의해 연결된 두 사슬로 효소원(zymogen)을 생체 내에서(in vivo) 분리한 데에서 유래한다. FⅦa 단독은 그 효소활성이 매우 약하지만, 공동인자(cofactor), 즉 조직인자(tissue factor; TF)와의 복합체는 FⅩ 및 FⅨ의 활성화에 의한 응고 과정을 촉진한다.

FⅦa는 조직인자(TF)와의 상호작용에 의해 FⅦ보다 25 내지 100배 더 높은 응고 활성을 나타낸다.

본 발명의 구체예에서, FⅦ는 인자 Ⅹa, Ⅶa, Ⅱa, Ⅸa 및 XIIa에 의해 생체 외에서 활성화될 수 있다.

본 발명의 FⅦ는 또한 그 정제 과정 동안 활성화될 수 있다.

본 출원인은 WAP 프로모터와 같은 락토세럼에서 선천적으로 생성된 단백질의 프로모터의 제어하에 놓인 경우라 할지라도, 관심대상 단백질은 예를 들면 칼슘 이온에 결합하고 따라서 카세인 미셸에 결합한다는 것에 주목하였다.

따라서, 본 발명의 방법은 락토세럼 단백질의 프로모터의 제어하에서 생성된 재조합 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명의 방법은 카세인 프로모터의 제어하에tj 생성된 재조합 단백질을 분리하는데 특히 적용된다.

단백질은 또한 인자 Ⅷ(Factor Ⅷ), α-1 안티트립신(α-1 anti-trypsin), 안티트롭빈 Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ), 알부민(albumin), 피브리노겐(fibrinogen), 인슐린(insulin), 미엘린 염기성 단백질(myeline basic protein), 프로인슐린(proinsulin), 플라스미노겐 조직 활성제(plasminogen tissular activator) 및 항체 또는 그들의 혼합물에서 선택될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 재조합 락틴 단백질(lactic protein)을 제조하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 그것은 다른 종의 동물의 유선(mammary gland)에서 합성된 락틴 단백질에 있어 중요하다(Simons and al, (1987), Aug 6-12 ; 328(6130):530-532). 이 때문에 형질전환 락토페린(transgenic lactoferrin), 락토글로불린, 리소자임(lysozyme) 및/또는 락토알부민이 예로서 언급될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 적어도 하나의 단백질을 포함하는 우유의 비-지질 수상에 관한 것이다. 유리하게, 수상은 과염분(hypersaline), 염기성이며, 가용성 카세인 및 적어도 하나의 다른 관심대상 단백질을 포함한다. 과염분은 적어도 7g/ℓ의 나트륨 이온 또는 적어도 18g/ℓ의 염화나트륨, 또는 적어도 0.3몰의 염화나트륨의 농도를 말한다. 바람직하게, 이 농도는 대략 8g/ℓ의 나트륨 이온 또는 약 20g/ℓ의 염화나트륨이다. 염기성은 8 내지 9의 pH를 의미하며, 바람직하게는 pH 7.8이상이다. 가용성 카세인은 전체 카세인의 적어도 25%, 및 더 바람직하게는 전체 카세인의 적어도 50%를 의미한다.

방법 단계를 거치지 않은 우유에 비해, 수상은 정제될 관심대상 단백질 전체의 적어도 50%, 또는 유리하게 적어도 60~80%를 포함한다. 특히 유리한 방법에서, 비-지질 수상은 추출 전에 우유에 존재하는 전체 관심대상 단백질의 적어도 90%를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 비-지질 수상에 존재하는, 관심대상 단백질은 인자 Ⅶ(FⅦ) 및 활성화된 인자 Ⅶ(FⅦa)이다.

그러나 더 이상 카세인 미셸 및 불용성 칼슘 화합물을 포함하지 않는다고 해도, 본 발명의 비-지질 수상은 여전히 불순물을 포함한다. 따라서, 개별적인 경우에 따라서, 수상에서 단백질을 정제하는 과정이 필요하다.

게다가, 본 발명의 방법은 단계 c) 후에, 또는 경우에 따라서 이 단계 c) 후에 수행되는 여과 및 농축/투석 단계 후에 얻어진, 단백질 또는 관심대상 단백질을 포함하는 비-지질 수상의 연속적인 정제 단계를 포함할 수 있다.

따라서, 단계 c) 후에 하이드록시아파타이트 젤(hydroxyapatite gel; Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) 또는 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca₁₀(PO₄)₆F₂) 고정상을 가지는 크로마토그래피 컬럼에서 수행되는 표준 크로마토그래피 시스템을 이용하여, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)인 단계 d)가 수행된다. 따라서, 비-지질 수상의 단백질은 고정상에 잔류하고, 잔류하지 않는 락틴 단백질이 제거된다. λ=280㎚에서의 흡수도 측정(absorbance measurement)을 통해 탐지한다.

크로마토그래피 컬럼은 바람직하게 pH 7.5~8.5인, 0.025M~0.035M의 인산나트륨에 기반을 둔 수성 버퍼 A로 평형을 유지한다. 관심대상 단백질을 잔류시키는, 컬럼으로 비-지질 수상을 주입한다. 락틴 단백질과 같은, 원하지 않는 화합물을 제거하기 위해, 기준선(RBL)로 복귀할 때까지, 버퍼 A의 삼투(percolation)에 의해 잔류되지 않는 단편을 제거한다.

미리 결정된 농도로, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 그 혼합물과 같은 인산염에 기반을 둔 버퍼로 단백질을 용출(elution)할 수 있고, 바람직하게, pH 7.5~8.5인 0.25~0.35M 인산나트륨에 기반을 둔 버퍼 B를 의미한다. 용출된 단편을 기준선에 복귀할 때까지 모은다.

이 단계 때문에, 전체 락틴 단백질의 90% 이상이 제거되고, 관심대상 단백질의 90% 이상이 회수된다. 이 용출된 단편의 순도는 이 단계에서 약 5%이다.

순도는 고려된 샘플, 단편 또는 용출액(eluate)에 존재하는 관심대상 단백질 및 전체 단백질 사이의 질량비로서 정의된다.

유리하게, 단백질(들)의 고유 활성은 크로마토그래피 고정상(chromato-graphic support)에 대한 관심대상 단백질의 친화력의 결과로서 인자 10 내지 25에 의해 증가된다.

단계 d)의 결과로 얻어진 용출액은 유리하게 연속적인 접선 여과(tangential filtration)를 거친다. 접선 여과용(tangential filtration) 막은 관심대상 단백질의 특성에 따라서 기술분야의 숙련자에 의해 선택된다. 일반적으로, 관심대상 단백질의 분자량보다 2배 큰 구멍 크기를 가진 공극률 제한을 통해 생성물을 유리하게 여과할 수 있다. 예를 들면, 100kDa의 구멍 크기를 가진 막을 통해 좋은 수확량으로 FⅦ를 여과할 수 있다.

이 여과 단계의 목표는 관심대상 단백질보다 큰 분자량을 가진 단백질의 하중을 줄이는 것이며, 특히, 관심대상 단백질의 불규칙한 형태 (예를 들면, 중합된 형태의 단백질) 및 특정 지연(delay) 내에서 관심대상 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제를 제거하는 것이다.

매우 바람직한 방법에서, 얻어진 여과된 용출액을 더 농축하고 투석한다. 울트라 필터 장치(ultrafiltration)에 의한 농축/투석 단계를 위한 적당한 시스템은 이미 기술하였다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 방법은 관심대상 단백질을 정제하기 위해 적어도 한 번의 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 단계 및 특히, 이온 교환기에서의 두 번의 연속 크로마토그래피 단계를 포함한다. 이를 통해 바람직하게 나머지 락틴 단백질을 제거할 수 있다.

이온 교환기와 평형 버퍼, 세척 버퍼 및 용출 버퍼의 선택은 정제될 단백질의 특성에 달려있다.

이 단계(들)은 단계 c), 또는 선택적으로, 친화성 크로마토그래피 및/또는 접선 여과 단계 후에 직접 실행될 수 있다.

바람직하게, 적어도 한 단계 및 두 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 더 바람직하게, 약 염기 유형 크로마토그래피 고정상을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. λ=280㎚에서의 흡수도 측정을 통해 화합물을 탐지한다.

두 번째 크로마토그래피 단계는 가능한 단백질이 단백질 분해(proteolytic degradation)되는 것을 제한하는 것으로 의도된다.

예로, 비-지질 수상에서 인자 Ⅶ를 정제하는 첫 번째 크로마토그래피 단계에서, 인자 Ⅶ가 잔류되는 Q-Sepharose® FF 젤 유형 크로마토그래피 고정상이 사용된다. 25%~75%의 순도인 중간 순도(intermediary purity)를 가진 인자 Ⅶ의 용출액을 얻기 위해, 바람직하게 pH 7.0~8.0인 0.05M의 트리스(Tris) 및 바람직하게 0.020M~0.05M의 염화칼슘에 기반을 둔 수성 용출 버퍼를 사용한다.

FⅦ의 용출액은 이전에 기술한 것처럼, 0.15M의 염화나트륨 수용액의 버퍼로 투석단계를 더 거칠 수 있다.

두 번째 크로마토그래피 단계에서, 예를 들면 이전 단계에서 얻어진, 선택적으로 다시 흡수되도록 하기 위해 희석된 인자 Ⅶ의 용출액을 정제하기 위해, 인자 Ⅶ가 잔류된 Q-Sepharose® FF 젤 유형 크로마토그래피 고정상을 사용한다. 90% 이상의 순도인, 고순도 단편의 인자 Ⅶ가 용출되도록, 바람직하게 pH 7.0~8.0인 0.05M의 트리스(Tris) 및 바람직하게 0.005M의 염화칼슘에 기반을 둔 수성 용출 버퍼를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 두 번의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에, 방법은 세 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 이 단계를 통해 의학적 사용에 적응시키는 방법으로 단백질이 풍부한 구성을 성분 배합한다. 더 바람직하게, 약 염기 유형 크로마토그래피 고정상을 사용하여 상기 세 번째 크로마토그래피 단계를 수행한다. 또한, λ=280㎚에서의 측정을 통해 화합물을 탐지한다.

예로서, 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 얻어진 용출액을 희석한 후, 인자 Ⅶ가 잔류되어 있는 Q-Sepharose® FF 젤 유형 고정상으로 채워진 컬럼으로 주입한다. 고정상에 잔류되어 있는 인자 Ⅶ는 바람직하게 pH 6.5~7.5인 0.02M 트리스 및 0.20~0.030M의 염화나트륨으로 구성된 수성 버퍼로 용출된다.

따라서, 음이온 교환기 젤에서의 세 번의 크로마토그래피 단계를 통해 관심대상 단백질을 더 정제하게 된다. 게다가, 그들을 통해 관심대상 단백질의 구성의 농도 및 성분 배합이 가능하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 정제될 관심대상 단백질이 응고 인자일 때, 음이온 교환기 고정상에서의 세 번의 크로마토그래피 단계 중 적어도 하나를 통해 응고 인자의 전부 또는 일부를 활성화한다. 유리하게, 첫 번째 크로마토그래피를 통해 응고 인자를 활성화한다.

일단 마지막 용출액이 회수되면, 상기 용출액은 0.22㎛ 필터에서의 필터 단계, 용기에서의 분산 단계를 거치고 나서, -30℃에서 냉동되고 이 온도에서 저장된다.

본 발명의 방법은 또한 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 성분 배합(formulation), 바이러스 비활성화 및 살균. 일반적으로, 방법은, 친화성 크로마토그래피 단계 전에, 유리하게, 특히 Tween® 80(1% w/v) 및 TnBP(tri-n-butylphosphate)(0.3% v/v)의 혼합물이 존재할 때, 용매/세제(solvent /detergent)로 수행하여 외피 바이러스(enveloped viruse)를 불활성화시키는, 안티바이러스 처리 단계를 포함할 수 있다. 게다가, 음이온 교환기에서의 두 번째 크로마토그래피 단계에서 유래하는 용출액은 바이러스, 특히 파보바이러스 B19 (Parvovirus B19)와 같은 비-외피 바이러스(nonenveloped viruse)를 효과적으로 제거하기 위해, 나노 필터(nanofiltration)의 단계를 거친다. 15㎚ 이상의 크기를 가지는 바이러스가 남아있는 필터 아사히(ASAHI) PLANOVA™15를 사용할 수 있다.

도 1은 카세인 미셸에서 단백질이 추출되는 메커니즘을 도시한 것이다.

본 발명의 다른 측면 및 이점은 다음의 실시예에서 기술될 것이지만, 이는 발명을 설명하기 위한 것이며, 발명의 범위를 제한하지 않는다.

이하의 실시예는 형질전환 암컷 토끼의 우유에서 활성화된 인자 Ⅶ(FⅦa)의 농축물을 제조하는 발명의 추출 단계 및 정제단계의 적용을 설명한다(FⅦ-tg: 형질전환 FⅦ).

5마리의 암컷 F1(창시자 혈통의 제2 세대)의 제1 젖 분비기(lactation)에서 원유가 유래한다. FⅦ 항원(FⅦ: Ag)의 젖 분비의 비율을 기초로 암컷을 선택하였다. STAGO(ASSERACHROM Ⅶ) 키트를 통해 제1 젖 분비로부터 D04부터 D25까지의 인간 FⅦ의 함량을 따르게 하였다(D: 착유일(milking day)). 이 분비는 이런 암컷에 있어 비교적 안정적이다(암컷 및 모집 기간에 따라, FⅦ의 188 내지 844IU/㎖) .

선택된 정제 방법을 통해 예를 들면 원유의 500㎖에서 12㎎의 FⅦ-tg를 정제하였다. 정제의 전체적인 수확량은 22%이다.

비환원 상태(non reduced condition), 즉 이황화 결합이 유지된 상태하에서 SDS-PAGE 전기영동법에 의하면 이 농축물은 순수하고, 이 과정 동안 활성화된 FⅦ(FⅦa)로 완전히 변환된, 환원 상태하에서 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)로 완전히 분열된다.

[실시예 1] 우유에서 FⅦ의 추출

전체 원유 500㎖를 pH 8.2인 0.25M의 인산나트륨의 9배 양으로 희석시킨다. 상온에서 30분 동안 교반한 후, FⅦ이 풍부한 수상을 15℃에서 1시간 동안 10,000g으로 원심분리한다(centrifuge Sorvall Evolution RC-6700 rpm -rotor SLC-6000). 약 835㎖의 6개의 포트가 필요하다.

원심분리 후 3상이 존재한다: 표면의 지질상(크림), (대부분의 상인) FⅦ가 풍부한 투명한 비-지질 수상 및 펠릿에서의 흰 고체상(불용성 카세인 및 칼슘 화합물의 침전물).

연동펌프(peristaltic pump)에 의해 크림상 및 FⅦ을 포함하는 비-지질 수상을 모으고 나서, 크림상을 따로 모은다. 고체상(침전물)을 제거한다.

그러나 여전히 소량의 지질을 포함하는 비-지질 수상을 일련의 필터(Pall SLK7002U010ZP - 1㎛의 세공을 가지는 유리섬유의 프리필터(prefilter)- Pall SLK7002NXP - 0.45㎛의 세공을 가지는 나일론 66(Nylon 66))로 여과한다. 여과가 끝난 후에, 우유의 지방구가 잔류되어 있는 상기 일련의 필터 장치를 지질상이 통과하여, 여과액이 투명해진다.

크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)을 가지도록 하기 위해, 여과된 비-지질 수상을 울트라 필터용 막(Millipore Biomax 50kDa - 0.1㎡)에서 더 투석시킨다. 우유의 염, 당 및 펩티드와 달리, 약 50kDa의 고 분자량을 가진 FⅦ는 막을 통해 여과되지 않는다. 처음에, 수용액(약 5,000㎖)을 500㎖으로 농축시키고 나서, 일정한 양을 유지하는 울트라 필터 장치에 의한 투석에 의해 전해질(electrolyte)을 제거하고 크로마토그래피 단계를 위한 생물학적 물질로 조절한다. 투석 버퍼는 pH 8.2의 0.025M 인산나트륨 버퍼이다.

FⅦ를 포함하는 이 비-지질 수상은 FⅦ-tg가 풍부한 락토세럼에 동화될 수 있다. 방법을 계속하기 전에 -30℃에서 이 제조물을 저장한다.

이 단계에 의하여 FⅦ의 전체적인 회수량이 만족할 정도가 된다: 90%(인산염을 가진 91%의 추출물 + 99% 투석/농축).

이 단계에서 유래하는 FⅦ를 포함하는 비-지질 수상은 완전히 투명하고 다른 크로마토그래피 단계와 친화성(compatible)이 있다.

약 93,000IU의 FⅦ-tg가 이 단계에서 추출된다. FⅦ에서 이 제조물의 순도는 약 0.2%이다.

[실시예 2] FⅦa의 정제과정

2-1. 하이드록시아파타이트 젤 크로마토그래피

Amicon 90(지름 9㎝-단면 64㎠) 컬럼을 BioRad 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 젤(CHT-I)로 채운다. λ=280㎚에서의 흡수도 측정을 통해 탐지한다.

젤은 pH 8.0의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨의 혼합물로 이루어 진 수성 버퍼 A로 평형을 유지된다. -30℃에서 보존된 전체 제조물을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃에서 중탕냄비(water bath)에서 해동하고 나서, 젤에 주입한다(선형 유속 100㎝/h, 즉, 105㎖/min). pH 8.2의 0.025M의 인산나트륨 및 0.04M 염화나트륨로 이루어진 버퍼를 통과시켜, 기준선(RBL)으로 복귀할 때까지, 잔류되지 않는 단편을 제거한다.

FⅦ-tg를 포함하는 단편을 pH 8.0인 0.25M의 인산나트륨 및 0.4M의 염화나트륨으로 구성된 버퍼 B로 용출시킨다. 용출된 단편을 기준선에 복귀할 때까지 모은다.

95% 이상의 락틴 단백질을 제거하면서, 이 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 FⅦ-tg를 회수한다. 고유 활성도(S.A.)를 25로 곱한다. 4%의 순도를 가지는 약 85,000IU의 FⅦ-tg를 이 단계에서 이용할 수 있다.

2-2. 100kDa 접선 여과 및 50kDa 농축/투석

이전 단계의 전체 용출액을 100kDa 울트라 필터용 막(Pall OMEGA SC 100K-0.1㎡)에서 접선 형태로 여과시킨다. FⅦ는 100kDa 막을 통해서 여과되는 반면, 100kDa이상의 분자량을 가진 단백질은 여과되지 않는다.

게다가, 실시예 1에서 이미 언급한 것처럼, 여과된 단편을 약 500㎖로 농축하고 나서 50kDa 울트라 필터에서 투석한다. 투석 버퍼는 0.15M 염화나트륨이다.

이 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피를 시행하기 전에 생성물을 -30℃에서 저장한다.

이 단계를 통해 100kDa 이상의 분자량을 가진 단백질과 특히 프로-효소(pro-enzyme)의 부하를 감소시킨다. 100kDa 막 처리를 통해 분자량이 높은 단백질 중에, 단백질의 약 50%가 유지되는 반면 95%의 FⅦ-tg, 즉 82,000IU의 FⅦ-tg가 여과된다.

이 처리를 통해 이후 단계(downstream step)의 단백질 가수분해(proteolytic hydrolysis)의 위험을 감소시킬 수 있다.

2-3. Q-Sepharose® FF 젤에서의 크로마토그래피

유효성분(active principle)을 정제하고, 활성화된 FⅦ(FⅦa)로 FⅦ를 활성화하며, 마지막으로 FⅦ의 구성을 농축하고 성분배합을 하기 위해 이온 교환기 젤 Q-Sepharose® Fast Flow(QSFF)에서 3번의 연속 크로마토그래피를 실시한다. λ=280㎚에서 흡수도 측정을 통해 화합물을 탐지한다.

2-3.1 Q-Sepharose® FF 1단계 - 용출 "고 칼슘"

2.6㎝의 지름(단면 5.3㎠)의 컬럼을 100㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지한다.

-30℃에 보존된 전체 단편을 얼음 블록이 완전히 녹을 때까지 37℃로 중탕냄비에서 해동시킨다. 젤로 주입하기 전에(유속 13㎖/min, 즉 선형 유속 150㎝/h) 평형 버퍼에 의해 단편을 ½[v/v]로 희석하고 나서, 잔류되지 않는 단편을 RLB까지 버퍼를 통과시켜 제거한다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스 및 0.15M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 소량의 FⅦ를 가지는 첫 번째 단백질 단편을 용출시켜서, 계속 제거한다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.05M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 9㎖/min(즉, 100㎝/h)의 속도로, 두 번째 FⅦ가 풍부한 단백질 단편을 용출시킨다. λ= 280㎚에서 탐지한다.

이 두 번째 단편을 이미 실시예 1에서 기술된 50kDa 울트라 필터로 투석시킨다. 투석 버퍼는 0.15M의 염화나트륨이다. 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피를 통과하기 전에 이 단편을 +4℃에서 밤 사이에 보존한다.

이 단계를 통해 80%의 결합 단백질을 제거하면서 73%의 FⅦ(즉, 60,000IU의 FⅦ-tg)를 회수한다. 또한, 이 단계에 의해 FⅦ가 FⅦa로 활성화된다.

2-3.2 Q-Sepharose® FF 2 단계 - 용출 "저 칼슘"

2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 30㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.

젤로 주입(유속 9㎖/min, 즉 선형 유속 100㎝/h)하기 전에, +4℃에서 저장된 이전에 용출된 단편(두 번째 단편)을 희석시킨다.

주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해 평형 버퍼로 젤을 세척한 다.

pH 7.5인 0.05M의 트리스, 0.05M의 염화나트륨 및 0.005M의 염화칼슘으로 된 버퍼를 가지고 4.5㎖/min(즉, 50㎝/h)의 속도로, 높은 순도의 FⅦ를 포함하는 단편을 용출시킨다.

약 23,000IU의 FⅦ-tg, 즉 12㎎의 FⅦ-tg를 정제하였다.

이 단계를 통해 95% 이상의 결합 단백질(암컷 토끼의 우유 단백질)을 제거한다.

90% 이상의 순도를 가진 이 용출액은 선천적으로 존재하는 인간 FⅦ 분자에 가까운 구조적 특징 및 기능성 특징으로 나타낸다. 그것은 음이온 교환 크로마토그래피에서의 세 번째 통과에 의해 농축되고 성분 배합된다.

2-3.3 Q-Sepharose® FF 3 단계 - 용출 "나트륨"

2.5㎝의 지름(단면 4.9㎠)의 컬럼을 10㎖의 Q-Sepharose® FF 젤(GE Healthcare)로 채운다.

젤을 pH 7.5인 0.05M 트리스 버퍼로 평형을 유지시킨다.

젤로 주입(유속 4.5㎖/min, 즉 선형 유속 50㎝/h)하기 전에, 이전 단계에서 정제한 단편을 주사용 정제수(purified water for injection; PWI)로 5배로 희석시킨다.

주입한 후에, 잔류되지 않는 단편을 제거하기 위해 평형 버퍼로 젤을 세척한다.

이후에, pH 7.0인 0.02M의 트리스, 0.28M의 염화나트륨으로 된 버퍼를 가지고 3㎖/min(즉, 36㎝/h)의 속도로, FⅦ-tg을 용출시킨다.

95% 이상의 순도로 FⅦ-tg의 농축물을 제조하였다. 생성물은 정맥 주사와 친화성이 있다. 방법은 사용된 우유의 리터당 적어도 20㎎의 FⅦ로 정제되어, 22%의 축적량을 가진다.

표 A은 본 발명의 바람직한 구체예에 다른 단계를 요약한 것으로, 각 단계에서 얻어진 다른 수확량, 순도 및 고유 활성도를 나타낸다.

[표 A]

배치번호 479030	부피 (㎖)	단백질 함량(㎎)	FⅦ:Ag(IU) 함량	FⅦ 수확량 /단계(%)	FⅦ 수확 량/농축된 %	SA (IU/㎎)	FⅦ 순도(%)
원유	500	42750	103450	100%	100%	2.4	0.12%
인산염 추출	4785	ND	93650	91%	91%	-	-
농축/투석 (50DKa UF)	667	29610	93233	99%	90%	3.1	0.20%
하이드록시아파타이트 용출액(CHT-I)	2644	1071	85692	92%	79%	80.0	4.0%
접선 여과 (100Ka UF)	459	518	81684	95%	72%	157.6	7.9%
용출액 QSFF1 (고Ca²⁺)	402	105	59757	73%	58%	572	28.6%
용출액 QSFF2 (저Ca²⁺)	157	12.8	22447	38%	22%	1749	87%
용출액 QSFF3 (나트륨)	42.5	12.7	21929	98%	21%	1727	86%
최종 생성물 (살균 0.2㎛)	50	12.4	23197	106%	22%	1878	94%

Claims

우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법으로,

상기 인자 Ⅶ은 상기 우유의 복합 또는 비복합 칼슘 이온에 대한 다수의 고정 위치(fixation site)를 가지며,

상기 방법은:

a) 인자 Ⅶ이 풍부한 액체상을 얻기 위해, 가용성 인산염(phosphate salt)의 음이온이 매체(medium)에서 불용성 칼슘 화합물을 형성하도록 선택된, 상기 가용성 인산염과 상기 우유를 접촉시켜 얻어진 칼슘 화합물을 침전시켜 복합 칼슘 이온 또는 비복합 칼슘 이온으로부터 인자 Ⅶ을 분리하는 단계;

b) 지질상 및 상기 인자 Ⅶ을 포함하는 비-지질 수상으로 더 분리되는, 인자 Ⅶ이 풍부한 액체상을 상기 칼슘 화합물의 침전물에서 분리하는 단계; 및

c) 상기 인자 Ⅶ을 포함하는 수용성 비-지질 수상을 회수하는 단계; 를 포함하며,

상기 a) 단계의 상기 칼슘 화합물은 카세인 소단위(sub-unit)의 집합체(aggregate)인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 인산염은 인산나트륨(sodium phosphate), 인산리튬(lithium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 인산루비듐(rubidium phosphate) 및 인산세슘(cesium phosphate)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제2항에 있어서,

상기 인산염은 인산나트륨인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

수용액에서 상기 가용성 인산염의 농도는 100mM 내지 3M인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 수용액에서 상기 가용성 인산염의 농도는 200mM 내지 500mM인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 수용액에서 상기 가용성 인산염의 농도는 200mM 내지 300mM인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 단계 b)는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 방법은 상기 단계 c) 후에, 공극률이 줄어드는 필터에서 연속적으로 수행되는 비-지질 수상(aqueous-phase)을 여과하는 단계 및 울트라 필터 장치(ultrafiltration)에 의한 농축(concentration) 및 투석(dialysis) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 여과하는 단계는 1㎛의 공극률에서 0.45㎛ 공극률로 공극률이 줄어드는 필터에서 수행되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 지질상은 1㎛에서 0.45㎛으로 공극률이 줄어드는 필터에서 여과되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 인자 Ⅶ은 우유에 선천적으로 존재하지 않는 단백질인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 우유는 인간이 아닌 형질전환 포유동물의 우유인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제12항에 있어서,

상기 포유동물은 토끼, 양, 산양, 소, 돼지 및 쥐의 암컷 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
과염분(hypersaline), 염기성이며, 가용성 카세인 및 적어도 하나의 인자 Ⅶ을 포함하며, 제1항에 의한 방법에 의해 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 우유의 비-지질 수상.
제1항에 있어서,

상기 단계 c) 후에, 미리 결정된 농도의 인산염에 기반을 둔 버퍼로 단백질을 용출시키는, 친화성 크로마토그래피의 단계 d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 친화성 크로마토그래피는 하이드록시아파타이트 젤(hydroxyapatite gel; Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) 또는 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca₁₀(PO₄)₆F₂)을 크로마토그래피 고정상으로 하는 크로마토그래피 컬럼에서 수행되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 단계 d)에서 얻어진 용출액은 접선 여과를 거치는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 방법은 단계 c) 다음에 바로, 적어도 한 번의 이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 단계 c) 다음에 바로, 이온 교환기에서 적어도 두 번의 연속 크로마토그래피가 수행되는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서,

상기 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제20항에 있어서,

상기 방법은 두 번의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 세 번째의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 방법은 상기 친화성 크로마토그래피 단계 전에 용매 및 세제 중 적어도 하나에 의해 수행되는 안티바이러스 처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
제20항에 있어서,

두 번째 음이온 교환 크로마토그래피에서 유래한 용출액을 나노 필터로 여과하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 Ⅶ을 추출하는 방법.
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