KR101294751B1 - 우유에서 단백질을 추출하는 방법 - Google Patents

우유에서 단백질을 추출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우유의 본래 pH에서 소수성 패치 및 음전하 중 적어도 하나를 가지는, 우유에 존재하는 단백질을 분리하는 방법으로, a) 상기 우유의 지방을 분리하고(skimming) 제거(defatting)하는 단계, b) 크로마토그래피 고정상(chromatographic support)에 상기 단백질이 포획될 수 있는 pH 조건 하에서, 소수성(hydrophobic) 및 이온성(ionic)이 공존하는 리간드(ligand)가 결합한 상기 고정상에 상기 단백질을 포함하는 탈지화된 단편을 통과시키는 단계, 이때 상기 pH는 4.6 이상이며, c) 상기 단백질을 용출시키는(eluting) 단계, d) 용출된 단편에서 우유 단백질을 제거하여 상기 용출된 단편을 정제하는 단계, 및 e) 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

Description

우유에서 단백질을 추출하는 방법{METHOD FOR EXTRACTING A PORTEIN FROM MILK}
본 발명은 소수성(hydrophobic) 및 이온성이 공존하는 리간드(ligand)와 결합한 고정상(support)을 이용하여, 우유에 존재하는 하나 이상의 단백질, 특히 그 3차 구조가 소수성 패치(hydrophobic patch)를 형성하는 구형 단백질의 추출하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 상업적으로 이용가능한 약물은 합성으로 얻어진 화학물질로 이루어져 있다. 실제로, 최근까지, 현대 의약은 질병의 치료 또는 진단을 위해 화학적 합성을 통해 생성된 약물에 상당히 의지하고 있다.
그러나, 단백질은 상당 부분의 생물학 정보를 전달하는 분자에 해당한다. 이것은 특히 많은 호르몬, 성장 인자, 혈액 응고 인자 및 항체를 포함한다.
일반적으로 말하자면, 단백질은 고분자량의 아미노산으로 이루어진 중합체(polymer)이고, 또한 단백질을 적당한 비용으로 화학적 합성을 통해 얻을 수 없다. 보통 치료용 단백질은 살아있는 유기체, 조직, 인간 혈액 또는 동물 혈액 등에서 분리 및 정제된다. 이런 치료용 단백질에는 돼지 췌장에서 추출되는 인슐린; 혈액의 혈장에서 추출되는, 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ와 같은 응고 인자; 및 면역글로불 린 등이 있다.
그러나, 이전의 단백질 제조 방법이 오늘날 널리 사용되고 있지만, 그것들은 단점을 가진다. 혈소판(blood platelet)에서 추출된 특정 단백질은 함량이 낮기 때문에 계속 증가하는 치료에 대한 요구를 충족할 만큼 충분한 양을 분리할 수 없다. 게다가 혈장에 바이러스, 프라이온 또는 다른 병원체가 존재하기 때문에, 치료용 목적을 위해 사용될 수 있는 그런 생성물을 얻기 위해서는 추가적인 바이러스 중화(viral neutralisation) 단계 및/또는 바이러스 제거(viral elimination) 단계를 거쳐야 한다.
이 단점을 극복하기 위해, 세포로 이식된 분리된 유전자에서 단백질을 합성하는데 널리 이용되는 기술인, 유전자 공학 분야에 많이 의지하고 있다. 본래 세포 시스템 밖에서 얻은 그런 단백질은 "재조합(recombinant)" 단백질로 알려져 있다.
이 기술에 따르면, 각종 세포 시스템을 이용할 수 있다.
대장균(E.　 coli) 등과 같은, 박테리아 시스템(Bacterial system)이 널리 이용되고 있고 또한 매우 효과적이다. 박테리아 시스템을 이용하면 저가로 재조합 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 박테리아 시스템은 정교한 폴딩(folding) 방법 등이 요구되지 않는, 간단하고 비-글리코실화된(glycosylated) 단백질의 제조로 제한된다.
균류 시스템(Fungal system) 또한 분비 단백질(secreted protein)의 생산에 이용된다. 그런 균류 시스템의 단점은 균류 시스템이 결과 단백질의 약물 동력적(pharmacokinetic) 성질에 강하게 영향을 주는, 특히 다양한 그룹의 만노스 유도 체(mannose derivative)를 첨가하여, 글리칸 유닛(glycan unit) 및 황산기(sulfate groups)의 그래프크(graft) 등과 같은, 번역-후-변형(post-translational modification)이 일어난다는 것이다.
바큘로바이러스(baculovirus)를 이용하는 시스템은 백신 단백질(vaccinal protein) 또는 성장 호르몬과 같은 다양한 단백질을 생성할 수 있지만, 이 시스템을 산업적으로 적용하는 것은 그리 낙관적이지 않다.
포유류 세포는 또한 단일클론항체(monoclonal antibody)와 같은 복합 재조합 단백질의 제조에서 발전된다. 세포 발현 시스템은 적절하게 접히고(folded) 변형된(modified) 재조합 단백질을 유도한다. 생산 비용에 대해 낮은 수확량이 주요 단점이다.
그런 세포 시스템의 대안으로, 상당량의 단백질을 얻기 위해 형질전환(transgenic) 식물이 채택된다. 그러나, 이들 시스템은 결과 단백질에 특히 많은 면역성 크실로오스 잔기(immunogenic xylose residue)의 첨가와 같은 식물-특이 번역-후 변형(plant-specific post-translational modification)을 수반하며, 그로 인하여 치료용 목적으로의 사용을 제한한다.
상술한 세포 시스템의 한 가지 대안은 재조합 백신 또는 복합 치료용 단백질을 생산하기 위해 형질전환(transgenic) 동물을 이용하는 것을 포함한다. 결과 단백질은 인간의 글리코실화(glycosylation)와 아주 유사한 글리코실화(glycosylation)를 나타내며 또한 적절하게 접힌다. 이 복합 단백질은 성장 호르몬 등과 같은, 단일 폴리펩티드 사슬로만 이루어져 있지 않고, 대신 아미노산의 어셈블리 후에, 특히 특이한 절단, 글리코실화(glycosylation) 및 카르복시메틸화(carboxymethylation)를 통해 다양한 방법으로 변형된다. 대다수의 경우, 박테리아 세포 또는 효모에서는 그런 변형이 일어날 수 없다. 반대로, 형질전환(transgenic) 동물은 박테리아 세포 시스템의 발현 수준 및 세포 배양을 이용하여 얻은 번역-후 변형을 결합할 수 있고, 세포 발현 시스템의 사용에서 소요된 비용보다 더 낮은 생산비로 모두 생산할 수 있다.
형질전환(transgenic) 동물의 생물 물질 중에서, 우유가 재조합 단백질의 매우 만족할만한 분비원이라 여겨지기 때문에, 우유가 연구의 대상이 되고 있다.
형질전환 동물의 유선(mammary gland)에서 특이적으로 우유 단백질을 합성하는 우유 단백질-합성 유전자(milk protein-synthesis gene) 중 하나의 조절 부위(regulatory region)에, 원하는 단백질의 유전암호를 지정한 유전자를 그래프트(graft)하고, 우유로 분비하여 형질전환(transgenic) 동물의 우유에서 생성된 재조합 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.
한 예로, 유청(whey) 단백질 프로모터에 의해 제어되는 원하는 단백질의 유전암호를 지정하는 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 형질전환(transgenic) 포유동물의 우유에서 원하는 단백질을 생성하는 것에 대해 기술하는 유럽특허출원 EP 0 527 063을 참조할 수 있다.
다른 특허 또는 특허 출원으로, 형질전환(transgenic) 포유동물의 우유에서 항체(EP 0 741 515), 콜라겐(WO 96/03051), 인간 인자 Ⅸ(US 6,046,380) 및 인자 Ⅷ/폰비레브컬럼드 인자(von Willebrand factor) 복합물(EP 0 807 170)을 제조하는 것을 들 수 있다.
단백질 발현의 관점에서 이들 방법은 만족할만한 결과를 나타내지만, 재조합 단백질의 근원으로 우유를 사용하는 것은 단점을 가진다. 주요 단점은 만족할만한 수확량으로 우유에서 추출하기 어렵고, 또한 그 후에 정제하기도 어렵다는 것이다.
실제로, 우유는 90%의 물과 3 카테고리로 분류될 수 있는 다양한 성분의 혼합물이다. "락토세럼(lactoserum)"(또는 유청(whey))으로 알려진 첫 번째 카테고리는 탄수화물, 수용성 단백질, 무기질 및 수용성 비타민으로 이루어져 있다. "지질 상(lipidic pHase)" (또는 크림)으로 알려진 두 번째 카테고리는 에멀젼 형상의 지방(fat)을 포함한다. "단백질상(protein pHase)"으로 알려진 세 번째 카테고리는 약 80%의 카세인(casein)을 포함한다. 카세인은 pH 4.6에서 침전가능하며, 또한 칼슘이 있으면 효소 응고제(enzymatic coagulant)인 레닌(rennet)의 작용으로 응고되는 그룹의 단백질을 형성한다. 다양한 카세인이 삼인산칼슘(tricalcium phosphate)의 집합체(집단(cluster))의 형태, 즉 Ca9(PO4)6 등으로 나타나는, 인산칼슘염과 함께 콜로이드 미셀 복합물(colloidal micellary complex)을 형성하며, 이는 약 0.5㎛의 지름에 도달할 수 있다. 친수성 층에 인산칼슘염이 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 결합하면서, 그런 미셀(micelle)은 소수성 핵을 둘러싼 κ-카세인이 풍부한(casein-κ-rich) 친수성 층으로 이루어진 카세인 소단위(sub-unit) 안에서 형성된다. 이 인산칼슘염은 또한 카세인에 결합하지 않고 미셀의 내부 공간에 존재할 수도 있다. 이 단백질상은 락토알부민(락토알부민) 및 락토글로불린(lactoglobulin), 혈액 유래의 알부민 및 면역글로불린 등과 같은 수용성 단백질을 또한 포함한다.
형질전환 동물의 우유로 분비된 재조합 단백질의 특성에 따라서, 재조합 단백질은 락토세럼 또는 단백질상 또는 동시에 둘 다에서 존재할 수도 있다. 특히 카세인 미셀에 포획되어 있을 때, 우유 성분의 각 카테고리가 많고 복잡하여 이 단백질을 더 추출하기 어려워진다. 또한, 두 상 중 하나에 이 단백질이 우세하게 존재하는지 확실하게 예측할 수 없기 때문에 어렵다.
재조합 단백질은 또한 염 및/또는 각종 수용성 복합물의 형태로 존재하는, 우유의 칼슘 이온에, 또는 카세인 미셀의 인삼칼슘염의 칼슘 이온에 친화력을 나타낼 수 있다. 이 친화력은 단백질과 2가(bivalent) 칼슘 양이온 사이 정전기 결합으로 나타난다. 단백질/칼슘 이온의 친화력을 통해 그들의 수치에 따라, 결합력을 결정하는 친화력 상수를 정의할 수 있다. 일반적으로 말하면, 칼슘 이온에 대한 친화력을 나타내는 단백질의 대부분은 미셀의 인산칼슘 염에 결합된다. 따라서, 그것을 추출하기 위해서는 실행과 수확량의 문제와 결부된, 복잡한 단계를 거쳐야 한다.
온도와 pH의 복합적 영향 하에서 종종 재조합 단백질이 변성(denaturation)되기 때문에, 효소 응고 또는 산 침전(pH 4.6) 후 저온 살균을 통해 단백질을 분리하는 낙농 산업에서 사용되고 있는 종래의 용액을 재조합 단백질의 분리(추출)에는 적용할 수 없다. 게다가, 카세인 미셀에 단백질이 포획되어 있으므로 그 추출률이 낮다. 여과, 원심분리 및/또는 침전(sedimentation) 기술에 의하여 우유를 분별하는 물리적인 방법을 포함하는 다른 용액이 있으나, 그 추출 수확량이 상당히 낮고 추출된 재조합 단백질의 순도도 낮다.
유럽특허출원 EP 0 264 166에서 유전적으로 변형된 동물의 우유로 원하는 단백질을 분비하는 것에 대해 기술하고 있으나, 우유에서 이 단백질을 정제하는 단계에 대해서는 기재하고 있지 않다.
미국특허 US 4,519,945에는 상술한 것처럼 산화 및 가열 단계를 통해, 우유에서 카세인 및 락토세린을 침전시켜 재조합 단백질을 추출하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 원하는 단백질의 활성이 상당히 상실되며 그 추출량이 낮다.
미국특허 US 6,984,772에서 형질전환(transgenic) 포유동물의 우유에서 재조합 피브리노겐(fibrinogen)을 정제하는 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 연속적인 원심 분리를 통해 카세인 펠릿에서의 락토세럼 및 단백상을 분리하는 단계를 포함한다. 락토세럼을 분리하고 연속 가공을 통해 저장하여, 피브리노겐의 정제된 용액을 얻는다.
그러나 이 방법은 예를 들면 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ 등의 혈장 응고 인자(plasma coagulation factor)와 같은, 카세인 미셀 안 및/또는 카세인 미셀에 포획된 재조합 단백질을 만족할 수확량으로 생산하는데 적용할 수 없다.
국제공개특허 WO 2004/076695에는 형질전환 동물의 우유로부터 재조합 단백질을 여과하는 방법에 대해 기술한다. 이 방법은 우유를 정화(clarification)하는 제1 단계, 즉 0.2㎛ 세공(pore)의 여과막을 통해 여과될 수 있는 용액을 얻기 위해 우유 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 그런 단계를 통해 결국 카세인 미셀이 제거된다. 따라서, 카세인 미셀 구조 안에 포획된 관심대상의 단백질이 포함되어 있 는 경우에, 수확량의 측면에서 이 단계를 실행하는 것은 타당하지 않다.
미국특허 US 6,183,803에는 우유에서 락토알부민과 같이 우유에서 본래 존재하는 단백질 및 인간 알부민 또는 α1-안티트립신(antitrypsin) 등과 같은 재조합 단백질을 분리하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이 방법은 원하는 단백질을 포함하는 우유를 킬레이트제(chelating agent)와 접촉시키는 초기 단계를 포함한다. 이는 카세인 미셀 구조를 파괴하고 차례로 카세인, 락토세럼 단백질 및 원하는 단백질을 포함하는 정화된 우유 세럼을 형성한다. 방법은 2가 양이온의 불용성 염을 액체 고정상(liquid support)(즉, 정제된 우유 세럼)에 첨가하여, 카세인 미셀의 구조를 재구성하는 단계를 포함한다. 염이 카세인의 정전기 결합 위치를 포화하기 때문에, 미셀에 포획되어 있지 않은 원하는 단백질을 포함하는 액체상 형성을 유도하는, 미셀이 침전한다. 따라서, 이 방법에 따르면, 원하는 단백질은 미셀의 구조상 재형성 및 그 침전에 의해 최종적으로 분리된다.
이 방법은 실행하기에 복잡하며 칼슘 이온에 대해 상대적으로 높은 친화력을 가진 단백질에는 적용될 수 없다. 비타민 K의 영향을 받아 합성되는 것으로 알려진, 응고 단백질은 이 카테고리에 포함된다.
형질전환 동물의 우유로 분비되고 락토세럼에 존재하는 특정 카테고리의 재조합 단백질을 분리하고 정제하는 방법은 수확량이 매우 낮고, 카세인 미셀에 포획된 다른 카테고리의 단백질을 분리하고 정제하는 방법은 실행하기 복잡하고 어렵다는 2가지 사실에서 출발하여, 본 출원인은 단백질의 생물적 활성을 유지하면서, 게다가 만족할 만한 생산량을 가지는, 간단한 실행방법으로 선천적으로 존재하는 또 는 재조합 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ와 같은 선천적으로 존재하지 않는 우유 성분 단백질을 우유에서 추출하는 방법을 제공하게 되었다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 출원인은 다음의 단계를 포함하는, 우유의 본래 pH에서, 소수성 패치 및 음전하 중 적어도 하나를 가지는 우유에 존재하는 단백질을 분리하는 방법을 개발하였다:
a) 상기 우유의 지방 분리(skimming) 및 제거(defatting) 단계,
b) 크로마토그래피 고정상(chromatograhpic support)에 상기 단백질이 포획될 수 있는 pH 조건 하에서, 소수성(hydrophobic) 및 이온성(ionic)이 공존하는 리간드(ligand)가 결합한 상기 고정상에 상기 단백질을 포함하는 지방 분리 및 제거된 단편을 통과시키는 단계, 이때 상기 pH는 4.6 이상이며,
c) 상기 단백질을 용출시키는(eluting) 단계,
d) 용출된 단편에서 우유 단백질을 제거하여 상기 용출된 단편을 정제하는 단계, 및
e) 상기 단백질을 회수하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 한편으로는, 단지 몇 단계만 포함하고, 다른 한편으로는, 리간드(ligand)가 결합된 고정상에 원하는 단백질을 포획하기 위한 첫 번째 단계를 실행하기 전에 우유 정화(milk clarification) 단계를 실행할 필요가 없기 때문에, 실행이 매우 용이하다.
본 발명에 따른 발명은 생우유(fresh milk) 또는 냉동우유에 적용될 수도 있다. 우유는 원하는 단백질을 포함하는, 암소(cow), 암양(ewe), 산양(goat), 토끼(rabbit), 쥐(mouse, rat), 또는 암퇘지(sow) 등의 암컷 포유류의 우유일 수도 있다.
당해 포유류 우유의 본래 유동성(natural fluidity)에 따라, 지방을 분리하고(skimming) 제거(defatting)하는 (즉 탈지화) 단계 이전에 우유를 유동화하는 것이 유리할 수도 있다. 한 예로, 상당히 농도가 진한, 토끼 우유는 본 발명을 더 용이하게 실시하기 위해 유동화(fluidisation)시킬 수도 있다. 그러나, 상당히 농도가 진한 우유의 경우조차, 유동화 단계는 순전히 선택적이다. 이 유동화 단계는 원유에 수용성 용매를 추가해서 실행될 수도 있다. 예를 들면, 수용성 용매는 pH 8.0인, 30mM 인산나트륨 용액과 같은, pH가 7.5 내지 8.5, 바람직하게는 8.0 내지 8.3인, 100mM 이하의 인산염 기반 용액(phosphate salt based solution)일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그런 수용성 용매는 또한 염화나트륨을 포함할 수 있으나, 그 최대 농도는 약 40mM이다. 그런 용액은 우유의 안정된 미셀 구조(현탁액의 카세인 미셀)를 유지한다.
본 발명에 있어, 용어 "지방 분리(skimming)"는 우유에서 지방을 분리하여 탈지유(skim milk) 및 크림의 두 단편을 얻는 것을 의미하는 것으로 이해할 것이다. 지방 분리(skimming)는 당업자에게 공지된 기술이며, 예를 들면 스키머(skimmer) 또는 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)과 같은 유기 용매를 이용하여 지방 분리를 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 특정 구체예에서는, 우유 지방의 분리(skimming)는 양 제타 전위(positive zeta potential)를 가지는 유리섬유 고정상을 통해 여과하여 이루어진다. 그런 여과기의 한 예로, Ultipor® GF Plus filter, HP serie Supradisk filter, AKS active charcoal serie(Pall Life Science), GF filter(whatman), VR Zetaplus filter 또는 Delipid filter(Cuno 3M)를 들 수도 있다. 1μm 임계값(threshold)을 가진 Ultipor® GF Plus filter(Pall) 및 deep filter VR02 또는 VR04(Pall)가 유리하게 사용된다.
이 여과 단계는 단편에서 지방 제거(de-fat), 즉 지방산, 글리세라이드 및 스테롤과 같은 지질을 제거할 수 있게 한다. 이 지방제거(defatting)는 희석된 우유를 30분 동안 유지(stand)하게 한 후 (그래서 표면에 지방질이 떠있고, 그로 인해 우유에서의 크림 분리가 최적화된다) Ultipor® GF Plus 여과기를 통해 우유를 전면 여과(frontal filtration)를 하여 이루어진다.
고정상과 결합한, 소수성과 이온성이 공존하는, 리간드(ligand)가 지질을 흡착하기 때문에 이 지방 분리(skimming) 및 제거(defatting) 단계(탈지 단계)는 중요하다. 지질이 단계 b) 전에 제거되지 않으면, 원하는 단백질이 리간드(ligand)에 의해 유지될 수 없기 때문에, 또는 거의 유지될 수 없기 때문에, 지질은 단계 b) 전에 제거되어야 한다. 그렇지 않으면, 원하는 단백질의 추출 방법에서 수확량이 감소할 것이다.
본 발명의 유리한 한 측면은 단순히 우유 지방이 분리(skimming)되고 제거(defatting)되는, 단계 a)에서 유래하는 단편이 매우 유리하게 친화성 크로마토그래피(affinity chromatograpHy)을 통한 정제 단계인, 단계 b)를 실시하는데 적당하다는 사실이다. 따라서, 단계 b)의 친화성 크로마토그래피를 통한 정제 단계에 적당한 탈지된(defatted and skimmed) 단편을 만들기 위해서 중간 단계가 필요하지 않다는 것은 확실하다.
4.6 내지 5 사이의, 카세인의 등전점(isoelectric point; pI)보다 낮은 pH에서 단계 b)를 실행하면 안 된다. 사실, 단계 b)가 카세인의 pI보다 낮은 pH에 실행되면, 카세인이 침전될 것이며, 그로 인하여 크로마토그래피 고정상에 심각한 손상을 초래할 위험이 있다. 특히, 컬럼을 사용하여 크로마토그래피 단계를 실행할 때, 카세인 침전물이 컬럼을 막을 수도 있고, 그로 인하여 컬럼 및 그 내용물, 즉 크로마토그래피 젤에 손상을 입힐 수도 있다. 게다가, 4.6 이하의 pH에서는 트랜스페린(transferrin) 또는 알부민(albumin) 등과 같은 다른 단백질도 침전될 수 있으므로, 그 수확량이 감소할 것이다. 마지막으로, 특정 단백질은 산성 pH에서 변성된다. 이 예로서, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 피브리노겐 및 보체 인자 H(complement factor H)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 b)는 pH 5 내지 8.5 사이에서 유리하게 실행된다. 그래서 단계 a)에서 생성된 탈지되고 변성된 우유는 pH 5 내지 8.5 사이에서 단계 b)의 크로마토그래피 고정상에 적용된다. 이 pH는 5.5 내지 8, 또는 6 내지 7.5 사이에서 유리하다. 이 pH는 바람직하게 6.5 내지 6.8 사이이다. 이 pH는 더 바람직하게 우유 본래의 pH이다.
그런 pH(즉, pH 5 내지 8.5)에서, 본래의 상호작용 자리를 가지는 단백질, 즉 항원/항체 친화력 또는 위친화력(pseudoaffinity), 효소/기질 친화력 또는 위친화력 또는 효소/저해제(inhibitor) 친화력 또는 위친화력 (이에 한정되는 것은 아님) 등을 가지는 단백질은 전하 및 서로에 대해 상대 위치에서 소수성 영역을 본래 가지며, pH 5 내지 pH 8.5 사이로 매우 다양하지 않다. 그러므로, 이 pH에서, 이들 단백질은 음 전하를 띤다. 유리하게, 이 pH에서, 리간드(ligand)와 단백질 사이의 상호작용은 근본적으로 소수성 반응이다.
유리하게 본 발명에 따른 방법에서 사용된 크로마토그래피 기술은 원하는 단백질을 포함하는 탈지된(defatted and skimmed) 단편이 소수성과 이온성이 공존하는 리간드(ligand)가 결합한 고정상에 포획되게 하는 것이다. 놀랍게도, 그런 리간드(ligand)는, 그 구조 때문에, 해리된, 카세인 미셀을 포함하는, 불순물을 남기면서, 소수성 패치를 가지는 원하는 단백질과 결합할 수 있게 된다. 단백질의 내부 소수성 영역은 이런 종류의 리간드(ligand)에 결합할 수 있고, 그로 인하여 원하는 단백질에 대한 높은 친화력 및 정제될 단백질에 대한 증가된 선택도(selectivity)를 보장한다.
해리된 단백질은 근본적으로 대부분 카세인(casein), 유청 산 단백질(whey acid protein; WAP), 트랜스페린(transferrin), 락토글로부민(lactoglobumin), 락토알부민(lactalbumin) 및 혈청 알부민(serum albumin)으로 이루어져 있다.
게다가, 이 방법은 지정된 특성을 가진 모든 단백질을 추출하기에 적당하다: 즉, 약 6.5 내지 6.8 범위 내인, 우유의 본래 pH에서, 단백질이 소수성 영역을 가지며 음전하를 띠며; 또는, 적어도 전하의 전체 균형이 음 전하 쪽으로 치우쳐 있다.
본 발명의 범위 내에서, pH 조건을 통해 단백질이 소수성 상호작용뿐만 아니라 소수성 상호작용 또는 정전기 상호 작용을 통해, 크로마토그래피 고정상의 리간드(ligand)에 의해 유지- 또는 일반적으로 결합-될 수 있다. 그런 조건은 정제될 단백질의 등전점에, 그로 인해 방법이 실행되는 pH에 상당히 의존한다. 이용될 수 있는 크로마토그래피 고정상은 (음이온 교환(anion-exchange) 유형의) 양 전하를 띤 리간드를 가지는 고정상이며, 단백질이 전반적으로 음전하를 띠도록 pH를 조정할 수도 있다. 반대로, 본 발명의 실행에 유리하게 사용되는, 즉 5 내지 8.5의 pH에서 방법이 실행될 때. 음 전하를 띠는 리간드(ligand)가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 이 리간드(ligand)의 말단 작용기(terminal functional group)는 술포닐기(sulfonyl group) 또는 카르복실기(carboxyl group)일 수도 있고, pH는 6 이상으로 설정되어, 단백질이 전반적으로 양전하를 띤다. 정제될 단백질의 등전점이 염기 pH, 특히 6 이상이여서, 단백질이 양전하를 띄 때, 이 구체예를 적용할 수 있다. 본 발명을 실행함에 있어 pH는 호환가능해서, 추출될 단백질 또는 우유 단백질에 상당한 손상을 입히지 않는 것을 보장해야 한다.
다른 구체예에서, 단계 b)가 실행되는 pH는 5 내지 8.5 사이에 있고, 단백질과 리간드(ligand) 사이 상호작용이 근본적으로 소수성 상호작용이 되도록 pH 값을 선택한다.
예를 들면, 단계 c) (용출(elution))는 이온 반발작용 효력(ionic repulsion effect) 및 무질서 효력(chaotropic effect) 때문에 단백질이 더 이상 유지되지 않게 하는, 당업자에게 공지된 모든 용리액(eluent)을 이용하여 실행될 수 있다. 용출은 바람직하게 이온 반발작용 효력을 필요로 한다. 단백질의 구조상 형태 및 단백질의 전하를 용출 버퍼(elution buffer)의 pH를 조정하거나, 적당한 용출 버퍼를 선택하여 변경할 수 있다.
단계 b) 실시 전에, 20 내지 30mM, pH 8.0인 인산나트륨 용액과 같은, 농도가 100mM 이하이고, pH가 7.5 내지 8.5, 바람직하게는 8.0 내지 8.3인, 인산염을 기반으로 한 용액(로딩 버퍼(loading buffer))으로 크로마토그래피 고정상을 평형화시킨다. 그런 용액은 또한 최대 농도가 약 100mM이고 바람직하게 20~60mM의 범위인, 염화나트륨을 포함할 수도 있다. 또한, 그런 용액은 전도도가 30 내지 40mS/cm 사이, 특히 35mS/cm인, 구연산염, 특히 pH 7.5~8.5이고 0.20~0.30M, 바람직하게는 0.25M인 구연산삼나트륨(trisodium citrate)일 수도 있다.
추가로, 로딩 버퍼와 동일한 버퍼로 단계 b) 바로 다음에 세척 단계를 실행할 수도 있다. 이 세척 단계의 효과는 정의된 파장, 예를 들면 280㎚에서, 0 또는 기준값으로 회복되어야 하는, 광학 밀도 측정(optical density measurement)(OD)을 통해 체크된다. 따라서 얻어진 단편을, 사정에 따라서 모을 수도 있다. 용출, 단계 c)의 실시는 이온 반발작용 효력을 통해 또는 또한 무질서 효력을 통해, 더 이상 단백질을 유지시킬 수 없는, 당업자에게 공지된 어떤 용리액으로 실행될 수도 있다. 바람직하게, 용출은 이온 반발작용 효력을 통해 실행된다. 단백질의 구조상 형태 및 단백질의 전하를 용출 버퍼의 pH를 조정하거나, 적당한 용출 버퍼를 선택하여 변경할 수 있다.
한 예로, 크로마토그래피 고정상은 농도가 1.2 내지 8M인 우레아(urea) 및 농도가 25mM 내지 50mM인 글리신(glycine)의 혼합물로 형성될 수 있는, 양 전하를 띠는 리간드(ligand)를 가지는 것으로 추정되며, 상기 농도는 혼합물의 최종 농도이다. 단백질의 아미노 그룹과 우레아가 반응하면 단백질이 일부 변성될 수도 있고, 외래 화합물(exogen compound)(여기서는 글리신)에 아미노 그룹이 존재하면, 우레아가 단백질, 즉 표적 단백질을 덜 변성시킨다는 것을 주목해야 한다.
다른 예의 용리액은 pH가 4 내지 6인 산성 수용액을 포함할 수 있고, 수용성 혼합물은 5mM 내지 50mM, 바람직하게 30mM의 인산나트륨 및 에틸렌 글리콜(ethylene glycol); 5mM 내지 50mM, 바람직하게 30mM의 구연산나트륨 및 에틸렌 글리콜; 5mM 내지 50mM, 바람직하게 30mM의 인산나트륨 및 에틸렌 글리콜; TRIS/NaCl, 1mM 내지 10mM, 바람직하게 5mM의 칼슘염 및 에틸렌 글리콜; 10mM 내지 100mM, 바람직하게는 30mM인 카프르산 나트륨(sodium caprate) 및 에틸렌 글리콜; 로 이루어진 그룹에서 선택된 둘 또는 세 개의 구성요소를 포함한다.
30mM 인산나트륨 용액과 같은 화합물의 존재 결과, 전도도가 3mS/㎝ 이하인 수용성 혼합물이 이용될 수 있다. 상기 농도는 혼합물의 최종 농도이다. 에틸렌 글리콜을 포함하는 상기 두 종류 혼합물에 있어, 에틸렌 글리콜의 부피비는 특히 20 내지 70%이다.
에틸렌 글리콜을 포함하는 이들 버퍼 전부에 있어, 에틸렌 글리콜은 덜 유독한 프로필렌 글리콜, 또는 다른 용매로 대체될 수도 있다. 우레아는 아미노산의 존재 하에 유리하게 용출제(elution agent)로 이용될 수도 있고, (용출제의 최종 농도는 우레아에 있어 1.2 내지 8M, 글리신 또는 다른 아미노산에 있어 25 내지 50mM으로 다양하며,) 무질서도(chaotropic power) 때문에, 이 용액은 리간드(ligand)와 흡착된 단백질 사이의 상호작용을 억압할 수 있다.
수용성 혼합물의 pH는 바람직하게 7 내지 8.5이며, 너무 산성의 pH는 관심대상 단백질을 변성시킬 수도 있고, 그래서 불용성 단백질로 될 수 있다.
이 수용성 혼합물은 또한 0.5% 내지 1.5%, 특히 1%의 비이온성 계면활성제(non-ionic detergent)로서, Triton® X100를 포함할 수도 있다. 본 출원인은 일부 실험에서, pH가 7 내지 8.5인 그런 계면활성제가 존재하면 용출된 단백질의 회수량이 향상됨을 관찰하였다.
또한 물, 바람직하게 WFI(주사용 이중증류수(bi-distilled water for injection))을 이용할 수도 있다.
한 특정 구체예에서, 단계 b)의 실시를 위한 pH가 5 내지 8.5일 때, 리간드(ligand)의 pKa가 단백질의 등전점보다 낮으면, 리간드(ligand)의 pKa 이하로 pH 값을 낮춰서 용출시키고, 단백질의 등전점보다 리간드(ligand)의 pKa가 낮으면, 단백질의 등전점 이하로 pH를 낮춰서 용출시킬 수도 있다.
원하는 단백질을 포함하는 단편의 용출에 이어, 락토페린, 락토알부민, 트랜스페린, 알부민 및 면역글로불린과 같은 오염 단백질(contaminant protein)을 제거하기 위하여 정제 단계(purification step)가 필요하다. 그런 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예로, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온-교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography), 음이온-교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography), 또는 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 d)는 또한 유리하게, 표적 단백질의 복원을 즉, 적당한 폴딩(folding) 을 이룰 수 있게 하여, 본래 단백질과 동등한 생물 활성을 단백질에 부여한다.
선택적으로, 변성제(denaturing agent)를 제거하기 위한 간단한 투석 또는 투석여과(diafiltration)를 통해 복원될 수도 있다.
특히 펌핑 장치(pumping device) 및 검출 시스템(detection system)을 포함하는 표준 크로마토그래피 기구로 UV-가시광선 흡수(UV-visible absorption)를 통해 다양한 크로마토그래피 단계를 실시한다.
원하는 단백질을 포함하는 단편에 존재하는 마지막 유단백질(lactic protein)을 제거하는 이 단계에 이어, 정제된 원하는 단백질을 포함하는 단편을 회수한다.
원하는 단백질을 포함하는 단편을 회수하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예로, 용출에서 상용화된, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온-교환 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 또는 크기 배제 크로마토그래피를 들 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 우유 지방 분리(skimming) 및 제거(defatting) 단계(단계 a)) 후 단계 b) 전에 우유를 정화하는(clarifying) 단계를 실시한다.
용어 우유의 "정화(clarification)"는 미셀을 붕괴하여 제거하고, 카세인, 락토세럼 단백질 및 원하는 단백질을 포함한 정화된 우유 세럼을 얻는 것으로 이루어진 단계를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이 경우, 카세인 미셀과 결합하고 있던 원하는 단백질이 정제된 단편을 농축할 수 있기 때문에, 미셀과 결합한 원하는 단백질을 운반하는 미셀이 제거되는, 정화 단계를 포함하지 않는 실시예에 비해, 이 구체예를 통해 더 양호한 생성량을 얻을 수 있다. 또한, 이 구체예를 통해 우유에 존재하는 (박테리아, 상피 세포 또는 우유 림프구 등과 같은) 어떤 미생물 병원체 또는 세포성 병원체(cellular agents) 및 세포 잔해(cell debris)를 제거하기 위해 미크론 이하(submicron) 여과를 실행할 수 있다.
특히, 우유 정화 단계는 일정 농도로 킬레이트화제(chelating agent)를 추가하면, 우유와 혼합된 후에 우유의 미셀 구조가 사라져 정제된 우유(용액 내의 카세인 또는 락토세럼)를 얻는다. 킬레이트화제를 이용한 우유 정화는 당업자에게 공지되어 있다. 킬레이트화제의 한 예로, 구연산삼나트륨(trisodium citrate) 또는 EDTA를 들 수 있다. 예를 들면, 최종 농도가 0.25M인 구연산삼나트륨은 우유를 완전히 정화한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 우유 지방 분리 및 제거(탈지화, skimming and defatting) 단계 (a) 단계) 후 단계 b) 전에, 일반적 실시에 따라 특히 여과 또는 원심분리를 통해, 카세인 서브유닛 집단(casein subunit cluster)을 침전시킨다.
선택적이지만, 이 단계는 침전을 통해 우유의 콜로이드 상태를 불안정하게 할 수 있다. 원하는 단백질을 카세인 미셀 또는 서브유닛에서 분리 또는 해리시키고, 그로 인하여 미셀과 결합한 단백질을 회수시킬 수 있다.
본 발명의 한 특정 구체예에서, 소수성과 이온성이 공존하는 리간드(ligand)는 4-메르캅토-에틸-피리딘(4-mercapto-ethyl-pyridine)이다.
이 리간드(ligand)를 포함하는 고정상의 한 예는 MEP HyperCel® gel (CipHergen®)이다. 한 예로, 그런 고정상에서 원하는 단백질을 흡착하게 하는 조건은 단백질의 등전점(단백질의 음전하) 이상에서 적어도 0.5pH 유닛 및 리간드(ligand)의 pI(젤의 양전하) 미만에서 적어도 1pH 유닛인 pH값을 포함할 수도 있다. 원하는 단백질이 FⅦ인 경우에, 선택된 pH는 8일 수도 있다. pH 조건 하에서 바람직하게 리간드(ligand)에 단백질이 흡착되어서 단백질과 리간드(ligand) 사이의 상호작용은 근본적으로 소수성이다. 이 pH는 바람직하게 5 내지 8.5이다.
정제될 단백질이 인자 Ⅶ인 본 발명의 특정한 구체예에서, 리간드(ligand)의 pKa 이하, 즉 4.8 이하인 pH로 pH를 낮춰서 용출시킬 수도 있다.
리간드(ligand)가 4-메르캅토-에틸-피리딘인 경우, 용출 단계 c)는 리간드(ligand)의 pKa 이상, 즉 4.8 이상인 pH에서, 물, 특히 WFI(bi-distilled water for injection)로, 상술한 수용성 용액과 혼합물을 이용하여 실시할 수 있고, 상기 pH는 6 이상 9 이하일 수 있고, 바람직하게는 7.0 내지 8.5일 수도 있다. 그 경우에서, 예를 들면 단백질은 인자 Ⅶ이다.
또한, 본 출원인은 4-메르캅토-에틸-피리딘 유형의 리간드(ligand)를 가지는, MEP HyperCel® 젤, 또는 2-메트캅토피리딘(2-mercaptopyridine) 유형의 리간드(ligand)를 가지는 Hitrap IgY 젤이 그 구조가 참조 분자와 "일치하는(consistent)", 즉 활성화될 수 있는, 특정한 FⅦ에 관한 선택도를 나타낸다는 것을 발견하였다. 실제로, 이 젤에 흡착되지 않는 형태에 관하여, 본 출원인은, 정기적으로, 활성화 가능한 형태(FⅦ 비색검사법(amidolytic FⅦ assay)) 및 전체 형태(FⅦ 항원검사법(antigen FVⅡ assay)) 사이의 차이를 관찰했다. FⅦ 비색검사법은 1 혈장 항원단위(plasma antigen unit)를 산출하는, 항원의 생체조건외(in vitro) 활성에 대응되며, 1 비색(amidolytic) 단위를 활성 비율=1로 정의한다. 단백질은 정제 과정 동안 많은 물리-화학적 또는 생화학적인 변성이 일어날 수도 있다. 이 비율은 0.8 내지 1.2 사이에 있을 때 정상이라고 하고, 유리하게는 1이다. 형질전환(transgenic) 동물에서, 인자 Ⅶ의 젖 분비는 100% 균질이 아니며, 당업자는 특히 단백질의 3차원 구조의 글리코실화(glycosylation) 및 폴딩(folding)을 포함하는 번역-후 변형의 차이를 알고 있다. 따라서, 형질전환(transgenesis) 후에 FⅦ가 유방 세포(mammary cell)에 의하여 생성되고, 상기 FⅦ는 유선에 의해 우유로 분리되기 전에 글리코실화(glycosylation)되고 폴딩(folding)된다. 생성될 분자의 100%가 기능성이라는 것을 보장할 수 없다. 본래 포함되어 있는 제어 메커니즘이 형질전환(transgenic) 세포에서 변형될 확률이 높다; 특히, 본래 단백질과 비교하여 형질전환(transgenic) 단백질의 글리코형태(glycoforms)의 성숙에서 차이가 관찰되었다.
따라서, 4-메르캅토-에틸-피리딘 유형의 리간드(ligand)를 가지는 MEP HyperCel® 젤 또는 2-메르캅토피리틴 유형의 리간드(ligand)를 가지는 Hitrap IgY 젤에 흡착되지 않는 FⅦ의 형태는 0.4 내지 0.5의 비율이고, 용출된 형태는 1.0 내지 1.4의 비율이다. 그러므로, MEP HyperCel® 젤은, 흡착에 의하여, 본래 형태와 가장 유사한 항원 형태를 선정하고, 반대로 형질전환(transgenic) 동물에 의한 가공에서 결합되지 않은 형태가 결점을 나타낸다는 가설을 세울 수 있다. 목적이 우유에서 눈에 띄는 부작용 없이 인간에 주입될 수 있는 인간 FⅦ를 추출하는 것이고, 이 목적을 위해, FⅦ가 본래 형태와 가능한 유사해야 하므로, 이것은 명확한 장점이다. 비색(amidolytic)/항원 활성 비율은 이 조건이 성취되었는지를 나타내는 도구이다.
본 발명의 다른 특정한 구체예에서, 소수성과 이온성이 공존하는 리간드(ligand)는 메르카토-벤지미다졸 술폰산(mercapto-benzimidazole sulfonic acid)이다.
이 리간드(ligand)를 포함하는 고정상의 한 예는 MBI HyperCel® 젤 (CipHergen®) 또는 Capto MMC(GE Healthcare)이다.
이 유형의 고정상을 이용할 때, pH 5 내지 6의, 약산성인 유지 조건(단계 b)을 채용하는 것이 적당하다. 그런 pH 값에서, 카세인의 가용성이 낮고, 침전이 일어나기 시작할 수도 있다. 1M NaCl와 같은, 염을 추가하면 pH 5 내지 6에서 카세인의 가용성을 유지할 수 있다. 이미 정의된 수용성 용액과 혼합물로 용출시킬 수도 있다.
단계 d)는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해, 특히 강염기 유형 음이온 교환 고정상의 실시를 통해, 즉 R이 메틸기 또는 에틸기와 같은 알킬기인, -NR3+ 유형의 4급 암모늄 그룹(quaternary ammonium group)으로 유리하게 실시된다. 상업적으로 이용 가능한 그런 고정상은 이 단계의 실시에 적당할 수도 있다.
음이온 교환 단계가 원하는 분자, 즉 FⅦ를 농축하고 활성화 인자 Ⅶ로 전환시키고 배좌 용출(conformational elution)을 통해 정제되는 것을 허용하므로, 유리하게 낮은 이온 세기 및 pH는 음이온 교환 단계를 특히 적합하게 한다(즉, 칼슘 포화 후의 전체적인 단백질 전하가 음성을 띠도록 N-말단부(gla 도메인)에서의 전하에서 교환이 일어나는, 칼슘 결합에 특히 연결되는 형태의 교환).
바람직하게 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 일어나는 단계 d)에서, 1 내지 50mM, 바람직하게는 2 내지 25mM, 더 바람직하게는 3 내지 12.5mM, 또는 4 내지 6mM의 칼슘 이온 용액을 이용하여 단백질을 용출시키며, 상기 칼슘 이온원은 예를 들면, 염화칼슘에 의해 제공된다. 유리하게, 단계 d)에서, 5mM 칼슘 이온 용액으로 단백질을 용출시킨다.
다른 구체예에서, 용출에 사용되는 용액은 구리염, 아연염 또는 망간염을 기반으로할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 재조합 단백질의 추출 또는 당해 포유동물의 우유에서 본래 존재하는 단백질의 추출을 위해 실행될 수도 있다.
단백질은 우유에 본래 존재하는 단백질, 예를 들면, β-락토글로불린, 락토페린, α-락토알부민, 또는 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 또는 그 혼합물일 수도 있다.
단백질은 또한 우유에 본래 존재하지 않는 단백질일 수도 있다. 예로서 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 X, 알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin), 안티트롬빈 Ⅲ(antithrombin Ⅲ), 알부민, 브리노겐, 인슐린, 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), 프로인슐린(proinsulin), 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator) 및 항체 등을 들 수 있다.
한 구체예에서, 단백질은 재조합 단백질이고 그것을 포함하는 우유는 형질전환(transgenic) 우유이다. 실제로, 우유에 본래 존재하지 않는 단백질은 재조합 DNA와 형질전환(transgenesis) 기술을 사용하여, 비-인간 형질전환(transgenic) 포유동물에 의해 우유에 합성될 수 있다.
당업자에게 공지되어 있는, 이 기술은 형질전환(transgenic) 동물의 우유에서 모든 원하는 단백질을 합성할 수 있게 한다.
그런 단백질은 재조합 단백질 또는 형질전환(transgenic) 단백질이며, 본 출원에서는 상기 두 형태를 동등물로 취급하기 때문에, 그런 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성된다.
용어 "형질전환(transgenic) 동물"은 그의 게놈에, 특히 원하는 단백질의 유전정보를 암호화한 단편을 포함하는, 외래 DNA의 단편이 통합된 모든 비-인간 동물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 따라서 당해 동물은 외래 DNA에 의해 인코딩되는 단백질을 발현하고 그 자손에게 외래 DNA를 전달할 수 있다,
그러므로, 모든 비-인간 포유동물도 그런 우유의 생산에 적당하다.
토끼, 암양, 산양, 암소, 암퇘지 및 쥐를 유리하게 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환(transgenic) 포유동물의 우유로의 분비를 유도하는, 유선에 의한 원하는 단백질의 분비는, 조직-의존적 방법(tissue-dependent manner)으로 재조합 단백질의 발현을 제어하는 것을 필요로 한다.
그런 제어 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 발현의 제어는 특정한 동물 조직에서 단백질을 발현시키는 서열을 통해 달성된다. 이 서열은 신호 펩티드 서열뿐만 아니라, 특히, 프로모터 서열을 포함한다.
당업자에게 공지되어 있는 프로모터의 예는 WAP(whey acidic protein) 프로모터, 카세인 프로모터 및 β-락토글로불린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환(transgenic) 동물의 우유에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수도 있다: 유전자가 우유에 본래 분비되는 단백질의 프로모터에 의해 제어되는, 원하는 단백질의 유전암호를 지정하는 유전자를 포함하는 합성 DNA 분자를 비-인간 포유동물의 배(embryo)로 이식한다. 배는 동종의 암컷 포유동물로 도입되어, 형질전환(transgenic) 동물을 낳는다. 일단 객체가 충분히 성장하면, 포유동물의 젖 분비를 유도하여 우유를 모은다. 그러면, 우유는 원하는 재조합 단백질을 포함한다.
인간 이외에 암컷 포유동물의 우유에서 단백질을 제조하는 방법의 한 예는 본 발명에 따른 원하는 단백질의 생산에 적용될 수도 있는 EP 0 527 063이다.
WAP 프로모터를 포함하는 플라스미드를 WAP 유전자를 위한 프로모터를 포함하는 서열을 도입하여 제조하고, 이 플라스미드를 WAP 프로모터에 의존하는 외래 유전자를 받을 수 있는 방법으로 만든다. 원하는 단백질의 유전암호를 지정하는 유전자가 통합되고, WAP 프로모터에 의존적으로 만들어진다. 프로모터 및 원하는 단백질의 유전정보를 지정하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 토끼 배의 수컷 전핵(male pronucleus)으로 미세주입(microinjection)하여 토끼와 같은, 형질전환(transgenic) 동물을 얻기 위하여 이용한다. 그러고 나서 배를 호르몬이 준비된 암컷의 수란관으로 이식한다. 생성된 젊은 형질전환(transgenic) 토끼에서 추출된 DNA를 사용하여, 서던 블랏팅(Southern blotting)을 통해, 외래유전자(transgenes)의 존재를 검출한다. 특정한 방사선면역분석(Radioimmunological assay)을 사용하여 동물 우유의 농도를 평가한다.
단백질은 유리하게 응고 단백질이다. 본 발명에 따른 단백질은 인자 Ⅱ(FⅡ), 인자 Ⅶ(FⅦ), 인자 Ⅸ(FⅨ), 인자 X(FX) 및 그들의 활성화 형태, C 단백질, 활성화된 C 단백질, S 단백질 및 Z 단백질, 또는 그 혼합물에서 유리하게 선택된다.
특히 유리한 방법에서, 본 발명에 따른 단백질은 FⅦ 또는 활성화된 FⅦ(FⅦa)이다.
이때, FⅦ 또는 FⅦa는 상기에서 그 방법의 요약을 제공한 EP 0 527 063의 개시에 따라 생성될 수도 있다. 인간 FⅦ의 서열인 DNA 단편을 WAP 프로모터의 제어 하에 둔다. 예를 들면, 그런 DNA 서열은 EP 0 200 421에서 기술된 서열번호 1b이다.
본 발명에 따른 FⅦ는 유리하게 활성화된다. FⅦa는 각종 프로테아제(FⅨa, FXa, 및/또는 FⅦa)에 의해 효소원(zymogen)을 절단하여 생체내(in vivo)에서 얻어진다. FⅦa 만으로는 효소 활성이 매우 작지만, 그 공동 인자(조직 인자(FT))와 복합체를 형성하면, FX 및 FⅨ를 활성화하여 응고 반응을 촉진한다.
조직 인자 (FT) 상호작용할 때의 FⅦa의 응고 효력은 FⅦ의 응고효력보다 25 내지 100배 더 크다.
특히 유리한 방법에서, 단백질은 인자 Ⅶ(FⅦ)이다.
본 발명의 한 구체예에서, FⅦ는 인자 Xa, Ⅶa, Ⅱa, Ⅸa 및 XⅡa에 의해 생체외에서(in vitro) 활성화될 수도 있다.
본 발명에 따른 FⅦ는 또한 그 정제 과정 동안 활성화될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 포유류 우유의 지방 분리 및 제거를 위한 양 제타 전위(positive zeta potential)를 가지는 유리필터를 이용하는 것이다. 원심분리에 의한 전통적인 분리방법은 산업적 규모로 사용하기에 시간이 너무 소요되고 지방 제거를 위한 특정 용매(프레온과 같은, 클로로포름(chloroform) 유도체 또는 플루오로알칸(fluoroalkane) 유도체)를 사용하기 때문에 유리하게 이와 같은 실시를 통해 대체한다.
본 발명의 또 다른 목적은 지방이 분리 및 제거된(skimmed and defatted) 우유에 존재하는 단백질을 추출하기 위해, 소수성과 이온성이 공존하는 리간드(ligand)가 결합된 고정상을 이용하는 것이다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 다음의 실시예에서 기술되며, 이는 설명의 목적을 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도 1: MEP HyperCel® 젤에서의 용출 버퍼 실험.
실시예 1: 우유에서 인간 FⅦ을 생성하는 형질전환( transgenic ) 토끼의 제조
먼저, Bam H1 및 Hind Ⅲ 서열 사이에, p-poly Ⅲ-I 벡터(Lathe et al., Gene (1987) 57, 193 201)의 폴리링커(polylinker)로 WAP 유전자(Devinoy et al ., Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16 (August 25, 1988, page 8180))의 BamH1-Hind Ⅲ 서열(6.3Kb 단편)을 도입하여 p1 플라스미드를 제조하였다.
이 클로닝 동안, BamH1 자리를 삭제하고 p1 벡터에서 나타나는 ClaI 위치로 대체하였다. 따라서, p1 벡터는 6.3Kb WAP 프로모터의 제어하의 외래 유전자를 받을 수 있는 플라스미드이다. 예를 들면 외래 유전자는 폴리링커의 SalI 위치로 도입될 수 있다. 프로모터 전체를 포함하는 삽입물(insert) 및 외래 유전자는 p-poly Ⅲ-I 플라스미드 폴리링커의 말단에 위치한 2개의 Not1 자리에서 절단된 후 플라스미드에서 분리될 수 있다.
p1 플라스미드에서 얻어진 p2 플라스미드는, 토끼 WAP 유전자(6.3Kb) 및 인간 FⅦ 유전자를 위한 프로모터를 포함한다. 형질전환(transgenic) 토끼를 얻기 위하여 이용된 단편은 2개의 Not1 자리 사이에 있다.
클로닝 자리로 역할을 하기 위해 특정 부위의 돌연 변이(site directed mutagenesis)를 통해 HindⅢ 자리를 유전자 선도 서열(gene leader sequence)로 도입하였다.
전통적인 미세주입 기술(classical microinjection technique)(Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438 4442)을 통해 형질전환(transgenic) 토끼를 얻었다. 유전자 500 카피를 포함하는 하나 또는 두 개의 p1 플라스미드를 쥐 배의 수컷 전핵(male pronucleus)으로 주입하였다. p-poly Ⅲ-I 벡터((Lathe et al., Gene (1987) 57, 193 201))를 제조하였다. 재조합된 유전자를 포함하는 이 벡터의 Not1-Not1 단편을 미세주입하였다. 그러고 나서 배를 호르몬이 준비된 채용 암컷의 수란관으로 이식하였다. 조작된 배의 약 10%가 어린 토끼를 낳았고, 조작된 배의 2 내지 5%는 어린 형질전환(transgenic) 토끼를 낳았다. 토끼의 꼬리에서 추출된 DNA를 이용하여 서던 블랏팅(Southern blotting)를 통해 외래유전자(transgene)의 존재를 검출하였다. 특정 방사선면역분석법(radioimmunological assay)를 사용하여 동물의 혈액 및 우유의 FⅦ 농도를 평가하였다.
세포 배양 고정상 또는 토끼 유방 외식 배양 고정상(rabbit mammary explant culture support)에 우유를 첨가해서 FⅦ의 생물 활성도를 평가하였다.
본 발명에 따라, 그들의 우유에서, FⅦ를 생성하는 형질전환(transgenic) 토끼를 얻기 위하여 이용된 기술은 유럽특허번호 EP 0 527 063에 상세히 기술되어 있다.
실시예 2: 지방 분리 및 제거된 단편의 제조
원료는 1리터당 약 150그램의 단백질과 대등한 양의 지질(15% 크림)을 포함하는 토끼 원유(즉 냉동 비탈지 우유)를 포함하기 때문에, 크로마토그래피 조건과 양립가능하게 하기 위해 매체를 "유동화 및 탈지"해야 한다.
이렇게 하기 위하여:
- 해동된 원유를 2배 양의 수용성 용매와 혼합하였다.
- 완전한 유동성 혼합물을 양 제타 전위를 가지는 유리필터 고정상, 즉 Ultipor GF Plus filter(Pall Life Science)으로 여과하였다.
그 결과, 크로마토그래피 기술과 사용을 위해 충분히 지방질이 제거된 완전한 유동성 원료를 얻었다.
프로토콜 "A":
수용성 용매는 염화나트륨을 추가하거나 추가하지 않고 낮은 이온 세기(100mM 미만)를 가진 인산염 용액이었다.
프로토콜 "B":
용매는 일정 농도의 구연산삼나트륨 또는 EDTA와 같은 킬레이트화제를 포함하여, 우유와 혼합한 후에, 우유의 미셀 구조가 사라져서, "정화된" 우유를 얻었다(용액의 카세인 또는 락토세럼). 예를 들면, 우유를 완전히 정화하기 위해 pH 8.0에서 최종 농도가 0.25M인 구연산삼나트륨이 제공되었다.
실시예 3: 실시예 2에서 프로토콜 "A"에 따라 지방이 분리되고 제거된 단편의 친화성 크로마토그래피
MEP HyperCel 젤에 우유의 형질전환(transgenic) 또는 재조합 FⅦ(rFⅦ)을 안정하게 포착된다는 것이 다음의 분석법을 이용하여 증명되었다:
a) MEP 젤의 양 = 2 mL /원유 F1의 양 = 4 mL
MEP 젤의 양에 대한 우유 양의 비율 = 2
이 실시예에서, 427ml의 우유를 25℃에서 4.5mS/㎝의 전도도를 가진, pH 8.27 및 0.015M인 3843ml의 인산나트륨 버퍼와 혼합하였다. 혼합물을 1㎛의 임계치(threshold)를 가지는, Utripor GF+ 여과기로 여과하여, 연속 크로마토그래피를 위해 정화된 우유 4240ml를 얻었다. 이때, 정화된 우유의 pH는 8.2이고, 전도도는 25℃에서 8mS/㎝이었다. (원유 4ml에 대응하는) 이 용액 40ml를 1.1㎝ 지름의 컬럼에 조건이 설정된, 젤로 주입하였다. 안정화된 젤 베드의 높이는 2㎝이고, 2ml의 쌓인 젤을 제공한다(비율 원유/젤=2).
생물 물질을 주입하기 전에, 전도도가 25℃에서 8 mS/cm이고, pH 8.2에서 염화나트륨 40mM을 포함하는 25mM 인산나트륨 용액으로 평형하였다(로딩 버퍼).
펌프의 유량(flow rate)을 1.5ml/분으로 조정하고, 즉 약 1분 E/E (Entry/Exit)의 젤에서의 접촉시간을 측정한다. 컬럼을 280nm UV 램프 검출기에 연결시키고 광학 밀도 신호(optical density signal)를 지속적으로 종이에 기록하였다. 40ml의 생물물질을 주입하고, 샘플 "MEP 시작"을 옆에 둔다. 주입한 다음, 280nm에서의 OD 기록계의 기준선을 다시 얻기 위해 필요한 8.5ml의, 40mM 염화나트륨을 포함하는 25mM 인산나트륨 로딩 용액으로 젤을 세척한다.
"비-유지 MEP(non-retained MEP)"이라고 불리는 흡착되지 않은 단백질 단편 48.3ml가 모인다. 3번 연속하여 용출을 실행한다.
용액 A = 20.6ml의 MEP 용출액 1 제공
→ 80% 로딩 버퍼 + 20% 에틸렌 글리콜
용액 B = 17ml의 MEP 용출액 2 제공
→ 50% 로딩 버퍼 + 50% 에틸렌 글리콜
용액 C = 시험되는 않는 9ml 제공
→ 로딩 버퍼를 pH 3의 빙초산(glacial acetic acid)으로 조정했다.
그러고 나서, 젤을 1M NaOH로 재생하고, 20% 에탄올(v/v)을 포함하는 1M 염화나트륨 매질로 보전한다.
분석한 데이터를 하기 표에 나타낸다.
단편 양
(mL)		 FⅦ 항원 농도
(IU/mL)		 FⅦ 항원의 양
(IU)		 산출율
(%)
초기 MEP 40 22.2 887 100%
비결합 MEP 48.3 5.6 269 30%
용출액 1-MEP (20% EG) 20.6 6.4 131 15%
용출액 2-MEP (50% EG) 17.0 23.0 390 44%
결론:
FⅦ의 30%가 젤에 유지되지 않으며, 전체 용출액이 채택된 59%의 FⅦ를 다시 제공하였다. 결과(89%)에 따르면, 약 10%의 FⅦ가 회수되지 않았다.
b) MEP 젤의 양 = 10 mL /F1 원유의 양 = 200 mL
MEP 젤의 양에 대한 우유 양의 비율은 100mL 만큼 증가하여 분류법으로 3 내지 20으로 증가하였다.
단편 양
(mL)		 FⅦ 항원 농도
(IU/mL)		 FⅦ 항원의 양
(IU)		 산출율
(%)
초기 MEP 624 91.3 56,971 100%
비결합 1 100 20.6 2,057 22.5%
비결합 2 100 23.7 2,394 26.2%
비결합 3 100 28.9 2,914 31.9%
비결합 4 100 28.5 2,967 32.5%
비결합 5 100 32.2 3,247 35.6%
비결합 6 130 35.7 4,644 41%
비결합, 풀(pool) 637 28.6 18,222 32%
용출액 -MEP
(50% EG)		 130 156.3 20,323 36%
결론:
32%의 FⅦ가 젤 전하의 기능으로(22 내지 41%) 젤에 유지되지 않았다. 최적의 우유-대-젤(milk-to-gel) 비율은 10 내지 15였다. 용리액(pH 8의 30mM 인산염에서의 50% EG)이채택된 FⅦ의 44%를 다시 제공하였다. 결과(68%)에 따르면, FⅦ의 30%가 회수되지 않았고, 그는 포획된 형태가 매우 강한 소수성을 나타냄을 의미한다.
("F1"이라고 불리는) 형질전환(transgenic) 토끼 우유의 2세대에서 실행된 이 2 분석법은 약 30%의 rFⅦ가 "혼용 모드(mixed-mode)" MEP-HyperCel gel에서 흡착되지 않았다는 것을 나타내었다.
MEP HyperCel 에 고정된 결과물:
(카세인 미셀을 안정화하는) 프로토콜 "A" 또는 (카세인을 안정화하는) 프로토콜 "B"에 따라, 여기에서, 목적은 제1 세대("F0") 형질전환(transgenic) 토끼 우유의 일차 결과물을 고정하고 MEP-Hypercel 젤에 "결합하지 않은" 단편을 재처리하 는 것이다.
a) MEP 젤의 양 1 = 10 mL /F0 원유의 양 = 133 mL
MEP 젤 양에 대한 우유의 양의 비율 = 13.3
프로토콜 A에 따른 원유의 초기 처리
단편 양
(mL)		 FⅦ 항원 농도
(IU/mL)		 FⅦ 항원의 양
(IU)		 산출율
(%)
초기 MEP 400 97.8 39,104 100%
비결합, MEP　1 421 43.1 18,145 46%
용출액 -MEP1 (50% EG) 163.5 45.5 7,439 19%
프로토콜 A에 따른 비결합 1의 재처리(안정한 미셀)
비결합, MEP　2 444 29.2 12,969 71%
용출액 -MEP2 (50% EG) 100 19.6 1,955 11%
결론:
46%의 FⅦ가 첫 번째 통과 후에 젤에 유지되지 않았다. 이 비율은 두 번째 통과 때 71%로 상승했다. F1 우유보다 F0 우유가 더 큰 비율의 이 형태를 산출하였다.
반대로, 첫 번째 통과 동안 19%의 FⅦ가 용출되었고(MEP1 결과 = 65%), 두 번째 통과 동안 11%가 용출되었다(MEP2 결과 = 82%). 전체 (MEP1+2)에서, 33%의 FⅦ가 결합하지 않았고, 24%의 FⅦ가 결합하고, EG로 용출되었다. 결과(57%)에 따르면, 약 40%의 FⅦ가 회수되지 않았으며, 유지된 형태가 소수성이 강하다는 것을 나타낸다.
b) MEP 젤의 양 = 10 mL /F0 원유의 양 = 140 mL
MEP 젤의 양에 대한 우유의 양의 비율 = 14
프로토콜 A에 따른 원유의 초기 처리
단편 양
(mL)		 FⅦ 항원 농도
(IU/mL)		 FⅦ 항원의 양
(IU)		 산출율
(%)
초기 MEP 390 109 42,393 100%
비결합, MEP　1 425 45.5 19,316 46%
용출액 -MEP1 (50% EG) 155 45.3 7,014 17%
프로토콜 B에 따른 비결합 1의 재처리(안정화된 미셀)
비결합, MEP　2 609 14.2 8,642 46%
인산염 용출액 (30　mM,　pH　8) 91 39.5 3,595 19%
용출액 -MEP2 (50% EG) 98 27.9 2,733 14%
결론:
46%의 FⅦ가 첫 번째 통과 후에 젤에 흡착되지 않았다. 충분한 양의 0.25M의 구연산염으로 "우유를 정화"한 후에, 이 비율은 두번째 통과 후에 46%로 유지되었다.
젤을 30mM 인산염 버퍼로 세척할 때(주입 후 세척), FⅦ 용출이 전체의 19%를 다시 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이 용출은 명확하게 소수성이 조금 약한 형태의 FⅦ를 반영했다.
첫 번째 통과 동안 전체의 17% FⅦ가 용출되었고(MEP1 결과 = 63%), 두 번째 통과 동안 14%가 용출되었다(MEP2 결과 = 79%). 전체 (MEP1+2)에서, 29%의 FⅦ가 유지되지 않거나 이미 용출되지만, 23%의 FⅦ의 23%가 흡착되고 EG로 용출된다. 결 과(52%)에 따르면, 약 40%의 FⅦ가 유지되지 않으며, 이는 유지된 형태가 매우 소수성이 강한 형태임을 나타낸다.
실시예 4: MEP HyperCel ® 젤에서의 용출 버퍼 시험
여기에서, 목적은 에틸렌 글리콜과 각종 보조제를 조합한 실험에 의해 용출 수확량을 향상하기 위한 것이었다.
에틸렌 글리콜 pH 계면활성제 용매 염 산출율
1 (표준) 50% 7.0 - - 30mM 인산나트륨 26%
2 50% 6.0 - - 구연산염/30mM 구연산 10%
3 50% 5.0 - - 구연산염/30mM 구연산 2%
4 50% 4.0 - - 구연산염/30mM 구연산 7%
5 50% 3.0 - - 구연산염/30mM 구연산 20%
6 50% 7.5 1% - 30mM 인산나트륨 31%
7 50% 6.0 - - Tris/NaCl + 5mM 칼슘 9%
8 70% 6.0 - - 구연산/30mM 구연산 29%
9 50% 7.2 - - 30mM 카프릴산 나트륨 31%
10 - 8.0 1% 0.3% 30mM 인산나트륨 7%
비이온성 계면활성제(Triton X100) 및 염기 pH를 추가하면 용출 수확량이 향상되는 것처럼 보였다. 또한 에틸렌 글리콜(CH2OH-CH2OH) 대신에 덜 유독한 프로필렌 글리콜(CH2OH-CH2-CH2OH)로 대체하고, 6M의 농도로 재생시키면서, 유레아(NH2-CO-NH2), 변성제로 실험하였다.
각종 용출 방법을 시험하였고, 또한 그 결과는 다음과 같다.
·50% 에틸렌 글리콜(v/v)로 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 1.7 분(최적이 아님).
·용출: 혼합물: 50% 에틸렌 글리콜 + 1% Triton X100 + 49% 15mM 나트륨 인산염, pH 8
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의 순도(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 8,642 100% 27,910 (14　mg) 100% 0.16%
MEP-HyperCel에 비결합 8,496 98% 10,614 (5.3　mg) 38% 0.06%
MEP-HyperCel 용출액 238 3% 12,256 (6.1　mg) 44% 2.6%
MEP 결과물 101% MEP 결과물 82%
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·50% 프로필렌 글리콜(v/v)로 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8 분(최적).
·용출: 혼합물: 50% 프로필렌 글리콜 + 1% Triton X100 + 49% 15mM 나트륨 인산염, pH 8
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의
순도(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 8,500 100% 21,600 (10.8　mg) 100% 0.13%
MEP-HyperCel에 비결합 8,250 97% 3,220 (1.6　mg) 15% 0.02%
MEP-HyperCel 용출액 412 5% 11,039 (5.5　mg) 51% 1.3%
MEP 결과물 101% MEP 결과물 66%
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·6M 우레아로 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 1.7분.
·용출: 혼합물: 6M 우레아 + 20mM 글리신 + 50mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 버퍼, pH 8.2
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의 순도
(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 9,210 100% 27,262 (14.1　mg) 100% 0.15%
MEP-HyperCel에 비결합 9,086 99% 12,945 (6.5　mg) 47% 0.07%
MEP-HyperCel 용출액 178 2% 11,955 (6　mg) 44% 3.3%
MEP 결과물 101% MEP 결과물 91%
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·2M 우레아로 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8분.
·용출: 혼합물: 2M 우레아 + 20mM 글리신 + 50mM HEPES 버퍼, pH 8.2
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의 순도
(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 8,931 100% 26,037 (13.5　mg) 100% 0.15%
MEP-HyperCel에 비결합 8,790 98% 4,389 (2.2　mg) 17% 0.02%
MEP-HyperCel 용출액 320 4% 17,963 (9　mg) 69% 2.8%
MEP 결과물 102% MEP 결과물 86%
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·0.5M 우레아로 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8분.
·용출: 혼합물: 0.5M 우레아 + 20mM 글리신 + 50mM HEPES 버퍼, pH 8.2
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의 순도
(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 1,155 100% 3,440 (1.7　mg) 100% 0.15%
MEP-HyperCel에 비결합 1,129 98% 241 (0.12　mg) 7% 0.01%
MEP-HyperCel 용출액 21.7 2% 1,533 (0.77　mg) 45% 3.5%
MEP 결과물 102% MEP 결과물 52%
주의: 1　IU의 FⅦ:am = 1 IU의 기능적 FⅦ:Ag, 또는 약 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·우레아를 이용하지 않고 MEP HyperCel 용출
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8분.
·용출: 혼합물: 20mM 글리신 + 50mM HEPES 버퍼, pH 8.2
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의 순도
(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 1,733 100% 4,442 (2.2　mg) 100% 0.13%
MEP-HyperCel에 비결합 ND NA ND NA NA
MEP-HyperCel 용출액 45.9 3% 2,496 (1.25　mg) 56% 2.7%
ND = 결정되지 않음(Not determined) ; NA = 적용할 수 없음(Not applicable)
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·MEP HyperCel 산 용출(용출 pH =　3　<　MEP의 pKa)
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8분.
·용출: 혼합물: 0.1m 글리신 + 충분한 양의 pH 3인 HCl
단편 FⅦ:Ag의 양(IU &　mg) FⅦ 항원 산출율(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 44,275 (22　mg) 100%
MEP-HyperCel에 비결합 10,081 (5　mg) 23%
MEP-HyperCel 용출액 * 29,364 (14.7　mg) 66%
MEP 결과물 89%
용출 과정 동안 염기를 추가하여 용출액의 중화(neutralisation)
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
·정제수(WFI)로의 MEP HyperCel
·주입: 구연산나트륨(0.25 M)으로 정화된 우유
·MEP 젤에의 접촉 시간: 8분.
·용출: 이중증류된 WFI
단편 단백질 양
(mg)		 단백질 분포
(%)		 FⅦ:Ag의 양
(IU &　mg)		 FⅦ 항원
산출율(%)		 FⅦ의
순도(%)
여과 및 정화된 우유, GF+0.45㎛ 6,147 100% 22,713 (11.4　mg) 100% 0.18%
MEP-HyperCel에 비결합 5,929 96% 3,454.5 (1.7　mg) 15% 0.03%
MEP-HyperCel 용출액 298 5% 18,936 (9.5　mg) 83% 3%
MEP 결과물 101% MEP 결과물 99%
주: 1IU의 FⅦ:Ag = 0.5μg/mL의 FⅦ(표준 혈장)
FⅦ:Ag =　ELISA 시스템에서 FⅦ의 항체분석법(특정 항체에 근거하여 검출);
혈장에서, 1 IU/mL의 FⅦ는 0.5μg/mL의 순수 FⅦ 단백질과 동등하다;
FⅦ:am =　FⅦ 결핍-인간 혈장(FⅦ-deficient human plasma)에서 조직 인자와 접촉한 후에 측정된, 응고가능한(coagulable) FⅦ 양.
FⅦ(효소원(proenzyme))는 (피브린노겐에 작용하는, 트롬빈의 생성을 통해) 혈장 응고를 유발하는 FXa로 FX를 전환하는, FⅦa(효소)로 전환한다.
이론에서, (국제 기준 혈장에서) 분자 전부가 기능적인 경우에, 1IU의 FⅦ:Ag는 약 1IU의 FⅦ:am과 같다(r=100%).
이 분석실험에서, FⅦa (부분적으로 활성화된 FⅦ)가 이미 존재하는 경우, FXa의 발생이 약간 가속될 수도 있다(r = 100% 내지 200%).
그러나, FⅦ가 손상되거나 "불규칙"(조직 인자와 결합하지 않음)하다면, r<100%이다.
FⅦ:am/FⅦ:Ag 비율(퍼센트로 표현)은 정제 도중 FⅦ 분자의 기능적 상태를 반영한다.
FⅦ:Ag(IU/mL) FⅦ:am (IU/mL) FⅦ:Am/FⅦ:Ag (%)
초기 MEP 38.6 47.4 123%
비결합, MEP 6.9 4.8 70% 기능적 결함
MEP 용출액 (WFI) 151.9 179.3 118%
결론:
결합하지 않은 MEP에서, FⅦ의 (가공에서의) 결함이 나타나고 단백질 분해(proteolysis)를 나타내는 것처럼 보인다.
실시예 5: Q Sepharose FF 에의 MEP HyperCel 용출액 처리.
FⅦ는 Q-Sepharose FF 이온 교환기에서 두 형태로 나뉜다, 즉, 5mM 칼슘에서의 순수한 FⅦ의 용출("5mM Ca2 +" 단편이라 부름) 및 50mM 칼슘에서의 순도가 낮은 FⅦ 용출("50mM Ca2 +" 단편이라 부름). 관찰된(n=7 배치(batch)), 전통적인 비율은 각각 36%±8%, 40%±12%었다.
QSFF 젤의 1개 양 = 10 mL
MEP1 용출액의 처리 (프로토콜 A에 따른 처리 후 첫 번째 통과)
단편 양(mL) FⅦ 항원 농도(IU/mL) FⅦ 항원의 양(IU) 산출율(%)
MEP1 용출액 단편 163 45.5 7,416 100%
5mM Ca2 + 단편　 39 63.6 2,480 33%
50mM Ca2 + 단편　 48 28.3 1,358 18%
MEP2 용출액의 처리 (프로토콜 A에 따른 처리 후의 두 번째 통과)
단편 양(mL) FⅦ 항원 농도(IU/mL) FⅦ 항원의 양(IU) 산출율(%)
MEP2 용출액 단편 98 19.6 1,921 100%
5mM Ca2 + 단편　 31 26.0 806 42%
50mM Ca2 + 단편　 48 10.4 497 26%
상기에서 보는 바와 같이, 두 경우 전부에서 우세한 단편은 "5mM Ca2 +" 단편이었다. 전반적으로, 3,286 IU의 "5mM" FⅦ가 추출되었다. 우유 양의 관점에서, 이 수확량은 우유의 리터 당 12.5mg의 rFⅦ에 대응했다.
QSFF gel 의 1개 양 =　10　 mL
MEP1 용출액의 처리 (프로토콜 A에 따른 처리 후 첫 번째 통과)
단편 양(mL) FⅦ 항원 농도(IU/mL) FⅦ 항원의 양(IU) 산출율(%)
MEP1 용출액 단편 154 45.5 7,007 100%
5mM Ca2 + 단편　 50 71.6 3,574 51%
50mM Ca2 + 단편　 27 58.4 1,548 22%
MEP2 용출액의 처리 (프로토콜 B에 따른 처리 후의 두 번째 통과)
단편 양(mL) FⅦ 항원 농도(IU/mL) FⅦ 항원의 양(IU) 산출율(%)
MEP2 용출액 단편 96 27.9 2,678 100%
5mM Ca2 + 단편　 29.4 23.1 679 25%
50mM Ca2 + 단편　 40 19.1 764 28%
상기에서 보는 바와 같이, 프로토콜 A에 따른 처리에서의 우세한 단편은 "5mM Ca2 +" 단편이었지만, 프로토콜 B에서는 비율이 변했다. 이것은 덜 바람직한 "50mM" 형태의 존재가 구연산염으로의 처리를 돕는다는 것을 보여준다. 전반적으로, 4,253IU의 "5mM" FⅦ가 추출되었다. 우유 양의 관점에서, 이 수확량은 우유 리터 당 15mg의 rFⅦ에 대응했다.
실시예 6: MEP HyperCel + Q Sepharose FF 5 mM 칼슘 용출액에서 얻은 FⅦ의 특성
분석적인 특성은 다음과 같다:
- FⅦ: Ag = 252.9IU/mL
- 단백질 = 123μg/mL (산출된 순도: 98%)
- T0 FⅦ: C = T0에서 3,224 IU/mL, 또는 13.4의 비율
- 26h에서 T24 및 실내 온도(RT)에서 FⅦ: C = 3,721 내지 4,365IU/mL, 또는 15.5 내지 18.2의 비율
(NovoNordisk에서) rFⅦa에 대한 양 제어 → 비율 = 21.5 내지 25.1
- 밀도측정(Densitometric) 분석법:
T0에서: 50.3%의 절단되지 않은 rFⅦ;
실내 온도에 18시간 후: 5.3%의 절단되지 않은 rFⅦ 존재.
MEP + QSFF 순서에서 얻은 FⅦ는 약 50%의 비율로 활성화되는, 매우 정제된 FⅦ을 산출하였다; 그러나, 이 활성화는 고정상에서 본래 그리고 천천히 일어났다.

Claims (16)

  1. 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법으로,
    a) 상기 우유의 지방 분리(skimming) 및 제거(defatting) 단계,
    b) 크로마토그래피 고정상(chromatographic support)에 상기 인자 Ⅶ이 포획될 수 있는 pH 조건 하에서, 소수성(hydrophobic) 및 이온성(ionic)이 공존하는 리간드(ligand)가 결합한 상기 고정상에 상기 인자 Ⅶ을 포함하는 상기 지방이 분리 및 제거된 단편을 통과시키는 단계,
    c) 상기 인자 Ⅶ을 용출시키는(eluting) 단계,
    d) 상기 용출된 단편에서 우유 단백질을 제거하여 상기 용출된 단편을 정제하는 단계, 및
    e) 상기 인자 Ⅶ을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 b)에서 상기 pH는 4.6 이상인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 우유 지방의 분리(skimming) 및 제거(defatting) 단계 (단계 a)) 후 상기 단계 b) 전에 우유를 정화(clarification)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 우유를 정화하는 단계는 킬레이트화제(chelating agent)가 상기 우유와 혼합된 후에 상기 우유의 미셀 구조가 사라져 정화된 우유를 얻을 수 있는 농도의 상기 킬레이트화제를 추가하여 실시하는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a) 후 상기 단계 b) 전에, 카세인 서브유닛 집단이 침전되는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 소수성과 이온성이 공존하는 리간드(ligand)는 4-메르캅토-에틸-피리딘(4-mercapto-ethyl-pyridine)인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단백질을 용출하는 단계 c)는 1.2 내지 8M의 우레아(urea) 및 25mM 내지 50mM의 글리신(glycine), pH 4 내지 6의 산성 수용액, 5mM 내지 50mM의 인산나트륨 및 에틸렌 글리콜(ethylene glycol); 5mM 내지 50mM의 구연산나트륨 및 에틸렌 글리콜; TRIS/NaCl, 1mM 내지 10mM의 칼슘염 및 에틸렌 글리콜; 10mM 내지 100mM의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate) 및 에틸렌 글리콜; 로 이루어진 그룹에서 선택된 구성요소를 포함하고, 존재하는 화합물과 연결된, 전도도가 3mS/㎝ 이하인 수용성 혼합물, 또는 물의 혼합물을 이용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단백질을 용출하는 단계 c)는 1.2 내지 8M의 우레아(urea) 및 25mM 내지 50mM의 글리신(glycine), pH 4 내지 6의 산성 수용액, 5mM 내지 50mM의 인산나트륨 및 에틸렌 글리콜(ethylene glycol); 5mM 내지 50mM의 구연산나트륨 및 에틸렌 글리콜; TRIS/NaCl, 1mM 내지 10mM의 칼슘염 및 에틸렌 글리콜; 10mM 내지 100mM의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate) 및 에틸렌 글리콜; 로 이루어진 그룹에서 선택된 둘 또는 세 개의 구성요소를 포함하고, 존재하는 화합물과 연결된, 전도도가 3mS/㎝ 이하인 수용성 혼합물, 또는 물의 혼합물을 이용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 인산 나트륨의 농도는 30mM인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 구연산 나트륨의 농도는 30mM인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 칼슘염의 농도는 30mM인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 카푸릴산 나트륨의 농도는 30mM인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  12. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 물은 주사용 이중증류수(bi-distilled water for injection)인 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 단계 d)는 음이온-교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography)을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 음이온-교환 크로마토그래피 단계 후에, 1 내지 50mM 칼슘 이온 용액을 이용하여 인자 Ⅶ을 용출시키는 것을 특징으로 하는 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 분리하는 방법.
  15. 지방이 분리 및 제거된 우유에 존재하는 인자 Ⅶ을 추출하기 위해, 소수성 및 이온성이 공존하는 리간드와 결합한 고정상.
  16. 삭제
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4874806B2 (ja) 2003-12-01 2012-02-15 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 液体因子ｖｉｉ組成物のウイルス濾過
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
FR2910786B1 (fr) * 2006-12-29 2017-08-11 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies (Lfb) "procede d'extraction d'une proteine presente dans du lait"
FR2942231B1 (fr) 2009-02-19 2015-03-20 Lfb Biotechnologies Acides nucleiques se liant specifiquement au facteur vii/viia humain, et utilisations
FR2942233B1 (fr) * 2009-02-19 2015-03-13 Lfb Biotechnologies Moyens pour la purification d'une proteine du plasma sanguin, et procedes pour sa mise en oeuvre
FR2942232B1 (fr) * 2009-02-19 2015-03-13 Lfb Biotechnologies Moyens pour la purification d'une proteine de la coagulation et procedes pour sa mise en oeuvre
FR2947181B1 (fr) 2009-06-26 2012-05-04 Lfb Biotechnologies Composition de facteur vii
WO2011112075A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 N.V. Nutricia Controlling the texture of high-protein nutritional compositions comprising micellar casein
US9364021B2 (en) * 2011-09-09 2016-06-14 Tairob Ltd. Method for preparing micro-foam whipped milk for cappuccino or a method for whipping other liquids containing proteins, using an apparatus
EP2687595B1 (en) * 2012-07-19 2018-05-30 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Method for purifying transgenic factor VII
FR3006591B1 (fr) * 2013-06-11 2016-05-06 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene
CN106793793A (zh) * 2014-10-06 2017-05-31 预层析股份有限公司 来自含有聚集的酪蛋白的混合物的可溶性蛋白的分离
FR3034419B1 (fr) * 2015-04-02 2017-12-15 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'une proteine recombinante therapeutique a partir d'un lait transgenique
WO2018126095A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 Applied Stemcell, Inc. Transgenic animals and method for bioproduction
FR3076294B1 (fr) 2017-12-29 2022-01-28 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'anticorps a partir de lait brut
GB201815053D0 (en) * 2018-09-14 2018-10-31 Dublin Institute Of Tech Method
US11326176B2 (en) * 2019-11-22 2022-05-10 Mozza Foods, Inc. Recombinant micelle and method of in vivo assembly
CN112159458A (zh) * 2020-09-28 2021-01-01 靡特洛 一种从过期变质牛奶中提取牛奶蛋白的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6183803B1 (en) * 1999-06-11 2001-02-06 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method for processing milk
US20050272917A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-08 Hematech, Llc Methods for immunoglobulin purification

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4229342A (en) * 1977-05-18 1980-10-21 Rhone-Poulenc Industries Process for extracting proteins from milk using silica and anion exchange resins
NL8204923A (nl) 1982-12-21 1984-07-16 Stichting Nl I Zuivelonderzoek Werkwijze voor het bereiden van een precipitaat van caseine en wei-eiwit alsmede aldus bereid precipitaat.
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
ATE141646T1 (de) 1986-04-09 1996-09-15 Genzyme Corp Genetisch transformierte tiere, die ein gewünschtes protein in milch absondern
US6984772B1 (en) 1994-02-18 2006-01-10 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Transgenic non-human mammals producing fibrinogen in their milk
FR2677652B1 (fr) 1991-06-12 2005-05-27 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation d'une proteine d'interet dans le lait d'un animal transgenique, produit obtenu et cellule eucaryote utilisee.
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9408717D0 (en) 1994-05-03 1994-06-22 Biotech & Biolog Scien Res DNA sequences
US6713662B1 (en) 1994-07-27 2004-03-30 Pharming Intellectual Property B.V. Production of collagen in the milk of transgenic mammals
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US6268487B1 (en) 1996-05-13 2001-07-31 Genzyme Transgenics Corporation Purification of biologically active peptides from milk
ATE420108T1 (de) * 2001-07-20 2009-01-15 Campina Bv Verfahren zur herstellung von preparationen aus milchprodukten, welche wachstumsfaktoren (tgf- beta und igf-1), lactoperoxidase und immunglobuline mit niedriger gegenseitiger verunreinigung enthalten
US20040117862A1 (en) * 2002-03-11 2004-06-17 Cooper Julian D. Production of high levels of transgenic factor VII with engineered stability and its therapeutic uses
AU2003253625A1 (en) * 2002-06-05 2004-04-08 Henry C. Rust Injection molding head
FR2841747B1 (fr) 2002-07-02 2004-08-20 Cie Laitiere Europeenne Isolat de proteines de lait et procede pour sa preparation
US6911323B2 (en) * 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
JP4247880B2 (ja) * 2002-12-24 2009-04-02 Ｔｄｋ株式会社 電子部品の製造方法
EP1601788A4 (en) 2003-02-24 2006-11-15 Gtc Biotherapeutics Inc TANGENTIAL FILTRATION METHODS AND APPARATUS THEREFOR
WO2005089040A2 (en) * 2004-03-23 2005-09-29 Chr. Hansen A/S Method of producing chymosin c and uses thereof
NZ562949A (en) * 2005-04-11 2009-05-31 Medarex Inc Protein purification using HCIC and ion exchange chromatography
FR2910786B1 (fr) * 2006-12-29 2017-08-11 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies (Lfb) "procede d'extraction d'une proteine presente dans du lait"

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6183803B1 (en) * 1999-06-11 2001-02-06 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method for processing milk
US20050272917A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-08 Hematech, Llc Methods for immunoglobulin purification

Also Published As

Publication number Publication date
US8492524B2 (en) 2013-07-23
FR2910786B1 (fr) 2017-08-11
AU2008214544A1 (en) 2008-08-21
CN101600358B (zh) 2014-05-07
US20130295646A1 (en) 2013-11-07
WO2008099077A3 (fr) 2009-05-07
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