Procédé d'extraction d'une protéine présente dans du lait
La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction d'une ou plusieurs protéines, en particulier des protéines globulaires dont la structure tertiaire induit une poche hydrophobe, présentes dans du lait, au moyen d'un support sur lequel est lié un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique.
La majeure partie des médicaments disponibles dans le commerce correspond à des substances chimiques obtenues par synthèse. En effet, jusqu'à récemment, la médecine moderne a fortement compté sur les médicaments produits par voie de synthèse chimique pour le traitement ou le diagnostic des maladies.
Toutefois, les protéines représentent une partie essentielle des molécules portant une information biologique. C'est le cas notamment d'un grand nombre d'hormones, de facteurs de croissance, de facteurs sanguins de coagulation ou encore d'anticorps.
D'une manière générale, les protéines sont des polymères à base d'acides aminés le plus souvent de haut poids moléculaire ne pouvant pas être obtenus à des coûts raisonnables par synthèse chimique. De telles protéines à usage thérapeutique sont habituellement isolées et purifiées à partir, par exemple, d'organismes vivants, de tissus ou de sang humain ou animal. C'est le cas notamment de l'insuline extraite du pancréas de porc, des facteurs de la coagulation, tels que le facteur VIII ou le facteur IX, extraits du plasma sanguin, ou les immunoglobulines . Bien que les procédés de préparation des protéines ci-dessus soient largement utilisés aujourd'hui, ils présentent toutefois des
inconvénients. La faible teneur de certaines protéines extraite à partir de plaquettes du sang, ne permet pas de les isoler en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins thérapeutiques sans cesse croissants . De plus, la présence de virus, de prions ou d'autres agents pathogènes dans le plasma nécessite d'inclure dans les procédés de fabrication de protéines plasmatiques des étapes supplémentaires d' inactivation virale et/ou d'élimination virale afin d'obtenir de tels produits utilisables à des fins thérapeutiques.
Pour palier à ces inconvénients, on a recourt au génie génétique, technique également largement utilisée pour la synthèse d'une protéine à partir d'un gène isolé, transféré dans une cellule, qui prend alors en charge la sécrétion de la protéine considérée. Une telle protéine, obtenue hors de son système cellulaire d'origine, est dite « recombinante » .
Selon cette technique, différents systèmes cellulaires peuvent être utilisés.
Les systèmes bactériens, par exemple E. CoIi, sont très utilisés et efficaces. Ils permettent la production de protéines recombinantes à faible coût. Cependant, de tels systèmes sont limités à la préparation de protéines simples, non glycosylées, qui ne requièrent pas de processus élaboré de repliement.
Les systèmes fongiques sont également utilisés pour la production de protéines sécrétées. L'inconvénient de ces systèmes fongiques réside dans le fait qu'ils sont à la source de modifications post- traductionnelles, consistant par exemple en un greffage de motifs glycanniques et de groupes sulfate, qui affectent fortement les propriétés pharmacocinétiques des protéines produites, notamment par l'addition de divers groupements de dérivés du mannose .
Les systèmes utilisant des baculovirus permettent de produire des protéines très variées, telles que les protéines vaccinales ou l'hormone de croissance, mais leur application à l'échelle industrielle n'est pas optimisée.
On utilise également la culture de cellules de mammifères pour la préparation de protéines recombinantes complexes, telles que les anticorps monoclonaux. Les systèmes d'expression cellulaire conduisent à des protéines recombinantes correctement repliées et modifiées. Le faible rendement par rapport au coût de production est un inconvénient majeur.
Une variante à de tels systèmes cellulaires consiste à mettre en œuvre des plantes transgéniques pour l'obtention de protéines en des quantités importantes. Ces systèmes engendrent toutefois des modifications post-traductionnelles spécifiques aux plantes, en particulier par addition aux protéines produites de résidus de xylose fortement immunogènes, limitant ainsi leur utilisation à des fins thérapeutiques .
Une alternative aux systèmes cellulaires cités précédemment consiste à utiliser les animaux transgéniques pour la production de vaccins recombinants ou de protéines thérapeutiques complexes. Les protéines ainsi obtenues présentent une glycosylation proche de celle de l'être humain et sont correctement repliées. Ces protéines complexes ne sont pas constituées que d'une chaîne polypeptidique simple comme par exemple l'hormone de croissance, mais elles sont modifiées de diverses manières après l'assemblage des acides aminés , notamment par des clivages spécifiques, des glycosylations et des carboxyméthylations . Dans la grande majorité des cas, de telles modifications ne peuvent pas être effectuées par des cellules bactériennes ou de levures. En revanche, les animaux transgéniques permettent de
combiner à la fois les niveaux d'expression rencontrés dans les systèmes cellulaires de bactéries et les modifications post-traductionnelles obtenues par l'intermédiaire de cultures cellulaires, tout en engendrant des coûts de production plus faibles que par la mise en œuvre des systèmes d'expression cellulaires .
Parmi les matières biologiques d'animaux transgéniques, le lait a fait l'objet de travaux ayant conduit à le considérer comme une source de sécrétion très satisfaisante de protéines recombinantes.
Les protéines recombinantes , produites à partir de lait d'animaux transgéniques, peuvent être obtenues aisément par greffage du gène codant pour la protéine d'intérêt sur la région régulatrice d'un des gènes de synthèse de protéines du lait qui va diriger celle-ci spécifiquement dans la glande mammaire, puis sa sécrétion dans le lait.
A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet EP 0 527 063 qui décrit la production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgénique, l'expression du gène codant pour la protéine d'intérêt étant contrôlée par un promoteur d'une protéine du lactosérum. D'autres demandes de brevet ou brevets décrivent la préparation d'anticorps (EP 0 741 515), de collagène (WO 96/03051) , de facteur IX humain (US 6 046 380) et de complexes facteur VTII/facteur von Willebrand (EP 0 807 170) dans le lait de mammifères transgéniques .
Malgré les résultats satisfaisants de ces méthodes en termes d'expression des protéines, l'utilisation du lait comme source de protéines recombinantes présente des inconvénients . L'inconvénient majeur réside dans les difficultés, d'une part, de les extraire du lait avec un rendement
satisfaisant et, d'autre part, de les purifier subséquemment .
En effet, le lait est un mélange constitué à 90% d'eau comprenant divers constituants que l'on peut regrouper en trois catégories. La première catégorie, appelée lactosérum (ou petit lait) , est constituée de glucides , de protéines solubles , de minéraux et de vitamines hydrosolubles . La deuxième catégorie, appelée phase lipidique (ou crème) , contient des matières grasses sous forme d'émulsion. La troisième catégorie, dénommée phase protéinique, est constituée d'environ 80% de caséines, lesquelles forment un ensemble de protéines précipitables à un pH de 4 , 6 ou sous l'action de la présure, coagulant enzymatique, en présence de calcium. Les différentes caséines forment un complexe micellaire colloïdal, pouvant atteindre des diamètres d'environ 0,5 μm, avec des sels phosphocalciques, se présentant par exemple sous la forme d'agrégats (« clusters ») de phosphate tricalcique, soit Cag (PO4)O- De telles micelles sont formées de sous-unités de caséines constituées d'une couche hydrophile riche en caséine-κ entourant un noyau hydrophobe, les sels phosphocalciques étant liés par interaction électrostatique sur la couche hydrophile. Ces sels phosphocalciques peuvent également être présents dans le volume interne de la micelle sans être liés à la caséine. Cette phase protéinique contient également des protéines solubles, telles que les lactalbumines et les lactoglobulines, ainsi que les albumines et les immunoglobulines provenant du sang.
En fonction de la nature de la protéine recombinante sécrétée dans le lait d'animaux transgéniques, celle-ci peut être présente dans le lactosérum ou dans la phase protéinique, voire dans les deux à la fois. La richesse et la complexité de chaque catégorie de constituants du lait rend d'autant
plus difficile la mise en oeuvre d'une extraction de cette protéine, notamment celle piégée dans les micelles de caséines. Une autre difficulté réside dans le fait que la présence majoritaire de cette protéine dans l'une des deux phases n'est pas prévisible avec certitude.
Une protéine recombinante peut également présenter des affinités pour les ions calcium du lait présents sous la forme soit de sels et/ou divers complexes solubles, soit de sels phosphocalciques des micelles de caséines. Ces affinités se traduisent par des liaisons électrostatiques entre la protéine et les cations divalents du calcium. Les affinités protéine/ions calcium permettent de définir les constantes d'affinités qui, en fonction de leur valeur, déterminent la force de liaison. De façon générale, la majeure partie des protéines présentant une affinité pour les ions calcium est liée aux sels phosphocalciques des micelles . Son extraction nécessite la mise en œuvre d'étapes complexes, ce qui pose des problèmes de mise en œuvre et de rendement.
La solution classique utilisée dans l'industrie laitière pour isoler les protéines consistant à une pasteurisation suivie d'une coagulation enzymatique ou précipitation acide (pH 4,6) ne peut s'appliquer dans ce cas, car les protéines recombinantes sont souvent dénaturées sous l'effet combiné de la température et du pH. De plus, le piégeage des protéines dans les micelles de caséines conduit à de faibles rendements d'extraction. D'autres solutions consistant à mettre en œuvre des méthodes physiques de fractionnement du lait par les techniques de filtration, de centrifugation et/ou de sédimentation ou de précipitation conduisent également à des rendements d'extraction inacceptables et à des protéines recombinantes extraites de faible pureté.
Le document EP 0 264 166 décrit la sécrétion d'une protéine désirée dans du lait d'animaux génétiquement transformés. Ce document ne mentionne pas d'étapes de purification de cette protéine à partir du lait.
Le brevet US 4 519 945 décrit un procédé d'extraction d'une protéine recombinante par la préparation d'un précipité de caséines et de lactosérum à partir du lait, mettant en œuvre des étapes d'acidification et de chauffage, comme mentionné précédemment . Ce procédé engendre une perte significative de l'activité de la protéine considérée et un faible rendement d'extraction.
Le brevet US 6 984 772 divulgue un procédé de purification du fibrinogène recombinant a partir de lait d'un mammifère transgénique. Ce procédé comprend une étape de séparation du lactosérum du culot de caséines et de la phase protéinique par des centrifugations successives. Le lactosérum est isolé puis conservé pour la suite du procédé conduisant à une solution de fibrinogène purifiée.
Toutefois, ce procédé ne peut être appliqué à la production, à rendement satisfaisant, de protéines recombinantes piégées dans et/ou sur les micelles de caséines, telles que les facteurs plasmatiques de la coagulation, par exemple le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX.
La demande de brevet WO 2004/076695 décrit un procédé de filtration de protéines recombinantes à partir de lait d'animaux transgéniques. Ce procédé comprend une première étape de clarification du lait, c'est-à-dire une étape consistant à éliminer les composants du lait de façon à obtenir une solution susceptible d'être filtrable à travers une membrane de filtre dont les pores présentent un diamètre de 0,2 μm. Une telle étape aboutit à une élimination de micelles de caséines. Par conséquent, la mise en
oeuvre de cette étape peut être rédhibitoire, en termes de rendement, si les micelles de caséines sont susceptibles de contenir une protéine d'intérêt piégée au sein de leur structure. Le brevet US 6 183 803 décrit un procédé d'isolation de protéines naturellement présentes dans le lait, telles que les lactalbumines, et de protéines recombinantes , par exemple l'albumine humaine ou l'αl- antitrypsine, à partir de lait. Ce procédé comprend une étape initiale de mise en contact du lait comprenant une protéine d'intérêt avec un agent chélatant. Ceci engendre la déstructuration des micelles de caséines, ce qui conduit à un sérum de lait clarifié comprenant les caséines, les protéines du lactosérum et la protéine d'intérêt. Le procédé comprend ensuite une étape de restructuration des micelles de caséines par ajout au milieu liquide
(sérum de lait clarifié) de sels de cations divalents insolubles. Ces micelles précipitent, ce qui conduit à une phase liquide comprenant la protéine d'intérêt qui n'est pas piégée par les micelles, étant donné que les sels saturent les sites de liaison électrostatique des caséines. Selon ce procédé, la séparation de la protéine d'intérêt est donc effectuée au final par restructuration des micelles et leur précipitation.
Ce procédé est de mise en oeuvre complexe et ne peut être appliqué aux protéines ayant une affinité relativement élevée pour les ions calcium. Les protéines de la coagulation, et notamment celles connues comme étant synthétisées sous l'influence de la vitamine K, se trouvent dans cette catégorie.
Partant d'un double constat que les procédés de séparation et de purification de certaines catégories de protéines recombinanteε sécrétées dans le lait d'animaux transgéniques présentes dans le lactosérum conduisent à des rendements très faibles, et de ceux d'autres catégories de protéines qui sont piégées dans
les micelles de caséines, sont de mise en œuvre complexe, la Demanderesse s'est fixée pour objectif de mettre à disposition un procédé d'extraction, à partir du lait, de protéines constitutives du lait, naturelles- ou non, telles que le facteur VII (FVII), le facteur VIII et le facteur IX recombinants, notamment présentant une affinité pour les formes ioniques du calcium du lait, de mise en œuvre simplifiée, conduisant en outre à un rendement de production satisfaisant, tout en conservant l'activité biologique de la protéine.
C'est pour répondre à ce problème technique que la Demanderesse a mis au point un procédé d'extraction d'une protéine présente dans du lait, présentant au moins une poche hydrophobe et une charge négative au pH naturel du lait, comprenant les étapes suivantes de: a) Ecrémage et délipidation dudit lait, b) Passage de la fraction délipidée et écrémée contenant ladite protéine sur un support chromatographique sur lequel est greffé un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique, dans des ' conditions de pH permettant à ladite protéine
•d'être retenue sur ledit support, ledit pH étant supérieur à 4,6, c) Elution de la protéine, d) Purification de la fraction éluée par élimination des protéines du lait de ladite fraction éluée, et e) Récupération de ladite protéine.
Le procédé de l'invention est avantageux en ce qu'il est très facile de mise en œuvre, puisqu'il ne comporte que peu d'étapes d'une part, et d'autre part qu'il ne nécessite pas nécessairement la mise en
oeuvre d'une étape de clarification du lait avant mise en œuvre de la première étape de rétention de la protéine d'intérêt sur le support sur lequel est greffé le ligand.
Le procédé de l'invention peut être appliqué à du lait frais ou à du lait congelé. Le lait peut être du lait . de toute femelle de mammifère contenant une protéine d'intérêt, comme la vache, la brebis, la chèvre, la lapine, la souris, le rat, la truie, cette liste n'étant pas limitative.
Selon la fluidité naturelle du lait du mammifère considéré, il peut être avantageux de fluidifier le lait avant l'écrémage et la délipidation. A titre d'exemple, on peut citer ' le lait de lapine qui, étant assez dense, est avantageusement fluidifié pour une mise en œuvre plus aisée de l'invention. Toutefois, même dans le cas de laits assez denses, l'étape de fluidification n'est que facultative. Cette étape de fluidification peut être effectuée au moyen de l'ajout d'un solvant aqueux au lait brut. A titre d'exemple, le solvant aqueux est une solution à base de sel de phosphate de concentration inférieure à 100 πiM, de pH compris entre 7,5 et 8,5, de préférence compris entre 8,0 et 8,3, comme une solution de phosphate de sodium 30 mM pH 8,0, cette liste n'étant pas limitative. Un tel solvant aqueux peut également contenir du chlorure de sodium dont la concentration maximale est d'environ 40 mM. De telles solutions maintiennent la structure micellaire stabilisée du lait (micelles de caséines en suspension) .
Aux fins de l'invention, on entend par
« écrémage » la séparation de la matière grasse du lait, de manière à donner deux fractions : le lait écrémé et la crème. L'écrémage est une technique bien connue de l'homme du métier, et peut être effectué par
exemple par l'utilisation d'une écrémeuse, de solvants organiques comme l'acide trichloracétique, cette liste n'étant pas limitative. Dans un mode de réalisation particulier, l ' écrémage du lait est réalisé par filtration sur des filtres à fibres de verre à potentiel Zêta positif. A titre d'exemple d'un tel filtre, on peut citer les filtres Ultipor® GF-plus ainsi que les filtres Supradisk série HP ou série charbon actif AKS (PaIl Life science) , les filtres GF (Whatman) , les filtres Millistack+ série DE (Millipore) , les filtres Zetaplus VR ou Delipid (Cuno 3M) . Avantageusement, on utilise le filtre Ultipor® GF Plus au seuil de 1 um (PaIl) et le filtre profondeur VR02 ou VR04 (PaIl) . Cette étape de filtration permet également de délipider la fraction, c'est-à-dire de retirer les lipides, comme les acides gras, les glycérides et les stérols. Cette délipidation peut être effectuée par filtration frontale du lait sur le filtre Ultipor® GF plus après avoir laissé reposé 30 minutes le lait dilué (donc la matière grasse vient flotter en surface, ce qui permet une optimisation de la séparation crème/lait) .
Cette étape d'écrémage et de délipidation est indispensable, car le ligand greffé sur le support, qui présente à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique, adsorbe les lipides. Ainsi, les lipides doivent être éliminés avant l'étape b) , faute de quoi la protéine d'intérêt ne peut pas, ou peu, être retenue sur le ligand. Ceci aurait pour conséquence une perte de rendement du procédé d'extraction de la protéine d'intérêt.
Un des aspects avantageux de l'invention est que la fraction issue de l'étape a), simplement écrémée et délipidée, est directement adaptée à la mise en œuvre de l'étape b) qui représente très avantageusement une étape de purification par chromatographie d'affinité.
Ainsi, aucune étape intermédiaire n'est strictement nécessaire pour rendre la fraction délipidée et écrémée apte à être purifiée par la chromatographie d'affinité de l'étape b) . L'étape b) ne doit pas être effectuée à un pH inférieur au point isoélectrique (pi) des caséines, qui se situent entre 4,6 et 5. En effet, si l'on met en œuvre l'étape b) à un pH inférieur au pi des caséines, celles-ci précipitent, ce qui risque de créer des dommages importants au support chromatographique . En particulier, lorsque l'étape de chromatographie est réalisée sur une colonne, la précipitation des caséines peut colmater celle-ci, ce qui risque également d'endommager le support chromatographique. De plus, à un pH inférieur à 4,6, on peut s'attendre également à ce que d'autres protéines précipitent, par exemple la transferrine ou l'albumine, ce qui peut entraîner des baisses de rendement. Enfin, certaines protéines sont dénaturées à pH acide. C'est le cas par exemple du facteur VII, du Facteur VIII, du facteur IX,. du fibrinogène, du facteur H du complément, cette liste n'étant pas limitative.
De manière avantageuse, l'étape b) est réalisée à un pH compris entre 5 et 8,5. Le lait écrémé et dénaturé résultant de l'étape a) est donc appliqué sur le support chromatographique de l'étape b) à un pH compris entre 5 et 8,5. Avantageusement, ce pH est compris entre 5,5 et 8, ou entre 6 et 7,5. De manière préférée, ce pH est compris entre 6,5 et 6,8.
Préférentiellement, ce pH est le pH naturel du lait.
A un tel pH, c'est-à-dire à un pH compris entre 5 et 8,5, les protéines présentant des sites naturels d'interaction, comme par exemple les protéines présentant une affinité antigènes/anticorps, enzymes/substrats , enzymes/inhibiteurs, pseudoaffinité, ont, par nature, une position
relative des charges et des zones hydrophobes et elles varient peu entre pH 5 et pH 8,5. Les protéines sont donc, à ce pH, chargée négativement. Avantageusement, à ce pH, les interactions entre le ligand et la protéine sont des interactions essentiellement hydrophobes .
La technique de chromatographie avantageusement utilisée dans le procédé de l'invention permet la rétention de la fraction délipidée et écrémée contenant la protéine d'intérêt sur un support sur lequel est greffé un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique . De manière surprenante, un tel ligand permet de lier les protéines d'intérêt présentant de par leur structure une poche hydrophobe, et de laisser passer les impuretés, même les micelles de caséines. Les zones internes hydrophobes des protéines vont pouvoir se lier à ce type de ligand qui va permettre des interactions avec la protéine d'intérêt, ce qui garantit une affinité élevée pour la protéine d'intérêt, et une sélectivité accrue pour les protéines à purifier.
Les protéines non retenues sont essentiellement la majeure partie des caséines, de la Whey acid protein (WAP) , de la transferrine, des lactoglobumines, lactalbumines et serumalbumines .
En outre, ce procédé est adapté à l'extraction de toute protéine qui présente les caractéristiques indiquées, c'est-à-dire qu'au pH naturel du lait, soit compris dans la gamme d'environ 6,5-6,8, la protéine présente des zones hydrophobes et porte des charges négatives, à tout le moins le bilan des charges est très avantageusement en faveur de charges négatives .
Dans le cadre de l'invention, les conditions de pH permettent à la protéine d'être retenue, ou d'une manière générale, de se lier au ligand du support chromatographique, soit par des interactions
hydrophobes, soit aussi bien par interaction électrostatique que par interaction hydrophobe . De telles conditions dépendent dans une large mesure du point isoélectrique de la protéine à purifier et donc du pH de misé en œuvre du procédé. On peut choisir un support chromatographique dont le ligand sera chargé positivement (de type échangeur d'anions) et adapter le pH pour que la protéine soit globalement chargée négativement. Inversement, on peut utiliser un ligand chargé négativement lorsqu'on travaille au pH avantageusement utilisé pour la mise en œuvre de l'invention, i.e. entre 5 et 8,5. Le groupement terminal fonctionnel de ce ligand sera par exemple un groupement sulfonyle ou carboxyle, et fixer le pH, notamment à une valeur supérieure à 6, afin que la protéine présente une charge globale positive. Ce mode de réalisation est applicable lorsque le point isoélectrique de la protéine à purifier est tel qu'à pH basique, notamment supérieur à 6, la protéine est chargée positivement. On doit également veiller à ce que le pH soit compatible avec la mise en œuvre du procédé afin de ne pas dégrader notamment les protéines à extraire et le lait.
Dans un autre mode de réalisation, le pH de réalisation de l'étape b) est compris entre 5 et 8,5, et il est choisi de manière à ce que les interactions entre la protéine et le ligand sont essentiellement de nature hydrophobe.
Avant la mise en oeuvre de l'étape b) , le support chromatographique est de préférence équilibré par une solution (tampon d'équilibrage) à base de sel de phosphate de concentration inférieure à 100 mM, de pH compris entre 7,5 et 8,5, de préférence compris entre
8,0 et 8,3, comme une solution de phosphate de sodium de 20 à 30 mM, pH 8,0. Une telle solution peut également contenir du chlorure de sodium dont la concentration maximale est d'environ 100 mM, de
préférence située dans la plage de 20-60 inM. Une telle solution peut également être à base de sel de citrate, en particulier de citrate trisodique 0,20-0,30 M, de préférence 0,25 M, de pH 7,5-8,5, de conductivité située entre 30 et 40 mS/cm, en particulier de 35 mS/cm.
En outre, on peut mettre en œuvre une étape de lavage juste après l'étape b) avec, avantageusement, un tampon identique au tampon d'équilibrage. On s'assure que cette étape de lavage est effective par mesure de la densité optique (DO) à une longueur déterminée, par exemple à 280 nm, qui doit être retombée à la valeur de zéro ou à la valeur de la ligne de base. La fraction ainsi obtenue peut être récoltée selon les cas.
La réalisation de l'étape c) d'élution peut être effectuée par tout éluant connu de l'homme du métier, permettant à la protéine de ne plus être retenue, par exemple grâce aux effets de répulsions ioniques mais aussi aux effets chaotropiques . De manière préférée, l'élution est réalisée grâce aux effets de répulsion ionique. On peut modifier la forme structurelle des protéines et la charge des protéines en jouant sur le pH du tampon d'élution, ou encore sur le tampon d'élution choisi.
On peut citer à titre d'exemple comme éluant, dans le cas où le ligand greffé sur le support chromatographique est chargé positivement (de type échangeur d'anions), un mélange d'urée, de concentration comprise entre 1,2 et 8M, et de glycine, • de concentration comprise entre 25 et 50 mM, lesdites concentrations étant les concentrations finales dans' le mélange. Il est à noter que la réaction de l'urée sur les groupes aminé des protéines peut entraîner leurs dénaturâtions, et, en présence d'aminés exogènes
(ici la glycine), l'urée sera moins dénaturante pour les protéines donc pour la protéine cible.
D'autres exemples d'éluants sont les solutions aqueuses de pH acide compris entre pH 4 et 6, les mélanges aqueux comprenant les composants, de préférence deux ou trois, choisis dans le groupe constitué par le phosphate de sodium de concentration comprise entre 5 et 50 mM, de préférence 30 mM, et l'éthylène glycol, le citrate de sodium, de concentration comprise entre 5 et 50 mM, de préférence 30 mM, et l'éthylène glycol, le phosphate de sodium, de concentration comprise entre 5 et 50 mM, de préférence 30 mM, et l'éthylène glycol, le Tris/NaCl et un sel de calcium de concentration comprise entre 1 et 10 mM, de préférence 5 mM, et l'éthylène glycol, le caprylate de sodium, de concentration comprise entre 10 et 100 mM, de préférence 30 mM, et l'éthylène glycol. On peut également utiliser un mélange aqueux dont la conductivité, liée à la présence de composants, est inférieure à 3 mS/cm, telle une solution de phosphate de sodium 30 mM. Les concentrations ci-dessus sont les concentrations finales dans le mélange. Dans le cas de mélanges binaires ci-dessus à base d'éthylène glycol, la proportion de celui-ci varie en particulier entre 20 et 70%. On peut remplacer pour tous ces tampons l'éthylène glycol par du propylène glycol, qui est moins toxique, ou tout autre solvant. On peut avantageusement utiliser l'urée en présence d'acides aminés comme éluant (concentrations finales variant de 1,2 à 8 M pour l'urée et de 25 à 50 mM pour la glycine ou du tout autre acide aminé) , cette solution permettant grâce à son pouvoir chaotrope de lever l'interaction du ligand pour les protéines adsorbées . Le pH de ces mélanges aqueux est très avantageusement compris entre 7 et 8,5, des pH trop
acides étant plus dénaturants pour la protéine-cible et pouvant entrainer des protéines insolubles .
Les mélanges aqueux ci-dessus peuvent en outre comprendre un détergent non-ionique, de préférence le Triton® XlOO, à des teneurs présentes entre 0,5 et
1,5%, et, en particulier 1%. La Demanderesse a montré que dans certaines mises en œuvre, la présence d'un tel détergent avec les conditions de pH ci-dessus
(entre 7 et 8,5), pouvait améliorer le rendement d'élution de la protéine.
Il est également possible d'utiliser l'eau, et préférentiellement de l'eau PPI (eau bi-distillée pour préparation injectable) .
Dans un mode de réalisation particulier, quand le pH de mise en oeuvre de l'étape b) est compris entre 5 et 8,5, l'élution peut être effectuée en diminuant le pH à une valeur inférieure au pKa du ligand si celui- ci est inférieur au point isoélectrique de la protéine, ou bien en diminuant le pH à une valeur inférieure au point isoélectrique de la protéine si celui-ci est inférieur au pKa du ligand.
A l'issue de l'élution de la fraction contenant la protéine d'intérêt, une étape de purification est encore nécessaire afin d'éliminer les protéines contaminantes du lait, comme la lactoferrine, la lactalbumine, la transférine, l'albumine, les immunoglobulines . De tels moyens de purifications sont bien connus de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple les chromatographies d'affinité, la chromatographie hydrophobe, la chromatographie d'échange de cations ou d'anions, la chromatographie d'exclusion/diffusion, cette liste n'étant pas limitative. Cette étape d) permet également, de manière avantageuse, une bonne renaturation des protéines cibles, c'est-à-dire un repliement correct, conférant
à la protéine une activité biologique équivalente à celle de la protéine native.
Optionnellement , cette renaturation peut également être réalisée par simple dialyse ou diafiltration afin d'éliminer l'agent dénaturant.
Les différents étapes chromatographiques sont effectuées par tout appareillage chromatographique classique, comprenant notamment un dispositif de pompage et un système de détection en particulier par absorption UV-visible.
A l'issue de cette étape d'élimination des dernières protéines lactiques présentes dans la fraction contenant la protéine d'intérêt, on récupère une fraction contenant la protéine d'intérêt purifiée.
Les moyens pour récupérer la fraction contenant la protéine d'intérêt sont bien connus de l'homme du métier. A ce titre, on peut citer les chromatographies d'affinité, la chromatographie hydrophobe, la chromatpgraphie d'échange de cations ou d'anions, la chromatographie d'exclusion/diffusion, utilisant des éluants classiquement mis en œuvre.
Dans un mode de réalisation de l'invention, on effectue, de préférence, après l'étape d'écrémage et de délipidation (étape a), et avant l'étape b) , une étape de clarification du lait.
Par « clarification » du lait, on entend désigner une étape d'élimination des micelles, en les déstructurant, ce qui conduit à un sérum de lait clarifié comprenant les caséines, les protéines du lactosérum et la protéine d'intérêt.
Ce mode de réalisation permet d'obtenir de meilleurs rendements, puisque les protéines d'intérêt associées aux micelles de caséines sont dans ce cas susceptibles d'enrichir la fraction purifiée, ce qui n'est pas le cas dans le mode de réalisation sans
étape de clarification, dans lequel les micelles sont évacués, entraînant les protéines d'intérêt qui leur sont associées en même temps. Ce mode de réalisation permet également de réaliser une filtration submicrobienne qui permet l'élimination des agents microbiens ou cellulaires et des débris cellulaires présents dans le lait (bactéries, cellules epithéliales , lymphocytes du lait.
Plus particulièrement, l'étape de clarification du lait est effectuée par ajout d'un agent chélateur, à une concentration telle qu'après mélange au lait, la structure micellaire du lait disparaît, aboutissant à du lait clarifié (caséines en solution ou lactosérum) . La clarification du lait par les agents chélateurs est bien connue de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple d'agent chélateur le citrate trisodique ou l'EDTA. Par exemple, une concentration finale de 0;25 M en citrate de sodium à pH 8,0 permet une parfaite clarification du lait.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, après l'étape d'écrémage et de délipidation (étape a), et avant l'étape b) , on élimine les agrégats de sous- unités de caséine, notamment par filtration ou centrifugation selon des mises en œuvre habituelles.
Cette étape, bien qu'optionnelle, permet la déstabilisation, par la précipitation, de l'état colloïdal dans lequel se trouve le lait. Les protéines d'intérêt sont libérées ou dissociées des micelles ou des sous-unités de caséine, ce qui permet de récupérer ces protéines associées aux micelles.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique est le 4- Mercapto-Ethyl-Pyridine .
Un exemple de support comportant ce ligand est le gel MEP HyperCel® (Ciphergen®) . A titre d'exemple, des conditions permettant une adsorption de la protéine d'intérêt sur un tel support peuvent être un pH se situant au minimum 0,5 unité pH au-dessus du point isoélectrique de la protéine (charge négative de la protéine) et au minimum 1 unité pH au-dessous du pi du ligand (charge positive du gel) . Si la protéine d'intérêt est le FVII, le pH choisi peut être un pH de 8. De manière préférée, l' adsorption de la protéine sur le ligand se fait dans des conditions de pH telles que l'interaction entre la protéine et le ligand est une interaction essentiellement hydrophobe. Préférentiellement, ce pH est compris entre 5 et 8,5.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention où la protéine à purifier est le facteur VII, la Demanderesse a observé que l'élution de celle- ci pouvait être réalisée en baissant le pH à un pH inférieur au pKa du ligand, soit inférieur à 4,8.
Dans le cas où le ligand est le 4-Mercapto-Ethyl- Pyridine, l'étape c) d'élution peut être réalisée par les solutions et mélanges aqueux définis plus haut, à un pH supérieur au pKa de ce ligand, c'est-à-dire supérieur à 4,8, notamment à pH supérieur à 6 et inférieur à 9 et très avantageusement compris entre 7,0 et 8,5, et également avec de l'eau, et préférentiellement de l'eau PPI (eau bi-distillée pour préparation injectable) . La protéine, dans ce cas, est par exemple le Facteur VII .
De plus, le Demandeur a constaté de manière surprenante que le gel MEP Hypercel®, ayant un ligand de type 4-Mercapto-Ethyl-Pyridine ou le gel Hitrap IgY, ayant un ligand de type 2-Mercaptopyridine présente une sélectivité vis à vis du FVII dont la structure est "conforme" à la molécule de référence, c'est-à-dire à celle activable. En effet, le Demandeur
a observé dans les formes non adsobées du FVII sur ce gel l'existence d'un écart systématique entre les formes activables (dosage FVII amidolytique) et les formes totales (dosage FVII antigène) du FVII. Le dosage FVII amidolytique est assimilé à une activation in vitro des antigènes, 1 unité antigène du plasma donnant, par définition, 1 unité amidolytique, donc un rapport d'activités égal à 1. Au cours des procédés de purification, la protéine peut subir des dénaturations physico-chimiques ou biochimiques. On considère que ce rapport est « normal » lorsqu'il est compris entre 0,8 et 1,2, et avantageusement égal à 1. Chez l'animal transgénique, la sécrétion lactique du facteur VII n'est pas homogène à 100%, il est connu par l'homme de l'art des différences dans les transformations post- traductionnelles notamment de glycosylation et repliement de la structure tridimensionnelle des protéines. Les cellules mammaires fabriquent ainsi du FVII après transgénèse, ledit FVII est glycosylé puis replié avant d'être sécrété par la glande mammaire dans le lait. Rien ne garantit que 100% des molécules fabriquées soient fonctionnelles. Il est probable que les mécanismes de contrôle présents à l'état naturel soient modifiés dans les cellules transgéniques et on observe notamment des différences de maturation des glycoformes dans les protéines transgéniques par rapport aux protéines naturelles.
Ainsi, les formes de FVII non adsorbées sur le gel
MEP hypercel®, ayant un ligand de type 4-Mercapto- Ethyl-Pyridine, ou le gel Hitrap IgY, ayant un ligand de type 2-mercaptopyridine, ont un rapport de 0,4 à
0,5 et les formes éluées ont un rapport de 1,0 à 1,4.
Donc le gel MEP Hypercel® sélectionne par adsorption les formes antigéniques les plus proches des formes naturelles, et on peut penser que les formes non- adsorbées, a contrario, peuvent présenter des défauts de fabrication par l'animal transgénique. Ceci est un
avantage certain car le but est d'extraire du lait du FVII humain injectable à l'homme sans effet secondaire notable, et le FVII doit pour cela être le plus proche possible des formes naturelles. Le rapport activité amidolytique/antigène est un outil indicatif de cet état.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique est l ' acide Mercapto-Benzimidazole-Sulfonique .
Un exemple de support comportant ce ligand est le gel MBI HyperCel® (Ciphergen®) ou encore le Capto-MMC (GE Healthcare) . Sur ce genre de support, il convient de mettre en œuvre des conditions de rétention (étape b) ) légèrement plus acide comprises entre pH 5 et 6. A de tels pH, la solubilité des caséines est faible et il peut même y avoir un début de précipitation. L'addition de sels tels que du NaCl à 1 M permet de maintenir la solubilité des caséines entre pH 5 et pH 6.
De préférence, l'élution est effectuée avec les éluants, en particulier les solutions et mélanges aqueux, indiqués plus haut.
Avantageusement, l'étape d) est effectuée par chromatographie d'échange d'anions, en particulier par la mise en oeuvre d'un support échangeur d'anions de type base forte, c'est-à-dire à groupements ammonium quaternaire de type -NR3 +, R étant un groupe alkyle tel que méthyle ou éthyle. De tels supports disponibles dans le commerce peuvent convenir pour la mise en oeuvre de cette étape.
La force ionique étant avantageusement faible, et le pH, rendent particulièrement appropriée l'étape d'échange d'anions, qui permet de concentrer la molécule d'intérêt, notamment le FVII, de la transformer en facteur VII activé et de la purifier
par une élution conformationnelle (changement de forme lié spécifiquement à la fixation calcium qui induit un changement de charge dans la partie N-terminale (gla- domaines) , globalement la charge de la protéine devient négative après saturation en calcium) .
Avantageusement, à l'étape d) , préférentiellement effectuée par chromatographie d'échange d'anions, 1' élution de la protéine est effectuée au moyen d'une solution d'ions calcium de concentration comprise entre 1 et 50 mM, de préférence entre 2 et 25 mM, de manière préférée entre 3 et 12 , 5 mM ou entre 4 et 6 mM, la source d'ions calcium étant par exemple fournie par le chlorure de calcium.
Avantageusement, à l'étape d) , l' élution de la protéine est effectuée au moyen d'une solution d'ions calcium à 5mM.
Dans un autre mode de réalisation, la solution utilisée pour l' élution peut être à base de sels de cuivre, de zinc ou de manganèse.
Le procédé de l'invention est susceptible d'être mis en oeuvre pour l'extraction d'une protéine recombinante ou naturellement présente dans le lait du mammifère considéré. La protéine peut être une protéine naturellement présente dans le lait, et représente, à titre d'exemple, la β-lactoglobuline, la lactoferrine, l'α- lactalbumine, ou les protéoses peptones, ou leur mélange . La protéine peut également être une protéine non naturellement présente dans le lait. On peut citer a titre d'exemple le facteur VII, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur X, l'alpha-1 anti-trypsine, l 'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps.
Dans un mode de réalisation préféré, la protéine est une protéine recombinante, et le lait la contenant est un lait transgénique. En effet, les protéines non naturellement présentes dans le lait pourront y être synthétisé par des mammifères transgéniques non- humains , grâce aux techniques de l ' ADN recombinant et de la transgénèse .
Ces techniques, bien connues de l'homme du métier, permettent de synthétiser toute protéine d'intérêt dans le lait d'un animal transgénique.
Une telle protéine est alors une protéine recombinante ou transgénique, ces deux termes étant considérés comme équivalents dans la présente demande, synthétisée grâce aux techniques de l'ADN recombinant . On entend par « animal transgénique » tout animal non-humain ayant incorporé dans son génome un fragment d'ADN exogène, notamment codant pour une protéine d'intérêt, cet animal exprimant la protéine codée par l'ADN exogène, et susceptible de transmettre l'ADN exogène à sa descendante.
A ce titre, tout mammifère non-humain est adapté à la production d'un tel lait.
Avantageusement, on peut utiliser la lapine, la brebis, la chèvre, la vache, la truie et la souris, cette liste n'étant pas limitative.
La sécrétion par les glandes mammaires de la protéine d'intérêt, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression de la protéine recombinante de manière tissus-dépendante.
De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Ces séquences sont notamment les séquences promoteur, ainsi que les séquences peptides signal.
Des exemples de promoteurs bien connus de l'homme du métier sont le promoteur WAP (whey acidic protein) , le promoteur de la caséine et le promoteur de la β- lactoglobuline. Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour une protéine d'intérêt, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce laquelle donne ainsi naissance à un animal transgénique. Une fois que ce sujet s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors la protéine recombinante d' intérêt .
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine d'intérêt de l'invention.
Un plasmide contenant le promoteur WAP est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le gène codant pour une protéine d'intérêt est intégré, et placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine d'intérêt sont utilisés pour obtenir des animaux transgéniques, par exemple des lapines, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapins. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées . La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de
1 'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.
Avantageusement, la protéine est une protéine de la coagulation. Avantageusement, la protéine de l'invention est choisie parmi le facteur II (FII), le facteur VII (FVII) , le facteur IX (FIX) et le facteur
X (FX) , ainsi que leurs formes activées, la protéine
C, la protéine C activée, la protéine S et la protéine Z, ou leur mélange.
De manière particulièrement avantageuse, la protéine de l'invention est le FVII ou le FVII activé (FVIIa) .
A cet égard, le FVII ou le FVIIa peut être produit selon l'enseignement du document EP 0 527 063, et dont le résumé de la méthode est donné ci-avant. Un fragment d'ADN dont la séquence est celle du FVII humain est alors placé sous le contrôle du promoteur
WAP. Par exemple, une telle séquence d'ADN figure sous le numéro de séquence lt> décrite dans le document EP 0
200 421.
Avantageusement, le FVII de l'invention est activé. Le FVIIa résulte, in vivo, du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa seul a très peu d'activité enzymatique, mais complexé avec son cofacteur, le facteur tissulaire (FT) , il déclenche le processus de la coagulation en activant le FX et le FIX. Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure a celle du FVII lorsqu'ils interagissent avec le facteur tissulaire (FT) .
De manière particulièrement avantageuse, la protéine est le facteur VII (facteur VII) . Dans un mode de réalisation de l'invention, le FVII peut être activé in vitro par les facteurs Xa, VIIa, lia, IXa et XIIa.
Le FVII de l'invention peut également être activé pendant son procédé de purification.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un filtre de fibres de verre à potentiel Zêta positif pour l ' écrémage et la délipidation simultanée d'un lait de mammifère. Une telle mise en œuvre remplace avantageusement la séparation centrifuge
(écrémeuse, centrifugeuse) qui est consommatrice de temps et de volume ou l'usage de solvants délipidants (fréon, chloroforme) qui pose des problèmes de mise en installation industrielle.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un support sur lequel est greffé un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique, pour l'extraction d'une protéine présente dans du lait écrémé et délipidé.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Description des Figures
Figure 1 : Essais de tampons d'élution sur gel MEP HyperCel®
Exemples
Exemple 1 : Production de lapines transgéniques produisant une protéine de FVII humain dans leur lait
On prépare tout d'abord un plasmide pi en introduisant la séquence Bam Hl-Hind III (fragment 6,3 Kb) du gène WAP (décrite dans le document Devinoy et al., Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16, 25 août
1988, p. 8180) dans le polylinker du vecteur p-poly
IH-I (décrit dans le document Lathe et al., Gène (1987) 57, 193-201), entre les séquences Bain Hl et Hind III.
Au cours de ce clonage, le site Bam Hl a été supprimé et remplacé par le site CIa I qui figure dans le vecteur pi. Le vecteur pi est donc un plasmide capable de recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP 6,3 Kb. L'introduction du gène étranger peut se faire par exemple dans le site SaI I du poly linker. Les inserts contenant la totalité du promoteur et des gènes étrangers peuvent être isolés du plasmide après une coupure aux deux sites Not 1 qui sont aux extrémités du poly linker du plasmide p-poly III-I. Le plasmide p2, obtenu à partir du plasmide pi, contient le promoteur du gène de la WAP de lapin (6,3 Kb) et le gène du FVIl humain. Le fragment utilisé pour obtenir les lapines transgéniques est compris entre les deux sites Notl. Un site Hind III a été introduit dans la séquence de tête du gène (leader) par mutagénèse dirigée pour servir de site de clonage.
Les lapines transgéniques ont été obtenues par la technique classique de microinjection (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442).
1-2 pi contenant 500 copies du gène ont été injectés dans le pronucleus mâle d'embryons de souris. Les constructions ont été réalisées dans le vecteur p-poly IH-I (Lathe et al., Gène (1987) 57, 193-201). Les fragments Not 1 - Not 1 de ce vecteur contenant les gènes recombinés ont été microinjectés. Les embryons ont ensuite été transférés dans 1 ' oviducte de femelles adoptives hormonalement préparées. Environ 10% des embryons manipulés ont donné naissance à des lapereaux et 2-5 % des embryons manipulés à des lapereaux transgéniques . La présence des transgènes a été
révélée, par la technique de transfert de Southern à partir de l 'ADN extrait des queues des lapins. Les concentrations de FVII dans le sang et dans le lait des animaux ont été évaluées à l'aide de tests radioiinmunologiques spécifiques.
L'activité biologique du FVII a été évaluée en ajoutant du lait au milieu de culture de cellules ou d'expiants mammaires de lapin.
La technique utilisée pour l'obtention de lapines transgéniques produisant dans leur lait le FVII de l'invention est décrite plus en détails dans le document EP 0 527 063.
Exemple 2 : Préparation d'une fraction écrémée et délipidée
La matière première étant du lait de lapine brut c'est à dire non écrémé et congelé, contenant environ 150 grammes par litre de protéines et autant de lipides (15% de crème) , il convient avant toutes choses de « fluidifier et dégraisser » le milieu pour le rendre apte aux conditions chromatographiques .
Pour cela :
• un volume de lait brut décongelé est mélangé au minimum à 2 ou au maximum à 9 volumes de solvant aqueux,
• le mélange parfaitement fluide est filtré sur fibre de verre à potentiel Zêta positif :1e filtre
Ultipor GF plus (PaIl Life science) .
On obtient ainsi une matière première parfaitement fluide et suffisamment délipidée pour les techniques chromatographiques .
Protocole A :
Le solvant aqueux est une solution de phosphate de faible for-ce ionique (inférieure à 100 mM) , avec ou sans ajout de chlorure de sodium.
Protocole B :
Le solvant contient un agent chélateur tels que le citrate trisodique ou l 'EDTA à une concentration telle qu'après mélange au lait, la structure micellaire du lait disparaisse aboutissant à du lait « clarifié » (caséines en solution ou lactosérum) . Par exemple un concentration finale de 0,25M de citrate de sodium à pH 8,0 permet une parfaite clarification du lait.
Exemple 3 : Passage des fractions écrémées et délipidées selon le protocole A de l'exemple 2 sur un support de chromatographie d'affinité
La rétention du FVII-transgénique (FVII-tg) dans du lait stabilisé sur Gel MEP-HyperCel est démontrée par les essais suivants dans lesquels a) 1 volume de gel MEP = 2 ml / Volume de lait brut Fl = 4 ml. Le rapport volume de lait / volume de gel MEP = 2
Dans cet exemple, 427 ml de lait ont été mélangés à 3843 ml (mélange 1 :9) de tampon phosphate de sodium 0,015 M à pH 8,27 et conductivité 4,5 mS/cm à 25°C. Le mélange a été filtré sur un filtre Ultripor GF+ au seuil 1 μm donnant 4240 ml de lait clarifié pour la chromatographie ultérieure, le pH du lait clarifié étant de 8,2 et la conductivité 8 mS/cm à 250C. 40 ml de cette solution (correspondant à 4 ml de lait brut) ont été injectés sur le gel préalablement conditionné dans une colonne de diamètre 1,1 cm. La hauteur de lit de gel stabilisé est de 2 cm ce qui donne 2 ml de gel packé (rapport lait brut/gel = 2) .
Avant injection de la matière biologique, le gel est équilibré par passage d'une solution de phosphate de sodium 25 mM contenant du chlorure de sodium 40 πiM à pH 8,2 et dont la conductivité est de 8 mS/cm à 25°C (tampon d'équilibrage). Le débit de la pompe est ajusté à 1,5 ml/minutes, soit un temps de contact à travers le gel estimé à 1 minutes E/S (entrée/sortie) . La colonne est raccordée à un détecteur à lampe UV à 280 nm et le signal de densité optique est enregistré en continu sur papier. 40 ml de matière biologique est injecté, un échantillon « départ MEP » a été mis de côté pour analyse. A la suite de l'injection, le gel est lavé par la solution d'équilibrage phosphate de sodium 25 mM contenant du chlorure de sodium 40 mM, environ 8,5 ml étant nécessaires pour retrouver la ligne de base sur l'enregistreur de DO à 280 nm. 48,3 ml de fraction protéique non adsorbée appelée « non retenu MEP » sont recueillis. Trois élutions successives sont réalisées. Solution A : donnant 20,6 ml d'éluatl-MEP
-* 80% tampon d'équilibrage + 20% d'éthylène Glycol . Solution B : donnant 17 ml d'éluat2-MEP -> 50% de tampon d'équilibrage + 50% d'éthylène Glycol. Solution C : donnant 9 ml non testé -^ Tampon d'équilibrage ajusté à pH 3 avec acide acétique glacial.
Le gel est ensuite régénéré par passage de soude (NaOH) IM, puis est conservé en milieu chlorure de sodium IM additionné d'éthanol qsp 20% (v/v) . Le tableau ci-après rassemble les données analytiques.
Conclusions :
30% du FVII n'est pas retenu sur gel et la somme des éluats représente 59% du FVII mis en œuvre. Au bilan (89%), environ 10% du FVII n'est pas retrouvé.
b) 1 volume de gel MEP = 10 ml / volume de lait brut Fl = 200 ml
Le rapport volume de lait / volume de gel MEP croît de 3 à 20 - fractionnement par 100 ml.
Conclusions :
32% du FVII n'est pas retenu sur gel en fonction de la charge du gel (22 à 41%) . Le rapport lait/gel optimal est de 10 à 15. L'éluat (50%EG en phosphate 30 mM pH8) représente 44% du FVII mis en œuvre. Au bilan (68%), 30% de FVII n'est pas retrouvé ce gui indique une forte hydrophobicité de la forme retenue.
On observe dans ces 2 essais réalisés sur du lait de lapine transgénique de 2ème génération (dite Fi) qu'environ 30% du FVII-tg ne s'adsorbe pas sur le gel « mixed-mode » MEP-HyperCel .
Résultats confortés sur MEP-HyperCel :
On se propose ici de conforter les résultats préliminaires sur du lait de lapine transgénique de lere génération (dite F0) et de retraiter les fractions « non retenues » sur gel MEP-Hypercel selon soit un protocole A (micelles stabilisées de caséines) , soit un protocole B (Caséines solubilisées) .
a) 1 volume de gel MEP = 10 ml / Volume de lait brut FO = 133 ml
Le ratio volume de lait / volume de gel MEP = 13,3
Traitement initial du lait brut selon le Protocole A
Retraitement du Non retenu MEP-I selon le Protocole A (micelleε stables)
Conclusions :
46% du FVII n'est pas retenu sur gel au 1er passage, cette proportion monte à 71% lors du 2eme passage. Le lait F0 donne une proportion de cette forme plus importante que le lait Fi.
Inversement, 19% de FVII s 'élue lors du premier passage (Bilan MEPl = 65%) et 11% lors du 2ème passage (bilan MEP2 = 82%). Globalement (MEPl+2), 33% de FVII reste non adsorbé pour 24% de FVII adsorbé et élue en EG. Au bilan (57%), environ 40% de FVII n'est pas retrouvé ce qui indique une forte hydrophobicité de la forme retenue .
b) 1 volume de gel MEP = 10 ml / Volume de lait brut FO = 140 ml
Le rapport volume de lait / volume de gel MEP = 14
Traitement initial du lait brut selon le Protocole A
Retraitement du Non retenu MEP-I selon le Protocole B (micelles déstabilisées)
Conclusions : 46% du FVII ne s ' adsorbé pas au gel au 1er passage, cette proportion reste à 46% lors du 2eme
passage après « clarification du lait » en citrate gsp 0,25M.
On observe, lors du lavage du gel en tampon phosphate 30 mM (lavage après injection) , une élution de FVII représentant 19% du total, cette élution reflète bien une forme moins hydrophobe de FVII .
On a 17% de FVII élue lors du premier passage
(Bilan MEPl = 63%) et 14% lors du 2ème passage (bilan
MEP2 = 79%). Globalement (MEPl+2) , 29% de FVII reste non retenu ou élue prématurément pour 23% de FVII adsorbé et élue en EG. Au bilan (52%), environ 40% de
FVII n'est pas retrouvé ce qui indique une forte hydrophobicité de la forme retenue.
Exemple Essais de tampons d' élution sur MEP
HyperCel®
On se propose ici d'améliorer le rendement d' élution en testant l'association de l'éthylène glycol (identifié comme « Glycol » dans le Tableau qui suit) avec différents adjuvants
Rdt : Rendement
Ac : Acide
L'ajout de détergent non ionique (Triton XlOO) et un pH basique semble améliorer le rendement d' élution. Il est prévu également de remplacer l'éthylène glycol (CH2OH-CH2OH) par le propylène-glygol (CH2OH-CH2-CH2OH) moins toxique et également un essai en Urée (NH2-CO-NH2) agent dénaturant et renaturant à 6M.
Différentes méthodes d'élution on également été testées, et leurs résultats sont montrés ci-dessous :
MEP-HyperCel élution avec ETHYLENE-GLYCOL 50% (v/v)
Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M)
Temps de contact sur gel MEP : 1,7 minutes (non optimisé)
Elution : Mélange : 50% Ethylène Glycol + 1% Triton
XlOO + 49% Phosphate de sodium 15 mM, pH 8
Remarque 1 UI de FVII :Ag = 0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution avec PROPYLENE-GLYCOL 50% (v/v) Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M) Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes (optimisé) Elution : Mélange : 50% Propylène Glycol + 1% Triton XlOO + 49% Phosphate de sodium 15 mM, pH 8
Remarque 1 UI de FVII: Ag = 0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution avec UREE 6M
Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M)
Temps de contact sur gel MEP : 1,7 minutes
Elution : Mélange : 6M Urée + glycine 20 mM + tampon
HEPES (acide N-2-Hydroxyéthylpiperazine-N'-2-éthane- sulfonique) 50 mM, pH 8,2
Remarque : 1 UI de FVIIrAg = 0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution avec UREE 2M
Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M)
Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes
Élution : Mélange : 2M Urée + glycine 20 mM + tampon
HEPES' 50 mM, pH 8 , 2
Remarque : 1 UI de FVIIrAg = 0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution avec UREE 0 , 5M
Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M)
Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes
Elution : Mélange : 0,5M Urée + glycine 20 mM + tampon
HEPES 50 mM, pH 8,2
Remarque : 1 UI de FVII=Am 1 UI FVII :Ag fonctionnelle soit environ .0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution en l'absence d'urée Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M) Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes Elution : solution glycine 20 mM + tampon HEPES 50 mM, pH 8,2
ND=non déterminé NA=non applicable
Remarque : 1 UI de FVIIrAg = 0,5 μg/ml de FVII (plasma standard)
MEP-HyperCel élution acide (élution pH=3 < pKa de MEP) Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M) Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes Elution : Glycine 0,1M +- HCl qsp pour obtenir un pH 3
* Neutralisation de l'éluat par ajout de base au fur et à mesure de 1 ' élution
Remarque : 1 UI de FVIIiAg = 0,5 μg/ml de FVII (standard plasma)
MEP-HyperCel élution en Eau purifiée (PPI)
Injection : Lait clarifié au Citrate de sodium (0,25M)
Temps de contact sur gel MEP : 8 minutes
Elution : eau PPI (eau bi-distillée pour préparation injectable)
Remarque : 1 UI de FVII:Ag = 0,5 μg/ml de FVII (standard plasma)
FVIIrAg = Dosage antigènique du FVII dans un système ELISA (détection par anticorps spécifique) .
Dans le plasma, 1 Ul/ml de FVII équivaut à 0,5 μg/ml de protéine FVII pure.
FVII :am = Titre en FVII coagulable mesuré après contact au facteur tissulaire sur du plasma humain déficient en FVII.
Le FVII (proenzyme) est activé en FVIIa (enzyme) qui active le FX en FXa qui provoque la coagulation du plasma (génération de thrombine qui agit sur le fibrinogène) . En théorie, si toutes les molécules sont fonctionnelles (plasma, standard international etc.) : 1 UI FVIIrAg est équivalent à 1 UI FVIIram (r = 100%).
Dans ce dosage, si du FVIIa est déjà présent (FVII partiellemnt activé) , la génération de FXa peut être légèrement accélérée (r=100% à 200%) .
Mais si le FVIl est dégradé ou "atypique" (défaut d'association au facteur tissulaire) alors r <100%.
Le rapport FVII :am/FVII :Ag (exprimé en %) reflète l'état de fonctionnalité de la molécule FVII au cours de la purification
Conclusion : Dans la fraction « non adεorbé MEP », le FVII semble présenter un défaut (de fabrication) et subir une protéolyse.
Exemple 5 : Traitement des éluats MEP-HyperCel sur Q- sepharose FF
Le FVII se partage en 2 formes sur échangeurs d'ions Q-Sepharose FF, une élution de FVII quasi pur en Calcium 5 mM (di-te « fraction Ca2+ 5mM » ) et une élution de FVII de faible pureté en Calcium 50 mM (dite « fraction Ca2+ 5OmM ») . Les proportions classiques observées (n= 7 lots) sont respectivement 36% ± 8% et 40% ± 12%. 1 volume de gel QSFF = 10 ml
Traitement de l'éluat MEPl (1er passage après traitement au protocole A)
Traitement de l'éluat MEP2 (2ème passage après traitement au protocole A)
On observe que la fraction majoritaire est la « Fraction Ca2+ 5mM » dans les 2 cas. Globalement on a extrait 3286 UI de FVII « 5 mM » soit rapporté au volume de lait 12,5 mg de FVII-tg par litre de lait.
1 volume de gel QSFF = 10 ml
Traitement de 1 'éluat MEPl (1er passage après traitement au protocole A)
Traitement de 1 ' éluat MEP2 (2ème passage après traitement au protocole B)
On observe que la fraction majoritaire est la « Fraction Ca2+ 5mM » dans le traitement en protocole A mais que la proportion change en protocole B. Ceci indique que le traitement par le Citrate favorise la présence de la forme « 5OmM » moins désirable. Globalement on a extrait 4253 UI de FVII « 5 mM » soit rapporté au volume de lait 15 mg de FVII-tg par litre de lait.
Exemple 6 : Caractéristiques du FVII issu de la séquence MEP-Hypercel + Q-SepharoseFF éluat 5 mM Calcium
Les caractéristiques analytiques sont les suivantes :
• FVII:Ag = 252,9 UI/ml - Protéines = 123 μg/ml (pureté calculée 98%)
• TO FVII=C = 3224 UI/ml à TO, soit un rapport = 13,4
• T24 à 26h à température ambiante, le FVII: C = 3721 à 4365 UI/ml, soit un rapport = 15,5 à 18,2
Contrôle Qualité pour le FVIIa recombinant Novoseven® (NoveNordisk)-> rapport = 21,5 à 25,1
• Analyse densitométrique : A TO, présence de 50,3% de FVII-tg non clivée.
Après 18 heures à température ambiante, présence de 5,3% de FVII-tg non clivée.
Le FVII issu de la séquence MEP + QSFF donne un FVII très purifié dont l'activation est réalisée à environ 50%. Toutefois, cette activation se poursuit naturellement et lentement dans le milieu, à température ambiante.