TWI496542B - 萃取乳汁第ⅶ因子之方法 - Google Patents

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Description

萃取乳汁第VII因子之方法
本發明係關於一種使用結合同時為斥水性及離子性之一配體之一撐體，萃取存在於乳汁中之一種或多種蛋白質之方法，特別為其三度空間結構形成一斥水嵌片之球狀蛋白質。
大部分市售藥物係由合成所得化學物質所組成。實際上，至晚近，近代醫藥強力仰賴經由化學合成所製造的藥物來治療或診斷疾病。
但蛋白質呈現攜帶生物資訊之分子的顯著部分。於有大量激素、生長因子、血液凝固因子及甚至抗體特別為此種情況。
概略言之，蛋白質為由胺基酸所組成之聚合物，通常具有高分子量，無法以合理成本經由化學合成獲得。意圖供治療使用之此種蛋白質通常例如係由活生物體、組織或人血液或動物血液分離及純化。於萃取自豬胰臟之胰島素；凝固因子例如第VIII因子或第IX因子其係萃取自血漿；及免疫球蛋白特別為此種情況。
但雖然今日廣泛使用製備前述蛋白質之方法，但該等方法有缺點。萃取自血小板之某些蛋白質含量低，造成無法以足量分離來滿足日漸增加的治療需求。此外，血漿中存在有病毒、普利子(prion)或其他病原造成血漿蛋白質製造過程必須含括額外病毒中和步驟及/或病毒去除步驟，俾 便獲得可用於治療目的之產物。
為了彌補此等缺點必須訴諸遺傳工程學，遺傳工程學是一種同樣廣用於由經分離之基因合成蛋白質，由轉移入細胞之一經分離的基因合成蛋白質，然後進行該蛋白質之分泌。此種由其本身原先細胞系統外側所得之蛋白質稱作為「重組」蛋白質。
根據此項技術，可使用多種細胞系統。
細菌系統諸如大腸桿菌(E.coli)極為廣用且極為有效。細菌系統使低成本製造重組蛋白質為可能。雖言如此，此種系統限於簡單未經糖化蛋白質之製造，其無需繁瑣之摺疊過程。
真菌系統也可用於製造分泌的蛋白質。此種真菌系統之缺點在於其造成後轉譯修飾，後轉譯修飾例如主要包含聚糖單位及硫酸根之一接枝，特別係經由添加多個甘露糖衍生物基團而強力影響所得蛋白質之藥力學性質。
使用棒狀病毒(baculoviruse)之系統可製造寬廣多種蛋白質，諸如疫苗蛋白質或生長激素；但其工業應用尚未能最佳化。
哺乳動物細胞也生長用來製造複雜的重組蛋白質，諸如單株抗體。細胞表現系統結果導致經過適當摺疊及修改之重組蛋白質。相對於製造成本之產率低為其重大缺點。
至於此種細胞系統之替代之道，採用基因轉殖植物來獲得顯著量蛋白質。但此等系統包含植物特異性後轉譯修飾，特別係經由對所得蛋白質經由添加高度免疫原性木糖 殘基來修飾，因而限制其用於治療目的之用途。
前述細胞系統之一種替代之道，包含使用基因轉殖動物來製造重組疫苗或複雜的治療性蛋白質。所得蛋白質具有糖化作用，該等糖化作用極為類似人類的糖化作用且經過適當摺疊。此等複雜蛋白質並非單純由單一多肽鏈所組成，諸如生長激素；反而此種蛋白質於胺基酸組裝之後以多種方式修飾，特別係經由特定裂解、糖化及羧甲基化修飾。於大部分情況下，此種修飾無法藉細菌細胞或酵母進行。相反地，基因轉殖動物使其可能組合於細菌細胞系統所見之表現程度及使用細胞培養所得之後轉譯修改二者，全部皆係以較使用細胞表現系統所造成的成本更低的製造成本製造。
於基因轉殖動物之生物材料中，乳汁作為研究主題，已經讓乳汁被視為重組蛋白質之一種極為令人滿意的分泌來源。
由基因轉殖動物之乳汁所製造之重組蛋白質容易經由將編碼期望蛋白質之基因接枝至乳汁蛋白質合成基因中之一者將特別導引此種蛋白質至乳腺之該調節區，然後蛋白質分泌於乳汁中。
舉個實例，參考歐洲專利申請案第EP 0 527 063號，該案說明於基因轉殖哺乳動物乳汁中之期望蛋白質之製造，其中編碼期望蛋白質之基因表現係受乳清蛋白質啟動基因的控制。
其他專利案或專利申請案說明於基因轉殖哺乳動物乳 汁中製造抗體(EP 0 741 515)、膠原蛋白(WO 96/03051)、人第IX因子(U.S.6,046,380)、及第VIII因子/翁偉利布藍德(Von Willebrand)因子複體(EP 0 807 170)。
儘管就蛋白質之表現而言，此等方法獲得滿意的結果，但使用乳汁作為重組蛋白質來源有其缺點。主要缺點在於一方面難以以滿意之產率由乳汁中萃取重組蛋白質；而另一方面係隨後之純化困難。
實際上，乳汁是一種混合物，包含90%水及多種其他成分，該等成分可分成三個類別。第一類稱作為「乳清」(lactoserum)(或乳清(whey))，乳清包含碳水化合物、可溶性蛋白質、礦物質及水溶性維生素。第二類稱作為「脂質相」(或乳油)，乳油含有呈乳液形式之脂質材料。第三類稱作為「蛋白質相」，蛋白質相包含約80%酪蛋白，酪蛋白形成可於pH 4.6沉澱或透過凝乳酶一種酵素凝固劑，於鈣存在下的作用而沉澱的一組蛋白質。多種酪蛋白與磷酸鈣鹽形成膠體膠素錯合物，可能達到約0.5微米等級之直徑，該磷酸鈣鹽例如可呈磷酸三鈣之聚積體(聚簇)形式存在，亦即Ca9 (PO4 )6 。此種膠素包含酪蛋白亞單位，酪蛋白亞單位係由於酪蛋白中豐富之親水層環繞於斥水核心所製成，磷酸鈣鹽係經由靜電交互作用而結合至該親水層。此等磷酸鈣鹽也可存在於膠素之內容積而未結合至該酪蛋白。此種蛋白質相也含有可溶性蛋白質諸如乳白蛋白及乳球蛋白，以及得自血液之白蛋白及免疫球蛋白。
依據於基因轉殖動物之乳汁中所分泌之重組蛋白質之 性質而定，該蛋白質可存在於乳清或存在於蛋白質相，或甚至同時存在於二者。此等乳汁成分各類別之豐富及複雜度造成其甚至更難以實施蛋白質之萃取，特別係捕捉於酪蛋白膠素中之蛋白質之萃取。另一項困難係在於此種蛋白質於兩相中任一相中之優勢無法確切預測。
重組蛋白質也對乳汁中之鈣離子具有親和力，鈣離子係呈鹽形式及/或多種可溶性錯合物形式存在，或呈酪蛋白膠素之磷酸鈣鹽形式存在。此等親和力係由蛋白質與二價鈣陽離子間之靜電鍵結所反應。蛋白質/鈣離子親和性讓其可定義親和力常數，依據親和力常數之數值而定來決定鍵結之強度。大致上，對鈣離子有親和力之蛋白質大部分係結合至膠素之磷酸鈣鹽。其萃取要求實施複雜的步驟，且有相對應之實施及產率上的問題。
乳品業所使用來分離蛋白質的傳統解決之道，包含巴氏滅菌法，接著為酶凝固或酸沉澱(pH 4.6)，由於重組蛋白質經常因溫度及pH的組合效應而變性，故該傳統解決之道無法用於此種情況。此外，蛋白質捕捉於酪蛋白膠素，結果導致萃取產率低。其他解決之道，包含使用過濾、離心及/或沉降或沉澱技術來分選乳汁之實施物理方法，也導致萃取產率無法為人所接受，導致低純度萃取重組蛋白質。
文件EP 0 264 166說明於遺傳修飾動物乳汁中說明期望之蛋白質分泌於基因修飾動物之乳汁。本文件並未述及任何由該乳汁純化此種蛋白質之步驟。
美國專利案第4,519,945號說明一種萃取重組蛋白質之 方法，係經由如前文說明實施酸化步驟及加熱步驟來由乳汁製備酪蛋白及乳清沉澱物。此種方法結果導致該種蛋白質活性的顯著損失及萃取產率低。
美國專利案第6,984,772號揭示一種由基因轉殖哺乳動物之乳汁純化重組纖維蛋白原之方法。此種方法包括利用連續離心操作而由酪蛋白丸粒及蛋白質相分離乳清之步驟。乳清經分離，然後儲存用於該方法之其餘步驟，獲得經純化之纖維蛋白原溶液。
但本方法無法應用於以滿意的產率製造被捕捉於酪蛋白膠素內及/或捕捉於酪蛋白膠素上之重組蛋白質，諸如血漿凝固因子，例如第VII因子、第VIII因子及第IX因子。
專利申請案No.WO 2004/076695說明由基因轉殖動物之乳汁過濾重組蛋白質之方法。本方法包括一初始乳汁澄清步驟，亦即去除乳汁成分因而獲得可通過孔隙直徑為0.2微米之過濾膜過濾之溶液之步驟。此種步驟導致移除酪蛋白膠素。結果，若酪蛋白膠素含有期望之蛋白質捕捉於其結構內部，則實施此步驟可能導致產率過低。
美國專利案第6,183,803號說明一種由乳汁分離天然存在於乳汁之蛋白質諸如乳白蛋白及重組蛋白質諸如人白蛋白或α1抗胰蛋白酶之方法。此種方法包括一初始步驟，包含將螯合劑與含期望之蛋白質之乳汁接觸。本步驟造成酪蛋白膠素之崩潰，其又導致含有酪蛋白、乳清蛋白及期望之蛋白質之經澄清之乳清的形成，然後該方法包括一步驟，包含經由添加不溶性二價陽離子鹽至液體撐體(亦即經 過澄清之乳清)來將酪蛋白膠素之結構重新成形。此等膠素沉澱，結果導致包括期望之蛋白質之液相形成，由於鹽類飽和酪蛋白之靜電結合位置之故，該期望之蛋白質並未被捕捉於膠素內。如此，根據此種方法，經由膠素之結構重新成形及其製備，最終達成期望之蛋白質之分離。
此種方法複雜，難以實施，無法應用至對鈣離子有相對高親和力之蛋白質。凝固蛋白質特別包括落入此類中於維生素K之作用之下已知可被合成之蛋白質。
始於兩項觀察，亦即某些重組蛋白質類別其分泌於基因轉殖動物乳汁，且存在於乳清之分離及純化方法，結果導致其產率極低；以及其他捕捉於酪蛋白膠素內之蛋白質類別方法，該等方法複雜而難以實施，本案申請人將其目的設定於提供一種由乳汁萃取屬於乳汁成分之蛋白質之方法，該蛋白質無論是否為天然，諸如重組第VII因子、第VIII因子及第IX因子，特別對組織中之離子形式之鈣具有親和力，該方法可以簡單方式實施，有滿意之產率，且保有蛋白質之生物活性。
為了解決此項技術問題，本案申請人開發一種萃取乳汁蛋白質之方法，於該乳汁之天然pH下蛋白質具有至少一個斥水嵌片及一負電荷，該方法包括下列步驟：a)撇渣且脫脂該乳汁，b)於允許該蛋白質被捕捉於一層析術撐體之pH條件下(該pH係高於4.6)，將含有該蛋白質之經脫脂且經撇渣之選分轉移至一層析術撐體，該撐體其上接枝同時為斥水性 及離子性之一配體，c)洗提該蛋白質，d)經由自該經洗提之選分移除該乳汁蛋白質來純化該經洗提選分，以及e)回收該蛋白質。
根據本發明之方法之優點在於極為容易實施，一方面係由於只含少數幾個步驟，另一方面於實施該第一步驟前無須實施乳汁澄清步驟，該第一步驟係用來將期望之蛋白質捕捉於其上接枝有該配體之該撐體上。
根據本發明之方法可應用至新鮮乳汁或冷凍乳汁。乳汁可為得自任一種雌性哺乳動物且含有期望之蛋白質之乳汁，該哺乳動物例如牛、羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或豬，該表單為非限制性。
依據該哺乳動物乳汁之天然流動性而定，較佳係於撇渣與脫脂步驟之前將乳汁流體化。舉個實例，參照兔乳汁，兔乳汁相當濃稠，較佳經流體化以方便實施本發明。但即使於相對黏稠乳汁之情況下，流體化步驟也純然為選擇性。本流體化步驟可經由將水性溶劑添加至生乳進行。舉例言之，水性溶劑可為具有低離子強度之磷酸鹽溶液，諸如30 mM磷酸鈉溶液pH 8.0，但非限制性。此種溶液可維持穩定之乳汁膠素結構(於懸浮液中之酪蛋白膠素)。
供本發明之目的之用，「撇渣」一詞須瞭解係指乳汁之脂肪物質分離，因而獲得兩個選分，亦即脫脂乳及乳油。撇渣為熟諳技藝人士眾所周知之技術，例如可使用撇渣器 或利用有機溶劑例如三氯乙酸進行，但非限制性。於一個特定實施例中，經由使用正ζ電位，通過玻璃纖維撐體過濾進行乳汁之撇渣。可參照優堤頗(Ultipor)GF普拉斯(Plus)過濾器(培爾生命科學公司(Pall Life Science))、GF/F過濾器(惠特曼公司(Whatman))、或吉塔普拉斯(Zetaplus)滌利沛(Delipid)過濾器(丘諾(Cuno)3M公司)。較佳使用優堤頗GF普拉斯過濾器(培爾公司)及AKS5或AKS6活性炭(培爾司林克公司(Pall一Shrenk))。
本過濾步驟也可脫脂選分，亦即去除脂質，脂質諸如為脂肪酸類、三酸甘油酯類及固醇類。本脫脂可經由於已經允許稀釋後之乳汁放置30分鐘(因而脂肪物質漂浮至表面上，藉此最佳化乳油由乳汁之分離)後經由通過優堤頗GF普拉斯過濾器過濾之乳汁之前過濾來達成。
本撇渣與脫脂步驟主要原因係由於接枝於撐體上之配體吸附脂質，該配體同時為斥水性及離子性。因此，於步驟b)之前必須移除脂質，否則期望之蛋白質無法為配體所保有，或為配體所保有的情況極差。此種情況結果將導致期望蛋白質之萃取方法之產率降低。
本發明之優異態樣中之一者為單純經過撇渣及脫脂之得自步驟a)之選分，直接適合用於實施步驟b)，步驟b)極佳為經由親和層析術進行純化之步驟。如此，無需嚴格的中間步驟來讓經脫脂且經撇渣之選分適合用於透過步驟b)之親和層析術純化。
步驟b)不可於低於酪蛋白之等電點(pI)之pH進行，該 pI為4.6至5。實際上，若步驟b)係於比較酪蛋白質之pI更低之pH進行，則後者將沉澱，因此有對層析術撐體造成顯著損害的缺點。特別，當使用管柱進行層析步驟時，酪蛋白沉澱可能堵塞管柱，因而損壞管柱及其內容物，亦即層析術凝膠。此外，於pH低於5，也可能沉澱其他蛋白質，諸如轉鐵蛋白或白蛋白，將造成產率降低。最後，某些蛋白質於酸性pH變性。例如於第VII因子、第VIII因子、第IX因子、纖維蛋白原及補體因子H屬於此種情況，該表單並非限制性。
步驟b)較佳係於5至8.5之pH進行。如此於步驟a)製造之經過撇渣及變性之乳汁適用於於pH 5至8.5施加於步驟b)之層析術撐體。此種pH較佳為5.5至8，或6至7.5。此pH較佳為6.5至6.8。此pH更佳為乳汁之天然pH。
於此種pH(亦即於pH 5至8.5)，具有天然交互作用位置之蛋白質，諸如具有抗原/抗體、酶/酶基質、或酶/抑制劑親和力或假親和力之蛋白質(該表單非限性)，當然於彼此相對之相對位置具有電荷及斥水區，而於pH 5至pH 8.5之間不會有寬廣變化。因此於此pH，此等蛋白質帶有負電荷。較佳於此pH，配體與蛋白質間之交互作用大致上為斥水反應。
較佳用於根據本發明方法之層析技術允許含有期望之蛋白質之經過脫脂且經撇渣之選分被捕捉於其上已經接枝有同時為斥水性及離子性之一配體之一撐體上。出乎意外地，此種配體可結合期望之蛋白質，原因在於其結構式具 有斥水嵌片，同時留下雜質，包括未經結合之酪蛋白膠素。蛋白質之內部斥水區可結合至此種配體，由於其斥水本質及由於其電荷，將允許進行與期望之蛋白質間之離子交互作用，藉此來確保對期望之蛋白質有高度親和力，及對欲被純化之蛋白質具有較高選擇性。
未結合之蛋白質主要包含大部分酪蛋白、乳清酸蛋白質(WAP)、轉鐵蛋白、乳球蛋白、乳白蛋白及乳清白蛋白。
此外，此種方法適合萃取具有如下指定特性之任一種蛋白質：換言之，於乳汁之天然pH，亦即於約6.5至6.8之範圍，蛋白質具有斥水區，且攜帶負電荷；或至少，電荷之總體平衡極為有利於負電荷。
於本發明之範圍內，pH條件允許透過斥水交互作用，或透過靜電交互作用以及透過斥水交互作用，讓蛋白質被保有於或概略言之被結合於層析術撐體之配體。此種情況大為依賴欲純化之蛋白質之等電點，因此依賴實施該方法之pH。可使用之層析術撐體為帶有正電荷配體之撐體(屬於陰離子交換型)，pH適合讓蛋白質攜帶總負電荷。相反地，當該方法係於可優異地用於實施本發明之pH，亦即pH 5至pH 8.5間進行時，可使用帶負電荷之配體。本配體之端未官能基例如為磺醯基或羧基，pH可設定大於6之值，故蛋白質帶有總正電荷。本實施例適用於欲純化之蛋白質之等電點，於鹼性pH，特別於大於6之pH之情況，蛋白質帶有正電荷。須小心確保pH係與該方法之實施可相容，因而不會顯著破壞欲萃取之蛋白質或乳汁。
於另一個具體例中，實施步驟b)之pH為pH 5至8.5，pH值經選擇讓蛋白質與配體間之交互作用大致為斥水性。
步驟c)之實施(洗提)可使用熟諳技藝人士已知之任一種洗提劑進行，使蛋白質停止被保有，原因在於例如離子互斥效應，但也由於趨渾沌效應(chaotropic effect)緣故。洗提較佳涉及離子互斥效應。蛋白質之結構形式及蛋白質之電荷可經由調整洗提緩衝液之pH來修飾，或經由選擇適當洗提緩衝液來修飾。
舉個實例，假設層析術撐體具有一配體其將帶正電荷(屬於陰離子交換型)，則可述及尿素濃度為1.2 M至8 M與甘胺酸濃度為25 mM至50 mM間之混合物，該濃度為混合物之終濃度。須指出尿素與蛋白質之胺基反應將產生若干變性，於得自外生(exogen)化合物(此處為甘胺酸)之胺基存在下，尿素將產生期望蛋白質之較少變性。
其他洗提劑之實例包括4至6之酸性pH之水溶液，水性混合物包含選自於由下列所組成之組群之組分，較佳為兩種或三種組分：磷酸鈉，濃度為5 mM至50 mM且較佳為30 mM，及乙二醇；檸檬酸鈉，濃度為5 mM至50 mM且較佳為30 mM，及乙二醇；磷酸鈉，濃度為5 mM至50 mM且較佳為30 mM，及乙二醇；TRIS/NaCl及鈣鹽，濃度為1 mM至10 mM且較佳為5 mM，及乙二醇；辛酸鈉，濃度為10 mM至100 mM且較佳為30 mM，及乙二醇；及磷酸鈉，濃度為5 mM至50 mM且較佳為30 mM，或水且較佳為純水(重蒸餾注射用水)，該表單為非限制性。前述濃度為混 合物之終濃度。用於前述含乙二醇之二元混合物，乙二醇之體積比例特別為20%至70%。
用於全部此等含有乙二醇之緩衝液，乙二醇可以丙二醇替代，丙二醇之毒性較低，或由任何其他溶劑替代。尿素較佳係用於胺基酸之存在下作為洗提劑，其濃度較佳為先前指示之濃度。由於其趨渾沌能力之故，此種溶液可遏止配體與被吸附之蛋白質間之交互作用。
水性混合物之pH極佳為7至8，pH過酸可能造成所考慮之蛋白質的變性。
此等水性混合物也含有0.5%至1.5%非離子性清潔劑例如崔頓(Triton)X100。申請人觀察到存在有此種具有pH值為7至8之清潔劑可改良所洗提之蛋白質之回收產率。
於一個特定具體例中，當實施步驟b)之pH為5至8.5時，可經由將pH降至低於配體之pKa值以下來進行洗提(若該配體之pKa係低於蛋白質之等電點)，否則係經由將pH降至低於蛋白質之等電點來進行(若蛋白質之等電點係低於配體之pKa)。
於含有期望蛋白質之選分之洗提結束時，仍然需要純化步驟來由乳汁移除污染蛋白質，諸如乳鐵蛋白、乳白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白及免疫球蛋白。此種純化手段為熟諳技藝人士眾所周知。舉個實例值得一提者為親和層析術、斥水層析術、陽離子交換層析術或陰離子交換層析術、或尺寸排除層析術，該表單並非限制性。
步驟d)也可優異地達成標靶蛋白質之良好復性 (renaturing)，亦即適當摺疊，如此對蛋白質提供等於天然蛋白質之生物活性之一種生物活性。
任選地，復性也可經由單純滲析或滲濾進行來去除變性劑。
於移除存在於含有期望蛋白質之選分之最末乳蛋白步驟結束時，回收含有經純化之期望蛋白質之一選分。
回收含有期望之蛋白質之選分之手段為熟請技藝人士眾所周知。舉例言之，值得一提者有親和層析術、斥水層析術、陽離子交換層析術或陰離子交換層析術、或尺寸排除層析術，該表單並非限制性。
於本發明之一個具體例中，包含澄清乳汁之步驟較佳係於撇渣與脫脂步驟(步驟a)之後而於步驟b)之前進行。
乳汁之「澄清」一詞須瞭解係指透過崩解而移除膠素，藉此獲得含有酪蛋白、乳清蛋白質及期望之蛋白質之澄清後之乳清之步驟。
本具體例可獲得較佳產率，原因在於此種情況下，與酪蛋白膠素相關聯之期望蛋白質可富含純化選分，而於不包括澄清步驟之實施例中並非此種情況，於該具體例中膠素被移除，攜帶與其相關聯之期望蛋白質。本具體例也可進行移除存在於乳汁中之任何微生物劑或細胞劑及細胞碎屑(諸如細菌、表皮細胞或乳汁淋巴細胞，該表單並非限制性)之次微米過濾。
更特別，乳汁澄清步驟係透過添加一定濃度之螯合劑進行，該濃度螯合劑讓螯合劑與乳汁混合後，乳汁之膠素 結構消失，獲得澄清乳汁(酪蛋白於溶液或乳清)。乳汁使用螯合劑澄清為熟諳技藝人士眾所周知。至於螯合劑之例，值得一提者有檸檬酸三鈉或EDTA，但非限制性。例如0.25 M終檸檬酸鈉濃度獲得乳汁的完全澄清。
於本發明之另一個具體例中，於撇渣與脫脂步驟(步驟a))之後而於步驟b)之前，沉澱酪蛋白亞單位聚簇。
雖然並非必要，但本步驟可透過沉澱造成乳汁之膠態去穏定化。期望之蛋白質經過釋放，或由酪蛋白膠素或亞單位解離，因而可回收與膠素結合之蛋白質。
於本發明之一特定具體例中，同時為斥水性及離子性之配體為4－巰基－乙基－吡啶。
含有此種配體之撐體之一個實例為MEP海波希爾(HyperCel)凝膠(西弗京(Ciphergen))。舉例言之，允許期望之蛋白質吸附於此種撐體上之條件包括一種pH值，該pH值高於蛋白質之等電點(蛋白質上之負電荷)至少0.5 pH單位，而低於配體之pI(凝膠之正電荷)至少1 pH之單位。若期望之蛋白質為FVII，則選定之pH為pH 8。蛋白質吸附於配體上較佳係於pH條件下進行，讓蛋白質與配體間之交互作用大致上為斥水性。此種pH較佳為5至8.5。
於本發明之特定具體例中，其中欲純化之蛋白質為第VII因子，經由將pH降至低於配體之pKa之pH，亦即pH低於4.8來進行洗提。
若配體為4－巰基－乙基－吡啶且若蛋白質為第VII因子，則可使用如前文定義之水性溶液及混合物，也可使用 水且較佳使用重蒸餾WFI(注射用水)進行洗提。
此外，本案申請人出乎意外地發現有4－巰基－乙基－吡啶型配體之MEP海波希爾凝膠或有4－巰基吡啶型配體之海哲普(Hitrap)IgY凝膠，就FVII而言具有某種程度的選擇性，其結構式係與參考分子「符合一致」，亦即可被活化。實際上，有關未吸附於此凝膠上之形式，以常規基礎，發明人觀察到可被活化形式(醯胺分解FVII檢定分析)與整體形式(抗原FVII檢定分析)間之分歧。醯胺分解FVII檢定分析與使用一單位血漿抗原單位之試管試驗抗原之活化做比較，定義為獲得1醯胺分解單位，讓該比值為1。於純化過程中，蛋白質可進行多種物理化學變性或生物化學變性實例。當此比值為0.8至1.2時，此比值被視為正常，較佳比值係等於1。於基因轉殖動物體內，第VII因子之乳汁分泌並非100%均質，熟諳技藝人士瞭解轉譯後轉形之差異，特別包括蛋白質之三度空間結構之糖化與摺疊。如此乳腺細胞於基因轉殖後產生FVII，該FVII經過糖化然後摺疊，隨後由乳腺分泌入乳汁內。並未保證可形成之100%分子具有功能。可能天然涉及之控制機轉係於基因轉殖細胞內修飾；特別比較天然蛋白質，觀察到基因轉殖蛋白質中糖形式成熟之差異。
如此，未吸附於有4－巰基－乙基一吡啶型配體之MEP海波希爾凝膠，或未吸附於有4－巰基吡型配體之海哲普IgY凝膠之FVII形式具有0.4至0.5之比值，而洗提後形式具有1.0至1.4之比值。因此，MEP海波希爾凝膠藉吸附選 擇最類似天然形式之抗原形式，相反地其可被假設為未結合形式可能於基因轉殖動物製造時有缺陷。此乃一明確的優點，原因在於此目的係從乳汁萃取人FVII，該人FVII可注射入人體內而無顯著副作用，供此項目的之用，FVII須儘可能類似天然形式。烯胺分解/抗原比為顯示是否達成此種情況之工具。
於本發明之另一特定具體例中，同時為斥水性及離子性之配體為4－巰基－苯并咪唑磺酸。
含有此種配體之撐體之一個實例為MEI海波希爾凝膠(西弗京(Ciphergen))或凱普托(Capto)一MMC(GE健康照護公司(GE Healthcare))，該表單並非限制性。
當使用此型撐體時，適合採用略微較酸性之情況，pH值為5至6。於此種pH值時，酪蛋白之溶解度低，甚至可能開始出現沉澱。鹽諸如1M NaCl之添加讓其可能維持酪蛋白於pH 5至pH 6間為可溶性。洗提可使用如前文定義之水性溶液及混合物進行，也可使用水且較佳使用重蒸餾WFI(注射用水)進行。
步驟d)較佳係透過陰離子交換層析術實施。
較佳低離子強度及pH讓陰離子交換步驟特別適合，原因在於其允許期望之分子亦即FVII濃縮且轉化成活化第VII因子，然後透過構形洗提而純化[亦即其形式之改變特別與鈣結合連結，結果產生N端部(gla功能部位)電荷改變，於鈣飽和後讓總蛋白質電荷變陰性]。
於步驟d)中，步驟d)較佳係利用陰離子交換層析術進 行，蛋白質之洗提較佳係使用5 mM鈣離子溶液進行。
本溶液之鈣離子濃度較佳為1 mM至50 mM，較佳為2 mM至25 mM及更佳為3 mM至12.5 mM或4 mM至6 mM。
於另一個具體例中，洗提用溶液可基於銅鹽、鋅鹽或錳鹽。
根據本發明方法可實施用於重組蛋白質之萃取，或用於天然存在於哺乳動物乳汁中之蛋白質之萃取。
蛋白質可為天然存在於乳汁之蛋白質，例如可為β乳球蛋白、乳鐵蛋白、α乳白蛋白或膘(proteose)蛋白腖或其混合物。
蛋白質也可為非天然存在於乳汁之蛋白質。其實例包括第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、α－1、抗胰蛋白酶、酶、抗凝血酶III、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓鞘白質基本蛋白質、前胰島素、組織胞質素原活化劑及抗體。
於一個較佳具體例中，蛋白質為重組蛋白質，含有蛋白質之乳汁為基因轉殖乳汁。實質上，非天然存在於乳汁之蛋白質可透過重組DNA及基因轉殖技術的使用，藉非人基因轉殖哺乳動物合成。
此等技術為熟諳技藝人士眾所周知，讓其可於基因轉殖動物乳汁合成任一種期望之蛋白質。
此種蛋白質為重組蛋白質或基因轉殖蛋白質，原因在於兩個術語於本案中被視為相當術語，然後透過重組DNA技術之使用而合成。
須瞭解「基因轉殖動物」一詞係指其基因體內已經結合一外生DNA片段之任一種非人動物，特別該片段為編碼期望之蛋白質之片段，讓該動物可表現由該外生DNA所編碼之蛋白質，可將外生DNA傳遞給其後代。
如此，任一種非人哺乳動物皆適合用於製造此種乳汁。
較佳使用兔、羊、山羊、牛、豬或小鼠，該表單並非限制性。
乳腺分泌期望之蛋白質，結果導致其分泌於基因轉殖哺乳動物乳汁，暗示以組織依賴性方式控制重組蛋白質之表現。
此種控制方法為熟諳技藝人士眾所周知。表現之控制可經由可導致蛋白質於特定動物組織表現之序列來達成。此等序列特別包括啟動子序列及其信號胜肽序列。
熟諳技藝人士眾所周知之啟動子實例包括WAP(乳清酸性蛋白質)啟動子、酪蛋白啟動子及β乳球蛋白啟動子，該表單並非限制性。
於基因轉殖動物乳汁製造重組蛋白質之方法包括下列步驟：含有期望蛋白質之編碼基因而該基因係受乳汁中天然分泌之蛋白質之啟動子所控制之合成DNA分子，轉移入非人哺乳動物之胚胎。然後胚胎被導入同種雌性哺乳動物體內。然後生下基因轉殖動物。一旦個體已經充分發育，誘導哺乳動物泌乳且收集乳汁。則該乳汁含有期望之重組蛋白質。
於人以外之雌性哺乳動物乳汁中製造蛋白質之方法之 一個實例提供於文件No.EP 0 527 063，該案教示應用於根據本發明之期望之蛋白質之製造。
含有WAP啟動子之質體係經由導入含有WAP基因之啟動子之序列來組成，此質體之形成方式為可接收外來基因，該外來基因係根據WAP啟動子而形成。編碼期望蛋白質之基因係依據WAP啟動子之結合而形成。含有啟動子及編碼期望蛋白質之基因之質體用來透過微注射入兔胚胎雄性原核來獲得基因轉殖動物諸如兔：然後該胚胎轉移入激素準備妥當之雌兔之輸卵管轉殖基因之存在係使用得自所製造之幼小基因轉殖兔萃取之DNA，透過南方墨點技術來檢測。動物乳汁中之濃度係使用特異性放射性免疫檢定分析評估。
蛋白質較佳為凝固蛋白質。根據本發明之蛋白質較佳係選自於第II因子(FII)、第VII因子(FVII)、第IX因子(FIX)及第X因子(FX)及其活化形式；及C蛋白、活化C蛋白、S蛋白及Z蛋白或其混合物。
以特佳方式，根據本發明之蛋白質為FVII或活化FVII(FVIIa)。
就此方面而言，FVII或FVIIa可根據文件EP 0 527 063製造，該方法之摘要係如前文提供。其序列為人FVII序列之DNA片段隨後置於WAP啟動子之控制之下。例如此種DNA序列係出現於序列號碼1b，如文件EP 0 200 421所述。
根據本發明之FVII較佳被活化。於活體內FVIIa係藉多種蛋白酶(FIXa、FXa及/或FVIIa)透過酶原來裂解成二 鏈，二鏈係藉雙硫橋連接。單獨FVIIa極少具有酶活性，但FVIIa與其輔因子(組織因子(FT))複合時，藉活化FX及FIX來促發凝固過程。
FVIIa之凝固劑功效比FVII當其與組織因子(FT)交互作用時之凝固劑功效高25倍至100倍。
於特佳方式中，該蛋白質為第VII因子(FVII)。
於本發明之一個實施例中，FVII可於試管內藉第Xa、VIIa、IIa、IXa及XIIa因子活化。
根據本發明之FVII也可於其純化過程中活化。
本發明之另一目的係使用具有正ζ電位之玻璃過濾器來同時撇取與脫脂哺乳動物乳汁。此種實施可優異地替代耗時之傳統藉離心分離；或替代於工業規模時成問題之特定脫脂溶劑(氯仿或含氟烷衍生物例如氟利昂(Freon))之使用。
本發明之另一目的係使用於其上接枝同時為斥水性及離子性之一配體之一撐體來萃取存在於經撇渣且經脫脂乳中之蛋白質。
其他本發明之態樣及優點述於下列實施例，下列實施例僅供舉例說明之用而非囿限本發明之範圍。
 實施例 實施例1：於其乳汁中製造人FVII蛋白質之基因轉殖兔之製造
首先，p1質體之製法係經由將Bam H1與Hind III序列間之WAP基因之BamH1－Hind III序列(6.3 Kb片段)(述 於Devinoy等人，核酸研究，第16卷第16期，1988年8月25日，8180頁所述報告)導入p－poly III－I載體之多聯結子中(述於Lathe等人，基因(1987)57,193－201之報告)。
於此選殖期間，BamH1位置經刪失且由出現於p1載體之ClaI位置置換。如此，p1載體為於6.3 kb WAP啟動子之控制之下可接收替換的外來基因之質體。外來基因例如可導入多聯結子之SalI位置。含有全部起動子及外來基因之插入子可於位在p－poly III－I質體多聯結子兩端的兩個Notl位置裂解後而由質體分離。
由p1質體所得之p2質體含有兔WAP基因之啟動子(6.3 Kb)及人FVII基因。用來獲得基因轉殖兔之片段係位於兩個Notl位置間。
HindIII位置透過位置導向突變(site－directed mutagenesis)而導入基因先導子序列中來作為選殖位置。
基因轉殖兔係透過傳統微注射技術獲得(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,4438－4442)。含有500個複製成的基因之一個或兩個p1質體注入小鼠胚之雄原核內。該組成係於p－poly III－I載體內形成(Lathe等人，基因(1987)57,193－201)基因。微注射含有重組基因之此載體之Not1－Not1片段。然後胚胎轉移入經過激素準備妥當之代理孕母雌性動物的輸卵管。約10%經過基因操作的胚胎可生出幼兔，2%至5%經過基因操作之胚胎可產下基因轉殖幼兔。轉殖基因的存在係使用萃取自兔尾之DNA，透過南方墨點技術檢測。動物血液和動物乳汁內之FVII濃 度係使用特定放射性免疫檢定分析評估。
FVII之生物活性係經由將乳汁添加至細胞培養撐體或添加至兔乳房外殖體培養撐體來評估。
用來獲得基因轉殖兔而於乳汁內製造根據本發明之FVII之技術之進一步細節係說明於歐洲專利案No.EP 0 527 063。
實施例2：經撇渣且經脫脂之選分之製備
因原料包含兔生乳(亦即未經脫脂之冷凍乳汁)含有每升約150克蛋白質及類似量的脂質(15%乳油)，首先需要「流體化與脫脂」介質，來讓其與層析條件變成可相容。
為了達成此項目的：－一倍體積經解凍之生乳與兩倍體積水性溶劑混合，－全流體混合物通過有正ζ電位之玻璃過濾器撐體過濾，亦即優堤頗GF普拉斯過濾器(培爾生命科學公司製造)。
結果為全流體生材料，其充分脫脂來供層析技術使用。
方案「A」： 水性溶劑為具低離子強度(小於100 mM)之磷酸鹽溶液，添加或未添加氯化鈉。
方案「B」： 溶劑含有螯合劑：諸如檸檬酸三鈉或EDTA，螯合劑濃度為，與乳汁混合後，乳汁之膠素結構消失，留下所謂之「澄清」乳汁(酪蛋白於溶液或乳清)。例如於pH 8.0之終檸檬酸鈉濃度0.25 M可提供乳汁之完全澄清。
實施例3：經撇取且經脫脂選分根據實施例2之方案「A」之親和層析術
乳汁中之基因轉殖或重組VII(rFVII)穩定捕捉於MEP海波希爾凝膠係使用下述檢定分析驗證，其中： a)MEP凝膠體積＝2毫升/生乳F1體積＝4毫升 乳汁體積對MEP凝膠體積＝2
結論： 30% FVII未由凝膠所保有，洗提產物總量占所使用之FVII之59%。洗提係於乙二醇(EG)溶劑使用30 mM磷酸鹽緩衝液於pH 8進行。根據該結果(89%)，約有10% FVII未經回收。
b)MEP凝膠體積＝10毫升/生乳F1體積＝200毫升 乳汁體積對MEP凝膠體積之比由3增至20，係藉100毫升之增量分選。
結論： 呈凝膠電荷(22%至41%)之函數變化，32% FVII未由凝膠所保有。最佳乳汁對凝膠比係由10至15。洗提產物(50% EG於30 mM磷酸鹽，pH 8)表示所使用之FVII之44%。根據該項結果(68%)，有30% FVII未經回收，其指出所捕捉之形式為高度斥水性。
此二檢定分析係於第二代(所謂之「F1 」)基因轉殖兔乳汁進行，指出約30% rFVII並未吸附於所謂之「混合模式」MEP－海波希爾凝膠上。
MEP－海波希爾之經證實的結果： 此處，根據方案「A」(穩定化酪蛋白膠素)或方案「B」(增溶的酪蛋白)，證實第一代(所謂之「F0 」)基因轉殖兔乳 汁以及再度處理「未結合」於MEP－海波希爾凝膠上之選分之初步結果。
a)MEP凝膠體積＝10毫升/生乳F0體積＝133毫升 乳汁體積對MEP凝膠體積＝13.3
結論： 46% FVII於第一繼代之後並未被凝膠所保留。第二繼代後，此比例升高至71%。F0 乳汁獲得比F1 乳汁更高比例之此種形式。
相反地，於第一繼代期間洗提19% FVII(MEPI結果＝65%)，於第二繼代期間洗提11% FVII(MEP2結果＝82%)。整體之(MEP1＋2)，33% FVII維持未結合，與24% FVII結合且洗提於EG者相比。根據該結果(57%)，未回收約40%FVII，其指出所保有之形式為高度斥水。
b)MEP凝膠體積＝10毫升/生乳F0體積＝140毫升 乳汁體積對MEP凝膠體積＝14
結論： 於第一繼代後，46% FVII未吸附於凝膠上，於第二繼代期間，於使用足量濃度0.25 M之檸檬酸鹽「澄清乳」後，此比例維持於46%。
當凝膠係以30 mM磷酸鹽緩衝液(注入後洗滌)時，發現FVII之洗提占總量19%。此種洗提明白反映出較非斥水形式之FVII。
於第一繼代期間共17% FVII被洗提出(MEPI結果＝63%)，於第二繼代期間洗提14%(MEP2結果＝79%)。整體之(MEP1＋20，29% FVII未被保有或過早被洗提出，整體23% FVII被吸附且於EG中被洗提者相接。根據該等結果 (52%)，約40% FVII未被保有，其指出保有之形式為高度斥水。
實施例4：於MEP海波希爾凝膠上之洗提緩衝液試驗
此處，目的係經由試驗乙二醇與多種輔劑之組合來改良洗提產率。
添加非離子性清潔劑(崔頓X100)及鹼性pH顯然可改良洗提產率。試驗也包括以丙二醇(CH2 OH－CH2 －CH2 OH)置換(CH2 OH－CH2 OH)，丙二醇較為無毒；以及包括一尿素(NH2 －CO－NH2 )，一種變性劑中之試驗，而於6 M濃度復性。
也測試多種洗提方法，獲得下列結果： MEP－海波希爾以50%乙二醇(v/v)洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：1.7分鐘(未經最佳化) 洗提：混合物：50%乙二醇＋1%崔頓X100＋49% 15Mm磷酸鈉，pH 8
MEP－海波希爾以50%丙二醇(v/v)洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘(未經最佳化) 洗提：混合物：50%丙二醇＋1%崔頓×100＋49%15Mm磷酸鈉，pH 8
MEP－海波希爾以6M尿素洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：1.7分鐘 洗提：混合物：6M尿素＋20mM甘胺酸＋50mM希伯斯(N－2－羥乙基哌－N’－2－乙磺酸)緩衝液，pH 8.2
MEP－海波希爾以2M尿素洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘 洗提：混合物：2M尿素＋20mM甘胺酸＋50mM希伯斯緩衝液，pH 8.2
MEP－海波希爾以0.5M尿素洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘 洗提：混合物：0.5M尿素＋20mM甘胺酸＋50mM希伯斯緩衝液，pH 8.2
MEP－海波希爾以不含尿素洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘 洗提：混合物：20mM甘胺酸＋50mM希伯斯緩衝液，pH 8.2
MEP－海波希爾酸洗提(洗提pH＝3<MEP之pKa) 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘 洗提：0.1M甘胺酸＋鹽酸足量獲得pH 3
MEP－海波希爾於純水(WFI)洗提 注射：乳汁以檸檬酸鈉(0.25 M)澄清 於MEP凝膠上之接觸時間：8分鐘 洗提：重蒸餾WFI
FVII：Ag＝於ELISA系統中FVII之抗原檢定分析(基於特定抗體檢測)；於血漿中，1 IU/毫升FVII係等於0.5微克/毫升純FVII蛋白質；FVII：am＝可凝固之FVII含量，於接觸FVII缺乏人血漿上之組織因子後測定。
FVII(前酶)轉成FVIIa(酶)，其將FX轉成FXa，造成血漿的凝固(透過凝血酶的產生，凝血酶作用於纖維蛋白原)。
理論上，若全部分子(於國際標準血漿)皆有功能，則1 IU FVII：Ag約等於1 IU FVII：am(r＝100%)。
於本檢定分析中，若已經存在有FVIIa(部分活化FVII)則FXa的產生略微加速(r＝100%至200%)。
但若FVII受損或為「非典型」(未與組織因子結合)，則r<100%。
FVII：am/FVII：Ag比(以百分比表示)反映出純化過程中FVII分子之功能狀態。
結論： 於未結合之MEP中，FVII顯然有缺陷(製造上有缺陷)且蛋白質分解。
實施例5：於Q－西法羅斯(Sepharose)FF上MEP－海波希爾洗提產物之處理
FVII於Q－西法羅斯FF離子交換器上將其本身分割成為兩種形式，亦即幾乎純質之FVII洗提於5mM鈣(稱作為「5mM Ca2 ＋」選分及低純度FVII洗提於50 mM鈣(稱作為「50mM Ca2 ＋」選分)。觀察得之典型比例(n＝7批次)分別為36%±8%及40%±12%。
1體積QSFF凝膠＝10毫升
如此可知，於兩種情況下，主要選分皆為「5mM Ca2 ＋」選分。共萃取3,286 IU「5InM」FVII。以乳汁體積表示，此種產率係相當於每升乳汁12.5毫克rFVII。
1體積QSFF凝膠＝10毫升
如此可知，根據方案「A」之處理中之主要選分為「5mM Ca2 ＋」選分，而方案「B」之比例改變。如此顯示以檸檬酸鹽處理有利於較非期望之「50mM」形式的存在。共萃取4,253 IU「5mM」FVII。以乳汁體積表示，本產率係相當於每升乳汁15毫克rFVII。
實施例6：由MEP－海波希爾＋Q－西法羅斯FF 5mM鈣洗提產物順序所得FVII之特性
分析特性如下： －FVII：Ag＝252.9 IU/毫升－蛋白質＝123微克/毫升(計算得之純度：98%) －T0 FVII：C＝3,224 IU/毫升於T0，或13.4之比 －T24於26小時且於室溫(RT)FVII：C＝3,721至4,365 IU/毫升，或15.5至18.2之比rFVIIa之品質管制(得自諾瓦諾迪斯克(NovoNordisk))→比值＝21.5至25.1 －密度計分析：於T0：50.3%未經裂解之rFVII；於室溫經18小時後：存在有5.3%未經裂解之rFVII。
得自MEP＋QSFF順序之FVII獲得高度純化之FVII，其活化係以約50%比例進行；但此種活化於撐體中自然緩慢進行。
第1圖：於MEP海波希爾凝膠上之洗提緩衝試驗。

Claims (11)

  1. 一種萃取乳汁第VII因子之方法，其包括下列步驟：a)撇渣且脫脂該乳汁，b)於允許該第VII因子被捕捉於一層析撐體(chromatographic support)之pH條件下，其中該pH係5至8.5，將含有該第VII因子之經脫脂且經撇渣之選分(fraction)轉移至一層析撐體，於該撐體上接枝同時為斥水性(hrdrophobic)及離子性之一配體，c)洗提該第VII因子，d)經由自該經洗提選分移除該乳汁第VII因子而純化該經洗提選分，以及e)回收該第VII因子。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於撇渣與脫脂步驟(步驟a))之後而於步驟b)之前，進行一乳汁澄清步驟。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該乳汁澄清步驟係透過添加螯合劑進行，其中該螯合劑選自檸檬酸三鈉及EDTA組成之群，該螯合劑與乳汁混合後，乳汁之膠素(micellar)結構消失，獲得澄清的乳汁(酪蛋白於溶液或乳清(lactoserum))。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於撇渣與脫脂步驟(步驟a))之後而於步驟b)之前，沉澱該酪蛋白亞單位(subunit)團簇。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該同 時為斥水性及離子性之配體為4-巰基-乙基-吡啶。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中於包含洗提該第VII因子之步驟c)中，步驟c)係使用濃度為1.2M至8M之尿素與濃度為25mM至50mM之甘胺酸之混合物進行，使用pH 4至pH 6間之酸性pH水溶液進行，使用包含選自於由下列所組成之組群之組分之水性混合物進行：磷酸鈉，濃度為5mM至50mM，及乙二醇；檸檬酸鈉，濃度為5mM至50mM，及乙二醇；TRIS/NaCl及鈣鹽，濃度為1mM至10mM，及乙二醇；辛酸鈉，濃度為10mM至100mM及乙二醇；水性混合物之導電性於化合物存在下，係低於3mS/cm，或水。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中於包含洗提該第VII因子之步驟c)中，步驟c)係使用包含選自兩種或三種組分之下列所組成之組群之組分之水性混合物進行：磷酸鈉，濃度為30mM，及乙二醇；檸檬酸鈉，濃度為30mM，及乙二醇；TRIS/NaCl及鈣鹽，濃度為5mM，及乙二醇；辛酸鈉，濃度為30mM，及乙二醇；水性混合物之導電性於化合物存在下，係低於3mS/cm，或注射用重蒸餾水(WFI(bidistilled water for injection))。
  8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該步驟d)係經由陰離子交換層析術進行。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中於該陰離子交換層析步驟後，第VII因子之洗提係使用1mM至50mM鈣 離子溶液進行。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該第VII因子為重組第VII因子。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該第VII因子為經活化之FVII(第VIIa因子)。
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