JPH05123083A - ヒト成長ホルモンを乳中に分泌するトランスジエニツクアニマル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト成長ホルモンを乳中に分泌するトランス
ジェニックアニマル。 【構成】 乳蛋白質の染色体遺伝子制御領域の下流にヒ
ト成長ホルモン遺伝子を結合させたＤＮＡを導入して形
質転換させ、乳中にヒト成長ホルモンを分泌するように
したトランスシェニックアニマル。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト成長ホルモンを乳
中に分泌する新規なトランスジェニックアニマルに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はヒト脳下
垂体から分泌されるアミノ酸残基数116 からなるペプチ
ドホルモンである。ヒト成長ホルモンは現在、死体の脳
下垂体から抽出する方法、または遺伝子操作により大腸
菌等の微生物から得る方法等が知られておりこれらの方
法によって得られたｈＧＨが、小人症の治療やターナー
症の治療に用いられる。

【０００３】しかし、死体からの抽出は、量的な制限が
あり、また倫理上の問題もあり、次第にその生産は遺伝
子操作による生産が主流になりつつある。ヒト成長ホル
モン（ｈＧＨ）の遺伝子は特開昭56−21596 号公報に開
示されており公知である。

【０００４】最近、遺伝子操作による蛋白質の生産方法
としてトランスジェニックアニマルを作成し、このトラ
ンスジェニックアニマルを物質生産に利用しようという
考えが提案され、すでに一部の蛋白質については実施さ
れている。特に哺乳動物を使用すると乳中に大量の蛋白
質を分泌させることが可能であり、物質生産に適した発
現系であるといわれている。このような哺乳動物の乳中
に遺伝子操作により組み込んだ外来遺伝子の産物を分泌
させた例が報告されている。

【０００５】外来遺伝子を乳中に分泌させるためには乳
中に分泌される蛋白質の制御領域の下流に目的蛋白質を
コードする遺伝子を結合させた遺伝子を用いてトランス
ジェニックアニマルを作成することが必要である。この
ようにして作成された、外来の蛋白質を分泌するトラン
スジェニックアニマルとしては以下の例が挙げられる。

【０００６】マウスホエー酸性蛋白（ＷＡＰ）の制御領
域とｔＰＡ遺伝子の組合せによるｔＰＡ分泌マウス〔ピ
ティウス他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85 巻、
5874頁〜5878頁（1988年）〕、ヒツジβ−ラクトグロブ
リン制御領域とα1-antitrypsin 遺伝子の組合せによる
α1-antitrypsin分泌マウス〔アーキバルド他、Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A., 87 巻、5178頁〜5182頁（199
0年）〕、ウシαs1-カゼインの制御領域とウロキナーゼ
遺伝子の組合せによるウロキナーゼ分泌マウス〔ミード
他、BIO/TECHNOLOGY, ８巻、443 頁〜446 頁（1990
年）〕、マウスＷＡＰの制御領域とｈＧＨ遺伝子の組合
せによるｈＧＨ分泌マウス〔レディー他、J. Reprod. F
ert., Suppl., 43巻、297 頁（1991年）〕などマウスを
使用した例が一般的である。

【０００７】またヒツジβ−ラクトグロブリン制御領域
とFactorIX遺伝子の組合せによるFactorIX分泌ヒツジ
〔クラーク他、BIO/TECHNOLOGY, ７巻、487 頁〜492 頁
（1989年）〕、ウサギβ−カゼインの制御領域とインタ
ーロイキン2 遺伝子の組合せによるインターロイキン2
分泌ウサギ〔ビューラー他、BIO/TECHNOLOGY, ８巻、14
0 頁〜143 頁（1990年）〕など中型動物での分泌生産に
も成功している。

【０００８】乳中への分泌生産には目的とする蛋白質の
遺伝子上流域に結合させる乳蛋白質の制御領域の構造が
重要であることが確認されていることは上述した通りで
ある。乳中へ分泌させるための遺伝子構造と、この遺伝
子により形質転換されたトランスジェニックアニマルに
ついては、特開昭63−291号公報にはマウスＷＡＰ遺伝
子を使用した例が、特開昭63−309192号公報にはラット
カゼイン遺伝子を使用した例が、また特開昭64−500162
号公報にはヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子を使用し
た例が、さらに特開平２−261386号公報及び特開平２−
500798号公報にはウシαs1カゼインの遺伝子を使用した
例がそれぞれ開示されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明はｈＧＨを乳中
に分泌する新規なトランスジェニックアニマルを提供す
ることを課題とする。本発明により得られるトランスジ
ェニックアニマルは、分泌制御遺伝子の下流域にｈＧＨ
遺伝子を組み込んだ遺伝子により形質転換されたもの
で、染色体中にこの遺伝子を組み込んだ全く新規な哺乳
動物である。注入遺伝子はウシβ−カゼイン制御領域の
下流にｈＧＨ遺伝子を有する構造、或いは、ウシα−ラ
クトアルブミン制御領域の下流にｈＧＨ遺伝子を有する
構造を持つ。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明を実施するにあた
っては、ウシβ−カゼイン制御領域の下流にｈＧＨ遺伝
子を有する遺伝子、もしくはウシα−ラクトアルブミン
制御領域の下流にｈＧＨ遺伝子を次の方法で調製する。

【００１１】ウシβ−カゼイン制御領域の下流にｈＧ
Ｈ遺伝子を有する遺伝子の調製 ウシβ−カゼイン制御領域はウシ染色体ＤＮＡより調製
する。ウシ染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により目
的とするβ−カゼインの制御領域を含む断片を合成す
る。ＰＣＲ法の合成プライマーとしては目的とするウシ
β−カゼイン遺伝子の制御領域を挟む位置の２種のプラ
イマーを調製するが、本発明においては、ウシβ−カゼ
イン染色体遺伝子の配列〔ボンシング他、Aust. J. Bio
l. Sci.,第41巻、527 頁〜537 頁（1988年）〕から5'上
流域−1723→−1699の塩基に対応し、制限酵素BamHI 認
識部位を付加したプライマーBBC01H(配列表配列番号1
）と第一エクソン37→17の塩基に対応し、制限酵素Hin
dIII 認識部位を付加したプライマーBBC12B( 配列表配
列番号2 ) を用いることにより調製される。目的とする
制御領域を挟むような形のプライマーであれば、染色体
遺伝子のＤＮＡ配列中の他の部分であっても使用可能で
ある。

【００１２】ＰＣＲ法により調製したＤＮＡは、BamHI
とHindIII により処理後、ゲル電気泳動法により精製
し、目的とする断片を回収する。以上の処理によりウシ
β−カゼイン染色体遺伝子の5'上流域および第一エクソ
ンを含む 1.8kbの断片を得る。

【００１３】このウシβ−カゼイン染色体遺伝子の5'上
流域および第一エクソンを含む断片の下流にｈＧＨ遺伝
子を結合させたプラスミドを構築する。ｈＧＨ遺伝子と
しては染色体ＤＮＡであってもｃＤＮＡであっても良
い。ｈＧＨ遺伝子は染色体遺伝子としては、プラスミド
pOGH（ニコラスインスティチュートダイアグノスティッ
ク社製）をBamHI とHindIII で処理を行い、アガロース
ゲル電気泳動で分離して目的とする断片を得ることがで
きる。またｈＧＨのｃＤＮＡは特開昭56−21956号公報
に開示されており、ｃＤＮＡにリンカーを結合させて染
色体ＤＮＡのBamHI とHindIII 処理と同様に使用でき
る。

【００１４】ｈＧＨ遺伝子とウシβ−カゼイン染色体遺
伝子の5'上流域および第一エクソンを含む 1.8kbの断片
をライゲーションにより結合させ、プラスミドを得る。
このプラスミドにより大腸菌を形質転換し、次いでこの
形質転換株を培養しプラスミドＤＮＡを回収し、目的と
するウシβ−カゼイン制御領域の下流にｈＧＨ遺伝子を
有する遺伝子を得る。このようにして得たプラスミドと
してプラスミドpBBCGH1 が例示できる。このプラスミド
はウシβ−カゼイン染色体遺伝子の5'上流域約1.7kbか
ら第一エクソンまでを含み、その直後5'非翻訳領域を介
してｈＧＨ染色体遺伝子の全領域を含む。またこのプラ
スミドは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第12432 号として寄託されている。

【００１５】ウシα−ラクトアルブミン制御領域の下
流にｈＧＨ遺伝子を有する遺伝子の調製 ウシα−ラクトアルブミン制御領域はと同様に、ウシ
染色体ＤＮＡより調製する。ウシ染色体ＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲ法により目的とするα−ラクトアルブミンの
制御領域を含む断片を合成する。ＰＣＲ法の合成プライ
マーとしては目的とするウシα−ラクトアルブミン遺伝
子の制御領域を挟む位置の２種のプライマーを調製する
が、本発明においては、ウシα−ラクトアルブミン染色
体遺伝子の配列〔ヴィロッテ他、Biochimie., 69巻、60
9 頁〜620 頁（1987年）〕から5'上流域1 →21の塩基に
対応したプライマーBLA21X( 配列表配列番号3 ）と第一
エクソン765 →746 の塩基に対応したプライマーBLA31B
( 配列表配列番号4 ）を用いることにより調製される。
目的とする制御領域を挟むような形のプライマーであれ
ば、染色体遺伝子のＤＮＡ配列中の他の部分であっても
使用可能である。

【００１６】ＰＣＲ法により調製したＤＮＡは、BamHI
とHindIII により処理後、ゲル電気泳動により精製し、
目的とする断片を回収する。以上の処理によりウシα−
ラクトアルブミン染色体遺伝子の5'上流域および第一エ
クソンを含む 0.8kbの断片を得る。このウシα−ラクト
アルブミン染色体遺伝子の5'上流域および第一エクソン
を含む断片の下流にと同様にｈＧＨ遺伝子を結合させ
たプラスミドを構築する。

【００１７】ｈＧＨ遺伝子とウシα−ラクトアルブミン
染色体遺伝子の5'上流域および第一エクソンを含む 0.8
kbの断片をライゲーションにより結合させ、プラスミド
を得る。このプラスミドにより大腸菌を形質転換し、次
いでこの形質転換株を培養しプラスミドＤＮＡを回収
し、目的とするウシα−ラクトアルブミン制御領域の下
流にｈＧＨ遺伝子を有する遺伝子を得る。このようにし
て得たプラスミドとしてプラスミドpBLAGH1 が例示でき
る。このプラスミドはウシα−ラクトアルブミン染色体
遺伝子の5'上流域約 0.8kbから第一エクソン開始直前ま
でを含み、その直後5'非翻訳領域を介してｈＧＨ染色体
遺伝子の全領域を含む。またこのプラスミドは工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第12431 号として
寄託されている。

【００１８】このようにして得られたプラスミド遺伝子
は制限酵素処理により直鎖状とした後、哺乳動物の受精
卵に注入する。プラスミドpBBCGH1、プラスミドpBLAGH1
を使用する場合は制限酵素としてHindIII とEcoRI の
両方を使用すると本発明の目的にあった遺伝子が得られ
るが、これ以外の制限酵素であってもよい。トランスジ
ェニックアニマルの作成は、一般的に行われている方
法、動物であればどのような手段、動物であってもよ
い。

【００１９】トランスジェニックアニマルは、出生離乳
後、その体組織の一部、例えば尾の一部を切り取り、Ｄ
ＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲ法により注入Ｄ
ＮＡに由来する断片が増幅することを確認して、目的遺
伝子をもった個体を選別する。ＰＣＲ法のプライマーと
しては、導入遺伝子の一部分であれば使用可能である
が、本発明においては、ｈＧＨ由来の配列を使用するこ
とが好ましい。ｈＧＨ染色体遺伝子の配列〔デノート
他、Nucleic Acids Res.９巻、3719頁〜3730頁（1981
年）〕から第四エキソンの一部1038→1062の塩基に対応
したプライマーHGH004( 配列表配列番号5 ）と第五エク
ソンの一部1260→1236の塩基に対応したプライマーHGH1
04( 配列表配列番号6 ）を用いることにより調製され
る。これ以外のｈＧＨ染色体遺伝子のＤＮＡ配列であっ
ても使用可能である。

【００２０】目的とする遺伝子を保有している個体は、
交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、新
規遺伝子保有動物として飼育継代を行う。目的遺伝子を
保有する雌は、成熟期に達したのち、同系の雄動物と交
配し、妊娠、出産をさせ、分娩後９〜11日目から乳汁を
採取する。採取した乳汁は遠心分離等により脱脂し、イ
ムノアッセイ法によりその含量を定量できる。

【００２１】以下に実施例を示し、本発明を説明する。

【００２２】

【実施例１】ウシβカゼイン染色体遺伝子制御領域の調製（図１参
照） ウシ乳房（和光純薬）200mg よりホーガン等のＤＮＡ調
製法〔"Manipulatingthe Mouse Embryo: A Laboratory
Manual", 174 頁〜176 頁、Cold Spring Harbor Labora
tory 刊 (1986年) 〕に従ってＤＮＡを抽出し、約 300
μg のウシ染色体ＤＮＡを得た。このＤＮＡ 1μg を鋳
型とし、ＰＣＲ法にてウシβ−カゼイン染色体遺伝子の
制御領域を調製した。緩衝液およびdNTP溶液（dATP, dC
TP, TTP,dGTP)はサイキ等〔Science, 239巻、487 頁〜4
91 頁 (1988年) 〕によって述べられた方法に従った。
使用したプライマーを以下に示す。

【００２３】BBCO1H 5'-ctcaagcttTCGAATCCATCTCTATCAATTA-3' BBC12B 5'-ctcggatccCCAAAGTAGAGGACAAGAAGT-3' これらのプライマーは、アプライドバイオシステムズ社
製 380Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。

【００２４】BBC01Hの大文字で示した配列はウシβ−カ
ゼイン染色体遺伝子〔ボンシング等、Aust. J. Biol. S
ci.,41巻、527 頁〜537 頁（1988年) 〕の5'上流域（塩
基番号−1723→−1699）に対応し、BBC12Bでは第１エク
ソン（塩基番号37→17）に対応する。また小文字で示し
た配列は、調製したＤＮＡの両端に制限酵素認識部位を
付加するためのもので、BBC01H側ではHindIII 、BBC12B
側ではBamHI の認識部位が付加される。

【００２５】調製したＰＣＲ反応液 100μl を95℃で５
分間加熱し、４℃まで冷却した後、2.5単位ＴａｑＤＮ
Ａポリメレース（パーキンエルマー・シータス社製）を
加え、 100μl のミネラルオイル（シグマ社製）を重層
した。95℃１分間の変性反応、55℃２分間のアニーリン
グ反応、72℃３分間のプライマー伸長反応を１サイクル
として、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー
・シータス社製）にて30サイクルの反応を行い、最後の
サイクルの後、72℃で７分間伸長反応を行った。

【００２６】反応終了液からクロロホルム抽出でミネラ
ルオイルを除去した後、60％（v/v)のポリエチレングリ
コール溶液（20％ PEG6000／2.5M NaCl)を加え、氷中に
て１時間冷却した。15000xg にて10分間遠心することで
増幅したＤＮＡ断片を沈澱として回収し、70％の冷エタ
ノールで２回洗浄した。

【００２７】この反応産物約30μg を、20mM Tris-HCl
(pH8.5)、10mM MgCl₂ 、１mM Dithiothreitol 、100mM
KCl よりなる溶液 100μl にBamHI とHindIII(いずれ
も宝酒造社製)100単位を加え、37℃で一晩消化反応を行
った。反応終了液を１％アガロースゲル電気泳動にか
け、 1.8kbのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEA
N（BIO101社製）にて回収した。こうして約 1μg のウ
シβ−カゼイン染色体遺伝子の5'上流域及び第１エクソ
ンを含む 1.8kbの断片を得た。

【００２８】

【実施例２】ウシβカゼイン染色体遺伝子の制御領域の下流にｈＧＨ
染色体遺伝子を有するプラスミドpBBCGH1 の構築（図２
参照 ） ヒト成長ホルモン染色体遺伝子を含むプラスミドp0GH
（ニコラスインスティテュートダイアグノスティック
社）20μg を実施例１と同様の方法により、BamHIとHin
dIII で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後
ゲルから目的ＤＮＡを抽出することで、約10μg の 4.8
kb断片を得た。

【００２９】この断片100ng と実施例１で得たウシβ−
カゼイン染色体遺伝子の制御領域断片40ngをタカラライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合した。こ
の反応液を用い大腸菌ＪＭ１０９ (ニッポンジーン社
製）を形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素解析
を行いプラスミドpBBCGH1 (6.6kb) を得た。このプラス
ミドはウシβ−カゼイン染色体遺伝子の5'上流域約1.7k
b から第１エクソンまでを含み、その直後に5'非翻訳領
域（63bp）を介してｈＧＨ染色体遺伝子の全領域を含
む。

【００３０】

【実施例３】pBBCGH1 断片（β−ＣＮ／ｈＧＨ）を有するトランスジ
ェニックラットの作製 トランスジェニックラットの作製法についてはホチ等の
方法〔Animal Biotech.,１巻、175 頁〜184 頁（1990
年) 〕に従った。注入にはプラスミドpBBCGH1 をEcoRI
とHindIII で部分的に切断した後、ウシβ−カゼイン染
色体遺伝子部分からｈＧＨ染色体遺伝子の3'下流領域を
含む約3.9kb(β−ＣＮ／ｈＧＨ）を用いた（図２参
照）。このＤＮＡは、0.1mM ＥＤＴＡを含むpH7.6 の10
mM Tris-HCl 緩衝液中に５μg/mlになるように調製し、
ラット受精卵の雄性前核内に約２pl注入した。ＤＮＡを
注入した受精卵はパラフィンオイルで覆われたＴＣ媒液
で12〜15時間培養し、生き残った生存受精卵を偽妊娠雌
への移植に供した。偽妊娠雌には、精管結紮雄と交配さ
せた生後８週齢以上経過したウィスター系の成熟雌を用
い、プラグを確認した日に移植を行った。移植はペント
バルビタール麻酔下で受精卵を卵管釆からガラスマイク
ロピペットを用いて卵管内に導入することにより行っ
た。約３週間後、受精卵より発生した産子を得た。

【００３１】生まれたラットは離乳後、その尾の一部を
切り取って抽出したＤＮＡを用い、ＰＣＲ法によって注
入ＤＮＡに由来する断片が増幅するか否かを調べること
で、注入したＤＮＡを有するトランスジェニックラット
を選別した。ＤＮＡの抽出は前記のホーガン等の方法
に、ＰＣＲ法はサイキ等の方法に従った。ＰＣＲで使用
したプライマーを以下に示す。

【００３２】HGH004 5'-TCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTC-3' HGH104 5'-AAGACACTCCTGAGGAACTGCACGG-3' HGH004の配列はｈＧＨ染色体遺伝子〔デノート等、Nucl
eicAcids Res., ９巻、3719頁〜3730頁 (1981年) 〕の
第４エキソンの一部（塩基番号1038→1062) 、HGH104は
第５エキソンの一部（1260→1236）の塩基配列に対応す
る。

【００３３】この実施例におけるＤＮＡ注入卵数、生存
卵数、移植卵数、産子数、トランスジェニック（Ｔｇ）
ラット数を表１に示した。

【表１】 β−ＣＮ／ｈＧＨ(3.9kb) 遺伝子を有するＴｇラットの作製 ──────────────────────────────────── 実施例数 注入卵数 生存卵数 移植卵数 産子数 分析数 Ｔｇラット数 ──────────────────────────────────── 6 892 292 246 62 60 15 ────────────────────────────────────

【００３４】また、得られた初代Ｔｇラットで生存して
いる14匹を正常なウィスター系ラットと交配させたとこ
ろ、13匹から子孫が得られた。そのうち10系統では子孫
にも導入遺伝子が認められ、導入した遺伝子（β−ＣＮ
／ｈＧＨ）が、トランスジェニックラット中において、
安定に維持され子孫に伝達されることが示された（表２
参照）。

【００３５】

【表２】 β−ＣＮ／ｈＧＨ Ｔｇラットのトランスジーンの子孫への伝達 ────────────────────────────── 初代Ｔｇラット 性別 産子数 Ｔｇラット数（伝達率％） ────────────────────────────── #11-2 ♂ 23 7 (30.4) #12-2 ♂ 29 16 (55.2) #12-4 ♂ 27 16 (59.3) #12-5 ♀ 1 0 ( 0 ) #13-2 ♂ 31 5 (16.1) #13-3 ♀ 10 4 (40.0) #15-1 ♂ 0 ── #16-1 ♂ 19 10 (52.6) #16-4 ♀ 3 1 (33.3) #16-5 ♀ 7 0 ( 0 ) #18-5 ♀ 7 5 (71.4) #19-2 ♀ 11 2 (18.2) #19-3 ¹⁾ − #20-1 ♂ 20 8 (40.0) #20-12 ♀ 15 0 ( 0 ) ────────────────────────────── 1) 生後すぐに死亡したため性別不明

【００３６】子孫への伝達をＰＣＲ法で検定した一例を
図３に示す。レーンＭは分子量標準でφＸ１７４ファー
ジＤＮＡのHincII消化物を示す。レーン16がトランスジ
ェニックラット#12-4 、レーン1 から15は #12-4から得
られた産子のＤＮＡを鋳型とした反応産物を電気泳動し
た結果である。図中→の位置がHGH004とHGH104により増
幅された223bp のＤＮＡの泳動位置を示す。この例で
は、親と同様、223bp のバンドが認められるレーン1-3
、6 、9 、10、12-14 の産子が、導入したβ−ＣＮ／
ｈＧＨ遺伝子を有するラット、即ちトランスジェニック
ラットである。

【００３７】

【実施例４】β−ＣＮ／ｈＧＨ遺伝子を染色体上に有するトランスジ
ェニックラットによる乳汁中へのｈＧＨの生産 実施例３で得られたトランスジェニックラットのメス７
匹をウィスター系のオスと交配させ、分娩後９〜11日目
に乳汁を採取した。遠心分離（5000rpm.５分間、４℃）
により脱脂した後、乳汁中のｈＧＨの量をニコラスイン
スティテュートダイアグノスティック社 HUMAN GROWTH
HORMONE TRANSIENT GENE EXPRESSION ASSAY SYSTEMにて
免疫化学的に測定した。その結果、７匹中６匹において
0.1μg/ml以上のｈＧＨが検出され、トランスジェニッ
クラット個体でｈＧＨが乳汁中に分泌生産されているこ
とが確認された（表３参照）。また、＃12-5では、 109
00μg/mlと非常に高濃度のｈＧＨが生産されており、産
業的利用価値の極めて高い生産系であることが示され
た。

【００３８】

【表３】 β−ＣＮ／ｈＧＨ Ｔｇラット乳汁中のｈＧＨ ───────────────────────── Ｔｇラット 乳汁中のｈＧＨ（μg/ml） ───────────────────────── #12-5 10900.0 #13-3 1.73 #16-4 1.34 #16-5 0.11 #18-5 N.D. #19-2 368.0 #20-12 0.75 ───────────────────────── N.D. : 検出限界以下（＜0.01μg/ml）

【００３９】

【実施例５】次世代へのｈＧＨ生産能の伝達 実施例３で示したように、トランスジェニックラットの
オス７匹のうち６匹がトランスジーンを産子に伝達した
が、得られたＧ₁ ラットのうち、メスのトランスジェニ
ックラットをウィスター系のオスと交配させた。そのう
ち５匹から乳汁が得られ、脱脂した後、乳汁中のヒト成
長ホルモンの量を測定した。その結果、５匹中４匹にお
いて、0.67μg/ml以上のｈＧＨが検出され（表４参
照）、初代ラットがオスの場合でも、トランスジーンを
受け継いだ子孫から乳汁中にｈＧＨを分泌生産するトラ
ンスジェニックラット個体が得られることが示された。

【００４０】

【表４】 β−ＣＮ／ｈＧＨ Ｔｇラット（Ｇ₁ ）乳汁中のｈＧＨ ─────────────────────────── Ｔｇラット 乳汁中のｈＧＨ（μg/ml） ─────────────────────────── #11-2B-1 150.0 #12-2A-6 0.67 #12-4A-5 4.38 #13-2A-3 9.85 #20-1A-1 N.D. ─────────────────────────── N.D. : 検出限界以下（＜0.01μg/ml）

【００４１】

【実施例６】ウシα−ラクトアルブミン染色体遺伝子制御領域の調製
（図４参照 ） 実施例１と同様、ウシ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
法によりウシα−ラクトアルブミン染色体遺伝子の制御
領域を調製した。使用したプライマーを以下に示す。

【００４２】BLA21X 5'-ctctctagaAAGCTTATATATTTATGAACA-3' BLA31B 5'-ctcggatccTTTGGTGACCCCCCAAGATT-3'

【００４３】BLA21Xの大文字で示した配列はウシα−ラ
クトアルブミン染色体遺伝子〔ヴィロッテ等、Ｂiochim
ie, 69巻、609 頁〜620 頁 (1987年) 〕の5'上流域 (塩
基番号１→２１) に対応し、BLA31Bでは第１エクソン
（塩基番号 765→746)に対応する。また小文字で示した
配列によりBLA21X側にはXbal、BLA31B側にはBamH1 の認
識部位が付加される。

【００４４】ＰＣＲの反応産物約11μg をBamH1 とHind
III で消化し、電気泳動で分離した後、0.8kb の断片を
ゲルから切り出し回収した。こうして、約５μg のウシ
α−ラクトアルブミン染色体遺伝子の5'上流域および第
１エクソンの一部を含む 0.8kbの断片を得た。

【００４５】

【実施例７】ウシα−ラクトアルブミン染色体遺伝子の制御領域の下
流にｈＧＨ染色体遺伝子を有するプラスミドpBLAGH1 の
構築（図５参照 ） 実施例２で調整したｈＧＨ染色体遺伝子を含むプラスミ
ドp0GHのBamHｌ／HindIII 断片(4.8kb）200ng と実施例
５で得たウシα−ラクトアルブミン染色体遺伝子の制御
領域断片100ng をライゲーションで結合した。この反応
液を用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この株からプラスミドＤＮＡを回収し、
制限酵素解析を行い、プラスミドpBLAGH1 (5.6kb）を得
た。このプラスミドはウシα−ラクトアルブミン染色体
遺伝子の5'上流域約 0.8kbから第１エクソンの開始コド
ン直前までを含み、その直後に5'非翻訳領域（63bp) を
介してヒト成長ホルモン染色体遺伝子の全領域を含む。

【００４６】

【実施例８】プラスミドpBLAGH1 断片（α−ＬＡ／ｈＧＨ）を有する
トランスジェニックラットの作製 実施例６で得られたプラスミドpBLAGH1 をEcoR1 とHind
III で切断した後、ウシα−ラクトアルブミン染色体遺
伝子部分からｈＧＨ染色体遺伝子3'下流領域を含む約
2.9kb（α−ＬＡ／ｈＧＨ、図５参照）のＤＮＡ断片を
0.1mM ＥＤＴＡを含む pH7.6の10mM Tris-HCl 緩衝液
中に５μg/mlになるように調製した。このＤＮＡを用い
て、実施例３と同様の方法でトランスジェニックラット
を作製した。この実施例におけるＤＮＡ注入卵数、生存
卵数、移植卵数、産子数、トランスジェニック（Ｔｇ）
ラット数を表５に示した。

【００４７】

【表５】 α−ＬＡ／ｈＧＨ(2.9kb）遺伝子を有するＴｇラットの作製 ──────────────────────────────────── 実施例数 注入卵数 生存卵数 移植卵数 産子数 分析数 Ｔｇラット数 ──────────────────────────────────── 6 694 333 294 55 54 8 ────────────────────────────────────

【００４８】また、得られた初代Ｔｇラットの８匹を正
常なウィスター系ラットと交配させたところ、そのすべ
てから子孫が得られた。そのうち、５系統では子孫にも
導入遺伝子が認められ、導入した遺伝子（α−ＬＡ／ｈ
ＧＨ）が、トランスジェニックラット中において、安定
に維持され子孫に伝達されることが示された。（表６参
照）。

【００４９】

【表６】 α−ＬＡ／ｈＧＨ Ｔｇラットのトランスジーンの子孫への伝達 ────────────────────────────────── 初代Ｔｇラット 性 別 産子数 Ｔｇラット数（伝達率％） ────────────────────────────────── #21-2 ♀ 14 7 (50.0) #22-9 ♀ 9 6 (66.7) #23-1 ♂ 28 4 (14.3) #23-3 ♂ 26 10 (38.5) #25-1 ♂ 28 0 ( 0 ) #25-3 ♀ 13 0 ( 0 ) #26-4 ♀ 5 3 (60.0) #27-2 ♀ 3 0 ( 0 ) ──────────────────────────────────

【００５０】子孫への伝達をＰＣＲ法で検定した一例を
図６に示す。レーン10がトランスジェニックラット#22-
9 、レーン１から９は#22-9 から得られた産子のＤＮＡ
を鋳型とした反応産物を泳動した結果である。この例で
は、レーン1 、5-9 の６匹がトランスジェニックな子孫
である。

【００５１】

【実施例９】α−ＬＡ／ｈＧＨ遺伝子を染色体上に有するトランスジ
ェニックラットによる乳汁中へのｈＧＨの生産 実施例７で得られたトランスジェニックラットのメス５
匹をウィスター系のオスと交配させ、分娩後９〜11日目
に乳汁を採取し、実施例４で示した方法に従い、乳汁中
のｈＧＨの量を測定した。その結果、５匹中４匹におい
て１μg/ml以上のｈＧＨが検出され、トランスジェニッ
クラット個体でｈＧＨが乳汁中に分泌生産されているこ
とが確認された（表７参照）。また、#21-2では4710μg
/mlと非常に高濃度のｈＧＨが生産されており、産業的
利用価値の極めて高い生産系であることが示された。

【００５２】

【表７】 α−ＬＡ／ｈＧＨ Ｔｇラット乳汁中のｈＧＨ ───────────────────────── Ｔｇラット 乳汁中のｈＧＨ（μg/ml） ───────────────────────── #21-2 4710.0 #22-9 250.0 #25-3 N.D. #26-4 158.0 #27-2 1.03 ───────────────────────── N.D. : 検出限界以下（＜0.01μg/ml）

【００５３】

【発明の効果】本発明により、分泌制御遺伝子の下流域
にｈＧＨ遺伝子を組み込んだ遺伝子により形質転換さ
れ、染色体中にこの遺伝子を組み込んだ全く新規な哺乳
動物を得ることが可能となる。またこの哺乳動物は乳中
に大量のｈＧＨを分泌し、この哺乳動物を飼育し、搾乳
することにより、容易にｈＧＨを生産することができ
る。

【００５４】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 CTCAAGCTTT CGAATCCATC TCTATCAATT A 31

【００５５】配列番号：2 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 CTCGGATCCC CAAAGTAGA GACAAGAAGT 30

【００５６】配列番号：3 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 CTCTCTAGAA AGCTTATATA TTTATGAACA 30

【００５７】配列番号：4 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 CTCGGATCCT TTGGTGACCC CCCAAGATT 29

【００５８】配列番号：5 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 TCTCAGAGTC TATTCCGACA CCCTC 25

【００５９】配列番号：6 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 AAGACACTCC TGAGGAACTG CACGG 25

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ法によるウシβ−カゼイン染色体遺伝子
制御領域の調製方法を示す。

【図２】プラスミドpBBCGH1 の構築工程を示す。

【図３】導入したβ−ＣＮ／ｈＧＨ遺伝子の子孫への伝
達をＰＣＲ法で検定した結果の一例を示す。

【図４】ＰＣＲ法によるウシα−ラクトアルブミン染色
体遺伝子制御領域の調製方法を示す。

【図５】プラスミドpBLAGH1 の構築工程を示す。

【図６】導入したα−ＬＡ／ｈＧＨ遺伝子の子孫への伝
達をＰＣＲ法で検定した結果の一例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 相良 旬子 栃木県宇都宮市上戸祭町336−９ (72)発明者 結城 惇 埼玉県大宮市上小町1144−４ 信栄マンシ ヨン401

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳蛋白質の染色体遺伝子制御領域の下流
   にヒト成長ホルモン遺伝子を結合させたＤＮＡを導入し
   て形質転換させ、乳中にヒト成長ホルモンを分泌するよ
   うにしたトランスジェニックアニマル。
2. 【請求項２】 乳蛋白質がウシβ−カゼインまたは、ウ
   シα−ラクトアルブミンである請求項１記載のヒト成長
   ホルモンを乳中に分泌するトランスジェニックアニマ
   ル。
3. 【請求項３】 トランスジェニックアニマルがラットで
   ある請求項１または請求項２記載のヒト成長ホルモンを
   乳中に分泌するトランスジェニックアニマル。