CN1114357A

CN1114357A - 利用转基因动物生产重组多肽

Info

Publication number: CN1114357A
Application number: CN94107318A
Authority: CN
Inventors: 唐勇炜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 1996-01-03

Abstract

本发明涉及利用转基因动物生产重组多肽及产生具有预期特性的转基因非人类哺乳动物的方法，其包括：<1>分离得到动物胚胎；<2>把编码重组多肽的转移基因导入动物胚胎；<3>将上述胚胎移植入假孕母体内并检测其基因整合；<4>确定获得的雌性动物能在其乳汁中产生重组多肽。

Description

利用转基因动物生产重组多肽

本发明涉及利用转基因动物生产重组多肽及产生具有预期特性的转基因非人类哺乳动物的方法。

已经有大量关于异源基因在低等生物如单细胞细菌、酵母菌、丝状真菌以及诸如哺乳动物细胞等高等细胞中表达的文献。另外亦有许多转基因动物的报导，其中绝大多数是有关转基因鼠的报告。某些实验已获得转基因猪(Miller，K.F.，etal，(1989)，J.Endocrin，，120，481-488，Vize，P.D.，etal.(1988)，J.Cell Sci.，90，295-300，Ebert，k，etal，(1988)，Mol.Endocrin.，2，277-283)，转基因羊(Nancarrow，etal，(1987)Therigenology，27，263；Clark，A，J.，etal.(1989)Bio/Technology7，487-482；Simang，J.，Etal.(1988)，Bio/Technology6，179-183)，转基因兔(Hanorer，S.V.，etal，(1987)DeutcheTierarztliche Wochenschrift，94，476-478)，但是产生转基因母牛方面没有获得任何成功。到目前为止还没有见到用转基因母牛生产重组多肽的论文。

许多实验室报道了编码不同蛋白质的DNA在乳腺中的组织特异性表达和利用转基因鼠，羊的乳汁生产各种蛋白质。例如，Simmons，J.P.(1987，Nature，328，530-532)报导将编码β-乳球蛋白(BNG)的16.2KP基因片段(包括4Kb5’序列，4.9KbBLG转录单位和7.3Kb3’一旁侧序列显微注射至小数鼠受精卵内，并在乳腺中表达了羊β-乳球蛋白(BLG)，转基因小鼠乳汁中BLG的浓度约在3.0-23mg ml范围内。当将编码人因子IX或人a-1抗胰蛋白酶的cDNA插入基因的5’-非翻译区并显微注射至羊受精卵内(Sirmmons，J.P.，etal.(1988)Bio/Technology6，179-183)，人因子IX或a-1抗胰蛋白酶的产量显著降低(因子IX：25ng/ml，a-1抗胰蛋白酶：10mg /ml；参见Calrd，A.J.，etal.(1989)Bio/Technorloy，487-492)。

类似的报道还有将包括完整的7.6kp大鼠a-酪蛋白基因和3.5kb-5’，3.0kb-3’旁侧基因的14kb的基因组克隆显微注射至小鼠受精卵内(Lee，etal，(1988)Nucl，AcidsRes，1610271041)。将含有编码人-tpA的基因及其同源的分泌序列的cDNA在2.6kb5’-鼠乳清基因启动子的调控下表达时，人血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-pA)在小鼠乳汁中的表达产量在0.2-0.4μg/ml(Gordon，K.，et al.(1987)Bio/Technology5，1183-1187，进一步的实验研究表明不同的转基因乳汁中的tPA产量在20ng/ml至50μg/ml范围内(Pittius，C.W，et al，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85.5874-5878)。

通过对转基因技术的回顾，显然需要更有效地产生转基因哺乳动物(特别是非鼠类哺乳动物)的方法，特别是产生转基因牛的新种类的方法，该法所得的转基因牛应能在其乳汁中产生如人乳蛋白，人血清蛋白等重组多肽。

因此，本发明的一个目的是提供检测附植前的胚胎的基因整合的方法。

本发明的另一个目的是产生转基因牛的种类，其能够生产重组多肽(包括分泌型和非分泌型)。

本发明的另一个目的是产生能在乳汁中产生人乳蛋白、人血清蛋白等重组多肽的转基因牛的种群。

本发明的另一个目的的提供补充有来源于转基因牛奶中的重组多肽的食品配方，例如补充了人乳铁蛋白的婴儿食品配方。

本发明的更进一步的目的是提供能够控制在转基因牛奶中产生重组多肽的转移基因。

为实现上述目的，本发明包括可在转基因牛奶中生产重组多肽的转移基因。含有一种或多种重组多肽的转基因牛奶无需任何加工便可供人类消费。转移基因包括编码分泌信号序列的分泌DNA序列和编码重组多肽的重组DNA序列，这些DNA序列连接成分泌一重组DNA序列。如此构建的转移基因能够控制分泌-重组DNA在转移基因牛分泌细胞内的表达。

另外，本发明包括产生上述转移基因牛的种类的方法。该方法包括把上述转移基因导入牛胚胎，把导入基因后的牛胚胎移植入受体母牛内，至少确证一头能够在乳汁中产生重组多肽的母牛后代。

更进一步，本发明也包括产生具有预期表型的非人类转基因哺乳动物的方法。首先将编码所需表型的转移基因甲基化，然后将其导入哺乳动物受精卵内使之与受精卵基因组融合，将此受精卵培养成胚胎，从每个胚胎上至少取出一个细胞并分离基DNA，分离出的DNA用限制性内切酶消化，那些融合了转移基因的胚胎带有不能被限制性内切酶裂解的基因，消化产物经PCR扩增和标记探针杂交后通过电泳可方便地检测出成功的基因整合。

本发明也包括产生携带相同基因型的转基因动物种群的方法。本方法是上述检测早期基因整合方法的具体体现。在本方法中，甲基化的转移基因被导入受精卵并培养成胚胎，将每个胚胎分成两部分，一部分用上述方法进行转移基因整合分析，待确定已进行成功的基因整合后，将另一部分胚胎克隆形成转基因胚泡并移植入受体母牛体内，以产生具有相同基因型的转基因牛种群。

本发明所指的非人类哺乳动物包括所有能够产生合适的表型的转基因动物的哺乳动物，包括非人灵长类、鼠、牛、犬等种类。更为可取的哺乳动物是牛。

转基因哺乳动物的合适表型包括(决非局限于)用雌性转基因哺乳动物的乳汁产生重组多肽，还包括疾病模型的动物、抗病能力强的动物、以及在转基因动物血、尿等体液中产生重组多肽。本发明的更具体的体现是用转基因牛在其乳汁中产生重组人乳铁蛋白，人血清蛋白和人C-蛋白。

这里所说的重组多肽是指异源或同源多肽。异源多肽指那些不能由转基因动物正常产生的多肽如人乳蛋白(乳铁蛋白、溶菌酶、分泌型免疫球蛋白、人乳白蛋白)；人血清蛋白(白蛋白、免疫球蛋白、因子VII、因子IX、C-蛋白)；工业用酶(蛋白酶，几丁酶.脂酶)。重组DNA序列包括基因组基因和编码重组多肽的cDNA序列。

同源多肽是指转基因动物的内源性多肽，如牛乳蛋白(aS1，aS2，β-，k-酪蛋白，β-乳球蛋白、乳铁蛋白，溶菌酶，胆固醇水解酶)牛血清蛋白(血清白蛋白)牛蛋白类激素(生长激素等)。编码同源多肽的重组DNA转入动物后以随机整合的方式与其基因组融合。

无论同源或异源多肽都由特殊的氨基酸或核甘酸序列表现其特性。这样的序列包括自然产生的基因变异和重组方式产生的变异(通过替换、插入和/或删除一个或多个核苷酸从而导致重组多肽中一个或多个氨基酸残基的替换、插入、或删除)。

当转移基因的表达产物对产生合适的表型(如产生重组多肽)是必需的，转移基因应包括和重组子或分泌-重组DNA连接的5’-和合适的3’-端表达调控序列。这些表达调控序列除了控制转录外，还对RNA的稳定性起作用。

表达调控序列按照重组子或分泌-重组DNA在组织或细胞中的专一性表达来选择。一旦选择在某种组织或细胞内表达产物，5’-和随意的3’表达调控序列便被确定。一般地，5’-表达调控基因序列包括翻译起始序列上游的内源基因的转写部分(5’-非翻译区或5’-UTR)和启动子上游的旁侧序列。

当最终目的是分泌重组多肽时，编码分泌功能信号肽的分泌DNA序列应该与产生重组多肽的转移基因连接。

分泌DNA序列一般来自编码分泌蛋白的同种转基因动物基因组。

将待移基因片段导入胚胎的方法有显微注射法、胚胎干细胞法和逆转录病毒法。比较可取的方法是显微注射法。受精卵先用通用方法进行显微注射，体外培养为胚胎，(这样的胚胎包含16-150个细胞)。16-32细胞期胚胎，通常为桑椹胚，含有32以上个细胞的胚胎通称为胚泡。采用标准方法将胚胎移入受体母体内并使之发育到期，嵌合体的动物可以继续繁殖至形成真正的转基因动物种群。

由于基因整合的频率通常是比较低的，检测移植前胚胎中基因整合的方法应该有较高的灵敏性，一般是从胚胎中取部分细胞，分离其DNA，用限制性内切消化后用PCR方法扩增，电泳后分析检测结果。

含有重组多肽的转基因牛奶既可直接应用亦可进一步分离纯化。这部分依赖于乳汁中重组多肽的种类及其最终用途。当重组多肽是用来提高牛奶的营养价值时便没有必要进行纯化。例如含有人乳铁蛋白的转基因牛奶可防止婴儿肠道感染同时提高婴儿对铁的吸收。

转基因牛奶中的重组多肽亦可用于配方食品。例如含有从转基因牛奶中提取的人乳铁蛋白的婴儿食品有助于治疗新生儿的腹泻。同样，转基因牛奶中的人酪蛋白和人溶菌酶都具有营养价值。

当转基因牛奶中的重组多肽用作药物时，需要进行分离纯化工作。纯化方式的选择与具体的重组多肽有关，并可采用通常的纯化手段。如先进行酪蛋白的分步分离，然后将含有重组多肽的部分进行层析分离。所提到的层析法包括：亲合层析，离子交换层析，凝胶排阻层析和高压液相色谱(HPLC)。

本发明的一个具体体现是在转基因牛乳汁中产生人乳铁蛋白(HLF)。人乳铁蛋白是键合两个铁离子的单链糖蛋白，该蛋白能抑制不同细菌的生长。人乳铁蛋白是人乳中主要的金属离子结合蛋白质，可促进小肠中金属离子的吸收。体内试验表明：人乳对大肠杆菌的抑制主要归功于HLF。

转基因牛乳汁中的人乳铁蛋白提供了人乳铁蛋白的新来源。该乳汁可在巴氏灭菌后直接应用，也可进一步分离纯化。另外若将人乳铁蛋白或含有人乳铁蛋白的牛奶与溶菌酶协同使用则效果更好。可在已转入HLF基因的转基因牛的胚胎中再转入编码溶菌酶的基因序列，这样所得的转基因牛可产生不止一种重组多肽。

本发明的另一个体现是在转基因牛乳汁中产生人血清白蛋白(HSA)。人血清白蛋白是含有584个氨基酸残基的血清蛋白，它是人血清中含量最丰富的蛋白，发挥着非常重要的生理功能。血清白蛋白能够调节血液渗透压和运输脂肪组织中的脂肪酸。实施例1

牛卵母细胞在体外的发育、受精和培养

从牛卵巢内分离得到大量未受精卵，体外培养然后进行授精。将编码人乳铁蛋白的待转移基因导入到受精卵的原核内。显微注射后的受精卵在培养液中培养至桑椹期晚期或囊胚期，然后用非手术方式移入受体母牛体内，以使其继续发育。

(一)体外发育

从牛卵巢中分离出卵母细胞，冲洗后置于添加10％小牛血清的M199培养液内，39℃孵育24小时(Sirard et al.(1988)Bio.Reprod.39，546-552)。

(二)体外受精

成熟的卵母细胞可用新鲜或解冻的精子授精。使用的精子应预先进行“活力检查”。

(三)体外培养

常规的培养体系并不能促进8-16细胞期的牛胚胎的发育。若将牛胚胎与输卵管组织共同培养，可使之由8-16细胞期体外发育成囊胚。实施例2

HLF显微注射至牛受精卵前核

用限制性内切酶将含有HLF表达单元的DNA片段切下，琼脂糖电泳分离，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀。所得DNA片段溶于10mmol/l Tris，0.1mmol/l EDTA(PH7.2)中并透析至浓度为1-2μg/ml，并将此DNA溶液克满显微注射针。注射应在卵受精后18-24小时进行。

将受精牛卵母细胞置于Eppendorf管内，加入1mL Tyrdes-hepdes液，14500g离心8分钟后将卵移入栽玻片的Tyrodes-hepes液滴内(载玻片用矿物油覆盖)，置于倒置显微镜下，移动持卵管使其靠近一个卵，增加负压使吸住卵，聚焦以显示原核。必要时调节卵与持卵管的相对位置，可将卵吹离，略施压力使其轻微旋转至原核清晰可见时再吸住。将注射针通过透明带指向原核，此时持卵管、注射针与卵均聚焦清晰，继续前推注射针使其进入原核，推注射器活塞或踩压力泵将1-3plDNA(20-100拷贝)注入原核内。

实施例3

转基因牛乳汁中人血清白蛋白(HSA)的纯化

下面的步骤被用来纯化转基因牛乳中的HSA

1.调节乳汁pH值为4.5，加入凝乳酶使酪蛋白和其他脂肪沉淀，乳清中含有白蛋白；

2.用琼脂糖亲和层析除去杂蛋白，并将白蛋白用pH值为7.5的0.15mol/l氯化纳和20mmol/l水杨酸钠溶液洗脱，浓缩；

3.Sephadex G-25交换层析：在0.025mol/l乙酸钠溶液中脱盐，调pH至5.2，过滤；

4.阴离子交换层析(DEAE-Sepharose)；

在pH值为4.5条件下，洗脱；

5，阳离子交换层析(CM-Sepharose)

用p H为5.5的0.11mol/l的乙酸钠溶液洗脱，经超滤后白蛋白的浓度为6％(W/V)；

6.凝胶层析除去高分子量的蛋白质(如多聚白蛋白、致热原)，白蛋白单体经超滤浓缩得到成品。

Claims

1.一种产生转移基因动物的方法，所说的转基因动物能在其乳汁中产生重组多肽。

2.权利要求1所说的转移基因至少包括调控表达序列、分泌-重组DNA序列。

3.权利要求1所说的重组多肽包括：人分泌型免疫球蛋白、人乳铁蛋白、人乳球蛋白、a-人乳白蛋白、人血清白蛋白、人免疫球蛋白、人因子VII、人因子IX和人C-蛋白。

4.含有转基因牛乳汁中产生的重组多肽的配方食品。

5.一种检测转基因动物基因整合的方法。