CN101600358A - 从乳中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从乳中提取蛋白质的方法,具有至少一个疏水腔和在乳固有pH值下的负电荷,该方法包括以下步骤:a)乳的撇取和脱脂;b)在能使蛋白保留在基体上的pH条件下,将包含该蛋白质的所脱脂并撇取的馏分通过层析基体,其上嫁接有既具有疏水特性又具有离子特性的配体,该pH值高于4.6;c)蛋白质的洗脱;d)通过从馏分中去除乳蛋白质进行馏分的净化;以及e)回收该蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种或多种蛋白质,尤其是其三级结构形成疏水区并且存在于乳中的球状蛋白质的提取过程,该提取过程使用一种载体,该载体与同时具有疏水性和离子性的配体结合。
背景技术
市场上买得到的多数药物由通过合成而获得的化学物质组成。事实上,直到目前,现代医学已严重依赖于通过化学合成而生产的药物来进行治疗和疾病诊断。
然而,蛋白质表现了携带生物信息的分子的有效部分。尤其对于大量激素、生长因子、血液凝固因子、和甚至抗体来说,情况就是这样。
一般来说,蛋白质为由氨基酸组成的聚合物,通常具有高分子量、并且不能通过合理成本下的化学合成方式获得。治疗使用的蛋白质通常是从,例如活体、组织或者人类或动物的血液等中分离和纯化得到的。对于从猪胰腺中提取的胰岛素、例如因子VIII或因子IX等从血浆中提取的凝固因子、以及免疫球蛋白来说情况就是这样。
然而,尽管前述蛋白质的制备过程今天被广泛使用,但是它们具有缺点。从血小板中提取的某种蛋白质的低含量使满足日益增长的治疗需求的足够量的离析无法进行。而且,血浆中病毒、朊病毒、或其它病原体的存在使得对于血浆蛋白的制造过程来说包括附加的病毒中和和/或病毒消去步骤是必需的,以获得可以用于治疗目的的该产品。
为了弥补这些缺点,已经求助于基因工程,该技术也同样广泛用于将孤立基因转移至细胞的蛋白质合成,随后进行正被讨论的蛋白质的分泌过程。从其自有原始细胞系统外部获得的这种蛋白质为公知的“重组”蛋白质。
根据该技术,可以使用各种细胞系统。
例如E.coli等细菌系统被非常广泛地使用并且非常有效。它们使以低成本生产重组蛋白质成为可能。然而,该系统只限于用于不需要精细折叠过程的简单、非糖基化蛋白质的制备。
真菌系统也用于分泌蛋白质的制备。该真菌系统的缺点在于以下事实,即它们引起翻译后修饰,包括,例如多糖单元和硫酸基团的接枝,这极大影响了合成蛋白质的药物特性,尤其是通过加成各种甘露糖衍生物基团。
使用杆状病毒的系统使生产例如疫苗蛋白质或生长激素等多种蛋白质成为可能;然而,它们的工业应用并不乐观。
哺乳动物细胞也在例如单克隆抗体等复杂重组蛋白质的制备中生长。细胞表达系统导致适当地折叠和修饰重组蛋白质。关于产品成本的低收率是主要缺点。
作为对该细胞系统的替代,转基因植物被采用,以获得有效数量的蛋白质。然而,这些系统引起植物特异性翻译后修饰,尤其是通过将高免疫木糖残基加成到合成蛋白质上,因而限定了它们用于治疗目的的使用。
对以上所提及细胞系统的一个替代包括使用转基因动物,用于重组疫苗或复杂治疗蛋白质的生产。所合成蛋白质展示了非常类似于人类蛋白质的糖基化,并且被适当地折叠。这些复杂蛋白质不仅仅包括例如生长激素等单独的多肽链;相反,它们在氨基酸组合之后以各种方式修饰,尤其是通过特异性断裂、糖基化和羧甲基化。在绝大多数情况下,该修饰不能通过细菌细胞或酵母来执行。相反地,转基因动物使得在细菌细胞系统中所发现的表达水平和使用细胞培养所获得的翻译后修饰这两者的结合成为可能,其所有产品成本低于通过使用细胞表达系统而担负的成本。
在转基因动物的生物材料中,乳已成为已导致其被考虑作为重组蛋白质的非常良好的分泌源的研究主体。
从转基因动物的乳中所生产的重组蛋白可以轻易的通过将编码有期望得到的蛋白质的基因嫁接到乳中的蛋白质合成基因之一的调控区而获得,这将该蛋白质特定地导向乳腺,并随后在乳中分泌。
作为一个实例,可以参考欧洲专利申请号EP0527063,其描述了转基因哺乳动物的乳中的期望蛋白质的生产,其中编码期望蛋白质的基因表达由乳清蛋白启动子控制。
其它专利或专利申请描述了转基因哺乳动物的乳中的抗体的制备(EP0741515)、胶原(WO96/03051)、人类因子IX(US6046380)、以及因子VIII/血管性血友病因子络合物(EP0807170)。
尽管在蛋白质表达方面这些方法结果令人满意,但是使用乳作为重组蛋白源具有缺点。主要缺点在于一方面是难以具有令人满意收率地从乳中提取它们、另一方面是随后的纯化的困难。
事实上,乳是一种包括90%水以及可以划分入三类中的各种其它组分的混合物。第一类,被称作“抗乳血清”(或乳清),包括碳水化合物、可溶性蛋白质、无机物和水溶性维生素。第二类,被称作“脂相”(或乳脂),包含乳化形式的脂肪材料。第三类,被称作“蛋白质相”,包括大约80%酪蛋白,形成一组蛋白,其在钙存在的情况下,可以在pH值为4.6时或通过凝乳酶的作用而沉淀。各种酪蛋白可以与磷钙盐形成达到跟0.5μm类似直径的胶体胶束络合物,例如磷酸三钙聚合体(“族”),即Ca9(PO4)6。该胶束由酪蛋白亚基组成,该酪蛋白亚基由富含有k-酪蛋白的亲水层围绕疏水核组成,磷钙盐通过静电相互作用而与亲水层结合。这些磷钙盐也可以存在于胶束体内部,不与酪蛋白结合。该蛋白质相也包含可溶性蛋白质,例如乳清蛋白和乳球蛋白,以及来自血液的清蛋白和免疫球蛋白。
依赖于转基因动物乳中所分泌的重组蛋白质的种类,该蛋白质可以或者存在于抗乳血清中或者存在于蛋白质相中,或者甚至同时存在于它们两者中。乳组分中每一种类的富足和复杂使得进行蛋白质的提取更加困难,尤其是在酪蛋白胶束中的一种。另一个困难在于以下事实,即在两个相中任意一个中的该蛋白质的优势不能被确定性地预测。
重组蛋白质也可以展示乳中钙离子的亲和力,其以盐和/或各种可溶性复合物的形态、或以酪蛋白胶束钙磷酸盐的形态存在。这些亲和力通过蛋白质和二价钙阳离子之间的静电键来反映。蛋白质/钙离子亲和力使得定义亲和常数成为可能,其依赖于它们的值,并确定了键的强度。一般来说,大部分具有钙离子亲和力的蛋白质与胶束的钙磷酸盐结合。它们的提取需要执行复杂步骤,具有相应的执行和收率的问题。
乳业中所使用的传统解决方法是隔离蛋白质,其包括巴氏灭菌法,随后是酶凝聚或酸沉降(在pH值为4.6处),这在该情况下并不能应用,因为重组蛋白质通常由于温度和pH值的组合影响而变性。而且,蛋白质圈闭入酪蛋白胶束中导致低提取收率。其它解决方法,包括使用过滤、离心分离、和/或沉淀或沉降技术来执行分馏乳的物理方法,也导致不可接受的提取收率以及所提取重组蛋白质的纯度低。
文档EP0264166描述了在转基因动物的乳中的期望蛋白质的分泌。该文档没有提及用于从乳中纯化该蛋白质的任何步骤。
美国专利号4519945描述了通过从乳中制备酪蛋白和抗乳血清的沉淀来提取重组蛋白质的过程,其进行具有如上所述的酸化和加热步骤。该过程导致所讨论的蛋白质活性的显著损失以及低提取收率。
美国专利号6984772批露了从转基因哺乳动物乳中纯化重组纤维蛋白原的过程。该过程包括有使用连续离心操作从酪蛋白颗粒和蛋白质相中分离抗乳血清的步骤。抗乳血清被分离并且随后被存储用于该过程的其他步骤,其给出了纯化纤维蛋白原的解决方法。
然而,该过程不能以令人满意的收率应用于重组蛋白质的产品,蛋白质,例如因子VII、因子VIII和因子IX等血浆凝聚因子,被圈闭入酪蛋白胶束之中和/或之上。
专利申请WO2004/076695描述了从转基因动物乳中过滤重组蛋白质的过程。该过程包括初始化的乳澄清步骤,即包括去除乳组分,以获得能够通过其孔具有0.2μm直径的滤膜而被过滤的溶液。该步骤导致酪蛋白胶束的去除。其结果,依据收率,如果酪蛋白胶束能够包含一种被圈闭入它们结构内部的期望蛋白质,该步骤的执行可能是禁止的。
美国专利号6183803描述了例如乳清蛋白等天然存在于乳中的蛋白质、以及例如人血清蛋白或α1-抗胰蛋白酶等来自乳的重组蛋白质的分离。该过程包括初始化步骤,其包括放置螯合剂与包含期望蛋白质的乳接触。该步骤引起酪蛋白胶束的分裂,这依次导致包含酪蛋白的澄清乳清、抗乳血清蛋白质、以及期望蛋白质的形成。该过程随后包括一包含有通过不可溶的二价阳离子盐附加到液体载体(即澄清乳清)的酪蛋白胶束的结构再形成的步骤。这些胶束沉淀物,导致包括期望蛋白质的液相的形成,因为盐充满了酪蛋白的静电结合部位,该期望的蛋白质不被圈闭入胶束中。因而,根据该过程,期望蛋白质的分离最终通过胶束的结构再形成及其沉淀来实现。
该过程复杂并且难以执行,并且不能应用于具有对钙离子相对高亲和力的蛋白质。凝聚蛋白质,尤其包括那些公知的在维生素K的作用下合成的,属于该类别。
从两个观察开始——即转基因动物乳中分泌的和存在于抗乳血清中的特定种类的重组蛋白质的分离和纯化的过程导致非常低的收率,以及酪蛋白胶束中所收集的其它种类蛋白质的过程复杂并难以执行——本申请将其目标定位于提供从乳中提取不管是天然的还是其它形式的为乳的组分的蛋白质的过程,例如重组因子VII、因子VIII、以及因子IX,它们尤其表现出对于乳中的钙离子具有亲和力,该过程可以以简单的方式执行,具有令人满意的产品收率,并且保留了蛋白质的生物活性。
发明内容
基于应对该技术问题的目的,本申请提供了对于存在于乳中的蛋白质的提取的过程,该蛋白质具有至少一个疏水区以及在乳的固有pH值下带负电荷,包括以下步骤,包括:
a)撇取并脱脂所述乳,
b)将包含所述蛋白的经过脱脂并撇清后的馏分转移到层析载体上,在该层析载体上,在允许该蛋白质在该载体上被捕获的pH值下,在其上接枝有同时为疏水的和离子的配体,所述pH值高于4.6,
c)洗脱蛋白质,
d)通过从该所洗脱馏分中去除乳蛋白质而纯化所洗脱的馏分,以及
e)回收所述蛋白质。
本发明的过程的优点在于它非常容易实施,因为,一方面,它仅包含很少的步骤,并且另一方面,它不必要需要先于第一步骤实施之前实施乳澄清步骤,该第一步骤用于在其上嫁接有配体的载体上获得期望的蛋白质。
根据本发明的过程可以应用于新鲜乳或冰冻乳。乳可以来自于包含期望蛋白质的任意雌性哺乳动物,例如奶牛、母羊、山羊、兔子、小鼠、老鼠或母猪,所列出的是非限定性的。
依赖于所讨论的哺乳动物乳的天然流动性,有利于先于撇取和脱脂步骤之前使乳流动。作为一个实例,可以参考兔子乳,其相当稠密,有利地流动以更容易执行本发明。然而,即使在相当稠密的乳的情况下,流动步骤也只不过是可选的。该流动步骤可以通过将水性溶剂加入到生乳中而执行。例如,水性溶剂可以是浓度低于100mM的磷酸盐溶液,其pH值在7.5和8.5之间,优选地在8.0和8.3之间,例如浓度为30mM磷酸钠溶液,pH值为8.0,该列出的不是限定性的。例如水性溶剂也可以包含氯化钠,其最大浓度大约为40mM。该溶液维持乳的稳定胶束结构(悬浮酪蛋白胶束)。
出于本申请的目的,术语“撇取”应当理解为指的是乳的脂肪性物质的分离,以获得两个馏分,即撇取乳和乳脂。撇取是一种所属领域技术人员公知并且可以执行的技术,例如使用撇乳器或依靠诸如三氯乙酸的有机溶剂,这并不是限定性的。在一个特定实施例中,乳的撇取通过具有正zeta电位的玻璃纤维载体的过滤来执行。作为该过滤器的一个实例,可以参考GF Plus过滤器以及HP serie Supradisk过滤器或AKS活性炭系列(Pall Life Science)、GF过滤器(whatman)、VR Zetaplus过滤器或Delipid过滤器(Cuno 3M)。具有1μm阈值的GF Plus过滤器(Pall)和深度过滤器VR02或VR04(Pall)优选使用。
该过滤步骤也使得对该馏分进行脱脂成为可能,即,去除例如脂肪酸、甘油酯和固醇等脂质。该脱脂可以在将被稀释过的乳静置30分钟之后用GF Plus过滤器通过乳的正面过滤而完成(以使得脂肪性物质悬浮到表面,从而促进乳脂从乳中的分离)。
该撇取和脱脂步骤是必要的,因为嫁接到载体上的配体吸附脂质,该配体同时为疏水的和离子的。因此,该脂质必须先于步骤b)之前被去除,因为要不然,期望的蛋白质不能由配体保留,或者可能仅被很少地保留。该情况的结果将是期望蛋白质提取的过程收率的减少。
本发明优势方面之一在于以下事实,即经过步骤a)后产生的馏分已简单地被撇取并脱脂,可直接适于步骤b)的执行,步骤b)非常优势地是一个经由亲和层析纯化的步骤。因而,不严格必需进行中间步骤用以使所撇取和脱脂馏分适合于步骤b)中亲和层析的纯化。
步骤b)应当不会在低于酪蛋白等电点(pI)的pH值下执行,即在4.6和5之间。事实上,如果步骤b)在低于酪蛋白pI的pH值下执行,后者将沉淀,从而引起对层析载体的显著损坏的风险。特别地,当层析步骤使用柱执行,酪蛋白的沉淀可能阻塞该柱,从而损坏该柱及其内含物,即层析凝胶。而且,在低于4.6的pH值下,也可能导致其它蛋白质沉淀,例如诸如转铁蛋白或白蛋白,其能够引起收率降低。最后,某些蛋白质在酸性pH值下变性,例如因子VII、因子VIII、因子IX、纤维蛋白原以及补充因子H,该列出的并不是限定性的。
步骤b)有利地在5和8.5之间的pH值下执行。在步骤a)中所生产的所撇取和变性的乳因而在5和8.5之间的pH值下应用于步骤b)中的层析载体。该pH值有利地在5.5和8之间,或者在6和7.5之间。该pH值优选地在6.5和6.8之间。该pH值更优选地是乳的天然pH值。
在该pH值下(即,在5和8.5之间的pH值下),具有天然相互作用点的蛋白质,例如诸如抗原/抗体、酶/酶解物、或酶/抑制剂的亲和力或伪亲和力的蛋白质,该列出并不是限定性的,在关于彼此的相对位置上天然地具有它们的电荷和疏水区域,并且不会在pH值5和pH值8.5之间大幅变动。因此,在该pH值下,这些蛋白质是负电荷。有利地,在该pH值下,配体和蛋白质之间的相互作用实质上是疏水反应。
有利的,本发明的过程中使用的的层析技术允许包含有期望蛋白质的所脱脂和撇取的馏分在载体上被捕获,载体之上嫁接有同时是疏水的和离子的配体。出人意料地,该配体使得束缚由于其结构而具有疏水片的期望蛋白质成为可能,同时不束缚包括酪蛋白胶束在内的杂质。蛋白质的内部疏水区域可以束缚到该种配体,并将允许与所期望的蛋白质产生相互作用,从而确保与所期望的蛋白质的高亲和力并增加对即将要纯化的蛋白质的选择性。
未被束缚的蛋白质本质上包括大部分酪蛋白、乳清酸蛋白(WAP)、转铁蛋白、乳球蛋白、乳白蛋白和血清蛋白。
而且,该过程适于提取具有指定特性的任意蛋白:即在乳的天然pH值下,即在从大约6.5到6.8的范围内,蛋白质具有疏水区域并且携带负电荷;或者,最至少,电荷的综合平衡非常有利地偏向负电荷。
在本发明的范围内,pH条件允许蛋白质被保留、或通常来说被束缚到层析载体的配体上,或者通过疏水相互作用、或者通过静电相互作用以及疏水相互作用。该状况很大程度上依赖于将被纯化的蛋白质的等电点,并且因此在该pH值下完成过程。可能使用的层析载体是具有(阴离子交换体型的)正电荷配体的载体,并且pH值可适合于使得蛋白质携带总的负电荷。相反地,负电荷的配体可以使用,当过程在有利地用于执行本发明即在5和8.5之间的pH值下执行时。该配体的末端官能团例如可以是磺酰基或羧基官能团,并且pH值可以设置到大于6的值,使得蛋白质具有总的正电荷。该实施例是可以应用的,当将被纯化蛋白质的等电点是在碱性pH值下、尤其是在大于6的pH值下,蛋白质具有正电荷。也应该注意确保pH值与该过程的执行兼容,以便不显著损坏将被提取的蛋白质或乳。
在另一个实施例中,执行步骤b)所处的pH值在5和8.5之间,并且pH值以这样的方式选择:使蛋白质和配体之间的相互作用本质上是疏水的。
步骤c)(洗脱)的执行可以使用所属领域技术人员公知的任意洗脱剂来执行,其允许蛋白质停止被保留,例如由于离子排斥效应以及离液效应。洗脱优选地包括离子排斥效应。蛋白质的结构形态和蛋白质的电荷可以通过调整洗脱缓冲剂的pH值、或者通过选择适当的洗脱缓冲剂来修改。
在执行步骤b)之前,层析载体优选地用具有低于100mM浓度的基于磷酸盐的溶液(负载缓冲剂)来平衡,其pH值包括在7.5和8.5之间,优选地在8.0和8.3之间,例如从20到30mM、pH值为8.0的磷酸钠溶液。该溶液也可以包含氯化钠,其最大浓度大约为100mM,并且优选地处于20-60mM范围内。该溶液也可以基于柠檬酸盐,尤其是三钠柠檬酸盐0.20-0.30M,优选地为0.25M,pH值为7.5-8.5,其电导率在30和40mS/cm之间,尤其是35mS/cm。
更进一步,在步骤b)之后可以立即用缓冲剂执行的洗涤步骤,优选的,缓冲剂和负载缓冲剂相同。该洗涤步骤的有效性通过定义波长处的光学密度测定(OD)来检查,该定义波长例如为280nm,其应当返回空值或者返回基线值。在这种情况下,可以收集因此而获得的馏分。洗脱步骤c)的执行可以以所属领域技术人员公知的允许蛋白质不再被保留的任意洗脱剂来执行,作为一个实例是通过离子排斥效应或者也通过离液效应。优选地,通过离子排斥效应来执行洗脱。蛋白质结构形态和负荷可以利用洗脱缓冲剂的pH值、或者也利用选择洗脱缓冲剂来修改。
作为一个实例,假定层析载体具有正电荷(阴离子交换体型)的配体,可以参考尿素和氨基乙酸的混合物,尿素浓度在1.2和8M之间,氨基乙酸浓度在25mM和50mM之间,该浓度是在混合物中的最终浓度。应当指出具有蛋白质氨基与尿素反应可能产生其一些变性,并且在外因性化合物(这里是氨基乙酸)的氨基存在情况下,尿素随后将产生更少的蛋白质以及目标蛋白质的变性。
洗脱剂的其它实例包括包括pH值在4和6之间的酸性水溶液,含水混合物包括多种组分,优选地为从包括以下的组中选择出的两种或三种,该组包括磷酸钠和乙二醇,磷酸钠浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;柠檬酸钠和乙二醇,柠檬酸钠的浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;磷酸钠和乙二醇,磷酸钠浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;TRIS/NaCl及钙盐、和乙二醇,前者的浓度在1mM和10mM之间,优选地为5mM;辛酸钠和乙二醇,辛酸钠的浓度在10mM和100mM之间,优选地为30mM;含水混合物,由于化合物的存在其导电率低于3Ms/cm,例如30mM的磷酸钠溶液,也可以使用。上述浓度是混合物的最终浓度。对于包含乙二醇的上述二元混合物,乙二醇的体积比尤其在20和70%之间。
对于所有这些包含乙二醇的缓冲剂,可以用毒性更小的丙二醇替代,或者用任意其它溶剂替代。尿素有利地可以用作氨基酸存在时的洗脱剂,(其最终浓度对于尿素来说在从1.2到8M之间变动、对于氨基乙酸或任意其它氨基酸来说从25到50mM),该溶液由于其离液力而使得抑制配体和所吸收蛋白质之间的相互作用成为可能。
含水混合物的pH值非常优选地在7和8.5之间,过于酸性的pH值可能导致所考虑的蛋白质变性,并且可能因而导致不溶解的蛋白质。
这些含水混合物也可以包含从0.5%到1.5%,并且尤其是1%的非离子洗涤剂,优选地如X100。申请人已经注意到在一些实施过程中,具有在7和8.5之间的pH值的该洗涤剂的存在可以改进所洗脱蛋白质的回收率。
也可能使用水并且优选的是WFI(注射用水)。
在一个特定实施例中,当用于执行步骤b)的pH值在5和8.5之间时,洗脱可以通过降低pH值到低于配体pKa之下的值而执行,如果后者低于蛋白质的等电点,否则通过降低pH值到低于蛋白质等电点之下的值而执行,如果后者低于配体的pKa。
在包含有期望的蛋白质的馏分洗脱终了时,仍然必需纯化步骤,以便从乳中去除污物蛋白质,例如乳铁蛋白、乳白蛋白、转铁蛋白、白蛋白和免疫球蛋白。该纯化装置对于所属领域技术人员来说是公知的。作为实例,可以参考亲和层析、疏水层析、阳离子或阴离子交换体层析、或尺寸排阻层析,该列出不是限定性的。
步骤d)也有利地使得获得目标蛋白质的良好地复性成为可能,即适当地折叠,因而给予蛋白质等价于天然蛋白质生物活性的生物活性。
可选地,复性也可以通过简单渗析或渗滤来执行,以去除变性剂。
可以以任意标准层析装置来执行各种层析步骤,层析装置尤其包括抽吸设备、和检测系统,尤其是通过UV可见吸收。
在去除包含期望蛋白质的馏分中存在的最后乳蛋白质的步骤终了之后,回收包含纯化的期望蛋白质的馏分。
用于回收包含期望蛋白质的馏分的装置对于所属领域技术人员是公知的。作为实例,可以参考亲和层析、疏水层析、阳离子或阴离子交换体层析、或尺寸排阻层析,它们都使用通常所使用的洗脱剂。
在本发明的一个实施例中,包括澄清乳的步骤优选地在撇取和脱脂步骤(步骤a))之后、并且先于步骤b)之前执行。
术语乳的“澄清”应当理解为指包括经由分裂而去除胶束的步骤,从而获得包含酪蛋白、抗乳血清蛋白以及期望蛋白质的澄清的乳清。
该实施例使得获得更好的收率成为可能,因为在这种情况下,与酪蛋白胶束有关的期望蛋白质能够增加纯化馏分的浓度,在不包括澄清步骤的实施例的情况下,并非如此,在那其中胶束被去除,而且胶束中带有与它们有关的所期望的蛋白质。该实施例也使得能实现用于去除任意微生物或细胞剂以及存在于乳中的细胞碎片(例如细菌、上皮细胞或乳淋巴细胞)的亚微米过滤。
更特别地,乳澄清步骤通过增加一定浓度的螯合剂进行,使得在与乳混合后,乳的胶束结构消失,获得澄清的乳(溶液中酪蛋白或抗乳血清)。使用螯合剂的乳的澄清对于所属领域技术人员是公知的。作为螯合剂的一个实例,可以参考三钠柠檬酸盐或EDTA。例如,0.25M的最终柠檬酸钠浓度提供了乳的完全澄清。
在本发明的另一个实施例中,在撇取和脱脂步骤(步骤a))之后并且先于步骤b)之前,酪蛋白亚基束被沉淀,尤其是通过根据通常实施过程中的过滤或离心过滤。
尽管是可选的,但该步骤使得经由沉淀而使乳的胶体状态不稳定成为可能。期望蛋白质被从酪蛋白胶束或亚基释放或分离,从而使得与胶束相关的蛋白质的回收成为可能。
在本发明的一个特定实施例中,同时是疏水的和离子的配体为4-巯基-乙基吡啶。
包含该配体的载体的一个实例为MEP凝胶作为一个实例,允许吸收期望蛋白质发生在该载体上的条件可以包括在蛋白质的等电点(蛋白质上的负电荷)之上至少0.5pH单位以及在配体的pI(凝胶上的正电荷)之下至少1pH单位。如果期望蛋白质是FVII,则所选择pH值可以是8。在配体上蛋白质的吸收优选地在pH条件下发生,使得蛋白质和配体之间的相互作用本质上是疏水的。该pH值优选地在5和8.5之间。
本发明的一个特定实施例中,其中将被纯化的蛋白质是因子VII,洗脱可以通过将pH值降低到低于配体pKa的pH值来发生,即低于4.8。
如果配体是4-巯基-乙基吡啶,执行洗脱步骤c)可以使用水溶液和前面所描述混合物,以高于配体pKa的pH值,即高于4.8,尤其是以高于6并且低于9的pH值,并且非常有利地包括在7.0和8.5之间,并且具有水,且优选地具有WFI(注射用水)。在那种情况下,蛋白质例如是因子VII。
进一步地,本申请人惊奇地发现具有4-巯基-乙基吡啶配体的MEP凝胶、或具有2-巯基吡啶类型配体的Hitrap IgY凝胶显示了关于FVII的一定程度上的选择性,其结构与参考分子相“一致”,即能够被活化。事实上,关于没有在该凝胶上吸收的形态,本申请人在规则基准上已注意到能够被活化的形态(酰胺基FVII测定)和整体形态(抗原FVII测定)之间的区别。酰胺基FVII测定与抗原的体外活化相对照,1血浆抗原单位产出定义为1酰胺基单位,活化比率为1。蛋白质在纯化过程期间可以经受物理化学或生物化学变性的多种情况。当该比率在0.8和1.2之间时被认为是正常的,并且有利地,它等于1。在转基因动物中,因子VII的乳分泌并不100%同质,并且所属领域技术人员知道翻译后转化中的区别,尤其包括蛋白质三维结构的糖基化和折叠。因而,乳腺细胞在转基因后生产FVII,并且该FVII被糖基化并且随后在由乳腺分泌到乳中之前被合成。并不保证所创造的100%的分子是起作用的。很可能天然包括的控制机制将在转基因细胞中被修改;特别地,转基因蛋白质中与天然蛋白质相比,其糖形成熟间存在着差别。
因而,FVII形态没有被吸附到具有4-巯基-乙基-吡啶类型配体的MEP凝胶,或者具有2-巯基吡啶类型配体的Hitrap IgY凝胶,具有0.4到0.5的比率,并且所洗脱形态具有1.0到1.4的比率。因此,MEP凝胶通过吸附而选择最类似于天然形态的抗原形态,相反,可以假设未被吸附的形态可以显示出转基因动物制造中的缺陷。这无疑是一个优点,因为目标是从乳中提取可以注射到人类体内而没有显著副作用的人类FVII,并且出于这个目的,FVII应当尽可能类似于天然形态。酰胺基/抗原活化比率是一个显示出是否具备该条件的一个工具。
在本发明的另一个特定实施例中,同时是疏水的和离子的配体为巯基-苯并咪唑磺酸。
当使用这种类型载体时,适当采用轻微更酸的、具有在5和6之间的pH值的保留条件(步骤b)。在该pH值下,酪蛋白的溶解度是低的,并且沉淀甚至可能开始发生。例如1M NaCl等盐的增加使得在pH值5和pH值6之间保持酪蛋白可溶解成为可能。洗脱可以用先前所定义的水溶液和混合物进行。
步骤d)有利地经由阴离子交换体层析而实施,尤其是通过强碱型阴离子交换载体而实施,即-NR3+型的季铵组,R为烷基,例如甲基或乙基。市售的该载体可以适于该步骤的实施。
有利地低离子强度和pH值使得阴离子交换体步骤尤其适合,因为它允许期望分子,即FVII,聚集并且转换到活化因子VII,并且随后经由构象洗脱而纯化(即特别地连接到钙结合形式的改变,这使得N端部分(gla域)的电荷改变,使得整体上蛋白质电荷在钙饱和后变成负的)。
在步骤d)中,优选地通过阴离子交换体层析进行,有利地,蛋白质的洗脱使用钙离子溶液进行,其浓度包括在1和50mM之间,优选地在2和25mM之间,更优选地在3和12.5mM之间,或者在4和6mM之间,钙离子源例如由氯化钙提供。有利地,在步骤d),蛋白质的洗脱用5mM钙离子溶液来执行。
在另一个实施例中,用于洗脱的溶液可以基于铜、锌或锰酸盐。
根据本发明的过程可以为了提取重组蛋白质或提取所讨论的天然存在于哺乳动物乳中的蛋白质而实施。
蛋白质可以是天然存在于乳中的蛋白质,并且例如可以是β-乳球蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白、或朊间质蛋白胨,或者上述的混合物。
蛋白质也可以是非天然存在于乳中的蛋白质。实例包括因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、白蛋白、纤维蛋白原、胰岛素、髓鞘碱性蛋白、胰岛素原、组织纤溶酶原活化剂、以及抗体。
在一个优选实施例中,蛋白质为重组蛋白质并且包含它的乳为转基因乳。事实上,非天然存在于乳中的蛋白质可以通过使用重组DNA和转基因技术通过非人类转基因哺乳动物来合成。
这些技术对于所属领域技术人员公知的,这使得在转基因动物的乳中合成任意期望蛋白质成为可能。
该蛋白质则是重组或转基因蛋白质,由于这里这两个术语在本申请中被认为是等价的,并且随后通过使用重组DNA技术而合成。
术语“转基因动物”应当理解为任意非人类动物,在其基因组中已经被引入一外生DNA片段,尤其是编码有期望蛋白质的片段,使得所讨论动物表达由外生DNA编码的蛋白质,并且可以遗传该外生DNA到其后代。
相应地,任意非人类哺乳动物适于生产该乳。
有利的使用可以由兔子、母羊、山羊、奶牛、母猪和老鼠组成,该列出不是限定性的。
通过乳腺分泌期望蛋白质,导致转基因哺乳动物在乳中的分泌包含重组蛋白的表达以组织依赖的方式控制。
该控制方法对于所属领域技术人员是公知的。表达的控制通过导致特定动物组织中蛋白质的表达的序列来实现。这些序列尤其包括启动子序列、以及它们的信号肽序列。
所属领域技术人员公知的启动子的实例包括WAP(乳清酸蛋白)启动子、酪蛋白启动子、以及β-乳球蛋白启动子,该列出不是限定性的。
用于在转基因动物的乳中生产重组蛋白质的一种方法可以包括以下步骤:合成包含编码期望蛋白质的基因的DNA分子,该基因由乳中天然分泌的蛋白质启动子控制,合成的DNA分子被转移到非人类哺乳动物的胚胎中。胚胎随后引入到相同种类雌性哺乳动物中,其随后生产转基因动物。一旦该主题充分改进,哺乳动物的泌乳被诱发并且乳被收集。乳则包含期望的重组蛋白质。
用于在除人类之外的雌性哺乳动物的乳中蛋白质制备的过程的一个实例在文档EP0527063中提供,其教导可以应用到根据本发明的期望蛋白质的生产中。
包含WAP启动子的质粒通过引入包含用于WAP基因的启动子的序列而构造,并且该质粒以该这样的方式被创造从而其能够接收依赖于WAP启动子的外源基因。编码期望蛋白质的基因被结合并依赖于WAP启动子。包含启动子的质粒和编码期望蛋白质的基因被用来获得转基因动物,例如兔子,这经由显微注射到兔子胚胎的精原核中。胚胎随后传送到激素特制雌性的输卵管。转基因的存在通过Southern blotting检测,检测使用从所生产的年轻转基因兔子提取的DNA。动物乳中的浓度使用特定放射免疫测定来评估。
蛋白质有利地为凝聚蛋白质。根据本发明的蛋白质有利地从因子II(FII)、因子VII(FVII)、因子IX(FIX)以及因子X(FX)、以及它们的活化形态;以及C蛋白质,活化C蛋白质、S蛋白质、以及Z蛋白质、或上述的混合物中选择。
在一个特定有利的方式中,根据本发明的蛋白质为FVII或活化FVII(FVIIa)。
在这点上,FVII或FVIIa可以依据文档EP0527063的教导而生产,该文档简要提供了上述方法。一个序列是人类FVII的序列的DNA片段随后在WAP启动子的控制下被放置。例如,如文档EP0200421中所描述的,该DNA序列出现在序列号1b中。
有利地,根据本发明的FVII被活化。FVIIa通过各种蛋白酶(FIXa、FXa和/或FVIIa)酶原的解理成由二硫键桥连接的两链而在体内获得。FVIIa单独具有非常小的酶活性,但是当与其辅因子(组织因子(FT))复合时,它通过活化FX和FIX而触发凝聚过程。
当其与组织因子(FT)相互作用时,FVIIa的凝聚效果比FVII的大25到100倍。
在一个特别有利的方式中,蛋白质为因子VII(因子VII)。
在本发明的一个实施例中,FVII可以由因子Xa、VIIa、IIa、IXa和XIIa而在活体外活化。
根据本发明的FVII也可以在其纯化过程期间活化。
本发明的另一个目标是使用具有正zeta电势的玻璃过滤器用于同时撇取和脱脂哺乳动物乳。该实施过程有利地替代了耗时的经由离心沉淀的传统分离、或者对工业范围使用是个问题的用于脱脂的特定溶剂(三氯甲烷或氟烷衍生物,类似氟利昂)的使用。
本发明的另一个目标是载体的使用,其上嫁接有同时是疏水的和离子的、用于提取存在于经过撇取和脱脂的乳中的蛋白质的配体。
本发明的其它方面和优点将在以下实例中描述,其仅提供来用作阐述目的而不限定本发明的范围。
附图说明
具体实施方式
实例1:在其乳中生产人类FVII蛋白质的转基因兔子的生产
首先,通过将WAP基因的BamH1-HindIII序列(6.3Kb的片段)(在Devinoy等人于Nucleic Acids Research,vol.16,no.16(1988年08月25日,第8180页)的论文中描述)引入到在BamH1和HindIII序列之间的p-polyIII-1媒价(在Lathe等人于Gene(1987)57,193-201的论文中描述)的多位点接头(polylinker)而制备p1质粒。
在该克隆期间,BamH1位点被删除并且被出现在p1媒介中的ClaI位点替代。因而,p1媒介为可以在6.3Kb的WAP启动子控制之下接收外源基因的质粒。例如,外源基因可以被引入到多位点接头的SalI位点。包含启动子和外源基因整体的该插入物可以在位于p-poly III-I质粒多位点接头的末端的两个Not1位点分裂之后从质粒中分离。
从p1质粒获得的p2质粒包含兔子WAP基因(6.3Kb)和人类FVII基因的启动子。用于获得转基因兔子的片段位于两个Not1位点之间。
为了用作克隆位点,HindIII位点通过定点突变而被引入到基因前导序列。
转基因兔子经由传统显微注射技术而获得(Brinster等人发表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,第4438-4442页)。包含500份基因拷贝的一个或两个p1质粒被注射到老鼠胚胎的精原核中。构造在p-poly III-I媒介中产生(Lathe等人发表于Gene(1987)57,第193-201页)。包含重组基因的该媒介的Not1-Not1片段被显微注射。胚胎随后被传送到激素制备雌性的输卵管。所操作胚胎的大约10%产出年轻的兔子,并且所操作胚胎的2到5%产出年轻的转基因兔子。转基因的存在经由使用从兔子尾巴中所提取DNA的Southern印迹法而检测。动物血液和乳中的FVII浓度使用特定放射免疫测定来评估。
FVII的生物活性由将乳添加到细胞培养载体或兔子乳腺外植培养载体中而评估。
根据本发明的用来在其乳中生产FVII的转基因兔子的获得技术更详细地在欧洲专利EP0527063中描述。
实例2:撇取和洗脱馏分的制备
因为包括原兔子乳(即为未撇取冰冻乳)的原材料每升中大体包含150克蛋白质以及可比较量的脂质(15%乳脂),所以首先必需“流化并脱脂”该介质,以便使其能够相容于层析条件。
做法如下:
-一体积的解冻原乳与两体积的水溶剂混合,
-所有的流体混合物通过具有正zeta电位的玻璃纤维载体而过滤,即Ultipor GFPlus过滤器(由Pall Life Science制造)。
结果是所有流体原材料被充分脱脂,以用于层析技术。
试验“A”:
水溶剂是具有低离子强度(低于100mM)的磷酸盐溶液,有或者没有氯化钠添加。
试验“B”:
溶剂包含一定浓度的螯合剂,例如三钠柠檬酸盐或EDTA,与乳混合后,乳的胶束结构消失,保留所谓的“澄清”乳(溶液中酪蛋白或抗乳血清)。例如,在pH值8.0下最终柠檬酸钠浓度为0.25M,使乳完全澄清。
实例3:根据实例2中试验“A”的所撇取和脱脂馏分的亲和层析
MEP-HyperCel凝胶稳定的乳中转基因或重组FVII(rFVII)的捕获使用以下测定来论证,其中:
a)MEP凝胶的体积=2mL/原乳的体积F1=4mL
乳体积与MEP凝胶体积比率=2
在该实例中,427ml乳与3843ml磷酸钠缓冲剂混合(混合物1∶9),在pH值8.27下为0.015M,在25℃下具有4.5Ms/cm的电导率。该混合物在具有1m阈值的过滤器Ultripor GF+上过滤,得到用于随后层析的澄清乳4240ml,澄清乳的pH值为8.2,并且在25℃下电导率为8mS/cm。40ml的该溶液(相应于4ml的原乳)注射到凝胶中,凝胶以被制成1.1cm直径的柱。稳定凝胶床的高度是2cm,因而提供有2ml的封装凝胶(比率:原乳/凝胶=2)。
在注射生物材料之前,凝胶用pH值8.2的包含40mM氯化钠的25mM磷酸钠溶液平衡,其电导率在25℃下为8mS/cm(负载缓冲剂)。
泵的流速调整到1.5ml/分钟,即凝胶中估计的接触时间为大约1分钟E/E(进/出)。
该柱连接到280nm的UV灯检测器,并且光密度信号连续地记录到纸上。注射40ml的生物材料,一个“MEP开始”样品另外留作分析。注射后,凝胶用包含40mM氯化钠的25mM磷酸钠负载溶液洗涤,需要大约8.5ml以在280nm处的OD记录器上的重新获得基线。
收集被称作“非保留MEP”的48.3ml未被吸附蛋白质馏分。执行三个连续的洗脱。
溶液A=20.6ml的MEP洗脱液1→80%负载缓冲剂+20%乙二醇
溶液B=17ml的MEP洗脱液2→50%负载缓冲剂+50%乙二醇
溶液C=9ml未测试→负载缓冲剂用冰乙酸调整到pH值3。
凝胶随后用1MNaOH再生,并且保存在1M的包含20%乙醇(v/v)的氯化钠介质中。
分析数据收集到文中以下表格中。
馏分 | 体积(mL) | FVII抗原浓度(IU/mL) | FVII抗原量(IU) | 收率(%) |
初始MEP | 40 | 22.2 | 887 | 100% |
未被吸附的MEP | 48.3 | 5.6 | 269 | 30% |
洗脱液1-MEP(20%EG) | 20.6 | 6.4 | 131 | 15% |
洗脱液2-MEP(50%EG) | 17.0 | 23.0 | 390 | 44% |
结论:
百分之三十(30%)的FVII没有被凝胶保留,并且洗脱的总量占所采用的FVII59%。根据结果(89%),大约10%的FVII没有回收。
b)1体积的MEP凝胶=10mL/F1原乳的体积=200mL
乳体积和MEP凝胶体积的比率从3增加到20,增加100mL进行分馏。
馏分 | 体积(mL) | FVII抗原浓度(IU/mL) | FVII抗原量(IU) | 收率(%) |
初始MEP | 624 | 91.3 | 56,971 | 100% |
未被吸附1 | 100 | 20.6 | 2,057 | 22.5% |
未被吸附2 | 100 | 23.7 | 2,394 | 26.2% |
未被吸附3 | 100 | 28.9 | 2,914 | 31.9% |
未被吸附4 | 100 | 28.5 | 2,967 | 32.5% |
未被吸附5 | 100 | 32.2 | 3,247 | 35.6% |
未被吸附6 | 130 | 35.7 | 4,644 | 41% |
未被吸附,合并 | 637 | 28.6 | 18,222 | 32% |
洗脱液-MEP(50%EG) | 130 | 156.3 | 20,323 | 36% |
结论:
由于凝胶负荷(22到41%)的作用,百分之三十二(32%)的FVII没有被凝胶保留。最理想的乳对凝胶的比率是从10到15。洗脱液(含有50%EG的30mM磷酸盐、pH值为8)占所采用的FVII的44%。根据结果(68%),30%的FVII没有被回收,这表明捕获形态是高度疏水的。
在第二代(所谓的“F1”)转基因兔子乳中执行的这两个测定,大约30%的rFVII没有在所谓的“混合模式”MEP-HyperCel凝胶中吸附。
MEP-HyperCel的负载结果:
这里,或者根据试验“A”(稳定酪蛋白胶束)、或者根据试验“B”(可溶酪蛋白),目的是要支持第一代(称之为“F0”)转基因兔子乳的初步结果,以及对“未吸附”到MEP-HyperCel凝胶中的馏分进行再处理。
a)1体积的MEP凝胶=10mL/F0原乳的体积=133mL
乳体积对MEP凝胶体积的比率=13.3
结论:
在第一处理,百分之四十六(46%)的FVII没有被凝胶保留。对于第二处理,该比率上升到71%。F0乳收率比F1乳的收率具有这种形态的更大比率。
相反,19%的FVII在第一处理期间被洗脱(MEP1结果=65%),而在第二处理期间11%被洗脱(MEP2结果=82%)。全部地(MEP1+2),33%的FVII未被吸附,与之相比24%的FVII被吸附以及在EG中被洗脱。根据结果(57%),大约40%的FVII没有被回收,这表明,被保留的形态是高度疏水的。
b)MEP凝胶体积=10mL/F0原乳体积=140mL
乳体积对MEP凝胶体积的比率=14
结论:
在第一处理之后,百分之四十六(46%)的FVII没有被凝胶吸收。在具有0.25M浓度的充足数量柠檬酸盐的“乳的澄清”的第二传代期间,该比率保持在46%。
当凝胶用30mM磷酸盐缓冲剂洗涤(在注射后洗涤)时,发现FVII洗脱了全部的19%。该洗脱清楚地反映了FVII的更小的疏水形态。
总共17%的FVII在第一处理期间被洗脱(MEP1结果=63%),而14%在第二处理期间被洗脱(MEP2结果=79%)。全部地(MEP1+2),29%的FVII没有保留或者被过早地洗脱,与之相比23%的FVII在EG中吸收和洗脱。根据结果(52%),大约40%的FVII没有保留,这表明,所保留形态是高度疏水的。
实例4:关于MEP
凝胶的洗脱缓冲剂测试
这里,目标是通过测试乙二醇和各种辅助剂的组合来改进洗脱收率。
乙二醇 | pH值 | 清洁剂 | 溶剂 | 盐 | 收率 | |
1(标准)234 | 50%50%50%50% | 7.06.05.04.0 | ---- | ---- | 30mM磷酸钠柠檬酸盐/30mM柠檬酸柠檬酸盐/30mM柠檬酸柠檬酸盐/30mM柠檬酸 | 26%10%2%7% |
5678910 | 50%50%50%70%50%- | 3.07.56.06.07.28.0 | -1%---1% | -----0.3% | 柠檬酸盐/30mM柠檬酸30mM磷酸钠Tris/NaCl+5mM钙柠檬酸盐/30mM柠檬酸30mM辛酸钠30mM磷酸钠 | 20%31%9%29%31%7% |
非离子清洁剂(Triton X100)的增加和碱性pH值改进了洗脱收率。该测试也包括用丙二醇(CH2OH-CH2-CH2OH)替代乙二醇(CH2OH-CH2OH),丙二醇更小毒性,以及在一种变性剂尿素(NH2-CO-NH2)中在6M浓度时的复性测试。
还进行了各种洗脱方法的测试,结果如下:
用50%乙二醇(v/v)洗脱MEP-HyperCel
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:1.7分钟(不是最优的)
洗脱:混合物:50%乙二醇+1%Triton X100+49%的15mM柠檬酸钠,pH值为8
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 8,642 | 100% | 27,910(14mg) | 100% | 0.16% |
未吸附到MEP-HyperCel | 8,496 | 98% | 10,614(5.3mg) | 38% | 0.06% |
MEP-HyperCel洗出液 | 238 | 3% | 12,256(6.1mg) | 44% | 2.6% |
MEP结果 | 101% | MEP结果 | 82% |
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
用具有50%乙二醇(v/v)洗脱MEP-HyperCel
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟(最优的)
洗脱:混合物:50%丙二醇+1%TritonX100+49%的15mM磷酸钠,pH值为8
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 8,500 | 100% | 21,600(10.8mg) | 100% | 0.13% |
未吸附到MEP-HyperCel | 8,250 | 97% | 3,220(1.6mg) | 15% | 0.02% |
MEP-HyperCel洗出液 | 412 | 5% | 11,039(5.5mg) | 51% | 1.3% |
MEP结果 | 101% | MEP结果 | 66% |
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
用6M的尿素洗脱MEP-HyperCel
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:1.7分钟
洗脱:混合物:6M的原素+20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸基酸)缓冲剂,pH值为8.2
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 9,210 | 100% | 27,262(14.1mg) | 100% | 0.15% |
未吸附到MEP-HyperCel | 9,086 | 99% | 12,945(6.5mg) | 47% | 0.07% |
MEP-HyperCel洗出液 | 178 | 2% | 11,955(6mg) | 44% | 3.3% |
MEP结果 | 101% | MEP结果 | 91% |
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
用2M的尿素洗脱MEP-HyperCel
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟
洗脱:混合物:2M的尿素+20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES缓冲剂,pH值为8.2
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 8,931 | 100% | 26,037(13.5mg) | 100% | 0.15% |
未吸附到MEP-HyperCel | 8,790 | 98% | 4,389(2.2mg) | 17% | 0.02% |
MEP-HyperCel洗出液 | 320 | 4% | 17,963(9mg) | 69% | 2.8% |
MEP结果 | 102% | MEP结果 | 86% |
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
用0.5M的尿素洗脱MEP-HyperCel
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟
洗脱:混合物:0.5M的尿素+20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES缓冲剂,pH值为8.2
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 1,155 | 100% | 3,440(1.7mg) | 100% | 0.15% |
未吸附到MEP-HyperCel | 1,129 | 98% | 241(0.12mg) | 7% | 0.01% |
MEP-HyperCel洗出液 | 21.7 | 2% | 1,533(0.77mg) | 45% | 3.5% |
MEP结果 | 102% | MEP结果 | 52% |
注意:1IU的FVII:am=1IU的功能FVII:Ag,或者大约0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
未使用尿素的MEP-HyperCel洗脱
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟
洗脱:混合物:20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES缓冲剂,pH值为8.2
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 1,733 | 100% | 4,442(2.2mg) | 100% | 0.13% |
未吸附到MEP-HyperCel | ND | NA | ND | NA | NA |
MEP-HyperCel洗出液 | 45.9 | 3% | 2,496(1.25mg) | 56% | 2.7% |
ND=未检测到;NA=不可用
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
MEP-HyperCel酸洗脱(洗脱pH值=3<pKa的MEP)
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟
洗脱:混合物:0.1M的氨基乙酸+足够量的HCl使pH值为3
馏分 | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 44,275(22mg) | 100% |
未吸附到 | 10,081(5mg) | 23% |
MEP-HyperCel | ||
MEP-HyperCel洗出液* | 29,364(14.7mg) | 66% |
MEP结果 | 89% |
*在洗脱期间通过添加碱中和洗出液
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
用纯化水(WFI)进行MEP-HyperCel洗脱
注射:用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳
MEP凝胶的接触时间:8分钟
洗脱:再蒸馏WFI
馏分 | 蛋白质量(mg) | 蛋白质分布(%) | FVII:Ag的量(IU&mg) | FVII抗原收率(%) | FVII纯度(%) |
过滤的澄清乳,GF+0.45μm | 6,147 | 100% | 22,713(11.4mg) | 100% | 0.18% |
未吸附到MEP-HyperCel | 5,929 | 96% | 3,454.5(1.7mg) | 15% | 0.03% |
MEP-HyperCel洗出液 | 298 | 5% | 18,936(9.5mg) | 83% | 3% |
MEP结果 | 101% | MEP结果 | 99% |
注意:1IU的FVII:Ag=0.5μg/mL的FVII(标准血浆)
FVII:Ag=ELISA系统中FVII的抗原测定(基于特定抗体的检测);
血浆中,1IU/mL的FVII等价于0.5μg/mL的纯的FVII蛋白质;
FVII:am=可凝固FVII含量,在FVII缺乏的人类血浆中与组织因子接触后所测得的。
FVII(酶原)转化成FVIIa(酶),其将FX转换成FXa,这导致血浆凝聚(经由凝血酶的产生,其充当纤维蛋白原的作用)。
理论上,如果所有的分子(在国际标准血浆中)是起作用的,则1IU的FVII:Ag大约等于1IU的FVII:am(r=100%)。
在该测定中,如果FVIIa(部分活化的FVII)已经存在,则FXa的产生会稍微加速(r=100%至200%)。
然而,如果FVII被损坏或者是“非典型的”(没有关联有组织因子),则r<100%。
FVII:am/FVII:Ag比率(表示为百分比)反映了纯化期间FVII分子的功能状态。
FVII:Ag(IU/mL) | FVII:am(IU/mL) | FVII:am/FVII:Ag(%) | ||
初始MEP | 38.6 | 47.4 | 123% | |
未吸附的,MEP | 6.9 | 4.8 | 70% | 功能性缺陷 |
MEP洗出液(WFI) | 151.9 | 179.3 | 118% |
结论:
在未吸附的MEP中,FVII看起来展示(构造上的)缺陷和蛋白水解。
实例5:Q-Sepharose FF上MEP-HyperCel洗脱液的处理
FVII自身在Q-Sepharose FF离子交换体上划分成两种形态,即5mM钙(指“5mMCa2+”馏分)的近乎纯的FVII洗脱和50mM钙(指“50mM Ca2+”馏分)的低纯度FVII洗脱。所观察到(n=7批次)的传统比率分别为36%±8%以及40%±12%。
1体积QSFF凝胶=10mL
可以看到,在两个实例中,占优势地位的馏分是“5mMCa2+”馏分。全部地,3,286IU的“5mM”FVII被提取。依据乳的体积,该收率相应于每升乳12.5mg的rFVII。
1体积的QSEF凝胶=10mL
可以看到,根据试验“A”的处理中的占优势馏分为“5mMCa2+”馏分,该比率在试验“B”中改变了。这显示具有柠檬酸盐的处理喜好更少的期望“50mM”形态的存在。全部地,4,253 IU的“5mM”FVII被提取。依据乳的体积,该收率相应于每升乳15mg的rFVII。
实例6:从MEP-HyperCel+Q-Sepharose FF的5mM钙洗脱序列获得的FVII的特性
分析特性如下:
-FVII:Ag=252.9IU/mL
-蛋白质=123μg/mL(计算纯度:98%)
-T0在T0时FVII:C=3,224UI/mL,或者比率为13.4
-T24在26h并且在室温(RT)时,FVII:C=3,721到4,365UI/mL,或者比率为15.5到18.2,rFVIIa的质量控制(来自NovoNordisk)→比率=21.5到25.1
-密度分析:
在T0:50.3%的未分开的rFVII;
18小时之后在室温下:存在5.3%的未分开的rFVII。
从MEP+QSFF序列所获得的FVII产出高纯度FVII,其以大约50%的比率发生活化;然而,该活化在载体中天然且缓慢地发生。
Claims (13)
1、一种用于乳中所存在蛋白质的提取方法,该蛋白质在乳的正常pH值下具有至少一个疏水区以及负电荷,包括以下步骤:
a)撇取和脱脂该乳,
b)在允许所述蛋白质在层析载体上被捕获的pH值下,将包含所述蛋白质的脱脂和撇取后的馏分转移到层析载体上,在该层析载体上,嫁接有同时为疏水的和离子的配体,所述pH值高于4.6,
c)洗脱该蛋白质,
d)通过从所洗脱留分中去除乳蛋白质来纯化该所洗脱留分,以及
e)回收所述蛋白质。
2、根据权利要求1所述的方法,特征在于,在撇取和脱脂步骤(步骤a))之后,并且步骤b)之前,进行乳澄清步骤。
3、根据权利要求2所述的方法,特征在于,所述乳澄清步骤通过加入一定浓度的螯合剂进行,该螯合剂与所述乳混合之后,乳的胶束结构消失,获得澄清乳(酪蛋白溶液或抗乳血清)。
4、根据权利要求1或2所述的方法,特征在于,在撇取和脱脂步骤(步骤a))之后,并且在步骤b)之前,酪蛋白亚基簇被沉淀。
5、根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,特征在于,所述的同时为疏水的和离子的配体为4-巯基-乙基-吡啶。
6、根据权利要求1-5中任意一项所述的方法,特征在于,包括洗脱所述蛋白质的步骤c)使用浓度在1.2到8M之间的尿素、浓度在25mM和50mM之间的氨基乙酸、酸性pH值在4和6之间的水溶液的混合物,含水混合物包括从以下组中选择出的组分,优选地为两种或三种:磷酸钠和乙二醇,其中磷酸钠浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;柠檬酸钠和乙二醇,其中柠檬酸钠的浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;磷酸钠和乙二醇,其中磷酸钠浓度在5mM和50mM之间,优选地为30mM;TRIS/NaCl及钙盐、和乙二醇,前者的浓度在1mM和10mM之间,优选地为5mM;辛酸钠和乙二醇,其中辛酸钠的浓度在10mM和100mM之间,优选地为30mM;一水性混合物,其与存在的混合物相关联的传导率低于3mS/cm,或者水,并且优选地为WFI(注射用再蒸馏水),。
7、根据权利要求1-6中任意一项所述的方法,特征在于,步骤d)通过阴离子交换体层析进行。
8、根据权利要求7所述的方法,特征在于,在阴离子交换体层析步骤之后,蛋白质的洗脱使用1mM到50mM的钙离子溶液进行。
9、根据权利要求1-8中任意一项所述的方法,特征在于,所述蛋白质为重组蛋白质。
10、根据权利要求9所述的方法,特征在于,所述蛋白质为凝聚蛋白质。
11、根据权利要求10所述的方法,特征在于,所述蛋白质为因子VII和/或活化FVII(因子VIIa)。
12、具有正zeta电势的玻璃过滤器用于同时撇取和脱脂哺乳动物乳的用途。
13、连接有一同时具有疏水性的和离子的配体的载体的用途,用于提取存在于被撇取和脱脂过的乳中的蛋白质。
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