KR20100039281A

KR20100039281A - 변형된 인간 인자 Ⅶ／Ⅶａ 및 이를 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100039281A
Application number: KR1020097026182A
Authority: KR
Inventors: 엠마누엘 노니; 사미 크토로우; 니콜라스 비호레유
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date: 2007-06-15
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2010-04-15
Also published as: JP2010529848A; AR067335A1; BRPI0813372A2; CA2691110A1; FR2917414A1; FR2917414B1; WO2008155509A9; AU2008265021A1; WO2008155509A2; US20110162094A1; CN101743017A; EP2162147A2; TW200906851A; WO2008155509A3

Abstract

본 발명은 높은 안정성, 변형된 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산 및 이를 생산하는 방법을 가지는, 변형된 인자 VII/VIIa에 관한 것이다.

Description

변형된 인간 인자 Ⅶ／Ⅶａ 및 이를 함유하는 약학 조성물{Modified human factor Ⅶ/Ⅶa and pharmaceutical composition containing same}

본 발명의 분야는 약제용 활성제들로 사용될 인간 인자 Ⅶ(FVII)들/ 활성인자 Ⅶ (FⅦa)들의 제조에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 높은 안정성의 변형된 인자 Ⅶ/Ⅶa 들에 관한 것이고, 이러한 변형된 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 핵산들에 관한 것이며, 또한 이것들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인자 Ⅶ (FⅦ)는 칼슘과 조직 인자의 존재하에서 인자 Ⅹ 및 인자 Ⅸ를 활성화시켜 활성 형태(FⅦa)하에서 응고 과정에 기여하는 비타민 K에 의존적인 당단백질이다. FⅦ는 406 아미노산 잔기를 갖는 단일 펩타이드 체인의 형태로 분비되며, 그 분자량은 약 50 KDa이다. FⅦ는 4 개의 구별되는 구조적 도메인을 포함한다: N-말단 γ-카르복시 도메인(Gla), 2개의 표피성장 유사 도메인(EGF-유사), 및 세린 포로테아제 도메인. FⅦ 내지 FⅦa의 활성화는 Arg 152-Ile 153 결합(아르기닌 152-이소류신 153)의 절단의 특징을 나타낸다. 그러므로, FⅦa는 약 20 kDa의 분자량을 갖는 152 아미노산 경쇄와 단일 이황화결합(시스테인 135-시스테인 262)으로 함께 결합된 약 30 kDa의 분자량을 갖는 254 아미노산 중쇄로 이루어진다.

FⅦ/Ⅶa는 혈우병 및 인자 Ⅶ 결함( 혈우병 A) 또는 인자 Ⅸ 결함(혈우병 B) 을 겪는 환자의 치료뿐만 아니라, 기타 응고인자 결함(예를 들면, 유전성 FⅦ 결함)을 갖는 환자들을 위해 사용된다. FⅦ/Ⅶa는 또한 뇌혈관 사고를 치료하는 데 추천되어진다.

FⅦa 농축물을 얻는 가장 오래된 방법은 분획화 유래의 혈장 단백질에서 FⅦa를 정제하는 것이었다.

이 목적으로 위하여, EP 0 346 241는 FⅦ 와 FⅦa를 함유하는 혈장 단백질 분획화 부산물(plasma protein fractionation by-product) 및, PPSB 예비 용출액(P=프로트롬빈 또는 FⅡ, P=프로컨버틴(proconvertin) 또는 FⅦ, S=스튜어트 인자(Stuart factor) 또는 FⅩ 및 B=항 혈우병 B 인자 또는 FⅨ)을 포함하는, 인자 Ⅸ, Ⅹ 및 Ⅱ 등의 기타 단백질을 흡수한 다음 용출하여, FⅦa-풍부 분획물을 제조하는 방법을 기술하고 있다.

유사하게, EP 0 547 932는 비타민 K 종속-인자들과 실질적으로 FⅧ가 없는 고순도의 FⅦa 농축물을 제조하는 방법을 제시하고 있다.

혈장에서 FⅦ/Ⅶa을 얻는 이러한 방법들의 주요한 단점들 중의 하나는 이 방법들은 소량의 생성물을 얻을 수만 있다는 점이다. 한편, 주요한 단점은 절단된 형태를 체계적으로 제공하여 덜 활성적이며 원하지 않는 부작용을 일으킬 가능성이 있는 획득 생성물의 민감성(sensitivity)이다. 게다가, 공혈자로부터 모아진 혈장의 유용성이 제한되었다.

이 이유 때문에, 인간 인자 Ⅶ를 암호화하는 DNA(DNA encoding human factor Ⅶ)는 80년대 초에 분리되었으며(Hagen 등 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Apr 83(8):2412-6), 해당 단백질을 BHK(아기 햄스터 신장) 포유류 세포에서 발현시켰다(특허출원서류 EP 0 200 421). 그 출원인에 의해 출원된 불란서 출원 FR 06 04872는 또한 유전자이식 동물에서 FⅦa의 생산을 기술하고 있다.

이들 생성 방법은 바이러스 또는 기타 병원균으로부터 오염될 가능성이 없는 단백질을 얻을 수 있다. 이러한 방법들은 일차 서열이 인간 일차 서열과 동일한 단백질을 얻을 수 있다.

재조합 인간 FⅦa의 상업적 제조는 현재 상표명 NovoSeven^®(NovoNordisk^TM)으로 이용할 수 있다. 원하는 치료 및 예방 효과를 얻고 유지하기 위해 상당히 높은 복용량과 빈번한 정맥 투여(intravenous administration)가 요구된다. 그러므로, 이러한 치료법은 여전히 환자들에게 제한적이고 아주 고가이다.

게다가, FⅦ/Ⅶa는 단백질 가수분해 절단(비정형 절단)에 민감한 단백질로서어떠한 응고활성도 없는 다수의 분해 생성물의 형성을 한다는 것을 알 수 있었다. 비정형 절단은 제조방법의 여러 단계들에서 발생하지만, FⅦ/Ⅶa의 저장 동안에도 일어날 수 있다. 분해 생성물은 혈장 유래의 FⅦ/Ⅶa 및 유전자 재조합 과정들을 사용하여 제조된 FⅦ/Ⅶa에도 관찰되어왔다. 비정형 절단은 FⅦ이 FⅦa로 활성화되기 전에, 예를 들면, FⅦ의 생성과 정제 동안에, 이러한 활성화 단계 동안에, 또는 활성화된 생성물(FⅦa)의 정제 및/또는 저장 동안에 수반되어 진다.

유럽특허 EP 0 370 036은, FⅦ/Ⅶa 비정형 절단들을 감소시켜 더 안정한 FⅦ/Ⅶa을 얻기 위하여 FⅦ/Ⅶa 비정형 절단에 관련된 리신, 아르기닌, 이소류신 및 /또는 타이로신 잔기상에서 변형된 FⅦ/Ⅶa에 관한 것이다. 그러나, 이 특허는 비정형 절단과 연관된 아미노산의 변형에 의한 FⅦ/Ⅶa 입체구조에서의 문제의 변성을 처리하지 않았기 때문에, 더 안정한 FⅦ/Ⅶa을 얻는 데 있어서의 어려움을 단지 부분적으로 해결한다. 이 특허는 비정형 절단 자리 수준에서 변형될 FⅦ/Ⅶa 을 얻는 방식 및 아미노산 서열 변형에 의해 영향을 받지 않거나 또는 거의 받지 않을 FⅦ/Ⅶa 의 입체구조를 기재하거나 암시하지도 않았다.

특히 비정형 절단 자리 수준에서의 변형된 인간 FⅦ/Ⅶas 에 대한 문헌들의 존재에도 불구하고, 개선된 물성을 갖는 신규의 인간 FⅦ/Ⅶas 에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다

<요약>

본 발명은 리신 38, 아르기닌 290, 및 아르기닌 315으로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산 잔기상에서 변형된 아주 안정한 인자들 FⅦ/Ⅶa에 관한 것이며, 상기 아미노 잔기들은 다른 아미노산 잔기로 (i)대체되거나 또는 (ii)결손된다.

본 발명은 또한 상기 변형된 인자 FⅦ/FⅦa를 암호화하는 핵산들, 상기 핵산들이 삽입된 재조합 벡터들, 상기 핵산들 또는 상기 재조합 벡터들로 형질전환된 숙주세포들 및 상기 변형된 인자들 FⅦ/FⅦa을 발현하는 유전적으로 변형된 생물체들에 관한 것이다.

본 발명은 또한 위에서 정의한 바와 같은 변형된 인자 FⅦ/FⅦa을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 의약품을 제조하기위한 상기 변형된 인자들 FⅦ/FⅦa의 용 도, 및 상기 변형된 인자들 FⅦ/FⅦa을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 (i) 저장 기간 동안에 그리고 (ii) 환자에게 투여 후의 생체내에서 아주 안정한 신규의 변형된 인자들 FⅦ/Ⅶa을 제공한다.

놀랍게도, 출원인은 천연 인간 FⅦ/FⅦa의 아미노산 서열내의 리신 38(( Lys 38, K38), 아르기닌 290 (Arg290, R290) 및 아르기닌 315(Arg315, R315)의 아미노산 잔기의 일부 돌연변이가 천연 인간 FⅦ/FⅦa에 비해, 변형된 인간 FⅦ/Ⅶa의 입체구조를 변성시키지 않거나 또는 거의 변성시키지 않는다는 것을 보여준다.

또한, 출원인은, 본 발명의 변형된 FⅦ/Ⅶa가, 천연 인간 FⅦ/FⅦa의 3 차원 입체구조와 아주 유사하고 때때로 동일하기도 한 변형된 FⅦ/Ⅶa의 3차원 입체구조는 천연인간 FⅦ/FⅦa의 입체구조와 근접한 입체구조를 유지하면서, 천연인간 FⅦ/FⅦa 과 비교할 때 감소된 비정형 절단률, 더 우수한 생산수율, 줄어든 제거율(clearance) 및 더 높은 안정성을 포함하는 개선된 물성을 갖는다는 것을 보여준다.

여기서 사용된 "비정형 절단(atypical cleavage)"는, 활성화 자리의 절단(Arg152-Ile153 결합의 절단)을 제외한, FⅦ 또는 FⅦa 분자에서 발생하는 모든 펩타이드 결합 절단을 의미한다. 이들 비정형 절단은 특히 아미노산 리신 38(리신 38-류신 39 결합), 아르기닌 290(아르기닌 290-글리신 291 결합), 및 아르기닌 315(아르기닌 315-리신 316 결합)과 관련이 있으며, 구조적 변형을 일으켜 FⅦ/Ⅶa 약물동력학적 성질의 변성에 이르게 한다.

여기서 사용된 바와 같이, "생산 수율(production yield)"은 발효기(생물 반응기)의 체적당 또는 유전자 이식 동물로부터의 젖(milk) 체적당 또는 모든 생물자원(동물, 채소, 세균 또는 곤충 세포)의 중량당 생산된 구조적으로 변형가능하며 활성이 있는 FⅦ/Ⅶa의 양을 의미한다. 그러므로, 이 결과로 돌연변이된 FⅦ/Ⅶa 에 대한 제조비는 FⅦ/Ⅶa의 제조비보다 훨씬 더 낮으며, 여기서 FⅦ/Ⅶa의 일차 서열은 천연인간 FⅦ/Ⅶa 서열과 동일하다.

여기서 사용된 "제거율(clearance)"는 단위 시간당 FⅦ/Ⅶa를 더 이상 함유하지 않는 완전하게 정제된 이론 체적의 분획을 의미한다. FⅦ/Ⅶa 제거율은 혈장정제 계수(plasma purification coefficient)를 나타낸다. 이것은 단위 시간당 동맥 혈장의 주어진 체적으로부터 FⅦ/FⅦa를 완전히 제거하는 기관의 능력에 해당한다. FⅦ/FⅦa 제거율은 단위 시간당 주어진 FⅦ/FⅦa로부터 완전히 제거된 동맥혈장의 겉보기 체적(가상체적:virtual volume)이다.

여기서 사용된 "안정성(stability)"은 FⅦ/Ⅶa이 그 자체의 수명 동안에 그의 화학적, 물리적, 구조적, 입체구조적 및/또는 생물 약제학적 성질을 유지하는 능력을 의미한다.

여기서 사용된 "입체구조(conformation)"는 단백질의 3차원 구조를 의미한다. 즉, 폴리펩타이드 체인의 공간에서의 중첩을 의미한다. 그것은 빈번하게 3차원 구조, 또는 3D 구조라고 일컬어진다. 단백질의 입체구조는 생체 활성도와 밀접하게 관련이 되어 있으며, 이것은 단백질의 구조가 변성되었을 때 단백질은 그의 생체 활성을 잃고 변성되게 된다는 것을 설명한다. 그러므로, 여기서 사용된 "입체구조에서의 변성(alteration in the conformaiton)"은 단백질의 생체활성도의 상실을 초래하는 상기 단백질의 3차원 구조에 대한 어떠한 변형을 의미한다.

본 발명의 FVII/VIIa의 생체 활성도는, 예를 들면 특허 US 5,997,864 에 기재된 바와 같이, FⅦ-결손 혈장 및 트롬보플라스틴의 수단에 의하여 혈액응고를 유도하는 FⅦ/Ⅶa의 능력을 측정하여 정량화되어질 수 있다. 특허 US 5,997,864 에 기재된 분석결과에서 생체 활성도는 대조구 샘플과 비교하여 응고시간이 감소되어 나타나고, 1 unit/ml의 FⅦ/Ⅶa 활성도를 함유하는 인간 혈청 표준과 비교하여 "FⅦ/Ⅶa units"으로 변환된다.

본 발명의 FⅦ/Ⅶa 는 천연 인간 FⅦ/Ⅶa의 특성과 유사한 번역후 변형 특성을 가지지만, 그의 화학적, 물리적, 구조적, 입체구조적 및/또는 생물 약제학적 성질을 개선시키기 위하여 혈장 유래의 천연 인간 FⅦ/Ⅶa의 변형과는 다른, 번역후 변형을 가질 수 있다.

광의의 면에서, 본 발명은 리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산이치환 또는 결손되며, 천연 인간 FⅦ/Ⅶa의 펩타이드 서열과 비교하여, 변형된 인간 FⅦ/Ⅶa를 제공하는 것에 관한 것이며, 여기서 리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315는 다음과 같이 치환되거나 결손된다:

(i) 리신 38은 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 또는 발린으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 글루타민, 히스티딘 또는 글루탐산으로부터 선택된 아미노산에 의해 대체되며;

(ii) 아르기닌 290은 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 또는 발린으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 글루타민, 히스티딘, 아스파라긴, 또는 글루탐산으로부터 선택된 아미노산에 의해 대체되며; 및/또는

(iii) 아르기닌 315는 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 또는 발린으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 글루타민, 히스티딘, 아스파라긴, 또는 글루탐산으로부터 선택된 아미노산에 의해 대체된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, FⅦ/Ⅶa는 글루타민에 의해 대체된 리신 38, 글루타민에 의해 대체된 아르기닌 290, 및 글루타민에 의해 대체된 아르기닌 315로부터 선택된 적어도 2개의 치환을 포함한다.

본 발명의 제 1 특정 실시예에서, FⅦ/Ⅶa는 리신 38 및 아르기닌 290에서의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 제 2 특정 실시예에서, FⅦ/Ⅶa는 리신 38 및 아르기닌 315에서의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 제 3 특정 실시예에서, FⅦ/Ⅶa는 아르기닌 290 및 아르기닌 315에서의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 제 4 특정 실시예에서, FⅦ/Ⅶa는 리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315에서의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 특정 실시예에서, 리신 38은 글루타민에 의해 대체되고, 아르기닌 290은 글루타민에 의해 대체되며, 아르기닌 315는 글루타민에 의해 대체된다.

본 발명의 FⅦ/Ⅶa는 재조합 DNA 기술(유전적 재조합)을 실시하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 천연인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산(DNA 또는 RNA)의 서열은 원하는 단백질, 특히 본 발명에 따른 변형 FⅦ/Ⅶa을 암호화하도록 변형된다. 그리고나서, 그렇게 변형된 핵산은 별현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 이 발현 벡터는 숙주세포를 형질전환시키거나 또는 형질감염시키는 데 사용되어진다. 천연인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO. 1의 핵산에 의해 예시되어진다.

그래서, 본 발명은 또한 보체 서열(complementary sequence)의 핵산뿐만 아니라 본 발명에 따른 변형 인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산을 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변형 인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산은 이 분야의 당업자의 일반 지식에 속하는 공지의 전통 기법들 중의 어떤 것을 사용하여도 생성되거나 또는 합성될 수 있다. 하나의 예시로서, 본 발명에 따른 변형인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산은 천연인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산으로부터 유전적 재조합에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 변형 인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산은 천연인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 핵산에서 위치 특이적인 돌연변이 유발(site specific mutagenesis) 기술에 의해 얻어진다. 위치 특이적인 돌연변이 유발 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 원하는 변형 인간 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 DNA을 얻을 수 있다. 예를 들면, 1978년 Michael Smith 에 의해 기재된 위치 특이적인 돌연변이 유발 기법과 동일하거나 그 기법으로부터 유래된 위치 특이적인 돌연변이 유발 기법들이 행해질 수 있다(Smith and al.; "Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence"; J Biol Chem. (1978) Sep 25;253(18):655-60).

바람직하게는, 본 발명의 FⅦ/Ⅶa는 SEQ ID NO. 2의 자연인간 FⅦ의 아미노산들 리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315의 아미노산들로부터 선택된, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드이며, 그리고 이 아미노산들은 이 목적에서 선택된 아미노산들에 의해 대체되거나 또는 결손되어 진다.

구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 변형 FⅦ/Ⅶa는, 천연 인간 FⅦ/Ⅶa의 변이체로 부터 얻어질 수 있으며, 이 변이체는 천연 인간 Ⅶ/FⅦa보다 더 많은 면역원성이 없다는 가정하에 이루어진다. 이 변이체의 펩타이드 서열은 천연 인간 FⅦ의 펩타이드 서열과 적어도 70% 아미노산 동일성을 나타낼 수 있고, 바람하게는 적어도 80%, 또는 90%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 아이노산 동일성을 나타낼 수 있으며, 또한 이 변이체의 펩타이드 서열은 SEQ ID NO. 2의 자연인간 FⅦ의 아미노산 넘버링에 따라, 리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315 아미노산들로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산 잔기들로 이루어지며, 이 아미노산들은 이 때문에 선택된 아미노산들로 돌연변이되거나 또는 결손된다. 이러한 변이체는 천연 인간 Ⅶ/FⅦa와 비교할 때 실질적으로 유사하거나, 더 높은 생체 활성도를 갖는다.

본 발명의 목적을 위하여, "뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 의미하는 데 사용될 수 있다. "뉴클레오티드 서열"은 이러한 유전자 물질을 포함하나, 이 서열 정보에 제한되는 것은 아니다.

여기서 사용된 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 올리고뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 RNA, DNA, cDNA 서열들 또는 단일 나선 형태(single-straned form) 또는 이중 나선 형태(double-stranded form)의 하나 이상의 뉴클레오티드의 RNA/DNA 하이브리드 서열을 의미한다. "뉴클레오티드(nucleotide)"는 천연 뉴클레오티드들을[아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 시토신(C), 및 우라실(U)을 포함한다.

본 발명의 목적을 위하여, 제 1 폴리뉴클레오티드는, 제 1 폴리뉴클레오티드의 각 염기가 역 배향(reverse orientation)을 갖는 제 2 폴리뉴클레오티드의 상보적인 염기와 쌍을 이룰 때,제 1 폴리뉴클레오타이드는 제 2 폴리뉴클레오티드와 상보적이라고 여겨진다. 상보적인 "염기들"은 A와 T(A와 U) 및 C와 G이다.

본 발명에 따라, 제 2 참조 핵산과 적어도 90% 동일성을 갖는 제 1 핵산은, 상기 제 2 기준 핵산과 적어도 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3%, 98.6%, 99%, 및 99.6%의 뉴클레오티드 동일성을 가질 것이다. 본 발명에 따라, 제 2 기준 폴리펩타이드와 적어도 90% 동일성을 갖는 제 1 폴리펩타이드는, 상기 제 2 기준 폴리펩타이드와 적어도 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3%, 98.6%, 99%, 및 99.6%의 아미노산 동일성을 가질 것이다.

본 발명에서 정의한 두 핵산 서열 사이, 또는 두 아미노산 서열 사이의 "동일성 백분율(identity percentage)"은 비교창(comparison window)을 통해 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교하여 결정된다.

따라서, 비교창 내의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 부분은 두 개의 서열 사이의 최적의 배열을 얻기 위하여 참조 서열과 비교될 때 첨가 또는 결손(예를 들면, 갭들)을 포함할 수 있다.

동일성 백분율은, 두 비교 서열에 대하여 동일한 핵 염기 또는 동일한 아미노산이 관찰되는 위치들의 수를 결정한 다음, 두 핵 염기들 사이의 또는 두 아미노산들 사이의 동일성이 있는 위치들의 수를 비교창 내부의 위치들의 총수로 나누고, 마지막으로 양 서열 사이의 뉴클레오티드들의 동일성 백분율 또는 아미노산들의 동일성 백분율을 얻기 위하여 100를 결과 값에 곱하여 계산된다.

비교를 위한 최적의 서열의 배열은 공지 알고니즘을 사용한 컴퓨터 프로그램에 의해 계산될 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 서열 동일성 백분율은 파라미터들이 다음과 같이 설정된 CLUSTAL W 소프트웨어(버전 1.82)를 사용하여 결정된다:(1) CPU MODE=Clustal W mp ; (2) ALIGNMENT= "full" ; (3) OUTPUT FORMAT= "alnw/numbers" ; (4) OUTPUT ORDER = "aligned" ; (5) COLOR ALIGNMENT = "no" ; (6) KTUP(word size) = "default" ; (7) WINDOW LENGTH = "default" ; (8) SCORE TYPE = "percent" ; (9) TOPDIAG = "default" ; (10) PAIRGAP = "default" ; (11) PHYLOGENETIC TREE / TREE TYPE = "none" ; (12) MATRIX = "default" ; (13) GAP OPEN = "default" ; (14) END GAPS = "default" ; (17) TREE TYPE = "cladogram" 및 TREE GRAP DISTANCES = "hide".

본 발명은 또한 본 발명에 따른 변형 인간 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는, 핵산이 삽입된 발현벡터(expression vector)에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 백현벡터는 본 발명의 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 핵산의 전사를 명령할 수 있는 촉진자(promotor)를 포함할 수 있다. 포유류 세포 배양에 전통적으로 사용된 촉진자들은 이 분야에서 잘 알려진 바이러스 촉진자 및 세포 촉진자를 포함한다. 발현 벡터는 촉진자의 하위에 위치하고, 본 발명의 FⅦ/Ⅶa을 암호화하는 DNA 서열의 삽입자리의 상위에 위치하고 있는 스플라이싱 자리들(splicing sites)을 포함한다. 발현 벡터는 또한 본 발명의 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 DNA 서열의 삽입자리의 하위에 있는 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence)을 포함한다. 발현 벡터는 또한 본 발명의 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 모든 형태의 DNA 서열, FⅦ/Ⅶa의 발현, 선택 및/또는 삽입에 유용한 모든 형태의 DNA 서열 및/또는 본 발명의 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 모든 형태의 발현 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 변형 인간 FⅦ/Ⅶa를 생성하기 위하여 형질전환된 세포를 제공하는 것에 관한 것이다. 형질전환 세포들은 본 발명의 변형 인간 FⅦ/Ⅶa를 암호화하는 핵산을 숙주세포의 게놈내에 전달하여 얻어지며, 바람직하게는 상기 형질전환 세포에 의해 이 DNA 서열이 발현된다. 적절한 세포 형질전환 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 방법은 이에 제한되지 않지만, 리포솜의 사용, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), DEAE-덱스트란의 사용, 인산칼슘의 사용, 바이러스의 사용(주로 RNA 종양바이러스), DNA 건(gun), 세포융합, 미량주사(microinjection), 전기천공법, 등을 포함한다.

그러므로, 본 발명은 또한 위에서 정의한 바와 같이 변형된 인간 FVII/VIIa를 암호화하고 상기 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 발현하는 핵산으로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 형질전환 세포는 포유류의 형질전환 세포이고, 특히 설치류(쥣과), 소, 염소, 돼지, 비인간 영장류 형질전환 세포 또는 인간 형질전환 세포이다.

본 발명에 따른, 변형된 인간 FVII/VIIa는 본 발명에 따라 형질전환되고 배양된 세포로부터 얻어질 수 있다. 일례로서, 다음의 세포들이 언급될 수 있다: BHK (Baby Hamster Kidney: 아기 햄스터 신장) 및 특히 BHK tk^-ts13 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 79:1106-1110, 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham and al., J. Gen . Virol . 36:59-72, 1977), Rat Hep I (Rat hepatoma: 쥐의 간종양; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma: 쥐의 간종양; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포 (CHO 세포주) (Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220, 1980), 세포 YB2/0, 세포 3T3, 세포 Namalwa, 또는 무혈청 배양에 적합한 BHK 세포 (US 6,903,069).

또한, 본 발명은 본 발명의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 생산하는, 유전적으로 변형된 생물체에 관한 것이다. 유럽 연합에 의하여 주어진 정의에 따르면, "유전적으로 변형된 생물체"는 증식 및/또는 재조합에 의하여 자연적으로 발생할 수 없는 방식으로 변형된 유전 물질을 갖는 생물체 (인간 제외)이다. 본 발명의 설명에 있어서, 유전적으로 변형된 생물체는 본 발명의 FVII/VIIa를 암호화하는 DNA 서열을 병합하고 (integrate), 변형된 인간 FVII의 상기 DNA 서열을 발현시켜 본 발명의 상기 변형된 인간 FVII/VIIa를 생산한다. 상기 유전적으로 변형된 생물체는 미생물, 동물 또는 식물이다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같이 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산을 그 게놈 내에 포함하고, 상기 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 발현시키는, 유전적으로 변형된 생물체에 관한 것이다.

미생물은 현미경적 생물체이고, 박테리아, 효모 또는 바이러스일 수 있다. 상기 박테리아는, 예컨대, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (Palva and al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP 0 036 259 및 EP 0 063 953; WO 84/04541); 대장균 (Escherichia coli) (Shimatake and al. (1981) Nature 292:128; Amann and al. (1985) Gene 40:183; Studier and al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP 0 036 776, EP 0 136 829 및 EP 0 136 907); 스트렙토코커스 크레모리스 (Streptococcus cremoris) (Powell and al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; 스트렙토코커스 리비단스 (Streptococcus lividans) [Powell and al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655); 스트렙토미세스 리비단스 (Streptomyces lividans) (US 4,745,056) 등일 수 있다. 상기 효모는, 예컨대, 칸디다 (Candida) (Kurtz and al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze and al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141); 한세눌라 (Hansenula) (Gleeson and al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp and al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302); 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) (Das and al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt and al. (1983) J. Bacterial. 154:1165; Van den Berg and al. (1990) Bio/Technology 8:135); 피키아 (Pichia) (Cregg and al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze and al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; 미국 특허 번호 제4,837,148호 및 제4,929,555호); 사카로미세스 (Saccharomyces) (Hinnen and al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito and al. (1983) J. Bacteriol. 153:163); 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces) (Beach and Nurse (1981) Nature 300:706); 야로이야 (Yarrowia) (Davidow and al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin and al. (1985) Curr. Genet. 10:49) 등일 수 있다. 사용된 바이러스는, 예컨대, 조류 백혈구증 바이러스 (Avian Leukosis Virus), 소 백혈병 바이러스 (Bovine Leukemia Virus), 마우스 백혈병 바이러스 (Murine Leukemia Virus), 밍크 세포 포커스 인듀싱 바이러스 (Mink-Cell Focus-Inducing Virus), 마우스 육종 바이러스 (Murine Sarcoma Virus), (Reticuloendotheliosis Virus) 및 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus) 등의 레트로바이러스 일 수 있다.

본 발명에서 정의되는 동물은, 어떤 엽록체를 갖지 않는, 진핵생물체 (eukaryotic) 타입의, 비인간의, 살아 있는 다세포성 생물체이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 유전적으로 변형된 생물체는, 포유류, 바람직하게는 암컷 토끼이다. 유리하게는, 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa는, 포유류의 유선에서 생산될 수 있으며, 바람직하게는 상기 FVII/VIIa의 발현을 가능하게 하는 특정 프로모터의 조절 하에 있는 상기 암컷 토끼의 젖에서 생산될 수 있다.

유전자 이식 (transgenic) 동물의 젖에서 재조합 또는 유전자 이식 FVII/VIIa를 생산하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 분자를, 젖에서 자연 발생적으로 분비되는 단백질의 프로모터 (예컨대, 카제인 유전자 프로모터, 베타-카제인 유전자 프로모터, 락트알부민 유전자 프로모터, 베타-락토글로불린 유전자 프로모터 또는 WAP 유전자 프로모터)의 조절 하에 있는 상기 유전자를 비인간 포유류의 배아 내로 통합시킨다. 그런 다음, 상기 배아를 동일 종의 암컷 포유류에 이식한다. 일단 배아로부터 유래된 포유류가 충분히 발달되면 (developed), 상기 포유류의 젖분비가 유발되고, 젖이 모아진다. 그런 후에 상기 젖은 상기 재조합 또는 유전자 이식 FVII/VIIa를 포함한다.

인간이 아닌 암컷 포유류의 젖에서 단백질을 생산하는 방법의 일례는 EP 0 527 063에 제시되어 있으며, 이에 교시된 내용은 본 발명의 단백질을 생산하는 데에 있어서도 고려될 수 있다. WAP 유전자 프로모터 (Whey Acidic Protein)를 포함하는 플라스미드는 WAP 유전자 프로모터 함유 서열을 도입함으로써 얻어지는데, 이 플라스미드는 WAP 유전자 프로모터의 조절 하에 둔 외래 유전자를 받을 수 있도록 하기 위하여 제조된다. 상기 프로모터 및 본 발명의 단백질의 암호화하는 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 수컷 전핵 (pronucleus) 내에 암컷 토끼 배아를 미세주사함으로써 유전자 이식 암컷 토끼를 생성하는데 이용된다. 그런 후에 상기 배아를 호르몬 처리된 암컷의 자궁관 내로 이식하였다. 상기 이식유전자가 존재하는 지는 그 후 얻어지는 유전자 이식 어린 토끼로부터 추출된 DNA를 서던 블랏함으로써 확인된다. 동물의 젖 농도는 특정 방사성 면역측정법을 사용하여 분석된다.

기타의 문헌은 여자가 아닌 암컷 포유류의 젖에서 단백질을 생산하는 방법을 개시하고 있다. 그러한 예로는 US 7,045,676 (유전자 이식 마우스) 및 EP 1 739 170 (폰 빌레브란드 인자의 유전자 이식 포유류에서 생산) 등이 언급될 수 있으여, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제법은 본 발명의 변형된 FVII/VIIa로부터의 DNA를 사용하는 본 발명에 적용된다.

특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 생물체는 곤충, 예컨대 모기, 파리 (fly) 등이다.

본원에서 사용되는, "재조합 또는 유전자 이식 FVII/VIIa"는 형질전환된 세포로부터 또는 유전적으로 변형된 생물체, 즉 미생물, 동물 또는 식물로부터 얻어지는 모든 FVII/VIIa를 의미한다. 반면, 본 발명의 FVII/VIIa는 혈장 유래 FVII/VIIa가 아니며, 즉 이것은 인간 또는 동물 혈장으로부터 정제된 산물이 아니라는 말이다.

따라서, 본 발명의 FVII/VIIa는 본 발명의 변형된 변형 FVII을 암호화하는 DNA 분자의 전사 및 번역에서 유리되며, 유전자 이식 세포, 미생물, 동물 또는 식물에 의하여 생산된다. 따라서, 본 발명의 재조합 또는 유전자 이식 FVII/VIIa는 생물계 (biological system) 내에서 단백질을 발현시킬 수 있는, 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 통상의 방법을 사용하여 얻어질 수 있다.

또한, 본 발명은, 다음의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 변형된 인간 FVII/VIIa를 제조하는 방법에 관한 것이다:

a) 본 명세서에서 정의된 바와 같이 변형된 인간 FVII/VIIa를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질전환시키는 단계,

b) 단계 a)에서 얻은 세포가 상기 인자 VII/VIIa를 발현하도록 상기 세포를 배양하는 단계, 및

c) 단계 b)에서 배양된 상기 형질전환된 세포에 의하여 발현되는 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 정제하는 단계.

상기 형질전환된 세포를 FVII/VIIa의 발현을 가능하게 하는 적절한 배지에서 배양한다. 사용되는 배양 배지는 배양되는 세포에 따라 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 각 목적별로 선택된다. 세포 배양에 적절한 배지로는 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI 1640 또는 그 등가물 등이 있다. 이들 배양 배지는 무기염, 아미노산, 비타민과, 그 에너지 공급을 위한 글루코스 및 그 완충 효과를 위한 HEPES를 포함하는 기타의 성분으로 주로 구성되고, 특히 아미노산, 미네랄, 미량 성분, 각각의 배양되는 세포 타입용의 성장 및 대사 활성 특이 분자 보체 (complement) 등의 기본적인 보체를 포함한다.

또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 유전자 이식 포유류의 젖에서 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa를 생산하는 방법에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른, 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산을 그 유선 내에서 발현시키는 유전자 이식 포유류를 제공하는 단계,

b) 인자 VII/VIIa를 포함하는 유전자 이식 포유류의 젖을 모으는 단계,

c) 상기 모아진 젖으로부터 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 정제하는 단계.

유리하게는, 상기 유전자 이식 포유류는 마우스, 암컷 쥐, 암컷 토끼 또는 염소일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자 이식 포유류는 암컷 토끼일 수 있다.

유전자 이식 포유류를 생산하기 위하여, 예컨대, 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa를 암호화하는 DNA 서열을 포유류의 배아에 미세주사하고, 동일 종의 암컷 포유류의 자궁관 내강 (oviduct lumen) 내에 상기 미세주사된 배아를 도입하며, 상기 미세주사된 배아로부터 유래되는 어린 포유류의 분만을 기다리고, 상기 유전자 이식 동물이 정말로 그 젖에서 변형된 인간 FVII/VIIa를 발현되는지 여부를 체크하는 것을 포함하는 것으로 이루어진 통상의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 FVII/VIIa는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 크로마토그래피 (이온 교환, 친화성, 소수성 또는 크기 제한 크로마토그래피), 제조용 등전 포커싱 (isoelectric focusing, IEF)과 같은 전기영동에 기초한 방법, 용해도 차 (황산암모늄 침전) 또는 추출 (Protein Purification J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York (1989)) 등의 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 정제 방법에 의하여 정제될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 FVII/VIIa는 항-FVII 항체 컬럼 상에서의 또는 항-FVII 압타머 컬럼 상에서의 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)에 의하여 정제될 수 있다. 통상의 화학 정제 방법, 예컨대 HPLC (High performance liquid chromatography: 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 추가의 정제가 수행될 수 있다. 시트르산 바륨 침전을 포함하는, 기타의 정제 방법이 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 이는 본 발명의 FVII/VIIa를 정제하는 데에 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린 또는 그의 면역 활성 부분 (immunologically active fraction), 예컨대 항원 결합 부위를 의미한다. 따라서, 항체는 적어도 1개의, 바람직하게는 2개의 중쇄(들)와, 적어도 1개의, 바람직하게는 2개의 경쇄(들)를 포함하는 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 "압타머 (aptamer)"는 그것이 단백질에 특이적으로 결합할 수 있도록 하는 3차 구조를 가진 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)를 의미한다 (Osborne, and al. (1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1: 5-9; 및 Patel, D. J. (1997) Curr Opin Chem Biol 1:32-46).

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa와 부형제 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 비경구, 국소 또는 국부 투여용과, 예방 및/또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa는 선택되는 투여 경로에 적합한 형태로, 예컨대 액체 형태로 또는 동결 건조된 형태로 제조된다. 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa를 함유하는 약학 조성물은 부형제 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있고, 이들은 바람직하게는 수용성이다. 많은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체는 예컨대, 물, 완충 수용액 (buffered water), 식염수, 글리신 용액 및 그 유도체 뿐 아니라 생리 조건을 재현하는 데에 있어 필요한 제제, 예컨대 완충 용액 및 pH 조절 제제, 계면 활성제 등으로서 사용될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 계면 활성제로는 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등이 있다. 또한, 약학 조성물은 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 멸균 방법으로 멸균될 수 있다. 일반적으로 말하면, 본 발명에 따른 약학 조성물을 제조하기 위하여, 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 유럽 약전 (European Pharmacopoeia)의 최신 개정판, 예컨대 2005년 1월에 발행된 유럽 약전의 5번째 개정판이나 2007년 6월에 공개된 유럽 약전의 6번째 개정판을 유리하게 참고할 것이다.

본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa 및 이를 포함하는 약학 조성물은 의약품의 제조에 특히 유용하다. 본 발명의 변형된 인간 FVII/VIIa 및 이를 포함하는 약학 조성물은 환자에 있어서의 응고 장애 (clotting disorder)를 치료하는 의약품의 제조에 유용하다. 본 발명의 약학 조성물로 치료되는 응고 장애에는 다발성 출혈 외상 (multiple hemorrhagic trauma), 예로서 혈우병 (haemophilia) A 및 B, 또는 항응고제 과다 복용 (anticoagulant overdosage)에 의하여 발생하는 출혈 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른, 변형된 인간 FVII/VIIa는 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 기타의 약학 활성 분자(들)과 배합하여 사용될 수 있다.

도1은 FⅦ 비정형 절단된 아미노산 서열들을 보여주는 천연 조건하에서의 MALDI-TOF 질량스펙트럼이다.

도2는 FⅦ 비정형 절단된 아미노산 서열들을 보여주는 환원 조건하에서의 MALDI-TOF 질량스펙트럼이다.

도3은 Sybyl 7.2 소프트웨어(Tripos)를 이용한, 리신 38(백색)을 함유하는 천연 인간 FⅦ와, 위치 38에 글루타민(흑백)을 함유하는 변형된 인간 FⅦ의 구조적 중첩을 예시하는 분자 모델링이다.

도4는 Sybyl 7.2 소프트웨어(Tripos)를 이용한, 아르기닌 290 (백색)을 함유하는 천연 인간 FⅦ와, 위치 290에 글루타민(흑백)을 함유하는 변형된 인간 FⅦ의 구조적 중첩을 예시하는 분자 모델링이다.

도5는 Sybyl 7.2 소프트웨어(Tripos)를 이용한, 아르기닌 315 (백색)을 함유하는 천연 인간 FⅦ와, 위치 315에 글루타민(흑백)을 함유하는 변형된 인간 FⅦ의 구조적 중첩을 예시하는 분자 모델링이다.

실시예 1: 인간 FVII 3차원 모델

인간 3차원 모델은 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank (PDB))내의 활용가능한 모든 결정화 구조의 철저한 연구에 기초하여 착안되었다. 27개의 FVII 구 조는 발현 시스템, 중쇄 및 경쇄 보전, 조직 인자 발생, 분해, O- 및 N-당화 발생, γ-카르복시화 발생 및 단백질 데이터 뱅크(PDB) 공개일 등의 다양한 매개변수에 따라 분석되었다. 이 연구에 기초하여, 단백질 구조는 구조의 수집, 조립, 및 최소화 후에 구성되었다. 사용된 소프트웨어 군(The software suite)은 Sybyl v7.2 (Tripos, Inc.)이었다. Sybyl은, 따라서 가장 안정적인 구조를 한정하고, 그래서 가장 그럴듯한 구조를 한정하기 위하여 총 에너지 최소화를 토대로 하는, 모델화 소프트웨어이다. 조직 인자 발생을 모의 실험하여 단백질 뼈대를 고정하는 단계를 포함하는 총체적인 최소화 단계는, 하기의 조건하에서 수행된다:

- 정지 매개변수: 에너지 기울기 < 0.5 kCal/mol 또는 반복 도달 최대수 = 10000

- 최소화 방법: Powell

- 힘의 필드: 앰버 7FF99

- 당단백질 전하 계산방법: 앰버7FF99

- 이온 및 활성 자리 저해자 전하의 계산 방법: Gasteiger-Huckel

- 비결합 컷오프: 8Å.

실시예 2: 유전자 변형 암컷 토끼의 젖에서 얻은 FVII 추출 및 정제

a) FVII 추출

크림을 제거하지 않은 500 ml 부피의 날젖을 9배 부피의 0.25 M 인산나트륨 완충용액(pH 8.2)으로 희석하였다. 실온에서 30분 동안 연속혼합(stirring)한 후에 FVII-풍부 수용층을 10 000g, 15℃ 에서 1시간 동안, 원심분리하였다(Sorvall Evolution RC centrifuge 6700 rpm rotor SLC-6000). 약 835 ml짜리의 6개 포트(pots)가 사용되었다.

원심분리 후, 하기의 세 개의 층이 형성되었다: 표면의 지질층(크림), 맑고, FVII-풍부하고, 비지질성의 수용층(주요 층), 및 흰색의 고형 찌꺼기 층(불용성 카제인 및 칼슘 조성의 침전물).

FVII-풍부 비지질성 수용층은 크림 층에서 연속식 펌프로 수집되었다. 크림층은 다른 한쪽에 따로 모아졌다. 고형층(침전물)은 제거하였다.

그러나 소량의 지질을 여전히 함유하고 있는 비지질성 수용층을 (하기의) 필터 순서(1 μm의 공크기를 갖는 Pall SLK7002U010ZP 유리섬유 예비여과기를 거친 후 0.45 μm의 공크기의 Pall SLK7002NXP Nylon 66의 순서)를 거쳐 여과하였다. 이 여과를 위하여, 지질층을 이 여과 순서대로 통과시켰으며, 젖의 지질성 덩어리는 전부 남겨지고 여과물은 맑아졌다.

그런 다음, 여과된 비지질성 수용층을 초여과막(Millipore Biomax 50 kDa- 0.1 m²)을 통과시켜 투석하여 크로마토그래피층에 적합하게 하였다. 젖의 염들, 당들 및 펩타이드들과는 대조적으로, 분자량 약 50 kDa의 FVII는 이 막을 통해 여과되지 않았다. 첫 번째 단계에서, 용액(약 5000 ml)을 500ml로 농축한 다음, 일정한 수준으로 부피(체적)을 유지시키는 초여과 투석을 실시하여 전기분해물을 제거하고, 크로마토그래피 단계를 위한 생물학적 시료를 제조하였다. 투석용 완충용액은 0.025M 인산나트륨 완충용액(pH 8.2)이었다.

이 비지질성 수용층은 FVII를 포함하고 있으며, FVII-tg-풍부 젖혈청(lactoserum)과 비교할 수 있다. 이 제조물은 다음 단계의 과정을 진행하기 전에 -30℃에 보관하였다.

이 단계에서, FVII 함유 비지질성 수용층이 완벽하게 깨끗이 되었으며, 다음 단계인 크로마토그래피 단계에 적합하게 되었다.

약 93 000 IU FVII-tg이 이 단계에서 추출되었다. 이 제조물의 FVII의 정제도는 약 0.2%였다.

b) FVII 정제

1. 하이드록시아파타이트 겔상의 크로마토그래피

아미콘(Amicon 사) 90 컬럼(직경 9cm-64 cm²섹션)에 바이오라드(BioRad 사) 세라믹 하디드록시아파타이트 타입 I 겔(CHT-I)을 채웠다.

그 겔을 0.025 M 인산나트륨 및 0.04 M 염화나트륨 혼합물로 구성된 완충용액 A(pH 8.0)로 평형화시켰다. -30℃에 보관된 총 제조물을 얼음 블록이 완전히 용해될 때까지 37℃의 수조에서 녹인 다음, 상기 겔상에 주입하였다(직선 흐름률(유속) 100 cm/h, 즉 105 ml/min). 기초선(baseline:RBL)이 회복될 때까지 배출되지 않은 분획물을 0.025 M 인산 나트륨 및 0.04 M 염화 나트륨으로 구성된 완충용액(pH 8.2)으로 제거하였다.

FVII-함유 분획물의 용출은 0.25 M 인산 나트륨 및 0.4 M 염화나트륨로 구성된 완충용액 B(pH 8.0)에 영향을 받았다. 기초선이 회복될 때까지 이 용출 분획물을 수집하였다.

이 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 FVII를 회수 가능한 반면, 95% 이상의 젖 단백질은 제거되었다. 특이적인 활성(specific activity;SA)은 25배 였다. 4%의 정제도를 갖는 약 85000 IU의 FVII이 이 단계에서 얻어졌다.

2.접선( Tangential ) 여과(100 kDa ) 및 농축/투석(50 kDa )

상기 이전 단계의 전체 용출물을 100 kDa 초여과막(Pall OMEGA SC 100K 0.1 m²)상에서 접선 모드(tangential mode)로 여과하였다. FVII를 분자량 100 kDa 이상은 여과되지 않는 100 kDa 막을 통과시켜 여과하였다.

그리고 나서, 상기 여과된 분획물을 약 500 ml로 농축한 다음 실시예 1에 기재된 50 kDA의 초여과기 상에서 투석하였다. 투석 완충용액은 0.15M 연화 나트륨이었다.

이 과정의 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피에 전개시키기 전에 생산물을 -30℃에 보관하였다.

100 kDa 이상의 분자량을 가지는, 특히 전효소(proenzymes)의, 단백질의 전하를 감소시키기 위해 이 단계가 필요하다. 100 kDa 막상의 처리는 고분자량 단백질들을 포함하는 단백질들의 약 50%의 유지에 기여하지만, FVII, 즉, 82 000 IU FVII의 95%는 여과된다.

이 처리는 하위의 단계 동안에 단백질 분해성 가수분해 위험율을 감소시키기위해 처리되었다.

3. Q- 세파로스 ^® FF 겔상의 크로마토그래프화

Q-세파로스^® 빠른 흐름(Q-Separose^® Fast Flow ;QSFF) 이온-교환 겔상의 세 가지의 성공적인 크로마토프래프화는 활성제를 정제하고, FVII를 활성화된 FVII(FVIIa)로 활성화시키고, 및 FVII 조성물을 지속적으로 농축하고 제형화하기 위해 수행되었다.

3.1 Q-세파로스^® FF 첫 번째 단계 "고칼슘" 용출

직경 2.6 cm 컬럼(5.3 cm² 섹션)에 100 ml의 Q-Sepharose^® FF 겔 (GE Healthcare)을 채웠다.

그 겔을 0.05 M Tris 완충용액(pH 7.5)으로 평형화시켰다.

-30℃에 저장된 전체 분획물을 얼음 블락이 완전히 용해될 때까지 37℃ 수조에서 녹였다. 분획물을 평형 완충용액(balance buffer)으로 1/2 농도 [v/v]로 희석한 후에 겔상에 주입하고(흐름율(유속) 13 ml/min, 150 cm/h의 직선 흐름율(유속)), 그런 다음, 배출되지 않은 분획물을 기초선이 다시 회복될 때까지 완충용액 을 전개시켜 제거하였다.

첫 번째 단백질 분획물을 0.05 M Tris 및 0.15 M 염화나트륨 완충용액 (pH 7.5)을 이용하여 9 ml/min(즉. 100 cm/h)로 용출한 다음, 제거하였다.

FVII 고함량을 포함하는 두 번째 단백질 분획물을 0.05 M Tris, 0.15 M 염화나트륨 및 0.05M 염화 칼슘 완충용액 (pH 7.5)을 이용하여 9 ml/min(즉. 100 cm/h)로 용출하였다.

이 두 번째 분획물을 실시예 1에서 기재한 50 kDA 초여과기 상에서 투석하였다. 투석용 완충용액은 0.15 M 염화나트륨이었다. 이 분획물을 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피용 컬럼에서 전개시키지 전에 +4℃에서 밤새 보관하였다. 이 단계는 FVII (즉. 60000 IU FVII)의 73%를 회수 할 수 있지만, 이웃 단백질들의 80%는 제거되었다. 이것은 또한 FVII를 FVIIa로 활성화하는 것을 가능하게 하였다.

3.2 Q-세파로스^® FF 2차 단계 "저칼슘" 용출

직경 2.5 cm 컬럼(4.9 cm² 섹션)에 30ml의 Q-세파로스^® FF 겔 (GE Healthcare)을 채웠다.

그 겔을 0.05 M Tris 완충용액(pH 7.5)으로 평형화시켰다.

+4℃에 보관된 미리 용출된 분획물(2차 분획물)을 희석한 다음 겔상에 주입하였다(흐름율(유속) 9 ml/min, 100 cm/h의 직선 흐름율).

매우 고순도의 FVII를 함유하는 분획물을 0.05 M Tris, 0.05 M 염화나트륨 및 0.005 M 염화칼슘 완충용액(pH 7.5)을 사용하여 4.5 ml/min (즉, 50 cm/h)로 용출하였다.

약 23000 IU FVII이 정제되었다(즉, 12 mg의 FVII).

이 단계는 95% 이상의 동료 단백질들(토끼 암컷의 젖 단백질들)을 제거할 수 있었다.

이 용출은 90% 이상의 정제도를 가지며, 천연 인간 FVII의 구조적 및 기능적인 특성과 밀접한 특성을 가진다. II는 세 번째 이온 교환 크로마토그래피에 흘려서 농축하고 제형화하였다.

3.3 Q-세파로스^® FF 3차 단계 "나트륨" 용출

직경 2.5 cm의 컬럼(4.9 cm² 섹션)을 10 ml의 Q-세파로스ㄾ FF 겔 (GE Healthcare)로 채웠다. 그 겔을 0.05 M Tris 완충용액(pH 7.5)으로 평형화시켰다.

그 정제 용출된 이전 단계의 분획물을 주사용 정제수(WFI)로 5배 희석한 다음 겔상에 주입하였다(흐름율(유속) 4.5 ml/min, 50 cm/h의 직선 흐름율).

그런 다음, FVII를 0.02 M Tris 및 0.28 M 염화나트륨 완충용액(pH 7.0)을 이용하여 3 ml/min (즉, 36 cm/h)의 흐름율(유속)로 용출하였다.

농축물로서의 FVII 조성물은 95% 이상의 정제도를 갖도록 제조되었다. 그 생산물은 혈관 주사용으로 적합하였다. 그 방법은 누적 수율이 22%로, 사용된 젖 1리터 당 적어도 20 mg 의 FVII를 정제가능하였다.

그런 다음, FVII는 하기의 실시예들에서 수행된 다양한 구조적인 분석을 수행하였다.

실시예 3: MALDI - TOFMS 에 의한 FVII 비정형 절단 확인

질량 스펙트럼분석 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry)는 높은 정밀성으로 분자의 분자량을 측정하는 것이 가능한 기술방법이다.

테스트된 단백질들을, 사용된 레이저 파장에서 흡수하는 기질과 혼합하였다. 주요 기질로는 펩타이드 분석용 α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;HCCA), 단백질 분석용 시나피닉 산(sinapinic acid;SA) 및 올리고당 분석용 2,5-디하이드록시 벤젠산이 포함되었다.

그 방법은 기질/분석물을 레이저를 쬐어 공-결정화하는 단계로 구성되며, 이에 의해 기질 분자 및 분석물 분자의 상호 탈착을 일으킨다. 가스 이온화 후에, 분석물 분자들이 time-of-flight(이하, TOF) 탐색기에 도달하였다. 중량 및 TOF가 직접적으로 결합되면서, 후자를 측정하여 분석물 중량을 결정할 수 있다. 각각의 단백질 또는 각각의 펩타이드를 확인하는 것은 질량 스팩트럼 분석에서 관찰되는 바와 같이 그것의 중량을 측정하고, FVII 서열에서 유래된 이론적인 중량을 비교함으로써 수행될 수 있다. 사용된 기기는 TOF 및 TOF/TOF 모드에서 수행한 Bruker Autoflex II였다.

FVII MALDI-TOF 스펙트럼은, 대부분 바이안테너리 모노시알릴화 형태(A1) 및 기타 글리칸 (A1F, A2, …)의 올리고당으로 당화된 Asn₃₂₂ 를 포함하는 중쇄(HC)의 펩타이드 [Gly₂₉₁-Pro₄₀₆]의 C-말단에 해당되는 14.7 kDa (도 1, 폴리펩타이드 IV)에서 형성되었다. 또한, 스펙트럼에서, N-말단, FVII의 상보적인 형태(도1, 폴리펩타이드 IV), 아르기닌 290 말단끝의 존재가 34.6 kDa에서 관찰되었다. 또 다른 비정형 절단이 리신 38 뒤에 절단된 경쇄(light chain (LC))에 해당되는 44.8 kDa (도 1, 폴리펩타이드 II)에서 관찰되었으며, 이것은 Gla 도메인-결손 FVII 형태로서, 따라서 조직인자에 대한 친화도가 감소되었다.

환원된 조건하에서 (도 2), FVIIa 중쇄 및 경쇄의 존재는 각각 29.9과 19.3 kDa (폴리펩타이드 I)로 기록되었다. 당화된 Asn₃₂₂를 함유하는 펩타이드 [Lys₃₁₆- Pro₄₀₆]에 해당하는 또 다른 11.9 kDa 형태가 관찰되었다. 천연 상태에서, 이 펩타이드는 이황화결합(Cys₃₁₀-Cys₃₂₉)을 통하여 단백질의 N-말단에 결합하였다.

모든 테스트된 FVII 시료들은 하나 또는 그 이상의 이 절단된 형태들을 가졌다. 전체 확인된 형태들은 세린 단백질분해효소-타입 절단에서 기인되었다. 따라서 이들 다양한 절단들은 자가촉매 기원의 것일 수도 있다.

실시예 4: 에드만 서열화를 이용한 비정형 절단 정량화

에드만 화학 분해 원리에 기초한 미세서열화기(Procise 491 HT Applied Biosystem) 상에서 하기 3 단계로 구성된 FVII N-말단 서열화가 수행되었다: 커플 링-절단 및 전환, 그런 다음, 역상 컬럼 상에 형성된 아미노산의 분리. 그런 다음에, 이렇게 생성된 N-말단의 아미노산을 조사하고, 표준 아미노산들을 이용하여 확인하고, 고려된 단백질의 이론적인 서열과 비교하였다. 기록들의 평가는 데이터 수집 및 표준 아미노산 크로마토그램(SequencePro Applied Biosystems)과 비교분석 후에 수행하였다. 결정된 FVII 서열을 이론적인 아미노산 서열과 비교하였다.

2 개의 주요 서열이 구체적으로 확인되었다:

- N 말단 LC 서열: ANAFLE E LRPGSL E R E CK EE Q C SF (SEQ ID NO. 3)

- N 말단 HC 서열: IVGGKV C PKGE C PWQVLLLVNGAQL C G (SEQ ID NO. 4)

생산물들에 의존적인 3 개의 다른 서열이 확인되었다:

- LC 서열: LFWISYSDGDQ (SEQ ID NO. 5) (리신 38 뒤의 비정형 절단).

- HC 서열: GATALELMVLNVPRLMTQ (SEQ ID NO. 6) (아르기닌 290 뒤의 비정형 절단).

HC 서열: KVGDSP N ITEYMF C AGYSDGS (SEQ ID NO. 7) (아르기닌 315 뒤의 비정형 절단).

굵은 이탤릭체의 아미노산은 서열 갭들(gaps)을 나타낸 것으로, γ-카르복시화, N- 또는 O-당화 등의 번역후 변형이 발생되기 때문에 에드만 서열화로 동정되지 않은 아미노산을 표시한다. 정량 평가는 FVII 기원에 의존하는 다양한 비정형 절단의 함량을 평가하기 위하여 수행되었다. 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다:

총 생산물 대비 다양한 FVII 기원 의존성 비정형 절단의 백분율.

서열	FVII-pd (%)	FVII-Tg batch A (%)	FVII-Tg batch B (%)	FVII-rec (%)
K₃₁₆VGDSP…	27	17	52	9
G₂₉₁ATALEL…	8.5	8	13	4
L₃₉FWISYS…	12	26	8	4.5

*FVII-pd: 혈장-유래 인간 FVII

*FVII-Tg: 비돌연변이 유전자이식 인간 FVII

*FVII-rec: 상업적인 재조합 인간 FVII (비돌연변이)

FVII 경쇄는 아미노산 K38 및 L39 사이에 4.5 내지 26%의 생산 기원에 의존적인 다양한 비정형 절단율을 갖는다. FVII 중쇄는 R315 및 K316 사이에 (생산 기원에 의존적인 9 내지 52%의 다양한) 비정형 절단율을 가지며, R290 및 G291 사이에도 (생산 기원에 의존적인 4 내지 13%의 다양한) 절단된다.

<110> LFB BIOTECHNOLOGIES <120> Modified Human Factor VII/VIIa and Pharmaceutical Composition Containing Same <130> ip-2009-0123 <150> FR 0755775 <151> 2007-06-15 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120 cctcacagag tcttcgtaac ccaggaggaa gcccacggcg tcctgcaccg gcgccggcgc 180 gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 240 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 300 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 360 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 420 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 480 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 540 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 600 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 660 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 720 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac 780 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 840 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 900 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag cccgtggtcc tcactgacca tgtggtgccc 960 ctctgcctgc ccgaacggac gttctctgag aggacgctgg ccttcgtgcg cttctcattg 1020 gtcagcggct ggggccagct gctggaccgt ggcgccacgg ccctggagct catggtcctc 1080 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgc ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 1140 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctgc 1200 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggc 1260 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1320 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1380 ctgcgagccc catttcccta g 1401 <210> 2 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe 20 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly 20 25 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 5 Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 6 Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met 1 5 10 15 Thr Gln <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 7 Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Asp Gly Ser 20

Claims

리신 38, 아르기닌 290 및 아르기닌 315로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산이 치환 또는 결손되며, 천연 인간 인자 VII/VIIa의 펩타이드 서열과 비교하여 변형된 인간 인자 VII/VIIa:

여기에서, - 상기 리신 38은 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체되며,

- 상기 아르기닌 290은 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체되며, 및/또는

- 상기 아르기닌 315는 글루타민, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체됨.
제 1항에 있어서, 상기 리신 38은 글루타민, 히스티딘 및 글루탐산으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아르기닌 290은 글루타민, 히스티딘, 아스파라긴 및 글루탐산으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체되는 것인 변형 된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 315는 글루타민, 히스티딘, 아스파라긴 및 글루탐산으로부터 선택되는 하나의 아미노산으로 대체되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신 38은 글루타민으로 대체되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 290은 글루타민으로 대체되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 315는 글루타민으로 대체되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산.
제 8항의 핵산이 삽입된 것인 발현 벡터.
변형된 인간 인자 VII/VIIa를 발현하는 제 8항의 핵산으로 형질전환된 세포.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산을 생물체의 게놈에 포함하며, 상기 변형된 인간 인자 VII/VIIa가 발현되는, 유전적으로 변형된 생물체.
제 11항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 생물체는 미생물, 동물 또는 식물인 것인 유전적으로 변형된 생물체.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 생물체는 포유동물인 것인 유전적으로 변형된 생물체.
제 13항에 있어서, 상기 포유동물은 암컷 토끼인 것인 유전적으로 변형된 생물체.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 생물체는 곤충인 것인 유전적으로 변형된 생물체.
하기의 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 인자 VII/VIIa를 제조하는 방법:

a) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산을 세포에 형질전환하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 획득된 세포가 상기 인자 VII/VIIa를 발현하도록 상기 세포를 배양하는 단계, 및

c) 상기 단계 b)에서 배양한 형질전환 세포에서 발현된 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 정제하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 유전자 이식 포유동물의 젖에서 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 제조하는 방법:

a) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 암호화하는 핵산을 포유동물의 유선에서 발현하는, 유전자 이식 포유동물을 제공하는 단계,

b) 인자 VII/VIIa를 함유하는 유전자 이식 동물의 젖을 수집하는 단계, 및

c) 상기 수집된 젖으로부터 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 정제하는 단계.
제 17항에 있어서, 상기 유전자 이식 동물은 생쥐, 암컷 쥐, 염소 및 암컷 토끼로부터 선택되는 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 제조하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 유전자 이식 동물은 암컷 토끼인 것인 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa를 포함하는, 인간 인자 VII/VIIa 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa 및 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
의약품을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa의 용도.
응고 장애 치료용 의약품을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa의 용도.
다발성 출혈성 외상 치료용 의약품을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa의 용도.
혈우병 치료용 의약품을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa의 용도.
항응고제 과량복용에 의한 출혈 치료용 의약품을 제조하기 위한, 제 1항 내 지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 인간 인자 VII/VIIa의 용도.