FR2917414A1 - Facteur vii/viia humain modifie et composition pharmaceutique contenant celui-ci - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à des facteurs VII/VIIa modifiés possédant une haute stabilité, à des acides nucléiques codant pour de tels FVII/VIIa modifiés et à des procédés pour leur production.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la

fabrication de facteurs VII (FVII)/facteurs VII activés (FVIIa) humains utilisables comme principes actifs de médicaments. L'invention est en particulier relative à des facteurs VII/VIIa modifiés possédant une haute stabilité, à des acides nucléiques codant pour de tels FVII/VIIa modifiés et à des procédés pour leur production.

ART ANTERIEUR Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa. Le FVII comporte quatre domaines structuraux distincts : le domaine y-carboxylique (Gla) N-terminal, deux domaines "epidermal growth factor like" (EGF-like), ainsi qu'un domaine sérine protéase. L'activation du FVII en FVIIa est caractérisée par la coupure de la liaison Arg152-I1e153 (Arginine 152-Isoleucine 153). Le FVIIa est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de masse moléculaire d'environ 30 kDa liées entre elles par un seul pont disulfure (Cystéine 135-Cystéine 262).

Le FVII/VIIa est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B), ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII/VIIa est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux.

La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après absorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles que les facteurs IX, X et II, notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX). De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et du FVIII. L'un des inconvénients majeurs de ces procédés d'obtention du FVII/VIIa à partir du plasma sanguin est qu'il ne permet d'obtenir que de faibles quantités de produit. Par ailleurs, un inconvénient majeur réside dans la fragilité des produits obtenus qui présentent systématiquement des formes tronquées et donc moins actives et susceptibles d'entraîner des effets secondaires non souhaitables. De plus, l'approvisionnement en plasma collecté auprès des donneurs de sang reste limité.

C'est pourquoi, dés les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé (Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83(8):2412-6) et la protéine correspondante exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document EP 0 200 421). La demande FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.

Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire est identique à la séquence primaire humaine. Les préparations commerciales de FVIIa recombinant humain sont actuellement disponibles sous l'appellation NovoSeven (NovoNordiskTM). Des doses relativement élevées, ainsi que des administrations fréquentes par voie intraveineuse, sont nécessaires pour atteindre et conserver l'effet thérapeutique ou prophylactique désiré. Ce traitement reste donc à la fois contraignant pour les patients et très onéreux. Il a par ailleurs été montré que le FVII/VIIa est une protéine sensible au clivage protéolytique entraînant la formation de nombreux produits de dégradations dépourvus d'activité coagulante (clivages atypiques). Les clivages atypiques peuvent intervenir à différentes étapes du procédé d'obtention mais également pendant le stockage du FVII/VIIa. Les produits de dégradation ont été observés à la fois pour le FVII/VIIa dérivé du plasma, mais également pour le FVII/VIIa produit par recombinaison génétique. Les clivages atypiques peuvent intervenir avant l'activation du FVII en FVIIa, par exemple pendant la production et la purification du FVII, pendant l'étape d'activation en elle-même ou pendant la purification et/ou le stockage du produit activé (FVIIa). Le brevet EP 0 370 036 concerne un FVII/VIIa modifié sur des résidus lysine, arginine, isoleucine et/ou tyrosine impliqués dans le clivage atypique du FVII/VIIa afin de diminuer les clivages atypiques du FVII/VIIa et obtenir ainsi un FVII/VIIa plus stable. Néanmoins ce brevet ne résout que partiellement le problème de l'obtention d'un FVII/VIIa plus stable puisqu'il n'aborde pas le problème de l'altération de la conformation du FVII/VIIa lié à la modification des acides aminés impliqués dans le clivage atypique. Ce brevet ne décrit ni ne suggère l'obtention d'un FVII/VIIa modifié au niveau de sites de clivage atypique dont la conformation n'est pas ou peu altérée par la modification de la séquence en acides aminés.

En dépit de l'existence de documents relatifs à des FVII/VIIa humains modifiés, notamment au niveau de sites de clivage atypique, il existe encore un grand besoin de nouveaux FVII/VIIa humains aux propriétés améliorées.

RESUME DE L'INVENTION L'invention a pour objet des facteurs FVII/VIIa possédant une haute stabilité, modifiés sur au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315, lesdits résidus d'acides aminés étant (i) substitués par un résidu d'acide aminé distinct ou (ii) supprimés.

L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques codant les facteurs FVII/FVIIa modifiés ci-dessus, des vecteurs recombinants dans lesquels sont insérés lesdits acides nucléiques, des cellules hôtes transformées avec lesdits acides nucléiques ou lesdits vecteurs recombinants et des organismes génétiquement modifiés exprimant lesdits facteurs FVII/VIIa modifiés.

L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un facteur FVII/FVIIa modifié défini ci-dessus. L'invention a également trait à l'utilisation des facteurs FVII/VIIa modifiés ci-dessus pour la fabrication de médicaments, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits facteurs FVII/VIIa modifiés.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions natives montrant les séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.

Figure 2 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions réductrices montrant les séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.

Figure 3 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant la lysine 38 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une 30 glutamine en position 38 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos).

Figure 4 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant l'arginine 290 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une glutamine en position 290 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos). 35 Figure 5 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant l'arginine 315 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une glutamine en position 315 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos).

DESCRIPTION DE L'INVENTION Des nouveaux facteurs FVII/VIIa modifiés sont fournis par la présente invention, qui possèdent une haute stabilité, à la fois (i) au cours de la durée de stockage et (ii) in vivo après leur administration aux patients. La Demanderesse a montré que, de manière surprenante, certaines mutations des résidus d'acides aminés lysine 38 (Lys 38, K38), arginine 290 (Arg290, R290) et arginine 315 (Arg315, R315) dans la séquence d'acides aminés du FVII/FVIIa humain naturel n'altérent pas ou peu la conformation du FVII/VIIa humain ainsi modifié, par rapport à un FVII/VIIa humain naturel. De plus, la Demanderesse a montré qu'un FVII/VIIa modifié selon l'invention, dont la conformation tridimensionnelle est très proche, et parfois identique, à la conformation tridimensionnelle du FVII/FVIIa humain naturel, possède des propriétés améliorées, y compris un taux de clivage atypique diminué, de meilleurs rendements de production, une clairance diminuée et une stabilité accrue comparativement à un de FVII/VIIa humain naturel, tout en conservant une conformation proche de celle du FVII/VIIa humain naturel. Par clivages atypiques, on désigne toutes coupures de liaisons peptidiques, hors clivage du site d'activation (coupure de la liaison Arg152-I1e153), intervenant sur la molécule de FVII ou FVIIa. Ces coupures atypiques concernent en particulier les acides aminés lysine 38 (liaison lysine38-leucine39), arginine 290 (liaison arginine290-glycine291) et arginine 315 (liaison arginine315-lysine316) et provoquent des modifications de structures se traduisant par une altération des propriétés pharmacocinétiques du FVII/VIIa.

Par rendement de production, on désigne la quantité de FVII/VIIa structurellement conforme et actif produit par volume de fermenteur (ou bio-réacteur) ou par volume de lait issu d'animaux transgéniques ou par masse d'une quelconque bio-masse (cellules animales, végétales, bactériennes ou d'insectes). Le coût de production d'un FVII/VIIa muté de la sorte est donc significativement plus faible qu'un FVII/VIIa dont la séquence primaire est identique à la séquence du FVII/VIIa humain natif. Par clairance, on désigne la fraction d'un volume théorique totalement épuré, c'est-à-dire ne contenant plus le FVII/VIIa par unité de temps. La clairance d'un FVII/FVIIa représente un coefficient d'épuration plasmatique. Cela correspond à la capacité d'un organe à éliminer totalement le FVII/FVIIa d'un volume donné de plasma artériel par unité de temps. La clairance du FVII/FVIIa est le volume apparent (virtuel) de plasma artériel totalement débarrassé du FVII/FVIIa donnée par unité de temps. Par stabilité, on désigne l'aptitude du FVII/VIIa à conserver ses propriétés chimiques, physiques, structurales, conformationnelles et/ou biopharmaceutiques pendant toute sa durée de validité. Par conformation, on désigne la structure tertiaire d'une protéine, c'est à dire le repliement de la chaîne polypeptidique dans l'espace. On parle également de structure tridimensionnelle, ou structure 3D. La conformation d'une protéine est intimement liée à son activité biologique, ainsi lorsque cette structure est altérée la protéine perd son activité biologique, elle est dénaturée. Par altération de la conformation, on désigne donc toute modification de la structure tridimensionnelle d'une protéine entraînant une perte de l'activité biologique de ladite protéine. L'activité biologique du FVII/VIIa de l'invention peut être quantifiée en mesurant la capacité du FVII/VIIa à induire la coagulation sanguine au moyen d'un plasma déficient en FVII et de la thromboplastine, comme par exemple décrit dans le brevet US 5,997,864. Dans le test décrit dans le brevet US 5,997,864, l'activité biologique est exprimée par une réduction du temps de coagulation par rapport à l'échantillon contrôle, et est convertie en unités de FVII/VIIa par comparaison avec un standard de sérum humain contenant 1 unité/ml d'activité de FVII/VIIa. Le FVII/VIIa de l'invention possède des caractéristiques de modifications post- traductionnelles similaires à celle du FVII/VIIa humain natif mais peut également posséder des modifications post-traductionnelles différentes de celles du FVII/VIIa humain natif plasmatique de manière à améliorer ses propriétés chimiques, physiques, structurales, conformationnelles et/ou biopharmaceutiques. Dans son aspect le plus large, l'invention a pour objet un FVII/VIIa humain modifié par rapport à la séquence peptidique du FVII/VIIa humain natif dont au moins deux acides aminés sélectionnés parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315 sont substitués ou délétés, caractérisé en ce que : (i) la lysine 38 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine ou l'acide glutamique ; (ii) l'arginine 290 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique, et/ou (iii) l'arginine 315 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le FVII/VIIa contient au moins deux substitutions choisies parmi la lysine 38 substituée par une glutamine, l'arginine 290 substituée par une glutamine et l'arginine 315 substituée par une glutamine. Dans un premier mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/VIIa contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 290.

Dans un deuxième mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/VIIa contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 315. Dans un troisième autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/VIIa contient une mutation sur la l'arginine 290 et l'arginine 315. Dans un quatrième mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/VIIa contient une mutation sur la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la lysine 38 est substituée par une glutamine, l'arginine 290 est substitué par une glutamine et l'arginine 315 est substitué par une glutamine. Le FVII/VIIa de la présente invention peut être produit en utilisant les technologies de l'ADN recombinant (ou de recombinaison génétique). En règle générale, la séquence nucléique d'un acide nucléique (ADN ou ARN) codant un FVII/VIIa humain natif est modifiée afin de coder la protéine désirée, en particulier un FVII/FVIIa modifié selon l'invention. L'acide nucléique ainsi modifié peut être ensuite inséré dans un vecteur d'expression, lequel vecteur d'expression est ensuite utilisé pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain natif ou naturel est illustré par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 . Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un acide nucléique codant pour un FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.. Un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain modifié selon l'invention peut être produit ou synthétisé en utilisant l'une quelconque des techniques conventionnelles faisant partie des connaissances générales de l'homme du métier. A titre illustratif, un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain modifié conforme à l'invention peut être fabriqué par recombinaison génétique à partir de l'acide nucléique codant le FVII/VIIa humain natif. De préférence, l'acide nucléique codant le FVII/VIIa humain modifié est obtenu par mutagenèse dirigée à partir de l'acide nucléique codant pour le FVII/VIIa humain natif. Des techniques de mutagenèse dirigée sont bien connues de l'homme du métier et permettent d'obtenir un ADN codant pour le FVII/VIIa humain modifié désiré. On peut notamment mettre en oeuvre des techniques de mutagenèse dirigée qui sont identiques ou dérivées de la technique de mutagenèse dirigée décrite par Michael Smith en 1978 (Smith et al. ; Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence ; J Biol Chem. (1978) Sep 25;253(18):6551-60). Avantageusement, le FVII/VIIa de l'invention est un polypeptide dont au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine 38, arginine 290 et arginine 315 du FVII humain natif de séquence SEQ ID N 2 sont mutés par des acides aminés choisis à dessein, ou bien sont délétés.

Dans un mode de réalisation particulier, le FVII/VIIa modifié de l'invention peut être obtenu à partir d'un variant du FVII/VIIa humain natif, dans la mesure où ce variant n'est pas plus immunogène que le FVII/VIIa humain natif. Ainsi, la séquence peptidique de ce variant peut posséder au moins 70% d'identité, et de manière avantageuse au moins 80% ou 90%, et de manière encore plus avantageuse au moins 99% d'identité en acides aminés avec la séquence peptidique du FVII humain natif et comprenant dont au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine 38, arginine 290 et arginine 315, selon la numérotation en acides aminés du FVII humain natif de séquence SEQ ID N 2 sont mutés par des acides aminés choisis à dessein, ou bien sont délétés.. Un tel variant possède essentiellement la même ou une meilleure activité biologique que le FVII/VIIa humain natif.

Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels [Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) et Uracile (U)]. Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases , complémentaires sont A avec T (ou A avec U), et C avec G. Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence. Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 % d'identité avec un second polypeptide de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, ou entre deux séquences d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique, ou de la séquence d'acides aminés, dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gags ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique, ou un acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides, ou en acides aminés, des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière 20 informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) 25 KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS = default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP 30 DISTANCES = bide . La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention. Le vecteur d'expression utilisé dans la présente invention peut contenir un promoteur capable de diriger la transcription de l'acide nucléique codant le FVII/VIIa de l'invention. Des 35 promoteurs largement utilisés dans le cadre de cultures de cellules de mammifère comprennent des promoteurs viraux et des promoteurs cellulaires bien connus dans l'état de la technique. Le vecteur d'expression peut également contenir des sites d'épissage situés en aval du promoteur et en amont du site d'insertion de la séquence ADN codant pour un FVII/VIIa de la présente invention. Le vecteur d'expression peut également contenir une séquence de polyadénylation située en aval du site d'insertion de la séquence ADN codant pour le FVII/VIIa de la présente invention. Le vecteur d'expression peut également contenir tout type de séquence ADN utile pour l'expression, la sélection et/ou l'insertion du FVII/VIIa, de la séquence ADN codant pour le FVII/VIIa de la présente invention et/ou du vecteur d'expression contenant la séquence ADN codant pour le FVII/VIIa de la présente invention.

Un objet supplémentaire de la présente invention concerne une cellule transformée pour produire un FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention. Ces cellules transformées sont fabriquées en transférant un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention dans le génome d'une cellule hôte, de préférence afin de faire exprimer cette séquence ADN par la cellule ainsi transformée. Des techniques appropriées pour la transformation de cellules sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques comprennent et sans s'y limiter l'utilisation de liposomes, l'utilisation du polyéthylène glycol (PEG), l'utilisation de DEAE-dextran, l'utilisation du phosphate de calcium, l'utilisation de virus (principalement les rétrovirus), l'utilisation d'un canon à ADN, la fusion cellulaire, la microinj ection, l' électroporation etc. L'invention concerne donc également une cellule transformée par un acide nucléique codant un FVII/VIIa humain modifié défini ci-dessus et exprimant ledit facteur VII/VIIa humain modifié. Préférentiellement, ladite cellule transformée consiste en une cellule transformée de mammifère, et en particulier une cellule transformée d'un rongeur, d'un bovin, d'un caprin, d'un porcin, d'un primate non humain ou encore d'une cellule humaine.

Le FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention peut être obtenu à partir d'une cellule transformée selon la présente invention et mise en culture. A titre d'exemple, on peut citer les cellules suivantes : BHK (Baby Hamster Kidney) et notamment BHK tk-ts13 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) and DUKX cells (CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980), cellules YB2/0, cellules 3T3, cellules Namalwa, ou des cellules BHK adaptées à la culture sans sérum (Document US 6,903,069).

La présente invention concerne également un organisme génétiquement modifié pour produire un facteur VII/VIIa humain modifié selon la présente invention. Selon la définition donnée par l'Union Européenne, un organisme génétiquement modifié est un organisme (à l'exception des êtres humains) dont le matériel génétique a été modifié d'une manière qui ne peut s'effectuer naturellement par multiplication et/ou par recombinaison. En ce qui concerne la présente invention, un organisme génétiquement modifié intègre la séquence ADN codant pour un FVII/VIIa de la présente invention et exprime ladite séquence ADN du FVII humain modifié de manière à produire ledit FVII/VIIa humain modifié de la présente invention. L'organisme génétiquement modifié est un microorganisme, un animal ou un végétal. L'invention concerne donc aussi un organisme génétiquement modifié comprenant dans son génome un acide nucléique codant un facteur VII/VIIa humain modifié tel que défini dans la présente description, et exprimant ledit facteur VII/VIIa humain modifié. Un microorganisme est un organisme microscopique, il peut s'agir d'une bactérie, d'une levure ou d'un virus. La bactérie peut être, par exemple, Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 ; EP 0 036 259 et EP 0 063 953; WO 84/04541) Escherichia coli (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP 0 036 776, EP 0 136 829 et EP 0 136 907) Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655] ; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655) ; Streptomyces lividans (US 4,745,056). La levure peut être, par exemple, Candida (Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141) ; Hansenula (Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302) ; Kluyveromyces (Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135) ; Pichia (Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; U.S. Pat. Nos. 4,837,148 and 4,929,555) ; Saccharomyces (Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163) ; Schizosaccharomyces (Beach and Nurse (1981) Nature 300:706) Yarrowia (Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49). Le virus utilisé peut être, par exemple, un rétrovirus comme Avian Leukosis Virus, Bovine Leukemia Virus, Murine Leukemia Virus, Mink-Cell Focus-Inducing Virus, Murine Sarcoma Virus,Reticuloendotheliosis Virus et Rous Sarcoma Virus. Un animal selon la présente invention est un organisme vivant pluricellulaire, eucaryote, dépourvus de chloroplastes et non humain. Dans un mode de réalisation préféré, l'organisme génétiquement modifié utilisé dans la présente invention est un mammifère, de préférence une lapine. Avantageusement, le FVII/VIIa humain modifié de la présente invention peut être produit dans les glandes mammaires d'un mammifère, de préférence une lapine, sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression dudit FVII/VIIa dans le lait de ladite lapine. Une méthode de production d'un FVII/VIIa recombinant ou transgénique dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant pour le FVII/VIIa humain modifié selon l'invention, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP)est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors ledit FVII/VIIa recombinant ou transgénique. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique). Ces procédés de préparations sont applicables à l'invention en utilisant l'ADN du FVII/VIIa modifié selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier, l'organisme génétiquement modifié est un 30 insecte, par exemple un moustique, une mouche etc. Par FVII/VIIa recombinant ou transgénique , on désigne tout FVII/VIIa obtenu à partir d'une cellule transformée ou d'un organisme génétiquement modifié, c'est à dire à partir d'un microorganisme, d'un animal ou d'un végétal. Par opposition, le FVII/VIIa de l'invention n'est pas un FVII/VIIa plasmatique, c'est-à-dire qu'il n'est pas un produit purifié à partir de plasma 35 humain ou animal.

Ainsi, le FVIUVIIa de l'invention est issu de la transcription puis de la traduction d'une molécule d'ADN codant pour un FVII modifié selon l'invention et produit par une cellule, un microorganisme, un animal ou un végétal transgénique. Ainsi le FVIUVIIa recombinant ou transgénique de l'invention peut être obtenu au moyen de techniques standard, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une protéine dans un système biologique. La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un FVIUVIIa humain modifié selon la présente invention comprenant les étapes suivantes : a) transformation d'une cellule avec un acide nucléique codant pour un FVIUVIIa humain modifié tel que défini dans la présente description, b) mise en culture de la cellule obtenue à l'étape a) de manière à ce que la cellule exprime ledit facteur VIUVIIa, et c) purification du facteur VIUVIIa humain modifié exprimé par la cellule transformée mise en culture à l'étape b). La cellule transformée est mise en culture dans un milieu approprié lui permettant d'exprimer le FVIUVIIa. Les milieux de cultures utilisés sont choisi à dessein par l'homme du métier en fonction des cellules cultivées. Des milieux appropriés pour la culture cellulaire comprennent l'IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), le DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), le RPMI 1640 ou autres. Ces milieux de culture sont composées pour l'essentiel de sels inorganiques, d'acides aminés, de vitamines et d'autres composants, notamment le glucose pour son apport énergétique et 1'HEPES pour son pouvoir tampon, des compléments de base tels que notamment des acides aminés, des minéraux, des éléments traces, des compléments moléculaires spécifiques de la croissance et des activités métaboliques pour chaque type cellulaire cultivé etc. La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un FVIUVIIa 25 humain modifié selon la présente invention dans le lait d'un mammifère transgénique, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un mammifère transgénique qui exprime dans ses glandes mammaires un acide nucléique codant un facteur VIUVIIa humain modifié selon la présente invention, b) collecter le lait du mammifère transgénique qui contient le facteur VIUVIIa, 30 c) purifier le facteur VIUVIIa humain modifié à partir dudit lait collecté. Avantageusement, le mammifère transgénique peut être une souris, une rate, une lapine ou une chèvre. De préférence le mammifère transgénique est une lapine. L'obtention d'un mammifère transgénique peut se faire par des méthodes classiques, comme par exemple microinjecter un embryon d'un mammifère avec une séquence ADN codant 35 pour un FVIUVIIa humain modifié selon la présente invention, placer ledit embryon microinjecté dans la lumière de l'oviducte d'une femelle de mammifère de la même espèce, attendre la naissance des petits mammifères issus de l'embryon microinjecté, vérifier si l'animal transgénique exprime bien le FVII/VIIa humain modifié dans son lait. Le FVII/VIIa de la présente invention peut être purifié par des procédés de purification bien connus de l'homme du métier, comprenant, mais sans s'en limiter, la chromatographie (échangeuse d'ion, d'affinité, hydrophobe, d'exclusion par la taille), les techniques électrophorétiques comme le preparative isoelectric focusing (IEF), la différence de solubilité (précipitation au sulfate d'amonium) ou l'extraction (Protein Purification J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York (1989)). De préférence, le FVII/VIIa de l'invention peut être purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne contenant des anticorps anti-FVII ou sur une colonne contenant des aptamères anti-FVII. Une purification additionnelle peut être réalisée par des techniques conventionnelles de purification chimique, comme 1'HPLC (High performance liquid chromatography). D'autres procédés de purification, dont la précipitation au citrate de barium, sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés pour la purification du FVII/VIIa de l'invention. Le terme "anticorps" tel qu'utilisé ici se réfère à une immunoglobuline ou une portion immunologiquement active de celle-ci, par exemple la région liant un antigène. Un anticorps fait donc référence à une protéine comprenant au moins une, et de préférence deux, chaîne lourde et au moins une, de préférence deux chaines légères.

Par aptamère, on désigne une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) ayant une structure tertiaire qui lui permet de lier spécifiquement une protéine (Osborne, et al. (1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1: 5-9; and Patel, D. J. (1997) Curr Opin Chem Biol 1:32-46) Un autre objet de la présente invention concerne une composition de FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention.

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant un FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique de la présente invention peut être utilisée pour une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique et/ou thérapeutique.

Ainsi le FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques de FVII/VIIa humain modifié selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007. Le FVIUVIIa humain modifié selon la présente invention et les compositions pharmaceutiques de celui-ci sont particulièrement utiles pour la fabrication d'un médicament. En particulier le FVIUVIIa humain modifié selon la présente invention et les compositions pharmaceutiques de celui-ci sont utiles pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des désordres de la coagulation chez un patient. Comme désordre de la coagulation traité par une composition pharmaceutique selon la présente invention on peut citer de manière non exhaustive les traumatismes hémorragiques multiples, comme par exemple l'hémophilie A et B ou les hémorragies causées par un surdosage d'anticoagulant. Le FVIUVIIa humain modifié selon l'invention peut être utilisé seul ou en combinaison 20 avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives.

EXEMPLES Exemple 1 : Etablissement du modèle tridimensionnel du FVII humain Le modèle tridimensionnel du FVII humain a été construit à partir d'une étude exhaustive 25 de l'ensemble des structures cristallisées disponibles au sein de la Protein Data Bank (pdb). Ce sont 27 structures de FVII qui ont été analysées vis à vis de divers paramètres comme le système d'expression, l'intégrité des chaînes lourde et légère, la présence du facteur tissulaire, la résolution, la présence des O- et N-glycosylations, la présence des y-carboxylation et la date de publication à la banque de donnée protéique (pdb). A partir de cette étude, la structure protéique 30 a été construite après corrections, assemblage et minimisation des structures. La suite logicielle utilisée est Sybyl v7.2 (Tripos, Inc.). Sybyl est un logiciel de modélisation basé sur la minimisation de l'énergie totale permettant ainsi de définir la structure la plus stable et donc la plus probable. L'étape de minimisation globale comprenant la fixation du BackBone de la protéine en simulant la présence de facteur tissulaire, a été réalisée dans les conditions suivantes 35 - paramètre d'arrêt : gradient d'énergie < 0,5 kCal/mol ou nombre d'itérations maximum atteint = 10000 - méthode de minimisation : Powell - champ de force : Amber7FF99 - méthode de calcul des charges pour la glycoprotéine : Amber7FF99, - méthode de calcul des charges pour les ions et l'inhibiteur du site actif : Gasteiger-Hückel - non-bonded cutoff : 8 À.

Exemple 2 : Extraction et purification du FVII obtenu dans du lait de lapine transgénique a) Extraction du FVII Un volume de 500 ml de lait brut non écrémé a été dilué par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en FVII a été centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 15 C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC û 6700 tours/min û rotor SLC-6000). 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires. Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium). La phase aqueuse non lipidique FVII a été collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse a été collectée à part. La phase solide (précipité) a été éliminée. La phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles quantités de lipides, a été filtrée sur une séquence de filtres (Pall SLK7002UO10ZP û préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 m -puis Pall SLK7002NXP û Nylon 66 de taille de pores de 0,45 m). En fin de filtration, la phase lipidique a été passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair. La phase aqueuse non lipidique filtrée a ensuite été dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa û 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.

On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi en FVII-tg. Cette préparation est stockée à -30 C avant la poursuite du procédé. La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques qui font suite. Environ 93 000 UI de FVII-tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de cette préparation est de l'ordre de 0,2%.

b) Purification du FVII 1. Chromatographie sur gel d'hydroxyapatite Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre ù 64 cm' de section) a été remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I). Le gel a été équilibré en tampon A constitué d'un mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à ù 30 C est décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon puis a été injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105 ml/min). La fraction non-retenue a été éliminée par passage d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB). L'élution de la fraction contenant le FVII a été faite par le tampon B constitué de 20 phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée a été collectée jusqu'au retour à la ligne de base. Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A.S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII de pureté de 4% sont disponibles à ce stade. 25 2. Filtration tangentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa La totalité de l'éluat de l'étape précédente a été filtrée en mode tangentiel sur une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (Pall OMEGA SC 100K ù 0,1 m2). Le FVII a été filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa 30 ne sont pas filtrables. La fraction filtrée a été ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. A ce stade du procédé, le produit est stocké à -30 C avant passage en chromatographie 35 d'échange d'ions.

Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes. Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII, soit 82 000 UI de FVII.

Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales.

3.Chromatographies sur gel Q-Sepharose FF Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-Sepharose Fast 10 Flow (QSFF) ont été réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer et formuler la composition en FVII.

3.1 Etape Q-Sepharose FF 1 û élution High Calcium Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm' de section) a été remplie de 100 ml de gel 15 Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La totalité de fraction conservée à -30 C a été décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction a été diluée au 1/2 [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de 150 cm/h), puis 20 la fraction non retenue a été éliminée par passage du tampon jusqu'au RLB. Une première fraction protéique à faible teneur en FVII a été éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et a été ensuite éliminée. Une deuxième fraction protéique riche en FVII a été éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) 25 par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH 7,5. Cette deuxième fraction a été dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction a été conservée à +4 C durant une nuit avant le 2ème passage en chromatographie d'échange d'anions. Cette étape 30 permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI de FVII), tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes. Elle permet également l'activation du FVII en FVIIa.

3.2 Etape Q-Sepharose FF 2 û élution Low Calcium Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm' de section) a été remplie de 30 ml de gel 35 Q-Sepharose FF (GE Healthcare).

Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée précédente (deuxième fraction), conservée à +4 C, a été diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h). Une fraction contenant du FVII de très haute pureté a été éluée à 4,5 ml/min (soit 50 5 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,5. Environ 23 000 UI de FVII ont été purifiées, soit 12 mg de FVII. Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine). 10 Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches de celle du FVII humain natif. Il a été concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions.

3.3 Etape Q-Sepharose FF 3 û élution Sodium 15 Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm' de section) a été remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée purifiée de l'étape précédente a été diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 20 50 cm/h). Le FVII a été ensuite élué à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0. Une composition de FVII sous forme de concentré a été préparée dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le 25 procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en oeuvre. Les FVII peuvent ensuite être soumis à différentes analyses structurales, telles que développées dans les exemples qui suivent.

30 Exemple 3 : identification des clivages atypiques du FVII par MALDI-TOFMS La spectrométrie de masse MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry) est une technique permettant de mesurer la masse moléculaire des molécules avec une grande précision. Les protéines à analyser ont été mélangés à une matrice qui absorbe à la longueur d'onde 35 du laser utilisé. Les principales matrices sont l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) pour l'analyse des peptides, l'acide sinapinique (SA) pour les protéines et l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) pour les oligosaccharides. La méthode consiste à irradier les co-cristaux matrice/analyte à l'aide d'un laser, ceci entraînant la désorption conjointe des molécules de matrice et d'analyte. Après ionisation en phase gazeuse, les molécules d'analyte atteignent un détecteur de temps de vol. Masse et temps de vol étant directement liés, la mesure de ce dernier permet la détermination de la masse de l'analyte. L'identification de chaque protéine ou peptide peut être réalisée par mesure de sa masse observée en spectrométrie de masse, par comparaison avec la masse théorique déduite de la séquence du FVII. L'instrument utilisé est un Bruker Autoflex II fonctionnant dans les modes TOF et TOF/TOF. Le spectre MALDI-TOF du FVII montre une forme à 14.7 kDa (figure 1, polypeptide IV) qui correspond au peptide [G1y291-Pro406] C-terminal de la chaîne lourde contenant l'Asn322 glycosylée majoritairement par un oligosaccharide de type bianténné monosialylé (Al) et d'autres glycannes (A1F, A2, ...). On observe également sur le spectre la présence de la forme complémentaire (figure 1, polypeptide IV), N terminale du FVII, à 34.6 kDa se terminant par l'arginine 290. Un autre clivage atypique est également présente à 44.8 kDa (figure 1, polypeptide II) qui correspond à la coupure de la chaîne légère après la lysine 38, c'est-à-dire à une forme de FVII amputée du domaine Gla et donc dont l'affinité pour le facteur tissulaire est diminuée.

En conditions réductrices (figure 2) on note la présence des chaînes lourde et légère du FVIIa à 29.9 et 19.3 kDa (polypeptide I), respectivement. Une autre forme est observée à 11.9 kDa correspondant au peptide [Lys316- Pro406] contenant l'Asn322 glycosylée. A l'état natif, ce peptide est lié à la partie N-terminale de la protéine par un pont disulfure (Cys310-Cys329). Tous les échantillons de FVII analysés présentent une ou plusieurs de ces formes tronquées. L'ensemble des formes identifiées résultent de coupures de type "sérine protéase". Ces différents clivages peuvent donc être d'origine autocatalytique.

Exemple 4 : Quantification des clivages atypiques par séquençage d'Edman Le séquençage N-terminal du FVII a été réalisé sur microséquenceur (Procise 491 HT ; Applied Biosystem) selon le principe de la dégradation chimique d'Edman qui consiste en trois étapes : couplage û clivage et conversion puis séparation des acides aminés générés sur colonne en phase inverse. Les acides aminés N-terminaux ainsi générés sont ensuite analysés et identifiés par l'intermédiaire d'acides aminés standards et comparés à la séquence théorique de la protéine étudiée. L'exploitation des résultats a été effectuée après acquisition des données et analyse par comparaison avec un chromatogramme d'acides aminés standards (SequencePro Applied Biosystems). La séquence de FVII analysée a été comparée à la séquence théorique en acides aminés.

2 séquences majoritaires ont été identifiées systématiquement : - séquence N terminale LC : ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSF (SEQ ID N 3) - séquence N terminale HC : IVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCG (SEQ ID N 4)

3 autres séquences, présentes selon les produits, ont été identifiées : -séquence LC : LFWISYSDGDQ (SEQ ID N 5) (clivage atypique après la lysine 38). - séquence HC : GATALELMVLNVPRLMTQ (SEQ ID N 6) (clivage atypique après l'arginine 290). - séquence HC : KVGDSPNITEYMFCAGYSDGS (SEQ ID N 7) (clivage atypique après l'arginine 315). Les acides aminés représentés en gras et italique indiquent des trous de séquence, c'est à dire des acides aminés non identifiés en séquençage d'Edman du fait de la présence de modifications post-traductionnelles telles que les y-carboxylation, N- ou 0-glycosylation. Une évaluation quantitative a été réalisée afin d'estimer la proportion des différentes coupures atypiques en fonction des FVII. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1. Pourcentages des différentes coupures atypiques comparativement à la totalité du produit, en fonction des origines du FVII. FVII-pd : FVII humain plasmatique ; FVII-Tg : FVII humain non muté transgénique ; FVII-rec : FVII humain recombinant commercial (non muté) Séquence FVII-pd (%) FVII-Tg lot A FVII-Tg lot B FVII-rec (%) (%) (%) K316VGDSP...

27 17 52 9 G291ATALEL 8.5 8 13 4 L39FWISYS... 12 26 8 4.5 La chaîne légère du FVII présente un taux de clivage atypique entre les acides aminés K38 et L39 variant entre 4,5 et 26% suivant l'origine du produit. La chaîne lourde du FVII présente une coupure atypique entre R315 et K316 (variant entre 9 et 52% suivant l'origine du produit) et est également clivée entre R290 et G291 (variant entre 4 et 13% suivant l'origine du produit) . 21

Claims (26)

REVENDICATIONS

1. Facteur VII/VIIa humain modifié par rapport à la séquence peptidique du facteur VII/VIIa humain natif dont au moins deux acides aminés sélectionnés parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315 sont substitués ou délétés, caractérisé en ce que : ladite lysine 38 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine ; ladite arginine 290 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine et/ou Ladite arginine 315 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine.

2. Facteur VII/VIIa humain modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lysine 38 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine ou l'acide glutamique.

3. Facteur VII/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'arginine 290 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.

4. Facteur VII/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'arginine 315 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.

5. Facteur VII/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lysine 38 est substituée par une glutamine.

6. Facteur VII/VIIa humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'arginine 290 est substituée par une glutamine.

7. Facteur VII/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'arginine 315 est substituée par une glutamine.

8. Acide nucléique codant un facteur VII/VIIa humain modifié défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7.

9. Vecteur d'expression dans lequel est inséré un acide nucléique selon la revendication 8.

10. Cellule transformée par un acide nucléique selon la revendication 8 exprimant un facteur VII/VIIa humain modifié.

11. Organisme non humain génétiquement modifié comprenant dans son génome un acide nucléique codant un facteur VII/VIIa humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et exprimant ledit facteur VII/VIIa humain modifié.

12. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un microorganisme, un animal ou un végétal.

13. Organisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un mammifère.

14. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit mammifère est une lapine.

15. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un insecte.

16. Procédé de fabrication d'un facteur VII/VIIa défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant les étapes suivantes : a) transformation in vitro d'une cellule avec un acide nucléique codant pour un FVII/VIIa humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, b) mise en culture de la cellule obtenue à l'étape a) de manière à ce que la cellule exprime ledit facteur VII/VIIa, et c) purification du facteur VII/VIIa humain modifié exprimé par la cellule transformée mise en culture à l'étape b).

17. Procédé de fabrication d'un facteur VII/VIIa humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans le lait d'un mammifère non humain transgénique, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un mammifère transgénique qui exprime dans ses glandes mammaires un acide nucléique codant un facteur VII/VIIa humain modifié selon l'une des revendicatins 1 à 7, b) collecter le lait du mammifère transgénique qui contient le facteur VII/VIIa, c) purifier le facteur VII/VIIa humain modifié à partir dudit lait collecté.

18. Procédé de fabrication selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'animal transgénique est choisi parmi une souris, une rate, une chèvre et une lapine.

19. Procédé de fabrication selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'animal transgénique est une lapine.

20. Composition de facteur VII/VIIa, caractérisée en ce que ladite composition contient un facteur VII/VIIa humain modifié défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7.

21. Composition pharmaceutique comprenant un facteur VII/VIIa humain modifié tel que défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7, et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

22. Utilisation d'un facteur VII/VIIa selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament.

23. Utilisation d'un facteur VII/VIIa selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des désordres de la coagulation.

24. Utilisation d'un facteur VII/VIIa selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des traumatismes hémorragiques multiples.

25. Utilisation d'un facteur VII/VIIa d'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hémophilie.

26. Utilisation d'un facteur VII/VIIa d'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémorragies causées par un surdosage d'anticoagulant.