WO2008015339A2 - Composition de facteur vii recombinant - Google Patents

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WO2008015339A2
WO2008015339A2 PCT/FR2007/001324 FR2007001324W WO2008015339A2 WO 2008015339 A2 WO2008015339 A2 WO 2008015339A2 FR 2007001324 W FR2007001324 W FR 2007001324W WO 2008015339 A2 WO2008015339 A2 WO 2008015339A2
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Abdessatar Sami Chtourou
Emmanuel Nony
Nicolas Bihoreau
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Definitions

  • Factor VII is a vitamin K-dependent glycoprotein that, in its form. activated
  • FVIIa participates in the coagulation process by activating factor X and factor IX in the presence of calcium and tissue factor.
  • FVII is secreted as a single peptide chain of 406 residues, which has a molecular weight of about 50 kDa.
  • FVII has four distinct structural domains: the N-terminal ⁇ -carboxylic (GI) domain, two epidermal growth factor (EGF) -like domains, and a serine protease domain.
  • the activation of FVII in FVIIa is characterized by the cleavage of the Argi 52 -Ilei53 (Arginine 152-Isoleucine 153) linkage.
  • FVIIa is therefore composed of a light chain of 152 amino acids with a molecular weight of approximately 20 kDa and a heavy chain of 254 amino acids with a molecular mass of approximately 30 kDa linked together by a single disulfide bridge (Cysi 35 -Cys 2 62) •
  • Plasma FVIIa (FVIIa, p) has several post-translational modifications: the first ten glutamic acids are ⁇ -carboxylated, Asp 63 (aspartic acid) is partially hydroxylated, Sers 2 (Serine 52) and Ser ⁇ o (Serine 60 ) are O-glycosylated and bear respectively the units Glucose (Xylose) 0-2 and Fucose, Asni4 5 (Asparagine 145) and Asn 3 22 (Asparagine 322) are predominantly N-glycosylated by bisantiylated biantennary complexed glycan forms .
  • FVII is used in the treatment of hemophilia patients with factor VIII (haemophilia A) or factor IX deficiency
  • FVII Type B hemophilia
  • coagulation for example an inherited deficiency in FVII.
  • FVII is also recommended for the treatment of stroke. It is therefore necessary to have injectable FVIIa concentrates.
  • the oldest method of obtaining FVIIa concentrates was the purification of FVIIa from plasma proteins from fractionation.
  • PPSB prothrombin or FII
  • P proconvertin or FVII
  • S Stuart factor or FX
  • B antihemophilic factor B or FIX
  • EP 0 547 932 describes a method of manufacturing a high purity FVIIa concentrate essentially free of vitamin K dependent factors and FVIII.
  • the FVII obtained by this method despite its purity, has residual thrombogenic activity.
  • the human plasma FVII has complex post- translational modifications: the first ten glutamic acids are ⁇ -carboxylated, Asp 6 b 3 is partially-ydroxylé (aspartic acid 63) Ser 52 (Serine 52) and the Ser ⁇ o (Serine 60) are O-glycosylated and carry respectively the units Glucose (Xylose) 0-2 and Fucose, 1 Asni 45 (Asparagine 145) and Asn 32 2 (Asparagine 322) are predominantly N-glycosylated by forms of the type complex, bianten Amsterdams and bisialylées.
  • N-glycans glycans linked to 1-asparagine
  • bioactivity and pharmacokinetic properties bioavailability. for example
  • variations of all or part of the post-translational modifications expose, on the one hand, to the risk that the protein is not active, and, on the other hand, to the risk that it is immunogenic.
  • existing recombinant or transgenic FVIIs can exhibit, by their expression in systems different from human systems, a glycosylation which differs from the glycosylation of human plasma FVII, which can lead to the appearance of antibodies directed against the recombinant protein, and thereby less effective than human FVII purified from human plasma.
  • FVIIa the functional characteristics of which are similar to human FVII purified from human plasma, and whose mode of production is compatible with the need for large quantities of this protein.
  • the invention relates to a recombinant or transgenic factor VII composition, each factor VII molecule of the composition comprising glycan forms linked to the N-glycosylation sites, characterized in that, among all the factor VII molecules of said composition, the biantennary, bisialylated and non-fucosylated glycan forms are in the majority with respect to all the glycan forms linked to the N-glycosylation sites of the factor VII of the composition.
  • a recombinant or transgenic FVII composition whose biantennary forms, bisialylated and non-fucosylated are the majority, has an increased bioavailability, a decreased clearance and an increased stability compared to a recombinant FVII composition. or transgenic whose rate of bisialylated forms is less, that is to say with respect to a recombinant or transgenic FVII composition whose majority of biantennary, monosialylated and nonfucosylated forms.
  • the FVII of the invention therefore makes it possible to envisage less frequent administrations to the patient, as well as lower doses compared to a recombinant or transgenic FVII composition whose rate of bisialylated forms is less, that is to say whose rate of monosilalylated forms is the majority.
  • bioavailability is meant the percentage of administered FVII diffusing into the bloodstream and therefore particularly likely to reach the bleeding site.
  • clearance denotes the fraction of a theoretical volume totally purified, that is to say no longer containing the FVII per unit of time. In other words, this corresponds to the hypothetical quantity of fluid that would be completely free of the substance in a unit time interval.
  • Stability refers to the ability of FVII to maintain its chemical, physical, microbiological and biopharmaceutical properties within specific limits throughout its lifetime.
  • biantennary, bisialylated and non-fucosylated glycan forms means the forms below:
  • Form A2 (biantennate, bisialylated and not fucosylated)
  • the FVII of the invention comprises, like the human FVII, two N-glycosylation sites, at position 145 and 322, and 2 O-glycosylation sites, at position 52 and 60.
  • Oligosaccharide chains are linked to asparagine (N-linked).
  • the oligosaccharide chains are linked to a serine.
  • Each FVII molecule of the invention therefore comprises two N-linked oligosaccharide chains.
  • the FVII molecules of the composition do not exhibit homogeneous glycosylation, i.e. all N-linked oligosaccharide chains are not identical to each other. It is a mixture of different forms of glycan.
  • any FVII is in the form of a mixture of several FVII proteins, these proteins differentiating among themselves in particular by their glycosylation and otherwise called glycoforms.
  • This glycosylation is due to post-translational processing carried out by the cell organelles during the transfer of the FVII protein between the different cell compartments.
  • This biochemical modification deeply modifies the protein, so that the final protein is perfectly structured and therefore both active and well tolerated by the body.
  • This chemical modification contributes to the regulation of the activity of the protein as well as to its location. It is therefore possible to quantify, for the entire composition, and therefore for all the N-linked oligosaccharide chains. of the composition of FVII, the level of each glycan form or of each sugar present in said composition.
  • FVII composition is meant a composition whose only molecular entity is FVII, preferably activated. Each FVII molecule of the composition has the same primary sequence, but glycosylation varies from one molecule to another.
  • FVII composition therefore designates a mixture of molecules with the same primary sequence, characterized by its contents in glycan forms.
  • FVII and “composition of FVII” are equivalent. Therefore, within the scope of the invention, the term “FVII” refers to either the FVII molecule as such, or a mixture of such molecules, having the stated characteristics.
  • the FVII composition of the invention is a composition of FVII whose biantennary, bisialylated and nonfucosylated glycan forms are the majority. This means that among the set of N-linked oligosaccharides of the composition, that is to say all glycan forms linked to N-glycosylation sites of factor VII, the biantennary, bisialylated and non-fucosylated forms are the most represented. .
  • the level of biantennary, bisialylated and non-fucosylated glycan forms is greater than or equal to 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 95%.
  • the level of biantennary, bisialylated and non-fucosylated glycan forms is greater than or equal to 45%.
  • the level of biantennary, bisialylated and non-fucosylated glycan forms is between 45% and 65%, and preferably between 50% and 60%.
  • the rates of sialylated species can be determined empirically by HPCE-LIF (High Performance Capillary-Laser Fluorescence Electrophoresis) and / or NP-HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analyzes with quantification by measurement of the area of the peaks corresponding to the different glycans, or by any other method known to those skilled in the art.
  • HPCE-LIF High Performance Capillary-Laser Fluorescence Electrophoresis
  • NP-HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the FVII composition of the invention may also comprise monosialylated and triantennary biantennary minority forms, as well as neutral forms, which do not have sialic acids.
  • recombinant or transgenic FVII any FVII derived from genetic engineering, that is to say produced by cells whose DNA has been modified by genetic recombination so as to express a molecule of FVII, and presenting the glycosylation characteristics stated.
  • the FVII of the invention is derived from the transcription and then the translation of a DNA molecule encoding FVII in a cellular host or by a transgenic animal.
  • the recombinant or transgenic FVII of the invention can be obtained using standard techniques, well known to those skilled in the art, allowing the expression of a protein in a biological system.
  • recombinant FVII means any FVII obtained by genetic recombination and expressed by a cultured cell line.
  • BHK Baby Hamster Kidney
  • BHK tk tsl3
  • COS-I ATCC CRL 1650
  • HEK293 ATCC CRL 1573, Graham et al., J. Gen.
  • the rate of bisialylated forms of FVII of the invention can be achieved in different ways.
  • the FVII of the invention is expressed in a microorganism, cell, plant or animal conferring the stated glycosylation characteristics, that is to say a majority of biantennal, bisialylated and nonfucosylated forms. .
  • the FVII of the invention is expressed in a microorganism, plant or animal that does not make it possible to obtain an FVII composition exhibiting a majority of bisialylated and nonfucosylated biantennary forms, the sialylation being carried out by subsequently in vitro, using one or more enzymes to confer the desired sialylation, that is to say that bianten Avenues and bisialylées forms become the majority and trianten Spirits forms become trisialylées.
  • a sialyltransferase in vitro, can be made to act on an FVII composition chosen for its advantageous properties under appropriate conditions to allow the desired sialylation.
  • the FVII composition of the invention is capable of being obtained by sialyltransferase on a partially sialylated FVII composition (starting FVII composition).
  • the starting FVII composition has predominantly monosialylated biantennary glycan forms.
  • the starting FVII composition has biantennary, monosialylated and nonfucosylated glycan forms predominant.
  • the action of the sialyltransferase makes it possible to graft an additional sialic acid onto the monosialylated forms, converting them to a bisialylated form.
  • these biantennary, monosialylated forms are present in the starting FVII composition at a level greater than 40%, particularly advantageously at a level greater than 50%, or even at 60%.
  • the starting composition has a level of biantennane, monosialylated and non-fucosylated glycan forms greater than 20%, or particularly preferably greater than 30%, 40% or even 50%.
  • the sialic acids of the starting FVII composition involve ⁇ 2-6 linkages.
  • the level of sialic acids involving ⁇ 2- ⁇ bonds is greater than 60%, or greater than 70%, 80%, or 90%. In particular, this rate is between 60% and 90%.
  • all the sialic acids of the starting FVII composition involve ⁇ 2-6 bonds.
  • the starting FVII composition comprises fucosylated forms in too large a proportion, for example greater than 50%, or even 60%, it is possible to obtain biantennary, bisialylated and nonfucosylated forms. using one or more enzymes to defucosylate the composition.
  • a fucosidase for a time necessary for obtaining predominantly biantennary, bisialylated and nonfucosylated glycannic forms.
  • the starting FVII composition is chosen for its low immunogenicity.
  • the starting composition is the composition of FVII described in document FR 06 04872, the content of which is considered to be included in the present document.
  • the FVII of the invention is a polypeptide whose peptide sequence may be that of natural human FVII, that is to say the sequence present in humans not exhibiting FVII-related disorders.
  • a sequence can be coded for example by the sequence Ib described in the document EP
  • sequence of the FVII of the invention is the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the FVII of the invention may be a variant of natural human FVII, since this variant is not more immunogenic than natural FVII.
  • the peptide sequence of this variant may have at least 70% identity, and advantageously at least 80% or 90%, and even more advantageously at least 99% identity with the sequence of natural human FVII. such a variant having essentially the same biological activity as natural FVII.
  • the FVII of the invention also refers to any modified FVII sequence so that the biological activity of the protein is reduced compared to the natural human FVII.
  • FVII inactivated FFR-FVIIa used for the treatment or prevention of thromboses (Holst et al, Eur J.Vasc.Endovasc.Surg., 1998 Jun, 15 (6): 515-520).
  • FVIIs are polypeptides having an amino acid sequence which differs from the natural FVII sequence by insertion, deletion or substitution of one or more amino acids.
  • the biological activity of the FVII of the invention can be quantified by measuring the ability of an FVII composition to induce blood coagulation by means of FVII deficient plasma and thromboplastin, as for example described in US Pat. 5997864.
  • the biological activity is expressed by a reduction of the coagulation time relative to the control sample, and is converted into "units of FVII" by comparison with a human serum standard (pool ) containing 1 unit (1 U of FVII activity) / ml of serum.
  • the FVII composition of the invention has glycosylation characteristics approximating that of plasma FVII. Indeed, the major N-glycans form of plasma FVII (or plasma FVII composition) is also the biantennary, bisialylated form.
  • the level of biantennary, bisialylated (fucosylated and non-fucosylated) forms of the FVII of the composition of the invention is greater than 30%, or 40% or 50%.
  • the rate of biantennal, bisialylated forms is greater than 60%, or 70%, or 80% or even 90%.
  • the level of bisialylated forms (fucosylated and non-fucosylated) is between 50% and 80%, or between 60% and 90%, or, preferably, between 70% and 85%.
  • the fucose content of the FVII composition of the invention is greater than 20%, and is advantageously between 20% and 50%. This rate corresponds to the fucose rate measured among all the glycan forms of the FVII of the composition.
  • the sialic acids of the factor VII composition of the invention involve ⁇ 2-6 linkages.
  • the level of sialic acids involving ⁇ 2-6 bonds is greater than 60%, or greater than 70%, 80%, or 90%. In particular, this rate is between 60% and 90%.
  • the FVII composition of the invention therefore comprises a non-zero level of sialic acid involving ⁇ 2-6 bonds. This is an advantage over commercial recombinant FVII, which contains only sialic acids involving ⁇ 2-3 bonds, whereas plasma FVII has them.
  • all the sialic acids of the FVII composition of the invention involve ' ⁇ 2-6 bonds.
  • all sialic acids involve ⁇ 2,6 bonds, i.e., all sialic acids are linked to galactose via a? 2,6 bond, and in particular at least 90%? sialic acids of FVII involve ⁇ 2,6 bonds.
  • the composition of FVII according to the invention may further comprise sialigic acids of ⁇ 2-3 bonds.
  • sialic acids of the FVII of the composition involve ⁇ 2, 6 branches is one of the advantages of the FVII of the invention. Indeed, the sialic acids of the commercially available recombinant FVII involve only ⁇ 2, 3 bonds. However, the plasma FVII is a mixture of these two isomers. Such plasma FVII contains, for example, 40% oc2,3 isomers and 60% 2,6-isomers. However, the latter has more ⁇ 2,6 bonds, which brings the FVII even closer to the invention of plasma FVII.
  • certain sialic acids of the FVII composition of the invention involve ⁇ 2-3 linkages.
  • the recombinant or transgenic FVII of the composition has biantennary, bisilalylated and nonfucosylated glycan forms predominant with respect to all the glycan forms linked to the factor VII N-glycosylation sites. and a sialic acid level involving cx2-6 bonds greater than 90%.
  • the recombinant or transgenic FVII of the composition has biantennary, bisilalylated and nonfucosylated glycan forms predominant with respect to all the glycan forms linked to the factor VII N-glycosylation sites, and a level of sialic acids involving ⁇ 2-6 bonds equal to 100%.
  • the recombinant or transgenic FVII of the composition has biantennary, bisilalylated and nonfucosylated glycan forms predominant in relation to all forms. glycans linked to the N-glycosylation sites of Factor VII, the fucose content of the FVII composition being between 20% and 50%.
  • the recombinant or transgenic FVII of the composition has biantennary, bisilalylated and nonfucosylated glycan forms predominant with respect to all the glycan forms linked to the N-glycosylation sites of factor VII, all sialic acids involving ⁇ 2-6 linkages, and the fucose content of the FVII composition being between 20% and 50%.
  • the FVII composition of the invention is capable of being produced by a transgenic non-human mammal.
  • transgenic mammal means any mammal with the exception of the human being, genetically manipulated to express an exogenous protein, for example the rabbit, the goat, the mouse, the rat, the cattle, the horse, the pig, the insects, sheep, this list is not limiting.
  • the exogenous protein is FVII, preferably human FVII.
  • the transgenic non-human mammal may, in addition to FVII, express an exogenous enzyme so as to impart the desired sialylation to the transgenic FVII composition.
  • the transgenic non-human animal can co-express the gene encoding FVII and the gene encoding a sialyltransferase.
  • the transgenic FVII of the invention is expressed in the mammary glands of the transgenic mammal and produced in its milk.
  • expression of the transgene is tissue-dependent, by means of a promoter ensuring the production of the transgene in the mammary glands. the animal.
  • WAP whey acidic protein
  • the casein promoter in particular the ⁇ -casein promoter or ⁇ -casein
  • the ⁇ -lactoglobulin promoter the ⁇ -lactalbumin promoter.
  • the FVII composition of the invention is capable of being produced by a transgenic rabbit, said composition then being subjected to in vitro sialylation so that the biantennary, bisialylated forms become majoritarian.
  • the rabbit is a particularly advantageous species for the production of therapeutic proteins because the rabbit does not appear to be susceptible to prions, especially to transmissible spongiform encephalopathy, which constitutes a major public health problem.
  • the species barrier between the rabbit and the man is important.
  • the species barrier between man and hamster which is the biological system in which commercially available recombinant FVII is produced, is less important.
  • the production of FVII in the rabbit is advantageous in terms of safety as regards the transmission of pathogens, including unconventional pathogens of the prion type.
  • the FVII of the invention is produced in the mammary glands of transgenic rabbits.
  • the secretion by the mammary glands of the protein of interest, allowing its secretion in the milk of the transgenic mammal is a technique well known to those skilled in the art, which involves the control of the expression of the recombinant protein in tissues. dependent. Tissue control ⁇ e expression is performed through sequences allowing expression of the protein to a particular tissue of the animal. These sequences are in particular the promoter sequences, as well as the signal peptide sequences.
  • promoters allowing the expression of a protein of interest in the mammary glands are the WAP (whey acidic protein) promoter, the casein promoter, in particular the ⁇ -casein promoter, ⁇ -casein, the promoter of ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, this list not being limiting.
  • WAP whey acidic protein
  • casein promoter in particular the ⁇ -casein promoter, ⁇ -casein
  • the promoter of ⁇ -lactoglobulin ⁇ -lactalbumin
  • a method for producing a recombinant protein in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a synthetic DNA molecule comprising a gene coding for human FVII, this gene being under the control of a promoter of a a protein secreted naturally in milk, is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains the transgenic FVII of interest.
  • composition of FVII produced in the mammary glands of rabbit is characterized in that at least some of the factor VII sialic acids involve a.2-6 linkages.
  • all the sialic acids involve ⁇ 2, 6 bonds, and in particular at least 90% of the sialic acids of the FVII involve ⁇ 2, 6 bonds.
  • the FVII composition according to the invention can moreover include sialic acids of ⁇ 2-3 bonds.
  • the level of sialic acids involving 2-6 bonds is greater than 60%, or greater than 70%, 80%, or 90%. In particular, this rate is between 60% and 90%.
  • the majority glycan forms are non-fucosylated.
  • these biantennary glycan forms, monosialylated and non-fucosylated are present in the FVII of this composition at a rate greater than 20%.
  • this level is greater than 25%, or even greater than 40%.
  • the fucosylation rate of the FVII of this composition of the invention is between 20% and 50%. In another embodiment of the invention, this rate may be less than 15%.
  • Transgenic rabbit FVII has several post-translational modifications: the first nine or ten N-terminal glutamic acids are ⁇ carboxylated, Asp63 (Asparagine63) is partially hydroxylated, Sers2 (Serine 52) and Ser 60 (Serine 60) are O-glycosylated and carry respectively the units Glucose (Xylose) 0-2 and Fucose, Asni 45 and Asn 32 2 are N- predominantly glycosylated by monosialylated biantennary complex glycan forms.
  • FVII produced in milk by transgenic mammals can be purified from milk by techniques known to those skilled in the art.
  • a method of purifying a protein of interest from milk as described in US Pat. No. 6,268,487 may include the following steps: a) subjecting the milk to tangential filtration on a porosity membrane sufficient to form a retentate and a permeate, the permeate containing the exogenous protein, b) subject the permeate to a chromatographic capture apparatus so as to displace the exogenous protein and obtain an effluent, c) combine the effluent and the retentate, d) Repeat steps a) through c) until FVII is separated from lipids, casein micelles, and the FVII is at least 75% recovered.
  • This process for extracting and purifying FVII (Method A), contained in milk of a transgenic animal, comprises the following steps: a) extracting FVII from milk, Factor VII being salt-bound and and / or organic and / or inorganic complexes of calcium of said milk, by the precipitation of calcium compounds obtained by adding a soluble salt to the milk, of which the anion is chosen for its ability to form said insoluble calcium compounds to thereby release factor VII from said salts and / or complexes, factor VII being present in a liquid phase, b) separating the enriched liquid phase into the protein of the precipitate of calcium compounds, said liquid phase being further separated into a lipid phase and a non-lipidic aqueous phase comprising the protein, c) subjecting the non-lipidic aqueous phase to an affinity
  • the FVII composition When the FVII composition is produced by a transgenic rabbit, it is subjected to in vitro sialylation so that the biantennal, bisialylated forms become the majority.
  • the sialylation is carried out by means of a sialyltransferase, for example ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase (or ⁇ -D-Galactosyl- ⁇ 1,4-N-acetyl).
  • a sialyltransferase for example ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase (or ⁇ -D-Galactosyl- ⁇ 1,4-N-acetyl).
  • a sialyltransferase for example ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase (or ⁇ -D-Galactosyl- ⁇ 1,4-N-acetyl).
  • - ⁇ -D-glucosamine- ⁇ 2, 6-sialyltransferase) or the GaI beta 1,3GaINAc alpha 2,3-sialyltransferase, or the GaI beta 1,
  • the sialyltransferase used is a sialyltransferase for transferring sialic acids via an ⁇ 2,6 bond.
  • the FVII composition of the invention has sialic acids involving "2-6" linkages, as this isomer is more represented in the plasma FVII.
  • Sialylation can be carried out with a sialic acid donor substrate, such as sialic acid itself, or any molecule that has sialic acid and is capable of releasing sialic acid.
  • the substrate is cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid
  • a reaction medium suitable for allowing the transfer of the sialic acid from the sialic acid donor group to the FVII, the biantennary, bisialylated forms becoming the majority.
  • This reaction medium may, for example, be based on a buffer composed of 3-morpholino propanesulfone acid, and a buffer, for example, based on Tween.
  • the substrate can be synthesized in the reaction medium by including in this medium a cytidine monophosphate (CMP) -sialic acid synthetase, sialic acid, CTP (cytidine triphosphate) and a sufficient level of a divalent metal cation to allow the reaction to occur.
  • CMP cytidine monophosphate
  • the divalent metal cation may be calcium ion, zinc ion, magnesium ion, chromium ion, copper ion, iron ion or cobalt ion.
  • the reaction is always carried out for a sufficient time and suitable conditions to allow the increase of the bisialylated forms sufficiently to become the majority.
  • the reaction may be carried out for at least 0.5 hours, particularly advantageously for at least 5 hours, or for 7 hours, or for 8 hours, 9 hours or 10 hours.
  • the incubation takes place during any a night.
  • this reaction is carried out for periods of between 5 and 12 hours.
  • the FVII of the composition of the invention is activated (FVIIa).
  • the FVIIa can exhibit a coagulant activity 25 to 100 times greater than that of the FVII
  • tissue factor (not activated) when the latter interacts in place of the first with the tissue factor (FT).
  • FVII results in vivo cleavage of the zymogen by different proteases (FIXa, FXa, FVIIa) into two chains joined by a disulfide bridge.
  • FVIIa alone has very little enzymatic activity, but complexed with its cofactor, tissue factor (FT), it triggers the coagulation process by activating FX and FIX.
  • FVIIa is the coagulation factor responsible for hemostasis in hemophiliacs with circulating antibodies, for example. In a particularly advantageous manner, the FVII of the invention is fully activated.
  • the FVIIa of the invention comprises several post-translational modifications: the first nine or ten N-terminal glutamic acids are ⁇ -carboxylated, the Asp63 is partially hydroxylated, the Ser 5 2 and the Sergo are 0-glycosylated and carry respectively Glucose (Xylose) 0-2 and Fucose, the Asni45 and Asn 322 are N-glycosylated mainly by complex biantennary, bisialylated and non fucosylated.
  • the activation of FVII may also result from a process carried out in vitro, for example during the purification of the FVII of the invention (see Example 2).
  • the FVIIa of the invention is therefore composed of a light chain of 152 amino acids with a molecular weight of approximately 20 kDa and a heavy chain of 254 amino acids with a molecular weight of approximately 30 kDa linked together by a single molecule.
  • disulfide bridge (Cysi35-Cys 2 62) -
  • the FVII of the invention is an activated FVII having an activity and a structure close to the plasma FVII.
  • FVIIa has a coagulant activity 25 to 100 times greater than that of FVII when interacting with tissue factor (FT).
  • FVII can be activated in vitro by factors Xa, VIIa, Ha, IXa and XIIa.
  • the FVII of the invention may also be activated during its purification process.
  • Another object of the invention is an FVII composition of the invention for use as a medicament.
  • Another object of the invention is the use of a factor VII composition according to the invention, for the preparation of a medicament for the treatment of patients with hemophilia.
  • Another object of the invention is the use of a factor VII composition according to the invention for the preparation of a medicament for the treatment of multiple hemorrhagic traumas.
  • Another subject of the invention is the use of a factor VII composition according to the invention for the preparation of a medicament for the treatment of hemorrhages due to an overdose of anticoagulants.
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition comprising factor VII according to the invention and a pharmaceutically acceptable excipient and / or vehicle.
  • Another subject of the invention is a method for preparing a recombinant or transgenic factor VII composition, each factor VII molecule of which comprises glycan forms linked to N-glycosylation sites and in which, among all the molecules, of factor VII of said composition, the biantennary, bisialylated glycan forms are in the majority, comprising a sialylation step by contacting a partially sialylated transgenic or recombinant factor VII composition as defined above with a sialic acid donor substrate and a sialyltrasferase, in a reaction medium suitable to allow the activity of the sialyltransferase, for a sufficient time and under suitable conditions to allow a transfer of the sialic acid from the sialic acid donor substrate to FVII and an increase of the bisialylated forms of sufficiently, said bisialyl
  • partially sialylated means a composition of FVII whose N-bonded glycan forms are not all bisialylated, that is to say of which some forms are monosialylated.
  • these biantenned, monosialylated forms are present at a level greater than 40%, particularly advantageously at a level greater than 50%, or even at 60%.
  • the level of biantenned, monosialylated and non-fucosylated glycan forms is greater than 20%, or particularly preferably greater than 30%, 40% or even 50%.
  • the sialyltransferase is ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase (or ⁇ -D-Galactosyl- ⁇ 1,4-N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine- ⁇ 2,6-sialyltransferase), or GaI beta 1 , 3GaINAc alpha 2, 3-sialyltransferase, or the GaI beta 1,3 (4) GIcNAc alpha 2,3 sialyltransferase, or GaINAc alpha-2,6-sialyltransferase I.
  • the sialyltransferase used is a sialyltransferase which makes it possible to transfer sialic acids via an oc2, 6 bond.
  • the FVII of the composition of the invention it is advantageous for the FVII of the composition of the invention to have sialic acids involving ⁇ 2-6 bonds, because this isomer is more represented in the plasma FVII.
  • Sialylation can be performed with any sialic acid donor substrate.
  • the substrate is cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid, in a suitable reaction medium to allow the transfer of the sialic acid of the sialic acid donor group to FVII, the biantennary, bisialylated forms becoming the majority.
  • the reaction medium may be based on a biologically compatible surfactant, such as
  • This reaction medium may further comprise agents for adjusting the ionic strength and / or contributing to the maintenance of the pH of the medium, such as sodium cacodylate, 3-morpholinopropanesulphonic acid, Tris and NaCl at varying concentrations. from 40 mM to 60 mM. PH values are typically between 6 and 7.5.
  • the reaction medium may also comprise bovine serum albumin (BSA) at a concentration of between 0.05 and 0.15 mg / ml.
  • BSA bovine serum albumin
  • the substrate can be synthesized in the reaction medium by placing in this medium an acidic CMP-sialic synthetase, sialic acid, CTP (cytidine triphosphate) and a sufficient level of a divalent metal cation, examples of which are given above.
  • the reaction is always carried out for a sufficient time and appropriate conditions to allow the increase of the bisialylated forms sufficiently so that they become the majority, as defined more high .
  • the duration of the reaction is preferably between 0.5 and 3 hours at a temperature advantageously between 4 and 37 ° C., preferably between 40 ° C. and 20 ° C.
  • the duration of the reaction is preferably between 1 hour and 9 hours, preferably between 1 hour and 6 hours, at a temperature advantageously between 4 and 37 0 C, preferably between 40 ° C. and 20 ° C.
  • the method of the invention is a method for improving the bioavailability of the partially sialylated transgenic or recombinant factor VII composition.
  • This improvement in biodisposibility is achieved by contacting said composition with a sialic acid donor substrate and a sialyltrasferase, as mentioned above.
  • bioavailability enhancement is meant an increase of at least 5%, or at least 10%, or preferably at least 30% or 50%, and preferably at least 80% or more. 90% of the bioavailability of the FVII composition compared to the same composition of FVII whose sialylation was not modified.
  • a galactosylation step is carried out before the sialylation step. The purpose of this step is to graft galactose onto galactose deficient forms, i.e. the agalactosylated and monogalactosylated forms of FVII.
  • Galactose binds to the GIcNAc, and may be able to bind a sialic acid residue in the subsequent sialylation step.
  • This galactosylation step can be carried out using a galactosyltransferase, in a reaction medium including UDP-galuridine (5'-diphosphogalactose), known to those skilled in the art.
  • the major glycan forms of the partially sialylated FVII composition are of the complex, biantenned, monosialylated type.
  • Such glycan forms are represented below:
  • the partially sialylated FVII composition also comprises non-sialylated (fucosylated or non-fucosylated), non-sialylated triantenes, and bisialylated (fucosylated or non-fucosylated) non-sialylated complex forms.
  • the predominant glycannic forms are non-fucosylated.
  • the partially sialylated FVII composition has at least some of the sialic acids involving ⁇ 2-6 bonds, as indicated above.
  • the method further comprises, prior to the sialylation step, a step of producing the transgenic FVII composition partially sialylated by transgenic rabbits. This step is implemented as indicated above. This step can also be carried out before the galactosylation step.
  • the FVII of the partially sialylated FVII composition is activated.
  • the method of the invention makes it possible to obtain, among all the factor VII molecules of said composition, a rate of biantennary, bisialylated major forms.
  • the sialic acid donor group is cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid and the sialyltransferase is ⁇ 2, 6- (N) -sialyltransferase.
  • a partially sialylated FVII composition may be a transgenic FVII composition produced in the mammary glands of a transgenic rabbit.
  • the partially sialylated FVII composition is the composition described in document FR 06 04872, the content of which is considered to be included in the present document.
  • FVII-Tg FVIIa-Tg: Activated transgenic FVII according to
  • FVII-r FVIIa-r: commercially available recombinant activated FVII
  • FVII-p FVIIa-p: FVII of activated plasma origin, i.e., purified from human plasma.
  • HPCE-LIF High Performance Capillary Electrophoresis-
  • MS-ESI Electrospray mass ionization spectrometry.
  • PNGase F Normal Phase: Peptide: N-glycosidase F
  • FIG. 1 Extraction and purification of the FVII composition obtained in Example 1.
  • Figure 2 Deconvolved ESI mass spectra of peptides carrying N-glycosylation sites.
  • FIG. 3 HPCE-LIF electropherograms after deglyco ⁇ ylation of FVII by PNGase F;
  • top electropherogram FVIIa, p
  • the two electropherograms of the medium FVII-Tg
  • lower electropherogram FVIIa, r.
  • top chromatogram FVIIa, p
  • middle chromatogram FVII-Tg
  • bottom chromatogram FVIIa, r.
  • Figure 5 Identification of the major glycan forms of FVII-Tg by MALDI-TOFMS.
  • Figure 6 Identification of the major glycan forms of FVIIa, r by MALDI-TOFMS.
  • Figure 7 HPCE-LIF analyzes of in vitro resialylation: (low) oligosaccharide map of native FVII-Tg; (top) oligosaccharide map of FVII-Tg after resialylation.
  • Figure 8 Sialylation kinetics of FVII-Tg according to the percentage of biantennary, bisialylated, non-fucosylated (A2) and fucosylated (A2F) forms over time.
  • Figure 9 Results of the comparative PK (PK: pharmacokinetics) comparative study in rabbits, non-resialylated transgenic FVII (FVIITgNRS) compared with Resialylated transgenic FVII (FVIITgRS): semi-log elimination curves.
  • PK pharmacokinetics
  • a pi plasmid is first prepared by introducing the WAP gene sequence (described in Devinoy et al, Nucleic Acids Research, Vol 16, No. 16, Aug. 25, 1988, p 8180) into the vector polylinker.
  • p-poly III-I described in Lathe et al., Gene (1987) 57, 193-201).
  • Plasmid p2 obtained from plasmid p1, contains the rabbit WAP gene promoter and the human FVII gene.
  • Transgenic rabbits were obtained by the conventional microinjection technique (Brinster et al, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82, 4438-4442). 1-2 ⁇ l containing 500 copies of the gene were injected into the male pronucleus of rabbit embryos. Fragments of this vector containing the recombinant genes were microinjected. The embryos were then transferred to the oviduct of hormonally prepared adoptive females. About 10% of the embryos handled gave birth to rabbits and 2-5% of the embryos handled to transgenic rabbits. The presence of the transgenes was revealed by the Southern transfer technique from I 1 DNA extracted from tails of the rabbits. FVII concentrations in the blood and milk of animals were evaluated using specific radioimmunoassays.
  • FVII The biological activity of FVII was evaluated by adding milk to the culture medium of rabbit breast cells or explants.
  • a surface lipid phase cream
  • a clear non-lipidic aqueous phase enriched in FVII major phase
  • a solid white phase in pellet precipitates of insoluble caseins and calcium compounds
  • the non-lipidic aqueous phase FVII is collected at the peristaltic pump until the creamy phase.
  • the creamy phase is collected separately.
  • the solid phase (precipitate) is removed.
  • the non-lipidic aqueous phase is filtered through a sequence of filters (PaIl SLK7002U010ZP - 1 ⁇ m pore size glass fiber pre-filter - then SLK7002NXP - pore size nylon 66). 0.45 ⁇ m).
  • the lipid phase is passed on this filtration sequence which completely retains the lipid globules of the milk, and the filtrate is clear.
  • the filtered non-lipidic aqueous phase is then dialyzed on an ultrafiltration membrane (Millipore Biomax 50 kDa - 0.1 m 2 ) to make it compatible with the chromatography phase.
  • the molecular weight FVII of about 50 kDa does not filter through the membrane, unlike the milk salts, sugars and peptides.
  • the dialysis buffer is a 0.025M sodium phosphate buffer, pH 8.2.
  • This non-lipidic aqueous phase comprising FVII can be assimilated to whey enriched with FVII-Tg.
  • This preparation is stored at -30 ° C. before continuing the process.
  • the overall recovery yield of FVII by this step is very satisfactory: 90% (91% phosphate extraction + 99% Dialysis / concentration).
  • the non-lipidic aqueous phase comprising FVII at the end of this step is perfectly clear and is compatible with the chromatographic steps which follow.
  • An Amicon 90 column (9 cm diameter - 64 cm 2 section) is filled with BioRad Ceramic Hydroxyapatite Gel Type I (CHT-I).
  • the gel is equilibrated in aqueous buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • aqueous buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • the entire preparation stored at -30 ° C. is thawed on a water bath at 37 ° C. until the ice cube is completely dissolved and is then injected onto the gel (linear flow rate 100 cm / h, ie 105 ml / min).
  • the unbound fraction is removed by passing a buffer of 0.025 M sodium and 0.04 M sodium chloride, pH 8.2, up to baseline (RLB).
  • Elution of the FVII-Tg containing fraction is via buffer B consisting of 0.25 M sodium phosphate and 0.4 M sodium chloride, pH 8.0.
  • the eluted fraction is collected until the return to baseline.
  • This chromatography makes it possible to recover more than 90% of the FVII-Tg, while eliminating more than 95% of the lactic proteins.
  • the specific activity (A.S.) is multiplied by 25. About 85,000 IU of FVII-Tg of 4% purity are available at this stage.
  • the entire eluate from the previous step is filtered in tangential mode on a 100 kDa ultrafiltration membrane (PaIl OMEGA SC 100K - 0.1 m 2 ).
  • the FVII is filtered through the 100 kDa membrane, whereas the proteins of. Molecular weight greater than 100 kDa are not filterable.
  • the filtered fraction is then concentrated to about 500 ml and then dialyzed on the 50 kDa ultrafilter already described above.
  • the dialysis buffer is 0.15M sodium chloride.
  • the product is stored at -30 ° C. before passing through ion exchange chromatography.
  • This step made it possible to reduce the protein load of molecular weight greater than 100 kDa and in particular proenzymes.
  • the 100 kDa membrane treatment retains about 50% of proteins including high molecular weight proteins, while filtering 95% of FVII-Tg, or 82,000 IU of FVII-Tg. This treatment makes it possible to reduce the risks of proteolytic hydrolysis during the downstream stages.
  • QSFF Q-Sepharose® Fast Flow
  • a column 2.6 cm in diameter (5.3 cm 2 section) is filled with 100 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the entire fraction stored at -30 ° C. is thawed in a water bath at 37 ° C. until the ice cube is completely dissolved.
  • the fraction is diluted to 1 A [v / v] with the equilibration buffer before injection on the gel (flow rate 13 ml / min, ie linear flow of 150 cm / h), then the non-retained fraction is eliminated by passage of the buffer until RLB.
  • a first low FVII protein fraction is eluted at 9 ml / min (ie 100 cm / h) with a buffer of 0.05 M Tris and 0.15 M sodium chloride, pH 7.5, and is then eliminated.
  • a second protein fraction rich in FVII is eluted at 9 ml / min (ie 100 cm / h) with a buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.05 M calcium chloride, pH -7, 5. This second fraction is dialyzed on
  • the 50 kDa ultrafilter already described above.
  • the dialysis buffer is sodium chloride 0.15 M. This fraction is stored at +4 0 C overnight before 2 th passage chromatography anion exchange.
  • This step makes it possible to recover 73% of the FVII (ie 60000 IU of FVII-Tg), while eliminating 80% of the accompanying proteins. It also allows the activation of FVII in FVIIa.
  • a 2.5 cm diameter column (4.9 cm 2 section) is filled with 30 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare). The gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the preceding eluted fraction (second fraction), stored at + 40 ° C., is diluted before injection on the gel (flow rate 9 ml / min, ie linear flow rate of 100 cm / h). After injection of the fraction, the gel is washed with the equilibration buffer for removal of the non-retained fraction, up to RLB.
  • a fraction containing very high purity FVII is eluted at 4.5 ml / min (ie 50 cm / h) in buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.005 M calcium chloride, pH 7.5.
  • FVII-Tg About 23,000 IU of FVII-Tg were purified, or 12 mg of FVII-Tg.
  • a column 2.5 cm in diameter (4.9 cm 2 section) is filled with 10 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the gel is washed with the equilibration buffer for removal of the non-retained fraction, up to RLB.
  • the purified eluted fraction of the preceding step is diluted five times with purified water for injection (PPI) before injection on the gel (flow rate 4.5 ml / min, ie linear flow of 50 cm / h).
  • PPI purified water for injection
  • the FVII-Tg is then eluted at a flow rate of 3 ml / min (ie 36 cm / h) with the buffer of 0.02 M Tris and 0.28 M sodium chloride, pH 7.0.
  • a composition of FVII-Tg in concentrate form was prepared with purity greater than 95%.
  • the product is compatible with intravenous injection.
  • the process has a cumulative yield of 22%, which makes it possible to purify at least 20 mg of FVII per liter of milk used.
  • Table A summarizes the steps of the method according to a preferred embodiment of the invention to provide the purified FVII composition, and provides the different yields, purity and specific activities obtained at each step.
  • Figure 2 shows the deconvoluted ESI spectra of the glycopeptides containing the two glycosylated Asn residues. The location of the glycosylation sites was confirmed by MALDI-TOF (/ TOF) as well as by Edman sequencing.
  • ASn I45 also shows the presence of trisialylated trifunctional oligosaccharides, non-fucosylated (A3) (obstruction 6220.0 Da) and fucosylated (A3F) (obstruction mass 6366.1 Da).
  • the ASn I45 is modified by A2F, AlF and "AlF" type glycans, which corresponds to a monosialylated form with a GaINAc in the terminal position on the other antenna.
  • A3F glycols triantennate, trisialylated, fucosylated forms
  • the FVII-Tg the analysis of mass spectra of glycopeptides [D123-R152] and [K 3 L 6 -R 353] FVII-Tg, respectively having the N-glycosylation sites Asn 322 Asni4 5 and / reveals the presence of biantennary, non-fucosylated bisialylated forms (A2) (observed mass of glycopeptide containing ASn 145 : 5563.8 Da) and fucosylated (A2F) (observed mass: 5709.7 Da).
  • A2 biantennary, non-fucosylated bisialylated forms
  • A2F fucosylated
  • the triantennial forms are less represented on Asn 32 2 than on ASn I45 for the plasma product and absent on FVIIa, r and FVII-Tg. It should also be noted that Asn 145 and 322 are 100% glycosylated. Although only semi-quantitative, these results are in agreement with the quantitative data obtained by HPCE-LIF and NP-HPLC.
  • the identification and quantification of the N-linked oligosaccharides is carried out by HPCE-LIF after deglycosylation with PNGase F.
  • the FVII samples are treated with exoglycosidases (sialidase)
  • ProteomeLab PA800 capillary electrophoresis apparatus (Beckman Coulter) is used, the capillary of which is “coated” N-CHO (Beckman-Coulter) 50 cm ⁇ 50 ⁇ m internal diameter.
  • a "buffer-N gel” separation buffer (Beckman-Coulter) is used.
  • the migration is carried out by applying a voltage of 25 kV, for 20 min, at 20 ° C.
  • the detection takes place by laser at ⁇ ex quotation 488nm and ⁇ em ission 520 ⁇ m.
  • the fucosylation rate is calculated, after simultaneous deglycosylation by sialidase, galactosidase and hexacase, by the ratio between the peak areas corresponding to the "core” and "core” fucosylated.
  • the glycols of FVIIa, p are mainly of the biantenroid type, bisialylés non fucosylés (A2), and biantenmos bisialylés fucosylés (A2F).
  • the glycan profiles of FVII-Tg reveal the presence of biantennary, monosialylated, fucosylated or non-fucosylated (AlF, Al), and biantennal, bisialylated, fucosylated or non-fucosylated forms (A2F, A2). The distribution between these different forms varies between the two lots.
  • FVJIa shows biantennial sialylated fucosylated forms with predominant A2F forms, and fucosylated monosialylated biantennates (AlF).
  • Atypical migration times for the A2F and AlF forms are noted with respect to the migration times usually encountered for these structures.
  • the glycan profiles of two lots (A and B) of FVII-Tg reveal the presence of biantennous, monosialylated, fucosylated or non-fucosylated (AlF, Al), and biantenned, bisialylated, fucosylated forms. or not (A2F, A2).
  • Table 1 The quantitative analysis of the different glycan forms (Table 1) shows, for FVIIa, p, the predominance of sialylated forms with 51% of bisialylated glycans (A2 and A2F), and 30% of non-fucosylated and fucosylated sialylated triantennial forms (respectively G3 and G3F) (results not shown).
  • FVII-Tg (lots A and B) is less sialylated than FVIIa, p with 35% bisialylated biantennal forms, and only 6% sialylated triantennial forms (results not shown). The majority forms are monosialylated with 50% Al and AlF structures.
  • FVIIa r is also less sialylated than FVIIa, p with 45% A2F structures, and only 6% sialylated tri-annealed glycans (results not shown).
  • FVIIa we note the absence of non-fucosylated forms.
  • the labeled glycans are separated according to their hydrophilicity by HPLC chromatography in normal phase on an Amide-80 column, 4.6 x 250 mm (Tosohaas) thermostated at 30 ° C. Before injection of the sample, the column is equilibrated in buffer at 80% acetonitrile. The oligosaccharides are eluted by a growing gradient of 50 mM ammonium formate, pH 4.45, for times greater than or equal to 140 minutes. Detection is performed by fluorometry ⁇ exc i tat i on to 330 nm and ⁇ emission SL 420nitl.
  • the chromatographic profile of FVIIa, p shows that the majority of molecules are biantenocc, bisialylés (A2) with a rate of 39%. Bainenic, bisialylated, fucosylated (A2F), monosialylated (Al) and trisialylated fucosylated and nonfucosylated (A3F and A3) forms are also observed in smaller amounts.
  • MALDI-TOF MS Microx-Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • mass spectrometry is a technique for measuring the molecular mass of peptides, proteins, glycans, oligonucleotides, and the majority of ionizable polymers with high accuracy.
  • the peptides, proteins and glycans to be analyzed are mixed with a matrix that absorbs at the wavelength of the laser used.
  • the main matrices are ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) for peptide analysis, sinapinic acid (SA) for proteins and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) for oligosaccharides.
  • the method consists in irradiating the matrix / analyte co-crystals with the aid of a pulsed laser, this entails the joint desorption of the matrix and analyte molecules.
  • the analyte molecules pass through a time-of-flight detector.
  • the measurement of the latter allows the determination of the mass of the target analyte.
  • the identification is carried out by measuring the mass observed, compared with the theoretical mass.
  • the Sequencing can be performed in the MS / MS mode on the basis of the fragment ions obtained.
  • the instrument used is a Bruker Autoflex 2 operating in the TOF and TOF / TOF modes.
  • MALDI-TOF MS analyzes were performed from elution fractions derived from preparative NP-HPLC.
  • the MALDI-TOF analysis of FVII-Tg confirmed the identification of NP-HPLC-separated glycans, namely predominantly monosialyl Al forms and AlF, A2F and A2 minority forms.
  • the experimental procedure is similar to that developed in Example 4.
  • the oligosaccharides are treated with specific exosialidases so as to ensure the identification of the binding and the quantification of each isolated structure.
  • Assays have shown that FVIIa, r has biantennary, sialylated, fucosylated forms with predominant A2F forms, and biantenned, monosialylated, fucosylated (AlF) forms.
  • Atypical migration times for these A2F and AlF structures are noted with respect to the migration times usually encountered for these forms.
  • these sialylated oligosaccharide forms have atypical migration times in HPCE-LIF and NP-HPLC compared to those of FVII-Tg.
  • the analysis of the monosaccharide composition did not reveal any particular sialic acid other than Neu5Ac and the mass spectrometry tools reveal mass molecules in accordance with bisialylated types.
  • the desialylation of the FVIIa, r glycan allows to recover chromatographic and electrophoretic behaviors equivalent to those of the oligosaccharides of FVII-Tg.
  • Table 3 Sialic acid connections on the different lots of FVII.
  • Resialylation was performed using an ⁇ 2, 6- (N) -sialyltransferase (rat, Spodotera frugiperda,
  • reaction buffer contains 50 mM acid morpholino-3 propanesulfonic acid, 0.1% Tween®80, 0.1 mg / ml BSA, adjusted to pH 7.4 (Sigma reagents).
  • the electropherogram of native FVII-Tg shows the predominantly Al monosialylated biantenate form (42%) and the A2, A2F and AlF minus structures. represented.
  • the monosialylated form represents only 6% in favor of the bisialylated form, in particular not fucosylated, which has become a majority (52%).
  • Example 9 Comparative pharmacokinetic study in the rabbit of a non-resialylated transgenic FVII (FVII Tg NRS) relative to the resialylated transgenic FVII (FVII Tg RS), obtained at the end of Example 8)
  • the purpose of this study is to compare the pharmacokinetic profiles of FVII-TgRS versus FVII-TgNRS in the New Zealand Vigilant Male Rabbit.
  • the dose tested is 200 ⁇ g / kg per animal, which corresponds to twice the therapeutic dose in humans described for recombinant FVII.
  • the blood samples are taken on D-4 (4 days before the injection of the product) and on D1 (day of the injection of the product) at T0.17h (the day of the injection of the product, 10 minutes after the injection). injection), T0.33h (the day of injection of the product, 20 minutes after the injection), TIh (the day of the injection of the product, 1 hour after the injection), T3h (the day of the injection) injection of the product, 3 hours after the injection), T6h (the day of the injection of the product, 6 hours after the injection), T8h (the day of the injection of the product, 8 hours after the injection).
  • FVII Ag (FVII antigen) assays are performed by ELISA (Asserachrom kit). The results of the FVII: Ag assays in rabbit plasma make it possible to determine, on the one hand, the elimination profiles and, on the other hand, the pharmacokinetic parameters. The dosages and experimental groups are shown in Table 6.
  • FVII-TgRS has a different kinetic profile than FVII-TgNRS. Resialylation of FVII-Tg markedly improves half-life, mean residence time (MRT), Cmax, and recovery.
  • AUC peak area
  • Cl yield
  • Vd volume of distribution

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Abstract

La présente invention concerne une composition de facteur VII recombinant ou transgénique, chaque molécule de facteur VII de la composition comportant des formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation, dans laquelle parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, des formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées sont majoritaires. L'invention concerne également une telle composition pour son utilisation comme médicament, et, également, un procédé permettant de préparer entre autres ladite composition.

Description

Composition άe facteur VII recombinant ou transgénique, présentant majoritairement des formes glycannigues biantennées , bisialylées et non fucosylées
Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme . activée
(FVIIa) , participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et du facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa . Le FVII comporte quatre domaines structuraux distincts : le domaine γ-carboxylique (GIa) N-terminal, deux domaines "epidermal growth factor (EGF) -like", ainsi qu'un domaine serine protéase. L'activation du FVII en FVIIa est caractérisée par la coupure de la liaison Argi52-Ilei53 (Arginine 152- Isoleucine 153) . Le FVIIa est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de masse moléculaire d'environ 30 kDa liées entre elles par un seul pont disulfure (Cysi35-Cys262) •
Le FVIIa plasmatique (FVIIa, p) comporte plusieurs modifications post-traductionnelles : les dix premiers acides glutamiques sont γ-carboxylés, l'Asp63 (acide aspartique) est partiellement hydroxylé, la Sers2 (Serine 52) et la Serεo (Serine 60) sont O-glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose (Xylose) 0-2 et Fucose, l'Asni45 (Asparagine 145) et 1 'Asn322 (Asparagine 322) sont N-glycosylées majoritairement par des formes glycanniques complexes biantennées bisialylées .
Le FVII est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX
(hémophilie de type B) , ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FVIIa injectables.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement . Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles les facteurs IX (FIX), X (FX) et II (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX). L'inconvénient de ce procédé est que le FVII obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation.
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et du FVIII. Le FVII obtenu par ce procédé, malgré sa pureté, présente une activité thrombogénique résiduelle.
L'un des inconvénients majeurs de ces procédés est qu'ils ne permettent d'obtenir que de faibles quantités de produits . En outre, le volume de plasma collecté auprès des donneurs de sang reste limité.
C'est pourquoi, dès les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé (Hagen et al.
(1986) ; Proc. Natl . Acad. Sci. USA ; Apr 83 (8) : 2412-6) et la protéine correspondante a été exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document EP 0 200 421) . La demande de brevet FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, de tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine. Toutefois, le FVII plasmatique humain possède des modifications post- traductionnelles complexes : les dix premiers acides glutamiques sont γ-carboxylés, l'Asp63 est partiellement b-ydroxylé (acide aspartique 63), la Ser52 (Serine 52) et la Serβo (Serine 60) sont O-glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose (Xylose) 0-2 et Fucose, 1 Αsni45 (Asparagine 145) et l'Asn322 (Asparagine 322) sont N-glycosylées majoritairement par des formes de type complexe, biantennées et bisialylées. Notamment, l'addition des N-glycannes (glycannes liés à 1 'asparagine) est particulièrement importante pour le repliement correct de la protéine, la stabilité in vitro et in vivo, la bio-activité et les propriétés pharmaco-cinétiques (bio-disponibilité par exemple) de la protéine hétérologue produite. Ainsi, des variations de tout ou partie des modifications post- traductionnelles exposent d'une part au risque que la protéine ne soit pas active, et d'autre part au risque qu'elle soit immunogène.
Or les FVII recombinants ou transgéniques existants peuvent présenter, de par leur expression dans des systèmes différents des systèmes humains, une glycosylation qui diffère de la glycosylation du FVII plasmatique humain, ce qui peut entraîner l'apparition d'anticorps dirigés contre la protéine recombinante, et, par là, une efficacité moindre que le FVII humain purifié à partir de plasma humain. II existe donc un besoin de compositions thérapeutiques ou prophylactiques de FVIIa, dont les caractéristiques fonctionnelles se rapprochent du FVII humain purifié à partir de plasma humain, et dont le mode de production est compatible avec le besoin de grandes quantités de cette protéine.
Ainsi, l'invention se rapporte à une composition de facteur VII recombinant ou transgénique, chaque molécule de facteur VII de la composition comportant des formes glycanniques liées aux sites - de N- glycosylation, caractérisé en ce que, parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, les formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées sont majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII de la composition.
La Demanderesse a découvert de manière surprenante qu'une composition de FVII recombinant ou transgénique, dont les formes biantennées, bisialylées et non fucosylées sont- majoritaires, présente une biodisponibilité augmentée, une clairance diminuée et une stabilité accrue par rapport à une composition de FVII recombinant ou transgénique dont le taux de formes bisialylées est moindre, c'est-à-dire par rapport à une composition de FVII recombinant ou transgénique dont le taux de formes biantennées, monosialylées et non fucosylées est majoritaire. Le FVII de l'invention permet donc d'envisager des administrations au patient moins fréquentes, ainsi que des doses moins élevées par rapport à une composition de FVII recombinant ou transgénique dont le taux de formes bisialylées est moindre, c'est-à-dire dont le taux de formes monosilalylées est majoritaire. Par biodisponibilité, on désigne le pourcentage de FVII administré diffusant dans la circulation sanguine et donc susceptible en particulier de parvenir au site hémorragique . Par clairance, on désigne la fraction d'un volume théorique totalement épuré, c'est-à-dire ne contenant plus le FVII par unité de temps. Autrement dit, ceci correspond à la quantité hypothétique de fluide qui serait complètement débarrassée de la substance dans un intervalle unitaire de temps.
Par stabilité, on désigne l'aptitude du FVII à conserver ses propriétés chimiques, physiques, microbiologiques et biopharmaceutiques dans des limites spécifiques pendant toute sa durée de validité. Par « formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées», on désigne les formes ci-dessous :
Figure imgf000006_0001
Forme A2 (biantennée, bisialylée et non fucosylée)
A : Acide sialique
éεgà : Galactose
: N-acétylglucosamine (GIcNAc) φ -.Mannose
Ces formes glycanniqu.es sont liées aux sites de N- glycosylation constitués par l'asparagine 145 (Asnl45) et l'asparagine 322 (Asn322). En effet, le FVII de l'invention comporte, comme le FVII humain, deux sites de N-glycosylation, en position 145 et 322, et 2 sites de O-glycosylation, en position 52 et 60. Sur un site de N-glycosylation, les chaînes d'oligosaccharides sont liées à une asparagine (N-liées) . Sur un site de 0- glycosylation, les chaînes d'oligosaccharides sont liées à une serine. Chaque molécule de FVII de 1 ' invention comporte donc deux chaînes d'oligosaccharides N-liées. Toutefois, les molécules de FVII de la composition ne présentent pas une glycosylation homogène, c'est-à-dire que toutes les chaînes d'oligosaccharides N-liées ne sont pas identiques entre elles. Il s'agit d'un mélange de différentes formes glycanniques .
En effet, tout FVII, qu'il soit plasmatique, recombinant ou transgénique, se présente sous forme d'un mélange de plusieurs protéines de FVII, ces protéines se différenciant entre elles notamment par leur glycosylation et autrement appelées glycoformes. Cette glycosylation est due à une maturation post- traductionnelle effectuée par les organites cellulaires au cours du transfert de la protéine de FVII entre les différents compartiments cellulaires. Cette modification biochimique modifie profondément la protéine, de telle sorte que la protéine finale est parfaitement structurée et donc à la fois active et bien tolérée par l'organisme. Cette modification chimique contribue à la régulation de 1 ' activité de la protéine, ainsi qu'à sa localisation. On peut donc quantifier, pour la totalité de la composition, et donc pour la totalité des chaînes d'oligosaccharides N-liées de la composition de FVII, le taux de chaque forme glycannique ou de chaque sucre présent dans ladite composition.
Les pourcentages des différents glycannes donnés dans la présente demande ne tiennent pas compte de la O-glycosylation .
Par « composition de FVII » on désigne une composition dont la seule entité moléculaire est le FVII, de préférence activé. Chaque molécule de FVII de la composition présente la même séquence primaire, mais une glycosylation variant d'une molécule à l'autre. Le terme « composition de FVII » désigne donc un mélange de molécules de même séquence primaire, caractérisé par ses teneurs en formes glycanniques . Aux fins de l'invention, les expressions « FVII » et « composition de FVII » sont équivalentes. Par conséquent, dans le cadre de l'invention, le terme « FVII » désigne soit la molécule de FVII en tant que telle, soit un mélange de telles molécules, présentant les caractéristiques énoncées .
La composition de FVII de l'invention est une composition de FVII dont les formes glycanniques biantennées , bisialylées et non fucosylées sont majoritaires. Ceci signifie que parmi l'ensemble des oligosaccharides N-liées de la composition, c'est-à- dire toutes les formes glycanniqueε liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII, les formes biantennées, bisialylées et non fucosylées sont les plus représentées .
Avantageusement, le taux de formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées est supérieur ou égal à 30%, à 40%, à 50%, à 60%, à 70%, à 80%, 90% ou encore 95%. De manière particulièrement avantageuse, le taux de formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées est supérieur ou égal à 45%. De manière particulièrement avantageuse, le taux de formes glycanniques biantennées , bisialylées et non fucosylées est compris entre 45% et 65%, et de manière préférentielle, compris entre 50% et 60%. Les taux d'espèces sialylées peuvent être déterminés empiriquement par les analyses en HPCE-LIF (Electrophorèse capillaire haute performance- fluorescence induite par laser) et/ou NP-HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance de Partage Classique) avec quantification par mesure de l'aire des pics correspondants aux différents glycannes, ou par toute autre méthode connue de l'homme du métier.
La composition de FVII de l'invention peut comporter également des formes minoritaires biantennées monosialylées, et triantennées, ainsi que des formes neutres, ne présentant pas d'acides sialiques.
Par « FVII recombinant ou transgénique », on désigne tout FVII issu du génie génétique, c'est-à-dire produit par des cellules dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique de manière à exprimer une molécule de FVII, et présentant les caractéristiques de glycosylation énoncées .
Ainsi, le FVII de l'invention est issu de la transcription puis de la traduction d'une molécule d'ADN codant pour le FVII dans un hôte cellulaire ou par un animal transgénique. Le FVII recombinant ou transgénique de l'invention peut être obtenu au moyen de techniques standards, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une protéine dans un système biologique.
Plus particulièrement, on entend par « FVII recombinant » tout FVII obtenu par recombinaison génétique et exprimé par une lignée cellulaire mise en culture. A titre d'exemple, on peut citer les lignées suivantes : BHK (Baby. Hamster Kidney) et notamment BHK tk"tsl3 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-I (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al, J. Gen. Virol . 36:59-72, 1977), Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600) , Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) and DUKX cells (CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 77:4216-4220, 1980), cellules 3T3 , cellules Namalwa, ou des cellules BHK adaptées à la culture sans sérum (Document US 6,903,069). De plus, on entend plus particulièrement par « FVII transgénique » tout FVII obtenu par recombinaison génétique et exprimé par un tissu vivant, animal ou végétal .
Le taux de formes bisialylées du FVII de l'invention peut être atteint de différentes manières.
Dans un mode de réalisation particulier, le FVII de l'invention est exprimé dans un micro-organisme, cellule, plante ou animal conférant les caractéristiques de glycosylation énoncées, c'est-à- dire une majorité de formes biantennées, bisialylées et non fucosylées .
Dans un autre mode de réalisation, le FVII de l'invention est exprimé dans un micro-organisme, plante ou animal ne permettant pas d'obtenir une composition de FVII présentant une majorité de formes biantennées bisialylées et non fucosylées, la sialylation étant réalisée par la suite in vitro, au moyen d'une ou de plusieurs enzymes permettant de conférer la sialylation désirée, c'est-à-dire que les formes biantennées et bisialylées deviennent majoritaires et que les formes triantennées deviennent trisialylées .
A titre d'exemple, on peut faire agir une sialyltransférase, in vitro, sur une composition de FVII choisie pour ses propriétés avantageuses, dans des conditions appropriées pour permettre la sialylation souhaitée. Ainsi, la composition de FVII de l'invention est susceptible d'être obtenue en faisant agir une sialyltransférase sur une composition de FVII partiellement sialylée (composition de FVII de départ).
Avantageusement, la composition de FVII de départ présente des formes glycanniques biantennées, monosialylées majoritaires. Avantageusement, la composition de FVII de départ présente des formes glycanniques biantennées, monosialylées et non fucosylées majoritaires. L'action de la sialyltransférase permet de greffer un acide sialique supplémentaire sur les formes monosialylées, les faisant passer à une forme bisialylée. Avantageusement, ces formes biantennées, monosialylées sont présentes dans la composition de FVII de départ à un taux supérieur à 40%, de manière particulièrement avantageuse à un taux supérieur à 50%, ou encore à 60%. Avantageusement, la composition de départ présente un taux de formes glycanniques biantennées, monosialylées et non fucosylées supérieur à 20%, ou de manière particulièrement supérieur à 30%, à 40%, ou encore à 50%.
Avantageusement, au moins certains des acides sialiques de la composition de FVII de départ impliquent des liaisons α2-6. De manière particulièrement avantageuse, le taux d'acides sialiques impliquant des liaisons α2-β est supérieur à 60%, ou encore supérieur à 70%, à 80%, ou à 90%. En particulier, ce taux -est compris entre 60% et 90%.
Préférentiellement, tous les acides sialiques de la composition de FVII de départ impliquent des liaisons α2-6.
Dans un mode de réalisation particulier, si la composition de FVII de départ comporte des formes fucosylées en proportion trop importante, par exemple supérieure à 50%, ou encore à 60%, il est possible d'obtenir des formes biantennées, bisialylées et non fucosylées au moyen d'une ou de plusieurs enzymes permettant de défucosyler la composition. A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation d'une fucosidase, pendant un temps nécessaire à l'obtention de formes glycanniqu.es majoritairement biantennées, bisialylées et non fucosylées. D'une manière particulièrement avantageuse, la composition de FVII de départ est choisie pour son caractère peu immunogène .
Avantageusement, la composition de départ est la composition de FVII décrite dans le document FR 06 04872 dont le contenu est considéré comme inclus dans le présent document.
Avantageusement, le FVII de l'invention est un polypeptide dont la séquence peptidique peut être celle du FVII humain naturel, c'est-à-dire la séquence présente chez les humains ne présentant pas de troubles liés au FVII. Une telle séquence peut être codée par exemple par la séquence Ib décrite dans le document EP
0 200 421.
Avantageusement, la séquence du FVII de l'invention est la séquence de SEQ ID NO : 1.
Dans un autre mode de réalisation, le FVII de l ' invention peut être un variant du FVII humain naturel, dans la mesure où ce variant n'est pas plus immunogène que le FVII naturel. Ainsi, la séquence peptidique de ce variant peut posséder au moins 70% d'identité, et de manière avantageuse au moins 80% ou 90%, et de manière encore plus avantageuse au moins 99% d'identité avec la séquence du FVII humain naturel, un tel variant possédant essentiellement la même activité biologique que le FVII naturel .
Par ailleurs, le FVII de l'invention désigne également toute séquence de FVII modifiée de manière à ce que l'activité biologique de la protéine soit réduite par rapport au FVII naturel humain. A titre d'exemple, on peut citer le FVII humain recombinant inactivé FFR-FVIIa, utilisé pour le traitement ou la prévention des thromboses (Holst et al, Eur. J.Vasc.Endovasc.Surg. , 1998 Jun, 15(6) : 515-520). De tels FVII sont des polypeptides présentant une séquence en acides aminés gui diffère de la séquence du FVII naturel par l'insertion, la délétion ou la substitution d'un ou de plusieurs acides aminés.
L'activité biologique du FVII de l'invention peut être quantifiée en mesurant la capacité d'une composition de FVII à induire la coagulation sanguine au moyen d'un plasma déficient en FVII et de la thromboplastine, comme par exemple décrit dans le brevet US 5,997,864. Dans le test décrit dans le brevet US 5,997,864, l'activité biologique est exprimée par une réduction du temps de coagulation par rapport à l'échantillon contrôle, et est convertie en « unités de FVII » par comparaison avec un standard de sérum humain (pool) contenant 1 unité (1 U d'activité de FVII) /ml de sérum. La composition de FVII de l'invention présente des caractéristiques de glycosylation se rapprochant de celle du FVII plasmatique. En effet, la forme des N- glycannes majoritaire du FVII plasmatique (ou composition de FVII plasmatique) est également la forme biantennée, bisialylée.
Avantageusement, le taux de formes biantennées, bisialylées (fucosylées et non fucosylées) , du FVII de la composition de l'invention est supérieur à 30%, ou à 40% ou à 50%. De manière particulièrement avantageuse, le taux de formes biantennées, bisialylées est supérieur à 60%, ou à 70%, ou à 80% ou bien encore à 90%. De manière particulièrement avantageuse, le taux de formes bisialylées (fucosylées et non fucosylées) est compris entre 50% et 80%, ou entre 60% et 90%, ou, de manière préférentielle, entre 70% et 85%. Avantageusement, le taux de fucose de la composition de FVII de l'invention est supérieur à 20%, et est avantageusement compris entre 20% et 50%. Ce taux correspond au taux de fucose mesuré parmi toutes les formes glycanniques du FVII de la composition.
Cette caractéristique est l'un des avantages du FVII de l'invention. En effet, le FVII recombinant disponible dans le commerce présente un taux de fucosylation de 100%, alors que le FVII plasmatigue possède un taux de fucosylation de 16% environ. Ainsi, la fucosylation du FVII de l ' invention est proche de celle du FVII plasmatique, ce qui confère un avantage au FVII de l'invention en terme d'innocuité.
Avantageusement, au moins certains des acides sialiques de la composition de facteur VII de l'invention impliquent des liaisons α2-6. De manière particulièrement avantageuse, le taux d'acides .sialique impliquant des liaisons α2-6 est supérieur à 60%, ou encore supérieur à 70%, à 80%, ou à 90%. En particulier, ce taux est compris entre 60% et 90%.
La composition de FVII de l'invention comporte donc un taux non nul d'acide sialique impliquant des liaisons α2-6. Ceci est un avantage par rapport au FVII recombinant commercial, qui ne comporte que des acides sialiques impliquant des liaisons α2-3, alors que le FVII plasmatique en comporte.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, tous les acides sialiques de la composition de FVII de l'invention impliquent des ' liaisons α2-6.
De façon particulièrement préférée, tous les acides sialiques impliquent des liaisons α2,6, c'est-à- dire que tous les acides sialiques sont liés au galactose par une liaison a.2,6, et, en particulier, au moins 90% des acides sialiques du FVII impliquent des liaisons α2,6. La composition de FVII selon l'invention peut en outre comprendre des acides sialigues de liaisons α2-3.
Le fait que des acides sialiques du FVII de la composition impliquent des branchements α2 , 6 est un des avantages du FVII de l'invention. En effet, les acides sialiques du FVII recombinant disponible dans le commerce impliquent uniquement des liaisons α2 , 3. Or, le FVII plasmatique est un mélange de ces deux isomères . Un tel FVII plasmatique contient par exemple 40% d'isomères oc2,3 et 60% d'isomères «2,6. Toutefois, ce dernier comporte plus de liaisons α2,6, ce qui rapproche encore le FVII de l'invention du FVII plasmatique .
Dans un autre mode de réalisation, certains acides sialiques de la composition de FVII de l'invention impliquent des liaisons α2-3.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le FVII recombinant ou transgénique de la composition présente des formes glycanniques biantennées , bisilalylées et non fucosylées majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII, et un taux d'acides sialiques impliquant des liaisons cx2-6 supérieur à 90%. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le FVII recombinant ou transgénique de la composition présente des formes glycanniques biantennées, bisilalylées et non fucosylées majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII, et un taux d'acides sialiques impliquant des liaisons α2-6 égal à 100%.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le FVII recombinant ou transgénique de la composition présente des formes glycanniques biantennées, bisilalylées et non fucosylées majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniqu.es liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII, le taux de fucose de la composition de FVII étant compris entre 20% et 50%.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le FVII recombinant ou transgénique de la composition présente des formes glycanniques biantennées, bisilalylées et non fucosylées majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII, tous les acides sialiques impliquant des liaisons α2-6, et le taux de fucose de la composition de FVII étant compris entre 20% et 50%.
Avantageusement, la composition de FVII de l'invention est susceptible d'être produite par un mammifère non humain transgénique.
Dans ce mode de réalisation la composition de FVII de l'invention sera donc qualifiée de « transgénique ». Par mammifère transgénique, on entend tout mammifère à l'exception de l'être humain, manipulé génétiquement pour exprimer une protéine exogène, par exemple le lapin, la chèvre, la souris, le rat, les bovins, le cheval, le porc, les insectes, le mouton, cette liste n'étant pas limitative. La protéine exogène est le FVII, de préférence le FVII humain. Le mammifère non humain transgénique peut, en plus du FVII, exprimer une enzyme exogène de manière à conférer la sialylation désirée à la composition de FVII transgénique. A ce titre, l'animal non-humain transgénique peut co- exprimer le gène codant pour le FVII et le gène codant pour une sialyltransférase.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le FVII transgénique de l'invention est exprimé dans les glandes mammaires du mammifère transgénique et produit dans son lait. A ce titre, l'expression du transgène se fait de manière tissus- dépendante, au moyen d'un promoteur assurant la production du transgène dans les glandes mammaires de l'animal. On peut citer le promoteur WAP (whey acidic protein) , le promoteur de la caséine, en particulier le promoteur de la β-caséine ou l'α-caséine, le promoteur de la β-lactoglobuline, le promoteur de l'α- lactalbumine, cette liste n'étant pas limitative.
Avantageusement, la composition de FVII de l'invention est susceptible d'être produite par une lapine transgénique, ladite composition étant ensuite soumise à une sialylation in vitro de manière à ce que les formes biantennées , bisialylées deviennent maj oritaires .
Le lapin est une espèce particulièrement avantageuse pour la production de protéines thérapeutiques car le lapin ne semble pas sensible aux prions, notamment à 1 ' encéphalopathie spongiforme subaiguë transmissible, qui constitue un problème de santé publique majeur.
De plus, la barrière d'espèce entre le lapin et l'homme est importante. A l'inverse, la barrière d'espèce entre l'homme et le hamster, qui est le système biologique dans lequel est produit le FVII recombinant disponible dans le commerce, est moins importante.
Ainsi, la production du FVII dans le lapin est avantageuse en terme de sécurité quant à la transmission d'agents pathogènes, y compris d'agents pathogènes non conventionnels de type prions .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le FVII de l'invention est produit dans les glandes mammaires de lapines transgéniques .
La sécrétion par les glandes mammaires de la protéine d'intérêt, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique est une technique bien connue de l'homme du métier, qui implique le contrôle de l'expression de la protéine recombinante de manière tissus-dépendante. Le contrôle tissulaire άe l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Ces séquences, sont notamment les séquences promoteur, ainsi que les séquences peptides signal.
Des exemples de promoteurs permettant l'expression d'une protéine d'intérêt dans les glandes mammaires sont le promoteur WAP (whey acidic protein) , le promoteur de la caséine, notamment le promoteur de la β-caséine, l'α-caséine, le promoteur de la β- lactoglobuline, l 'ot-lactalbumine, cette liste n'étant pas limitative. De manière particulièrement avantageuse, l'expression dans les glandes mammaires de la lapine est effectuée sous le contrôle du promoteur de la β-caséine.
Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour le FVII humain, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le FVII transgénique d' intérêt.
Un exemple de procédé de préparation de protéine transgénique dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l ' être humain est donné dans le document EP 0 264 166, dont l'enseignement peut être repris pour la production du FVII de l'invention.
Un autre exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production du FVII de l'invention.
La composition de FVII produite dans les glandes mammaires de lapine se caractérise en ce que au moins certains des acides sialigues du facteur VII impliquent des liaisons a.2-6.
De façon particulièrement préférée, tous les acides sialiques impliquent des liaisons a.2,6, et, en particulier, au moins 90% des acides sialiques du FVII impliquent des liaisons α2 , 6. La composition de FVII selon l'invention peut en outre comprendre des acides sialiques de liaisons α2-3.
De manière particulièrement avantageuse, le taux d'acides sialiques impliquant des liaisons «2-6 est supérieur à 60%, ou encore supérieur à 70%, à 80%, ou à 90%. En particulier, ce taux est compris entre 60% et 90%.
Parmi les formes glycanniques biantennées, monosialylées de la composition de FVII exprimée par la lapine, les formes glycanniques majoritaires sont non fucosylées. Avantageusement, ces formes glycanniques biantennées, monosialylées et non fucosylées -sont présentes dans le FVII de cette composition à un taux supérieur à 20%. Avantageusement, ce taux est supérieur à 25%, ou encore supérieur à 40%.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le taux de fucosylation du FVII de cette composition de l'invention est compris entre 20% et 50%. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, ce taux peut être inférieur à 15%.
Le FVII transgénique de lapine comporte plusieurs modifications post-traductionnelles : les neuf ou dix premiers acides glutamiques N-terminaux sont γ carboxylés, l'Asp63 (Asparagine63) est partiellement hydroxylé, la Sers2 (Serine 52) et la Ser60 (Serine 60) sont O-glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose (Xylose) 0-2 et Fucose, l'Asni45 et l'Asn322 sont N- glycosylées majoritairement par des formes glycanniques complexes biantennées monosialylées .
Une telle composition de FVII produite par les glandes mammaires de lapine est décrite dans le document FR 06 04872, dont le contenu est incorporé dans le présent enseignement.
Le FVII produit dans le lait par des mammifères transgénique peut être purifié à partir du lait par des techniques connues de l'homme du métier.
Par exemple, une méthode de purification d'une protéine d'intérêt à partir de lait, telle que décrite dans le brevet US 6,268,487, peut comprendre les étapes suivantes consistant à : a) soumettre le lait à une filtration tangentielle sur une membrane de porosité suffisante pour former un rétentat et un perméat, le perméat contenant la protéine exogène, b) soumettre le perméat à un appareil de capture par chromatographie de manière à déplacer la protéine exogène et obtenir un effluent, c) combiner l'effluent et le rétentat, d) répéter les étapes a) à c) jusqu'à ce que le FVII soit séparé des lipides, des micelles- de caséines, et que le FVII soit récupéré à au moins 75%.
Une autre technique de purification du FVII produit dans le lait d'un mammifère transgénique est décrite dans la demande de brevet FR 06 04864 déposée par la Demanderesse, dont le contenu est incorporé par référence. Ce procédé d'extraction et de purification du FVII (Procédé A), contenu dans du lait d'un animal transgénique, comprend les étapes suivantes consistant à : a) extraire le FVII à partir du lait, le facteur VII étant lié aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait, par la précipitation de composés de calcium obtenue par ajout dans le lait d'un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former lesdits composés de calcium insolubles pour ainsi libérer le facteur VII desdits sels et/ou complexes, le facteur VII étant présent dans une phase liquide, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, c) soumettre la phase aqueuse non lipidique à une étape de chromâtographie d'affinité, en utilisant un tampon d'élution à base d'un sel de phosphate à une concentration prédéterminée, et d) soumettre l'éluat de facteur VII, obtenu selon l'étape c) , à deux ou trois étapes de chromâtographie sur des colonnes échangeuses d'anions de type base faible utilisant des tampons appropriés pour des élutions successives du facteur VII retenu sur lesdites colonnes. En effet, la Demanderesse a constaté de manière surprenante que le FVII, même placé sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine naturellement produite dans le lactosérum, comme le promoteur WAP ou le promoteur de la β-caséine par exemple, est néanmoins susceptible de se trouver associé aux ions calcium du lait, et donc aux micelles de caséines.
Une autre technique de purification du FVII produit dans le lait d'un mammifère transgénique est décrite dans la demande de brevet FR 06 11536 déposée par la Demanderesse, dont le contenu est incorporé par référence. Ce procédé d'extraction et de purification du FVII contenu dans du lait d'un animal transgénique (Procédé B) , comprenant les étapes suivantes de: a) Ecrémage et délipidation dudit lait, b) Passage de la fraction délipidée et écrémée contenant ladite protéine sur un support chromatographique sur lequel est greffé un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique, dans des conditions de pH permettant à ladite protéine d'être retenue sur ledit support, c) Elution de la protéine, d) Purification de la fraction éluée par élimination des protéines du lait de ladite fraction éluée, et e) Récupération de ladite protéine.
Lorsque la composition de FVII est produite par une lapine transgénique, elle est soumise à une sialylation in vitro de manière à ce que les formes biantennées, bisialylées deviennent majoritaires.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sialylation est effectuée au moyen d'une sialyltransférase, par exemple I'α2,6-(N)- sialyltransférase (ou β-D-Galactosyl- βl, 4-N-acétyl- β- D-glucosamine-α2 , 6-sialyltransférase) , ou la GaI bêta 1,3GaINAc alpha 2, 3-sialyltransférase, ou la GaI bêta 1,3(4) GIcNAc alpha 2,3 sialyltransférase, ou GaINAc alpha-2 , 6-sialyltransférase I, ces enzymes étant disponibles dans le commerce. Préférentiellement, la sialyltransférase utilisée est une sialyltransférase permettant de transférer des acides sialiques via une liaison α2,6. En effet, il est avantageux que la composition de FVII de l'invention présente des acides sialiques impliquant des liaisons «2-6, car cet isomère est plus représenté dans le FVII plasmatique. La sialylation peut être effectuée avec un substrat donneur d'acide sialigue, tel que l'acide sialique lui-même ou toute molécule qui comporte de l'acide sialique et susceptible de libérer de l'acide sialique.
Selon un mode de réalisation de l'invention, si l'enzyme est 1 'α2, 6- (N) -sialyltransférase, le substrat est l'acide cytidine-5 ' -monophospho-N- acétylneuraminique, dans un milieu réactionnel approprié pour permettre le transfert de l'acide sialique du groupement donneur d'acide sialique au FVII, les formes biantennées, bisialylées devenant majoritaires. Ce milieu réactionnel peut, par exemple, être à base d'un tampon composé d'acide morpholino-3 propanesulfone, et d'un tampon, par exemple, à base de Tween.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le substrat peut être synthétisé dans le milieu réactionnel en incluant dans ce milieu une cytidine monophosphate (CMP) -sialique acide synthetase, de l'acide sialique, du CTP (cytidine triphosphate) et un taux suffisant d'un cation métallique divalent pour permettre à la réaction de se produire. A titre d'exemple, le cation métallique divalent peut être l'ion calcium, l'ion zinc, l'ion magnésium, l'ion chrome, l'ion cuivre, l'ion fer ou l'ion cobalt.
Quel que soit le mode de réalisation de la sialylation de la composition de FVII, la réaction est toujours effectuée pendant un temps suffisant et des conditions appropriées pour permettre l'augmentation des formes bisialylées de manière suffisante pour qu'elles deviennent majoritaires. A titre indicatif, la réaction peut être effectuée pendant au moins 0,5 heures, de manière particulièrement avantageuse pendant au moins 5 heures, ou encore pendant 7 heures, ou encore pendant 8 heures, 9 heures, voire 10 heures. Préférentiellement, l'incubation a lieu pendant toute une nuit. En particulier, cette réaction est effectuée pendant des durées comprises entre 5 et 12 heures.
Avantageusement, le FVII de la composition de l'invention est activé (FVIIa). A ce titre, le FVIIa peut présenter une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII
(non activé) lorsque ce dernier interagit en lieu et place du premier avec le facteur tissulaire (FT) .
L'activation du FVII résulte, in vivo, du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa seul a très peu d'activité enzymatique, mais complexé avec son cofacteur, le facteur tissulaire (FT) , il déclenche le processus de la coagulation en activant le FX et le FIX. Le FVIIa est le facteur de la coagulation responsable de l'hémostase chez les hémophiles ayant des anticorps circulants par exemple. D'une manière- particulièrement avantageuse, le FVII de l'invention est totalement activé. Avantageusement, le FVIIa de l'invention comporte plusieurs modifications post- traductionnelles : les neuf ou dix premiers acides glutamiques N-terminaux sont Y -carboxylés, l'Asp63 est partiellement hydroxylé, la Ser52 et la Sergo sont 0- glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose (Xylose) 0-2 et Fucose, l'Asni45 et l 'ASn322 sont N- glycosylées majoritairement par des formes complexes biantennées, bisialylées et non fucosylées.
L'activation du FVII peut également résulter d'un procédé réalisé in vitro, par exemple lors de la purification du FVII de l'invention (cf. exemple 2).
Le FVIIa de l'invention est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de poids moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de poids moléculaire d'environ 30 kDa liées entre elles par un seul pont disulfure (Cysi35-Cys262) - Ainsi, le FVII de l'invention est un FVII activé possédant une activité et une structure proche du FVII plasmatique.
Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII lorsqu'ils interagissent avec le facteur tissulaire (FT) .
Dans un mode de réalisation de l'invention, le FVII peut être activé In vitro par les facteurs Xa, VIIa, Ha, IXa et XIIa. Le FVII de l'invention peut également être activé pendant son procédé de purification.
Un autre objet de l'invention est une composition de FVII de l'invention, pour son utilisation comme médicament .
Un autre objet de l'invention, est l'utilisation d'une composition de facteur VII selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients atteints d'hémophilie.
Un autre objet de l'invention- est l'utilisation d'une composition de facteur VII selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des traumatismes hémorragiques multiples.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une composition de facteur VII selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hémorragies dues à un surdosage en anticoagulants .
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant le facteur VII selon l'invention et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables. Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'une composition de facteur VII recombinant ou transgénique, dont chaque molécule de facteur VII de la composition comporte des formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation et dans laquelle parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, les formes glycanniques biantennées, bisialylées sont majoritaires, comprenant une étape de sialylation par mise en contact d'une composition de facteur VII transgénique ou recombinant partiellement sialylé comme définie plus haut avec un substrat donneur d'acide sialique et une sialyltrasférase, dans un milieu réactionnel approprié pour permettre l'activité de la sialyltransférase, pendant une durée suffisante et des conditions appropriées pour permettre un transfert de l'acide sialique du substrat donneur d'acide sialique au FVII et une augmentation des formes bisialylées de manière suffisante, lesdites formes bisialylées devenant ainsi majoritaires. Les conditions de mise en œuvre de la réaction sont illustrées plus haut, ainsi que dans les exemples .
On entend par « partiellement sialylé » une composition de FVII dont les formes glycanniques liées en N ne sont pas toutes bisialylées, c'est-à-dire dont certaines formes sont monosialylées . Avantageusement, ces formes biantennées, monosialylées sont présentes à un taux supérieur à 40%, de manière particulièrement avantageuse à un taux supérieur à 50%, ou encore à 60%. Avantageusement, le taux de formes glycanniques biantennées, monosialylées et non fucosylées est supérieur à 20%, ou de manière particulièrement supérieur à 30%, à 40%, ou encore à 50%.
Avantageusement, la sialyltransférase est I'α2,6- (N) -sialyltransférase (ou β-D-Galactosyl- βl,4-N- acétyl- β-D-glucosamine-α2, 6-sialyltransférase) , ou la GaI bêta 1,3GaINAc alpha 2, 3-sialyltransférase, ou la GaI bêta 1,3(4) GIcNAc alpha 2,3 sialyltransférase, ou GaINAc alpha-2, 6-sialyltransférase I.
Préférentiellement, la sialyltransférase utilisée est une sialyltransférase permettant de transférer des acides sialiqu.es via une liaison oc2 , 6. En effet, il est avantageux que le FVII de la composition de l'invention présente des acides sialiques impliquant des liaisons α2-6, car cet isomère est plus représenté dans le FVII plasmatique. La sialylation peut être effectuée avec tout substrat donneur d'acide sialique.
Selon un mode de réalisation, si l'enzyme est 1 ' α2 , 6- (N) -sialyltransférase, le substrat est l'acide cytidine-5 ' -monophospho-N-acétylneuraminique, dans un milieu réactionnel approprié pour permettre le transfert de l'acide sialique du groupement donneur d'acide sialique au FVII, les formes biantennées, bisialylées devenant majoritaires.
Le milieu réactionnel peut être à base d'un tensioactif biologiquement compatible, tel que le
Tween®80 ou le Triton®X-100 ou un mélange des deux à une concentration de 0,01% à 0,2%, ou d'un cation métallique divalent, tel que les cations Ca2+, Mn2+, Mg2+ ou Co2+, Ca2+ étant le préféré, à une concentration comprise entre 5 mM et 10 mM. Ce milieu réactionnel peut en outre comprendre des agents d'ajustement de la force ionique et/ou participant au maintien du pH du milieu, tel que le cacodylate de sodium, l'acide morpholino-3 propanesulfonique, le Tris et NaCl à des concentration variant de 40 mM à 60 mM. Les valeurs de pH sont typiquement comprises entre 6 et 7,5. Enfin, le milieu réactionnel peut également comprendre de l'albumine de sérum bovin (BSA) à une concentration comprise entre 0,05 et 0,15 mg/ml. Selon un autre mode de réalisation, le substrat peut être synthétisé dans le milieu réactionnel en mettant dans ce milieu une CMP-sialique acide synthetase, de l'acide sialique, du CTP (cytidine triphosphate) et un taux suffisant d'un cation métallique divalent, dont des exemples sont donnés plus haut. Quel que soit le mode de réalisation de la sialylation de la composition de FVII, la réaction est toujours effectuée pendant un temps suffisant et des conditions appropriées pour permettre l'augmentation des formes bisialylées de manière suffisante pour qu'elles deviennent majoritaires, comme défini plus haut .
Lorsque le procédé met en oeuvre une enzyme immobilisée, la durée de la réaction est de préférence comprise entre 0,5 à 3 heures à une température avantageusement comprise entre 4 et 370C, de préférence entre 40C et 2O0C.
Lorsque le procédé met en oeuvre une réaction en batch, la durée de la réaction est de préférence comprise entre 1 heure et 9 heures, de préférence entre 1 heure et 6 heures, à une température avantageusement comprise entre 4 et 370C, de préférence entre 40C et 2O0C.
De préférence, le procédé de l'invention est un procédé pour améliorer la biodisponibilité de la composition de facteur VII transgénique ou recombinant partiellement sialylé. Cette amélioration de la biodisposibilité est obtenue par la mise en contact de ladite composition avec un substrat donneur d'acide sialique et une sialyltrasférase, tel que mentionnée plus haut .
Par « amélioration de la biodisponibilité », on entend une augmentation d'au moins 5%, ou d'au moins 10%, ou avantageusement d'au moins 30% ou 50%, et de manière préférentielle d'au moins 80% ou 90% de la biodisponibilité de la composition de FVII par rapport à la même composition de FVII dont la sialylation n'a pas été modifiée. Dans un autre mode de réalisation particulier, il est effectué préalablement à l'étape de sialylation une étape de galactosylation. Cette étape a pour but de greffer un galactose sur des formes déficientes en galactose, c'est-à-dire les formes agalactosylées et monogalactosylées du FVII. Le galactose se fixe à la GIcNAc, et sera susceptible de pouvoir fixer un résidu d'acide sialique lors de l'étape ultérieure de sialylation. Cette étape de galactosylation peut être effectuée au moyen d'une galactosyltransférase, dans un milieu réactionnel incluant de l'UDP-gal uridine (5'- diphosphogalactose) , connu de l'homme du métier.
Avantageusement, les formes glycanniques majoritaires de la composition de FVII partiellement sialylé sont de type complexe, biantenné, monosialylé.
De telles formes glycanniques sont représentées ci- dessous :
Figure imgf000029_0001
À : Acide sialique
Galactose
: N-acétylglucosamine (GIcNAc) •.Mannose
Fucose
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition de FVII partiellement sialylé comprend également des formes complexes biantennées non sialylées (fucosylées ou non) , trianténnées non sialylées (fucosylées ou non) , et bisialylées (fucosylées ou non) .
Avantageusement, parmi les formes glycannigues biantennées, monosialylées de ladite composition de FVII partiellement sialylé, les formes glycannigues majoritaires sont non fucosylées.
Avantageusement, la composition de FVII partiellement sialylé présente au moins certains des acides sialigues impliquant des liaisons α2-6, comme indiqué précédemment. De préférence, le procédé comporte en outre, préalablement à l'étape de sialylation, • une étape de production de la composition de FVII transgénique partiellement sialylé par des lapines transgéniques. Cette étape est mise en oeuvre comme indiqué précédemment. Cette étape peut également être mise en oeuvre avant l'étape de galactosylation.
Avantageusement, le FVII de la composition de FVII partiellement sialylé est activé.
Le procédé de l'invention permet d'obtenir, parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, un taux formes biantennées, bisialylées maj oritaires .
Avantageusement, le groupement donneur d'acide sialique est l'acide cytidine-5 ' -monophospho-N- acétylneuraminique et la sialyltransférase est l'a.2,6- (N) -sialyltransférase. Une telle composition de FVII partiellement sialylé peut être une composition de FVII transgénique produite dans les glandes mammaires d'une lapine transgénique . D'une manière particulièrement avantageuse, la composition de FVII partiellement sialylé est la composition décrite dans le document FR 06 04872, dont le contenu est considéré comme inclus dans le présent document .
D ' autres aspects et avantages de l ' invention seront décrits dans les exemples gui suivent , qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l ' étendue de l ' invention .
Abbréviations
FVII-Tg = FVIIa-Tg: FVII transgénique activé selon
1 ' invention
FVII-r = FVIIa-r : FVII recombinant activé disponible dans le commerce
FVII-p = FVIIa-p : FVII d'origine plasmatique activé, c'est-à-dire purifié à partir de plasma humain.
BIALDI-TOF : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight
HPCE-LIF : High Performance Capillary Electrophoresis-
Laser Induced Fluorescence (Electrophorèse capillaire haute performance-fluorescence induite par laser)
MS-ESI : Spectrométrie de masse-Ionisation « Electrospray ».
LC-ESIMS : Chromatographie liquide- Spectrométrie de masse-Ionisation « Electrospray »
NP-HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance en
Phase Normale PNGase F : Peptide : N-glycosidase F
LC-MS : Chromatographie en phase Liquide-Spectrométrie de Masse Description, des figures
Figure 1 : Extraction et purification de la composition de FVII obtenue dans l'exemple 1.
Figure 2 : Spectres de masse ESI déconvolués des peptides porteurs des sites de N-glycosylation.
Figure 3 : Electrophérogrammes HPCE-LIF après déglycoεylation du FVII par la PNGase F ;
Légende : électrophérogramme du haut : FVIIa, p ; les deux electrophérogrammes du milieu : FVII-Tg ; électrophérogramme du bas : FVIIa, r.
Figure 4 : Caractérisation du FVII par NP-HPLC ;
Légende : chromatogramme du haut : FVIIa, p ; chromatogramme du milieu : FVII-Tg ; chromatogramme du bas : FVIIa, r.
Figure 5 : Identification des formes glycanniques majoritaires du FVII-Tg par MALDI-TOFMS.
Figure 6 : Identification des formes glycanniques majoritaires du FVIIa, r par MALDI-TOFMS.
Figure 7 : Analyses HPCE-LIF de la resialylation in vitro : (bas) carte oligosaccharidique du FVII-Tg natif ; (haut) carte oligosaccharidique du FVII-Tg après resialylation.
Figure 8 : Cinétique de sialylation du FVII-Tg selon le pourcentage de formes biantennées, bisialylées, non fucosylées (A2) et fucosylées (A2F) au cours du temps. Figure 9 : Résultats de l'étude préliminaire PK (PK : pharmacocinétique) comparative chez le lapin, FVII transgénique non resialylé (FVIITgNRS) par rapport au FVII transgénique resialylé (FVIITgRS) : courbes d'élimination semi-log.
Exemples
Exemple 1 : Production de lapines transgéniques produisant une protéine de FVII humain dans leur lait
On prépare tout d'abord un plasmide pi en introduisant la séquence du gène WAP (décrite dans le document Devinoy et al, Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16, 25 août 1988, p. 8180) dans le polylinker du vecteur p-poly III-I (décrit dans le document Lathe ét al, Gène (1987) 57, 193-201).
Le plasmide p2 , obtenu à partir du plasmide pi, contient le promoteur du gène de la WAP de lapin et le gène du FVII humain.
Les lapines transgéniques ont été obtenues par la technique classique de microinjection (Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Sci . USA (1985) 82, 4438-4442). 1-2 pi contenant 500 copies du gène ont été injectés dans le pronucleus mâle d'embryons de lapins. Les fragments de ce vecteur contenant les gènes recombinés ont été microinjectés. Les embryons ont ensuite été transférés dans 1 'oviducte de femelles adoptives hormonalement préparées. Environ 10% des embryons manipulés ont donné naissance à des lapereaux et 2-5 % des embryons manipulés à des lapereaux transgéniques . La présence des transgènes a été révélée par la technique de transfert de Southern à partir de I1ADN extrait des queues des lapins . Les concentrations de FVII dans le sang et dans le lait des animaux ont été évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.
L ' activité biologique du FVII a été évaluée en ajoutant du lait au milieu de culture de cellules ou d'expiants mammaires de lapin.
Exemple 2 : Extraction et purification du FVII obtenu a) Extraction du FVII
On considère 500 ml de lait brut non écrémé qui sont dilués par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en FVII est centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 150C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min - rotor SLC-6000) . 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires.
Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème) , une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium) .
La phase aqueuse non lipidique FVII est collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse est collectée à part. La phase solide (précipité) est éliminée.
La phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles quantités de lipides, est filtrée sur une séquence de filtres (PaIl SLK7002U010ZP - préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 μm - puis PaIl SLK7002NXP - Nylon 66 de taille de pores de 0,45 μm) . En fin de filtration, la phase lipidique est passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair. La phase aqueuse non lipidique filtrée est ensuite dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution
(environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.
On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi en FVII-Tg. Cette préparation est stockée à -3O0C avant la poursuite du procédé. Le rendement global de récupération du FVII par cette étape est très satisfaisant : 90% (91% extraction au phosphate + 99% Dialyse/concentration) .
La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiqu.es qui font suite.
Environ 93 000 UI de FVII-Tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de cette préparation est de l'ordre de 0,2%.
b) Purification du FVII
1. Chromatographie sur gel d' hydroxyapatite
(chromatographie d'affinité)
Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) est remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I) .
Le gel est équilibré en tampon aqueux A constitué d'un mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à -300C est décongelée au bain- marie à 370C jusqu'à dissolution complète du glaçon puis est injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105 ml/min) . La fraction non-retenue est éliminée par passage d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB) .
L'élution de la fraction contenant le FVII-Tg se fait par le tampon B constitué de phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la ligne de base. La détection des composés est assurée par mesure de l 'absorban.ee à λ= 280 nm.
Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII-Tg, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A. S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII-Tg de pureté de 4% sont disponibles à ce stade.
2. Filtration tangentielle ICK) kDa et concentration/dialyse 50 kDa
La totalité de l'éluat de l'étape précédente est filtrée en mode tangentiel sur une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (PaIl OMEGA SC 100K - 0,1 m2) . Le FVII est filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de. poids moléculaire supérieur à 100 kDa ne sont pas filtrables.
La fraction filtrée est ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l 'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit plus haut. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M.
A ce stade du procédé, le produit est stocké à - 300C avant passage en chromatographie d'échange d'ions.
Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes . Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII-Tg, soit 82 000 UI de FVII-Tg. Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales.
3. Chromatographies sur gel Q-Sepharose® FF (étape d) - Procédé A)
Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-Sepharose® Fast Flow (QSFF) sont réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer et formuler la composition en FVII. La détection des composés est assurée par mesure de l'absorbance à λ= 280 nm.
3.1 Etape Q-Sepharose® FF 1 - élution « High Calcium »
Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de section) est remplie de 100 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) .
Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La- totalité de fraction conservée à -300C est décongelée au bain-marie à 370C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction est diluée au 1A [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de 150 cm/h) , puis la fraction non retenue est éliminée par passage du tampon jusqu'au RLB.
Une première fraction protéique à faible teneur en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et est ensuite éliminée.
Une deuxième fraction protéique riche en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH -7 , 5. Cette deuxième fraction est dialysée sur
1 'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit plus haut. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction est conservée à +40C durant une nuit avant le 2eme passage en chromatographie d'échange d'anions.
Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI de FVII-Tg) , tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes . Elle permet également l'activation du FVII en FVIIa.
3.2 Etape Q-Sepharose® FF 2 - élution « Low Calcium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 30 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) . Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée précédente (deuxième fraction) , conservée à +40C, est diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h) . Après injection de la fraction, le gel est lavé par le tampon d'équilibrage pour l'élimination de la fraction non retenue, jusqu'au RLB.
Une fraction contenant du FVII de très haute pureté est éluée à 4,5 ml/min (soit 50 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,5.
Environ 23 000 UI de FVII-Tg ont été purifiées, soit 12 mg de FVII-Tg.
Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine) .
Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches des molécules naturelles du FVII humain. Il est concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions. 3.3 Etape Q-Sepharose® FF 3 - élution « Sodium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) .
Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
Après injection de la fraction, le gel est lavé par le tampon d'équilibrage pour l'élimination de la fraction non retenue, jusqu'au RLB.
La fraction éluée purifiée de l'étape précédente est diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 50 cm/h) .
Le FVII-Tg est ensuite élue à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0. Une composition de FVII-Tg sous forme de concentré a été préparée dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en œuvre.
Le Tableau A résume les étapes du procédé selon une mise en œuvre préférée de l'invention pour fournir la composition de FVII purifiée, et fournit les différents rendements, la pureté et les activités spécifiques obtenus à chaque étape.
Le FVII-Tg de la composition est ensuite soumis à différentes analyses structurales, telles que développées dans les exemples qui suivent. Exemple 3 : Caractérisation des sites de glycosylation et des glycopeptides par MS-ESI
Les sites de N-glycosylation du FVII-Tg, du FVIIa, p (FVII plasmatique) et du FVIIa, r ont été identifiés par
LC-ESIMS ( /MS) , confirmés par MALDI-TOFMS, et les proportions relatives des différents glycannes présents sur chaque site ont été déterminées par LC-ESIMS.
La figure 2 représente les spectres ESI déconvolués des glycopeptides contenant les deux résidus Asn glycosylés. La localisation des sites de glycosylation a été confirmée par MALDI-TOF (/TOF) ainsi que par séquençage d'Edman.
L'analyse des spectres de masse des glycopeptides [D123-R152] et [K31-6-R353] du FVIIa, p, présentant respectivement les sites de N-glycosylation Asni45 et Asn322/ révèle la présence d'une forme biantennée, tdsialylée non fucosylé (A2) (masse observée du glycopeptide contenant l'ASn145: 5563,8 Da) et fucosylée (A2F) (masse observée pour le glycopeptide avec l'Asni45: 5709,8 Da). On note également pour l 'ASnI45 la présence d'oligosaccharides triantennés, trisialylés non fucosylés (A3) (masse obs . 6220,0 Da) et fucosylés (A3F) (masse obs. 6366,1 Da).
Pour le FVIIa, r, l 'ASnI45 est modifiée par des glycannes de type A2F, AlF et "AlF", celui-ci correspondant à une forme monosialylée avec un GaINAc en position terminale sur l'autre antenne. On note la présence de glycannes A3F (formes triantennées , trisialylées, fucosylés) .
Pour le FVII-Tg, l'analyse des spectres de masse des glycopeptides [D123-R152] et [K3L6-R353] du FVII-Tg, présentant respectivement les sites de N-glycosylation Asni45 et ASn322/ révèle la présence de formes biantennées, bisialylées non fucosylées (A2) (masse observée du glycopeptide contenant l'ASn145: 5563,8 Da) et fucosylées (A2F) (masse observée : 5709,7 Da). On note également la présence majoritaire â'oligosaccharides, situés sur l'Asni45, biantennés, monosialylés non fucosylés (Al) (masse observée : 5272,3 Da) et fucosylés (AlF) (masse observée : 5418,7 Da) . Les formes triantennées sont peu représentées. Il est à noter qu'aucune forme monosialylée avec un GaINAc en position terminale sur l'autre antenne n'est présente. Concernant les glycoformes majoritaires de l'Asn322/ on observe les mêmes structures glycanniques dans des proportions différentes. La figure 1 révèle la présence de formes moins matures (moins antennées et sialylées) que sur l'Asni45. Par exemple, les formes triantennées sont moins représentées sur Asn322 que sur ASnI45 pour le produit plasmatique et absentes sur les FVIIa, r et FVII-Tg. Il faut noter également que les Asn 145 et 322 sont glycosylées à 100%. Bien qu'uniquement semi-quantitatifs, ces résultats sont en accord avec les données quantitatives obtenues par HPCE-LIF et NP- HPLC.
Exemple 4 : Quantification des N-glycannes par HPCE-LIF
L'identification et la quantification des oligosaccharides N-liés sont réalisées par HPCE-LIF après déglycosylation par la PNGase F. Les échantillons de FVII sont traités par des exoglycosidases (sialidase
(ratio ENZYME/SUBSTRAT 1 mUI/10 μg) , galactosidase, hexnacase (kit Prozyme) , fucosidase (ratio E/S : 1 mUI/10 μg) de façon à s'assurer de l'identification et de la quantification de chaque structure isolée. Les glycannes obtenus sont marqués par un fluorochrome et séparés en fonction de leur masse et de leur charge. Deux standards (homopolyméres de glucose, oligosaccharidiques) permettent d'identifier les structures. La quantification se fait par l'intégration de chaque pic ramenée, en pourcentage, à l'ensemble des oligosacharides quantifiés. On utilise un appareillage d' électrophorèse capillaire ProteomeLab PA800 (Beckman Coulter) dont le capillaire est « coaté » N-CHO (Beckman-Coulter) de 50 cm x 50 um de diamètre interne. Il est utilisé un tampon de séparation «gel buffer-N » (Beckman-Coulter) . La migration est effectuée par l'application d'une tension de 25 kV, pendant 20 min, à 200C. La détection a lieu par laser à λexcitation 488nm et λemission 520 πm.
Le taux de fucosylation est calculé, après déglycosylation simultanée par les sialidase, galactosidase et hexnacase, par le rapport entre les surfaces des pics correspondant au "core" et "core" fucosylé.
Les glycannes du FVIIa, p sont majoritairement de type biantennés, bisialylés non fucosylés (A2), et biantennés bisialylés fucosylés (A2F) . Les profils glycanniques des FVII-Tg révèlent la présence de formes biantennées, monosialylées, fucosylées ou non (AlF, Al), et biantennées, bisialylées, fucosylées ou non (A2F, A2 ) . La répartition entre ces différentes formes varie entre les deux lots .
Le FVJIa, r présente des formes glycanigues biantennées sialylées fucosylées avec des formes A2F majoritaires, et biantennées monosialylées fucosylées (AlF) . On note des temps de migration atypiques pour les formes A2F et AlF par rapport aux temps de migration habituellement rencontrés pour ces structures .
Les profils glycaniques de deux lots (A et B) de FVII-Tg (cf figure 3-les deux électrophérogrammes du milieu) révèlent la présence de formes biantennées, monosialylées, fucosylées ou non (AlF, Al) , et biantennées, bisialylées, fucosylées ou non (A2F, A2).
Tableau 1. Récapitulatif du pourcentage des formes sialylées issues des échantillons natifs de différents lots de FVII.
Figure imgf000043_0001
L'analyse quantitative des différentes formes glycanniques (Tableau 1) montre, pour le FVIIa, p, la prédominance de formes sialylées avec 51% de glycannes bisialylées (A2 et A2F) , et 30% de formes triantennées sialylées non fucosylées et fucosylées (respectivement G3 et G3F) (résultats non montrés) . Le FVII-Tg (lots A et B) est moins sialylé que le FVIIa, p avec 35% de formes biantennées bisialylées, et seulement 6 % de formes triantennées sialylées (résultats non montrés) . Les formes majoritaires sont monosialylées avec 50% de structures Al et AlF. Le FVIIa, r est également moins sialylé que le FVIIa, p avec 45% de structures A2F et seulement 6% de glycannes triantennés sialylés (résultats non montrés). On note pour le FVIIa, r l'absence de formes non fucosylées.
Tableau 2 . Taux de fucosylation des dif férents FVII
FVIIa, p FVII-Tg FVII-Tg FVIIa, r Lot A f* Lot B
Taux de 16 . 2 23 . 6 41 . 8 100 fucosylation (%) Les résultats montrent le faible taux de fucosylation du FVIIa, p (16%) , un taux de fucosylation de 24 à 42% pour le FVII-Tg et une fucosylation de 100% pour le FVIIa, r.
Exemple 5 : Quantification des N-glycannes par NP-HPLC L'analyse qualitative et quantitative de la N- glycosylation des FVIIa, p, FVIIa, r et FVII-Tg a été étudiée par NP-HPLC (cf. figure 4). Après dessalage et séchage de la protéine, celle-ci est dénaturée et réduite selon des mises en œuvre connues de l'homme du métier. Les glycannes sont ensuite libérés par voie enzymatique (endoglycosidase PNGase F) , et purifiés par précipitation à l'éthanol. Les glycannes ainsi obtenus sont marqués à l'aide d'un fluorophore, le 2- aminobenzamide (2-AB) . Les glycannes marqués sont séparés en fonction de leur hydrophylie par chromatographie HPLC en phase normale sur colonne Amide-80, 4,6 x 250 mm (Tosohaas) thermostatée à 300C. Avant injection de l'échantillon, la colonne est équilibrée en tampon à 80 % acétonitrile. Les oligosaccharides sont élues par un gradient croissant de formiate d'ammonium 50 mM, pH 4,45, pendant des temps supérieurs ou égaux à 140 minutes. La détection est réalisée par fluorimétrie à λexCitation à 330nm et λemission SL 420nitl . Le profil chromatographique du FVIIa, p montre que les glycannes majoritaires sont de type biantennés, bisialylés (A2) avec un taux de 39 %. On observe également en plus faibles quantités des formes biantennées, bisialylées, fucosylées (A2F) , monosialylées (Al) et trisialylées fucosylées et non fucosylées (A3F et A3) .
L'analyse par NP-HPLC réalisée sur le FVII-Tg confirme la présence dOligosaccharides majoritairement de type Al, à un taux de 27%. Les formes AlF, A2 et A2F sont moins représentées et les formes triantennées sont présentes à l ' état de traces . Cela met en évidence une différence de sialylation entre le FVIIa, p et le facteur FVII-Tg (lot B), moins sialylé.
La même analyse réalisée sur un facteur FVIIa, r révèle des formes majoritaires de type A2F présente à un taux de 30%. Les formes AlF sont moins représentées et les formes triantennées sont présentes à l'état de traces. L'analyse du FVIIa, r montre également un important décalage du temps de rétention des formes AlF et A2F suggérant des formes différentes de celles présentes dans le FVIIa, p et dans le FVII-Tg.
L'ensemble de ces résultats est cohérent avec ceux obtenus en HPCE-LIF.
Exemple 6 : Identification par MALDI-TQFMS La spectrométrie de masse MALDI-TOF MS (Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry) est une technique permettant de mesurer la masse moléculaire des peptides, protéines, glycannes, oligonucléotides, et la majorité des polymères ionisables avec une grande précision.
Les peptides, protéines et glycannes à analyser sont mélangés à une matrice qui absorbe à la longueur d'onde du laser utilisé. Les principales matrices sont l'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) pour l'analyse des peptides, l'acide sinapinique (SA) pour les protéines et l'acide 2 , 5-dihydroxybenzoïque (DHB) pour les oligosaccharides .
La méthode consiste à irradier les co-cristaux matrice/analyte à l'aide d'un laser puisé, ceci entraîne la désorption conjointe des molécules de matrice et d'analyte. Après ionisation en phase gazeuse, les molécules d'analyte traversent un détecteur à temps de vol . Comme les masses et temps de vol sont directement liés, la mesure de ce dernier permet la détermination de la masse de l'analyte cible. L'identification est réalisée par mesure de la masse observée, par comparaison avec la masse théorique. Le séquençage peut être effectué dans le mode MS/MS sur la base des ions fragments obtenus. L'instrument utilisé est un Bruker Autoflex 2 fonctionnant dans les modes TOF et TOF/TOF. Afin d'identifier les formes glycanniques présentes dans le FVII-Tg et le FVIIa, r, des analyses MALDI-TOF MS ont été réalisées à partir de fractions d' élution issus de NP-HPLC préparâtive.
L'analyse MALDI-TOF du FVII-Tg a permis de confirmer l'identification des glycannes séparés par NP-HPLC, à savoir des formes majoritairement monosialylées Al et des formes minoritaires de type AlF, A2F et A2.
Cette étude a permis également d' identifier les formes minoritaires de type triantennées bisialylées et trisialylées, des formes hybrides et oligomannoses de type Man5 et Man6-P-HexNAc (cf. figure 5) .
L'analyse MALDI-TOF MS effectuée sur le FVIIa, r a révélé la présence des formes glycanniques présentées à la figure 6. Le facteur FVIIa, r est presque totalement fucosylé, contrairement au FVII-Tg qui ne l'est que partiellement. On note que la. forme glycannique majoritaire est A2F avec un taux quantifié en NP-HPLC à 30%. Des formes biantennées, monosialylées, fucosylées (AlF) et comportant un GaINAc en position terminale sur l'autre antenne sont identifiées ainsi que des formes neutres biantennées fucosylées avec des motifs Hex-NAc- HexNAc sur une et/ou deux antennes. On note également la présence de glycannes de type triantennés, trisialylés et fucosylés . Les formes non fucosylées sont présentes à l'état de trace.
Exemple 7 : Analyse HPCE-LIF de la liaison des acides sialiques - galactose
Concernant l'étude de la liaison acide sialique- galactose ( "branching" ) , la procédure expérimentale est similaire à celle développée à l'Exemple 4. Après déglycosylation à la PNGaseF, les oligosaccharides sont traités par des exosialidases spécifiques de façon à assurer 1 ' identification de la liaison et la quantification de chaque structure isolée. Les sialidases utilisées sont des enzymes recombinantes issues de S. pneumoniae (spécifique de la liaison «2-3, 0.02 IU, E/S=0.4 m/m), C. perfringens (spécifique des liaisons α2-3 et α2-6, 0.04 IU, E/S=0.1 m/m) et A. urefaciens (hydrolysant les liaisons α2-3, α2-6, α2-8 et «2-9, 0.01 IU, E/S=0.05 m/m). Des analyses ont montré que le FVIIa, r possède des formes glycanniqu.es biantennées, sialylées, fucosylées avec des formes A2F majoritaires, et biantennées, monosialylées, fucosylées (AlF) . On note des temps de migration atypiques pour ces structures A2F et AlF par rapport aux temps de migration habituellement rencontrés pour ces formes. Notamment, ces formes oligosaccharidiques sialylées présentent des temps de migration atypiques en HPCE-LIF et NP-HPLC par rapport à ceux du FVII-Tg. D'autre part, l'analyse de la composition en monosaccharides n'a pas révélé d'acide sialique particulier autre que Neu5Ac et les outils de spectrométrie de masse révèlent des glycannes de masse conforme à des types bisialylés. Enfin, la désialylation des glycannes du FVIIa, r permet de retrouver des comportements chromatographique et electrophorétique équivalents à ceux des oligosaccharides du FVII-Tg.
Ces différences de comportements electrophorétique et chromatographique peuvent donc s'expliquer par un branchement différent des acides sialiques . Cette hypothèse a été évaluée par les différentes approches d'HPCE-LIF et de MS.
Les résultats sont résumés dans le Tableau 3 ci- dessous. Tableau 3 : branchements des acides sialiques sur les différents lots de FVII.
Figure imgf000048_0001
Les résultats montrent des isoméries distinctes au niveau des acides sialiques entre les deux FVII. En effet, les acides sialiques du FVIIa, r impliquent des liaisons α2-3 alors que le FVII-Tg présente des branchements α2-6.
Les différences de comportements en HPCE-LIF et en NP-HPLC observés pour les glycannes du FVIIa, r par rapport au FVII-Tg sont liées à ces différences d'isomérie au niveau des acides sialiques.
Exemple 8 : Resialylation in vitro du FVII-Tg
La littérature (Zhang X. et al, Biochim. Biophys. Acta 1998, 1425; 441-52) fait mention du fait qu'une sialylation plus complète d'une glycoprotéine contribue à de meilleures stabilités in vitro et in vivo. L'objectif de cette étude est donc de démontrer la faisabilité d'une sialylation in vitro.
La resialylation a été réalisée à l'aide d'une α2 , 6- (N) -sialyltransférase (rat, Spodotera frugiperda,
AS > 1 unité/mg, 41 kDa, Calbiochem) et du substrat acide cytidine-5 ' -monophospho-N-acétylneuraminique
(Calbiochem) . Ces deux réactifs sont stockés à -8O0C du fait de leur instabilité. Le substrat de sialylation
(acide cytidine-5 ' -monophospho-N-acétylneuraπiinique) et l'enzyme (α2 , 6- (N) -sialyltransférase) sont mélangés, dans le tampon réactionnel, pendant une nuit à 370C. Le tampon réactionnel utilisé contient 50 mM d'acide morpholino-3 propanesulfonique, 0,1% Tween®80, 0,1 mg/ml BSA, ajusté à pH 7,4 (réactifs Sigma).
Le Tableau 4 ci-dessous résume les conditions expérimentales .
Tableau 4 : résumé des conditions expérimentales
Figure imgf000049_0001
L'électrophérogramme du FVII-Tg natif, tel qu'obtenu après la purification de l'Exemple 2 (figure 7, profil du bas), montre la forme bianténnée monosialylée Al majoritaire (42%) et les structures A2 , A2F et AlF moins représentées. Après resialylation (figure 7, profil du haut) la forme monosialylée ne représente plus que 6% au profit de la forme bisialylée, notamment non fucosylée, qui est devenue très majoritaire (52%) .
La quantification des glycannes avant et après resialylation est présentée dans le Tableau 5 ci- dessous . Tableau 5 : quantification des structures oligosaccharidiques avant et après sialylation
Figure imgf000050_0001
La cinétique de la sialylation du FVII transgénique est illustrée avec la figure 8.
Cette étude montre l'efficacité de la resialylation in vitro avec un taux de formes bisialylées augmenté de plus de 100%.
Exemple 9 : Etude pharmacocinétique comparative chez le lapin d'un FVII transgénique non resialylé (FVII Tg NRS) par rapport au FVII transgénique resialylé (FVII Tg RS), obtenu à l'issue de l'exemple 8)
Cette étude a pour objectif de comparer les profils pharmacocinétiques du FVII-TgRS par rapport au FVII-TgNRS chez le lapin néo-zélandais mâle vigile.
La dose testée est 200 μg/kg par animal, ce qui correspond à 2 fois la dose thérapeutique chez l'homme décrite pour le FVII recombinant.
Les prélèvements sanguins ont lieu à J-4 (4 jour avant l'injection du produit) et à Jl (jour de l'injection du produit) à T0,17h (le jour de l'injection du produit, 10 minutes après l'injection), T0,33h (le jour de l'injection du produit, 20 minutes après l'injection), TIh (le jour de l'injection du produit, 1 heure après l'injection), T3h (le jour de l'injection du produit, 3 heures après l'injection), T6h (le jour de l'injection du produit, 6 heures après l'injection), T8h (le jour de l'injection du produit, 8 heures après l'injection).
Les dosages du FVII :Ag (antigène FVII) sont réalisés par ELISA (kit Asserachrom) . Les résultats des dosages du FVII :Ag dans le plasma de lapin permettent de déterminer, d'une part, les profils d'élimination, et, d'autre part, les paramètres pharmacocinétiques . Les posologies et groupes expérimentaux figurent dans le Tableau 6.
Figure imgf000051_0001
Les courbes d'élimination sont représentées à la figure 9.
Les résultats sont retranscrits dans le Tableau 7.
Figure imgf000052_0001
Aux doses administrées, la demi-vie d'élimination, le temps de présence moyen (MRT) , la concentration maximale (Cmax) et le taux de récupération (« recovery ») sont comparables dans les 2 groupes expérimentaux .
Le FVII-TgRS possède un profil cinétique différent de celui du FVII-TgNRS. La resialylation du FVII-Tg améliore de façon non marquée la demi-vie, le temps de présence moyen (MRT) , la Cmax et la « recovery ».
Une différence est observée au niveau des paramètres AUC (aire du pic) , Cl (clairance) et volume de distribution (Vd) (Ce volume est obtenu en divisant la dose administrée ou absorbée par la concentration plasmatique) suggérant une élimination du FVII-TgRS de la circulation sanguine moins importante.
La resialylation du FVII-Tg induit une augmentation de la biodisponibilité du produit d'environ 30%. Tableau A
Figure imgf000053_0001
'
Rdt : Rendement

Claims

Revendications
1. Composition de facteur VII recombinant ou transgénique, chaque molécule de facteur VII de la composition comportant des formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation, caractérisé en ce que, parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, les formes glycanniques biantennées, bisialylées et non fucosylées sont majoritaires par rapport à toutes les formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation du facteur VII de la composition.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux de formes biantennées, bisialylées fucosylées et non fucosylées est supérieur à 50%.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que, parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, le taux de fucose est compris entre 20% et 50%.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'au moins certains des acides sialiques du facteur VII de ladite composition impliquent des liaisons α2-β.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que tous les acides sialiques du facteur VII de ladite composition impliquent des liaisons α2-6.
6. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'en outre des acides sialiques du FVII de ladite composition impliquent des liaisons «2-3.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit FVII est activé.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour son utilisation comme médicament .
9. Utilisation d'une composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients atteints d'hémophilie.
10. Utilisation d'une composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des traurαatismes hémorragiques multiples .
11. Utilisation d'une composition de FVII selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 , pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hémorragies dues à un surdosage en anticoagulants .
12. Composition pharmaceutique comprenant un FVII tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables .
13. Procédé de préparation d'une composition de facteur VII recombinant ou transgénique, dont chaque molécule de facteur VII de la composition comporte des formes glycanniques liées aux sites de N-glycosylation et dans laquelle parmi toutes les molécules de facteur VII de ladite composition, les formes glycanniques biantennées , bisialylées sont majoritaires, comprenant une étape de sialylation par mise en contact d'une composition de facteur VII transgénique ou recombinant partiellement sialylé avec un substrat donneur d'acide sialique et une sialyltransférase, dans un milieu réactionnel approprié pour permettre l'activité de la sialyltransférase, pendant une durée suffisante et des conditions appropriées pour permettre un transfert de l'acide sialique du substrat donneur d'acide sialique au FVII et une augmentation des formes bisialylées de manière suffisante pour que lesdites formes bisialylées deviennent majoritaires.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel il est effectué, préalablement- à l'étape de sialylation, une étape de galactosylation pour greffer un galactose sur des formes déficientes en galactose représentant les formes agalactosylées et monogalactosylées du FVII.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que ladite composition de FVII partiellement sialylé présente des formes glycanniques biantennées, monosialylées majoritaires.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que, parmi les formes glycanniques biantennées, monosialylées de ladite composition de FVII partiellement sialylé, les formes glycanniques majoritaires sont non fucosylées .
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que ladite composition de FVII partiellement sialylé présente au moins certains des acides sialiques impliquant des liaisons α2-6.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, préalablement à l'étape de sialylation, une étape de production de la composition de FVII transgénique partiellement sialylé par des lapines transgéniques.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que le FVII de ladite composition de FVII partiellement sialylée est activé.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que ladite sialyltransférase est I'α2 , 6- (N) -sialyltransférase, et en ce que ledit groupement donneur d'acide sialique est l'acide cytidine-5 ' -monophospho-N-acétylneuraminique .
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