CZ357199A3

CZ357199A3 - Způsob inaktivace patogenů, obzvláště virů, v biologickém materiálu a přípravky tímto způsobem získané

Info

Publication number: CZ357199A3
Application number: CZ19993571A
Authority: CZ
Inventors: Hans-Peter Schwarz; Gerold Zerlauth; Peter Turecek
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1998-04-06
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2000-02-16

Abstract

Popisuje se způsob inaktivace patogenů, obzvláště virů, v biologickémmateriálu inkubací s chemickýmprostředkem, kteiý se vyznačuje tím, že se inkubace provádí v přítomnosti eluotropní soli odpovídající koncentraci chloridu sodného nejméně 200 mmol/1, s výhodou nejméně 300 mmol/1, arovněž chromatorgafickyčištěný přípravek obsahující prothrorribinový komplex.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu inaktivace patogenů v biologickém materiálu inkubací s chemickým prostředkem a přípravků tímto způsobem získaných.

Dosavadní stav techniky

Biologický materiál pochází z organismů případně tělesných kapalin nebo mikroorganismů.

Protože biologický materiál nůže být kontaminován patogeny, jako příkladně infekčními molekulami nebo mikroorganismy a viry, případně pyrogeny, byly již vyvinuty různé způsoby inaktivace případně snížení kontaminace patogenů případně pyrogenů.

Takové způsoby zahrnuj í fyzikální a/nebo chemické ošetření, jako příkladně různé filtrační metody (příkladně nano-, dia- nebo ultrafiltrace), ošetření teplem, ošetření kyselinami nebo louhy, ošetření detergenty a/nebo organickými rozpouštědly a rovněž ošetření UV-světlem nebo laserem. Podle stavu techniky byly také navrhovány různé kombinace těchto způsobů k inaktivaci případně snížení kontaminace patogenů.

Z EP 0 197 554 je příkladně známý způsob k depyrogena• ·

ci a inaktivaci virů v biologickém nebo farmaceutickém produktu, který zahrnuje ošetření prostředkem k inaktivaci virů a depyrogenaci, jako je příkladně amfifilní substance a/nebo rozpouštědlo na pevné fázi, na které je produkt adsorbován. Po tomto ošetření se prostředek k inaktivaci virů a depyrogenaci oddělí od pevné fáze, adsorbovaný produkt se promyje a následně eluuje z pevné fáze.

Z EP 0 131 740 je známé ošetření přípravku obsahujícího protein v roztoku s organickými rozpouštědly jako dia/nebo trilalkylfosfáty, případně v přítomnosti detergentu (ošetřeni rozpouštědlo/detergent), přičemž se může získat proteinový přípravek neobsahující lipidové viry.

Z AT-PS 402 151 je známé ošetření teplem, při kterém se k preparátu ve vodném roztoku přidá před zahřátím tenzid v koncentraci nejméně 1 % hmotnostní.

Další způsob k redukci případně supresi nežádoucích aktivit v biologických nebo farmaceutických produktech je známý z EP 0 083 999. Tento způsob je založen na prodlouženém kontaktu s roztokem nebo suspenzí amfifilu, který nepůsobí denaturačně. Depyrogenovaný produkt se k odstranění amfifilu zpracuje s pomocí iontoměniče.

Nevýhodou mnoha těchto způsobů známých podle stavu techniky je častý výskyt ztráty aktivity labilních proteinů obsažených v ošetřovaných přípravcích, příkladně krevních proteinů. Obzvláště při provádění chromatografického čisticího procesu dochází k inaktivaci proteinů v relativně vysoké míře. Odbourání proteinů může vést také k aktivaci. Tak je příkladně známo, že faktor VII při chromatografickém čištění na základě autokatalytických procesů se může velmi leh• · ·

9 99 ·

• · • · · · 9 9

99

9 9 9 • · · 9

9 999

9 • · ·· ko aktivovat na nežádoucí faktor Vila, protože je velmi labilní.

Další nevýhoda spočívá ve vysoké časové a aparátové náročnosti mnoha způsobů, což velmi omezuje jejich proveditelnost a jejich použití v provozním měřítku je často nevhodné.

Předložený vynález si klade za úkol, dát k dispozici způsob, šetrný pro proteiny, obzvláště pro labilní krevní proteiny, k účinné inaktivaci patogenů v biologickém materiálu, který je možné snadno přenést do provozního pměřítka a může se provádět ekonomicky. Obzvláště se má tímto způsobem inaktivace patogenů dalekosáhle zabránit odbourání a možné aktivaci citlivých proteinů.

Podstata vynálezu

Výše uvedený úkol byl vyřešen tak, že byl dán k dispozici způsob inaktivace patogenů, obzvláště virů, v biologickém materiálu inkubací s chemickým prostředkem, při kterém se inkubace provádí v přítomnosti eluotropní soli odpovídajíc! koncentraci chloridu sodného nejméně

200 mmol/1, s výhodou nejméně 300 mmol/1.

Inaktivace patogenů v roztoku nabízí oproti ošetřeni adsorbentů některé výhody. Tak je příkladně proveditelnost takového způsobu v homogenním, jednofázovém systému snazší a validace inaktivace je lépe proveditelná. Rovněž se zdá, že lepší přístupnost patogenů v relativně homogenní fázi zvyšuje účinnost procesního kroku.

• · ··

Biologický materiál obsahuje s výhodou humánní protein a je obvzvláště plasmou nebo frakcí plasmy nebo pochází z buněčné kultury. S výhodou obsahuje biologický materiál krevní faktor, jako faktor XII, XI, VIII, V, protein závislý na Vollebrandově faktoru nebo fibrinogenu, obzvláště na vitaminu K, jako faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protein S případně protein Z.

Proteiny se mohou vyskytovat jako jednotlivé faktory, s výhodou ve vyčištěné formě, nebo jako komplexní směsi.

Při jedné obzvláště výhodné formě provedení obsahuje biologický materiál nejméně jeden faktor prothrombinového komplexu a je obzvláště materiál obsahující frakci obsahující prothrombinový komplex nebo faktor VII, příkladně se vychází z odpovídajícího zbytku (kryozbytek) po kryoprecipitaci plasmy.

Přípravek podle vynálezu je s výhodou přípravek s aktivitou FEIB (Factor Eight Inhibitor Bypassing-Activity), tedy přípravek, který je vhodný k ošetření pacientů s inhibitorem faktoru VIII.

Materiál pocházející z buněčné kultury je s výhodou materiál obsahující rekombinantně vyrobené krevní faktory, mezi nimi faktory vnitřního nebo vnějšího srážení, fibrinolyzy, trombolyzy nebo jejich inhibitorů, obzvláště krevních faktorů závislých na vitaminu K. Jako buňky přicházejí v úvahu běžné buňky pro expresi rekombinantních proteinů, s výhodou buňky savců, jako příkladně Věro-, CHO- nebo BHK-buňky. Odpovídající proteiny se mohou přímo ze surového buněnčného extraktu podrobit způsobu podle vynálezu k inaktivaci případně se vyskytujících patogenů, může se ale také jednat o předčištěnou buněčnou frakci.

9 9 9

9 9

Chemický prostředek je příkladně detergent (amfifil, tenzid), který je s výhodou obsažen v množství nejméně 1 %, výhodněji více jak 5 %, nejvýhodněji více jak 10 %; podle vynálezu se ale také mohou použít jiné chemické prostředky, obzvláště takové, u kterých je již příkladně znám virocidní, baktericidní nebo depyrogenační účinek, případně směsi nejrůznějších chemických prostředků.

Výběr je však limitován tím, aby nebyla podstatně ovlivněna nativita biologického materiálu. Pro ekonomický způsob se volí chemikálie, která zachová biologickou aktivitu materiálu více jak 50 %, vztaženo na aktivitu před inkubací, s výhodou nejméně 70 %, obzvláště více jak 85 %. Zachování biologické aktivity znamená, že proteiny obsažené v biologickém materiálu mohou vykonávat jim přirozeně připsané funkce případně různé funkce. Tato biologická aktivita se potom může podle druhu proteinu zjišťovat a udávat, příkladně pomocí standardizovaného chromogeního testu nebo stanovením antigenů.

Případně se chemický prostředek po inkubaci oddělí.

Jako detergent se obecně rozumí syntetická, organická substance aktivní na hraničních plochách.

S výhodou se pro způsob podle vynálezu použije neionický detergent. Neionické tenzidy jako polyether, obzvláště alkylfenolpolyglykolether jsou mezi jiným produkty ethoxylace mastných kyselin, amidů mastných kyselin, mastných aminů, mastných alkoholů, aminoxidů, esterů mastných kyselin polyalkoholů a esterů cukrů.

denaturačně a s výtritonu. Jako po• · 9 · ► · 9

9 99

99 99 9

9999 9«

Takový tenzid nepůsobí na proteiny hodou se vybere ze skupiny polysorbátů a n lysorbát se příkladně používá Tween .

Pokud se detergenty použijí jako chemické prostředky, potom se tyto detergenty podle výhodné formy provedení vynálezu použijí bez přídavku dalších prostředků, obzvláště bez přídavku toxických organických látek nebo rozpouštědel, jako příkladně TNBP. Tím se minimalizuje riziko kontaminace .

Biologický materiál se způsobem podle vynálezu inkubuje chemickým prostředkem. Inkubace znamená uvést v kontakt biologický materiál s roztokem, suspenzí nebo emulzí chemického prostředku po dostatečně dlouhou dobu potřebnou k inaktivaci případně přítomných patogenů případně pyrogenů při určité teplotě. Uvedení v kontakt se může příkladně provést jednoduchým ponecháním směsi po definovanou dobu.

Inkubace se podle předloženého vynálezu provádí v přítomnosti eluotropní sole. Jako eluotropní sůl se dále rozumí sůl ve směsi s chemickým prostředkem nebo sůl v komplexním přípravku, s vlastností vyloužit adsorbované látky z pevných adsorbentů nebo adsorbentů napojených kapalinou nebo gelovitých adsorbentů a/nebo vytlačit. S výhodou se v případě eluotropních solí jedná o desorpční prostředek, jaký se používá pro chromatografické procesy. Adsorbovaná látka je podle toho dostatečně rozpustná v přítomnosti eluotropní soli, to znamená, že se s výhodou volí podmínky, za kterých nedochází ke srážení biologického materiálu.

Druh a koncentrace soli případně přípravku se obecně volí podle použitého adsorbentů. Eluční účinek soli závisí • ·

44 44

4 4 4 4 4

44 444 444

4 4 4

444 44 44 příkladně na polaritě rozpouštědla, stoupá tedy příkladně v pořadí ethanol - aceton - methanol - voda. Adsorbent může být pevnou fází, obzvláště matrice vhodná pro iontoměničovou chromatografií. V přípravku obsahujícím eluotropní sůl mohou být obsaženy ještě další přísady, příkladně další soli.

S výhodou se v případě přípravků jedná o vodné přípravky s pH hodnotou v rozmezí mezi 6,0 až 8,0, výhodněj i okolo 7,0.

Při výhodné formě provedení se jako eluotropní sůl použije chlorid sodný, ale i jiné soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, mezi nimi chlorid vápenatý. Jako eluotropní soli se mohou použít i tak zvané chaotropy, jako příkladně močovina, rhodanidy nebo guanidin. Koncentrace soli je nejméně S: 200 mmol/1, s výhodou S: 300 mmol/1. Horní hranice použité koncentrace závisí obzvláště na rozpustnosti dané soli a pro chlorid sodný činí příkladně okolo 2 mol/1. Chaotropní látky, jako příkladně močovina, se mohou dokonce případně použít v koncentraci až do 8 mol/1.

Inkubace biologického materiálu chemickými prostředky se provádí po dobu dostatečně dlouhou k inaktivaci případně přítomných patogenů, s výhodou po dobu mezi 10 minut a 10 hodin, nejvýhodněji mezi 1 hodinou a 5 hodinami. Doba potřebná ke způsobu podle vynálezu se může zjistit pomocí modelových virů jako HIV, Sindbis-, FSME- nebo virů hepatitidy předběžným pokusem.

Také volba teploty ovlivňuje použitou dobu. Při způsobu podle vynálezu se s výhodou inkubuje při teplotě místnosti, příkladně v rozmezí teplot mezi 15 a 45 °C, obzvláště mezi 20 a 30 °C.

• · · · • · ·

9 99 9 9

9 9

9999 99

99 99

9 9 9 9 9 • · · · · 9

99 999 999

9 9 9

999 99 99

Při způsobu podle vynálezu se biologický materiál s výhodou adsorbuje na pevný nosič, vyčistí se a inkubace se provádí bezprostředně po eluci vyčištěného materiálu, přičemž eluát se ještě dále zpracovává, příkladně centrifugací, filtrací nebo jinými fyzikálními metodami.

Pevný nosič je s výhodou materiál vhodný pro chromatograf ii, obzvláště nosič vhodný pro iontoměničovou chromatografií, hydrofobní chromatografií nebo afinitní chromatografií. Příkladně se používají materiály jako Sepη n p D D harose , Superdex , Sephadex , Spherodex , Toyopearl , nebo anorganické materiály jako hydroxylapatit.

Jako iontoměniče se mohou používat iontoměničové materiály, jako příkladně DEAE-Sephacel^, DEAE-Sephadex^,

DEAE-Sepharose^ CL6B, DEAE-Sepharose^ Fast Flow, QAE- Sephadex^, Q-Sepharose^ Fast Flow, Q-Sepharose^ High Performance, DEAE-Tris-Acryl, DEAE-Spherodex^, Q-Hyper-D (dodávaný firmou Sepracor), DEAE-Toyopearl^, QAE-Toyopearl^, Fractogel^ EMD-TMAE nebo jiné Fractogelové materiály.

Jako příklady hydrofobních chromatografických materiáη n lů lze příkladně uvést Butyl-Sepharose , Octy1-Sepharose , Phenyl-Sepharose^, Fractogel^ TSK-butyl, t-Butyl-HIC Support nebo TSK-Gel Butyl Toyopearl^.

Biologický materiál se může přímo z komplexní směsi adsorbovat na nosič a čistit, inaktivačnímu kroku mohou ale předcházet nebo jemu následovat také další kroky k čištění materiálu, přičemž v rámci předloženého vynálezu je výhodné další chromatografické čištění.

Způsobem podle vynálezu se patogeny inaktivují. Jako

9

99 • 9 9 9

9 9 9

999 999 • 9

99 patogeny se rozumí také produkty degradace příkladně virů, obzvláště také izolovaný genom nebo jeho fragmenty.

Patogeny mohou být patogeny obklopené lipidy, jako příkladně Hepatitis-B-Virus, nebo nelipidické patogeny, jako příkladně Hepatitis-A-Virus.

Způsoby inaktivace virů se dnes označují za účinné, jestliže po použití způsobu na vzorku biologického materiálu, který byl smíchán s vysokou dávkou testovaného viru, příkladně HI-viru nebo Sindbis-viru jako modelového viru pro viry Hepatitis nelze ve vzorku prokázat žádné viry a titr viru byl tak redukován pod hranici prokazatelnosti. Průkaz a kvantifikace nukleových kyselin se může příkladně provádět pomocí metody PCR, jak se popisuje v AT-PS 401 062 nebo přímou titrací.

Jako míra inaktivace je znám tak zvaný redukční faktor, který se po jediném přidání testovaného viru vypočítá z dekadického logaritmu kvocientů počátečního a konečného titru viru. Podle evropské směrnice EC III/8115/89-EN Komise evropského společenství je dále znám tak zvaný celkový redukční faktor. Vypočítá se ze součtu redukčních faktorů jednotlivých subsekvenčních inaktivačních opatření.

S výhodou se provádí také další nezávislý krok k inaktivaci případně redukci kontaminace patogeny . Zde přicházej i v úvahu všechny podle stavu techniky známé způsoby k minimalizaci infekčního rizika.

Obzvláště se jako další krok k inaktivaci případně redukci kontaminace provádí filtrace a/nebo ošetření teplem.

·· ·· · ·· ·· ·· ··· · · · · · · · · ···· ·· · · ·· · • * · · · · ·· ··· ··· ··· ··· · · ···· ·· ··· ·· ·· ··

Jako filtrace se s výhodu provádí nanofiltrace. Výhodné ošetření teplem se provádí na pevném biologickém materiálu, příkladně na lyofilizátu s řízeným obsahem vody, příkladně obsahem vody mezi 5 a 8 % a teplotě mezi 50 a 80 °C, jak se popisuje v EP 0 159 311.

Při jedné výhodné formě provedení se provádí dvoustupňové ošetření s detergentem jako chemickým prostředkem. Přitom se v prvním kroku použije detergent v množství nejméně 1 %, s výhodou nejméně 5 %, nejvýhodněji nejméně 10 %.

Ve druhém stupni se použije další detergent v množství nejméně 10 %, s výhodou nejméně 12 %, nejvýhodněji nejméně 14 %. Použitý detergent může být pro oba dva stupně stejný, mohou se ale také použít rozdílné detergenty. Zcela obecně lze kombinací kroků k inaktivaci virů silně redukovat případně vyloučit riziko virové infekce po podání příslušného preparátu.

Podle předloženého vynálezu se dává k dispozici také chromatograficky čištěný přípravek, obsahující autodynamicky aktivovatelný krevní faktor s podílem aktivovaného krevního faktoru méně než 50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného krevního faktoru, s výhodou méně než 40 %, výhodněji méně než 30 %, ještě výhodněji méně než 20 %, ještě více výhodněji méně než 10 %, nejvýhodněji méně než 1 %, a s obsahem detergentu.

Obzvláště se jedná o přípravek obsahujíc! prothrombinový komplex s aktivitou faktoru Vila méně než 50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktoru VII, s výhodou méně než 10 % a nejvýhodněji méně než 1 %. Obsah detergentu v přípravku podle vynálezu přitom odpovídá farmaceuticky přijatelnému množství, s výhodou mezi 1 % a hranicí • φφφ • · · ·

• · • · • φ • · · •ΦΦΦ φφ « · · · · » φ · ·· φφ prokazatelnosti detergentu.

Jako autodynamicky aktivovatelný krevní faktor se podle předloženého vynálezu rozumí krevní faktor, který je aktivovatelný autokatalyticky, kontaktem na povrchu nebo pomocí procesu, jako příkladně chromatografického procesu. Obzvláště je takový krevní faktor vybrán ze skupiny faktor VII, faktor XII, faktor XI a prekallikrein.

V další výhodné formě provedení neobsahuje přípravek inhibitory serinproteázy, jako příkladně inhibitory thrombinu, případně kofaktory, jako příkladně heparin. Ve specielní formě provedení je nepřítomnost substancí tohoto druhu dána již během chromatografického procesu.

Proto se předložený vynález týká také odpovídajících přípravků, které se mohou získat způsobem podle vynálezu.

V přípravcích podle vynálezu mohou být obsaženy také další přísady, příkladně stabilizačně působící substance jako aminokyseliny.

Následujícími příklady má být předložený vynález ještě blíže vysvětlen, aniž by se však na tyto příklady omezoval.

• ·

• 00

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ošetření aktivovaného prothrombinového komplexu FEIBA detergentem v přítomnosti TVEEN^-80 mg DEAE-Sephadex^ A-50 firmy Pharmacia se po dobu minut při teplotě místnosti inkubuje k botnání s 1 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě . Potom se gel oddělí centrifugací od nabotnaného zbytku. Následně se pětkrát provede promytí gelu vždy 1 ml pufru (9 g/1 Na₂HP0₄ .

H₂0, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) a další dvě promytí pufrem (7 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl) a rovněž resuspendace a centrifugace.

ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se roztaví při 0 až +4 °C a vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při teplotě +2 °C. Vzniklý kryozbytek se n inkubuje promytým DEAE-Sephadex , přičemž se generuje FEIBA a spolu s faktory protrombinového komplexu a inertním proteinem se adsorbuje na gel. Potom se koadsorbovaný inertní protein odstraní z DEAE-gelu promytím pufrem (9 g/1

Na₂HP0₄ . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl).

Gelový proteinový komplex vlhký pufrem se nyní suspenduje s 1,5 ml roztoku 150 mg/ml TVEEN^-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny při teplotě 26 °C. Ošetřením roztokem vyššího iontového škrobu se protein společně s faktory protrombinového komplexu a případně přítomnými patogeny desorbuje. Následně se suspenze zředí přídavkem 6,5 ml vody a jednu hodinu se readsorbuje při teplotě místnosti, přičemž se proteinová frakce nově readsorbuje, zatímco složky inak• 9 * 9

9 • 9 9 9

9 9 9

999 999

9

9 9 9 tivovaného patogenu zůstávají v roztoku společně s detergentem. Gel/proteinový komplex se potom pětkrát promyje vždy 1 ml roztoku 7 g/1 chloridu sodného ve vodě do odstranění detergentu.

K elucí se gel zpracuje za míchání s 0,7 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě. Eluát se potom dialyzuje proti destilované vodě, zamrazí se a lyofilizuje. Po rekonstituci lyofilizátu se stanoví aktivita FEIB podle AT-B 350 726 .

Jako kontrola slouží rovněž vyrobený přípravek FEIBA, avšak bez ošetření detergentem.

Analýza získaného preparátu ukázala specifickou aktivitu 3,2 E FEIBA/mg proteinu při obsahu proteinu 16,6 mg/ml po rekonstituci lyofilizátu a je srovnatelná s variantou způsobu bez ošetřeni detergentem, kdy bylo dosaženo specifické aktivity 2,8 E/mg proteinu při koncentraci proteinu 16,5 mg/ml.

Příklad 2

Ošetření detergentem při desorpci FEIBA s prodlouženou inkubační dobou

Analogicky jako v příkladu 1 se adsorbuje frakce prothrombinového komplexu na DEAE-Sephadex , promyje se do odstranění inertního proteinu, následně se desorbuje s pomocí roztoku TVEEN -80/chlorid sodný. Proteinová frakce se ale více jak 2 až 3 hodiny udržuje v desorbovaném stavu za jinak zachovaných podmínek. Následně se produkt zpracuje na ko• · • frfrfr fr · frfr ♦ frfr • frfr · · • · · · · • · · · · • * frfrfr ··· nečný produkt stejným způsobem, jaký se popisuje v příkladu

1.

Analýza této násady udává specifickou aktivitu 2,5

E FEIBA/mg proteinu při obsahu proteinu 16,6 mg/ml při 2 hon dinách inkubace v přítomnosti TVEEN -80 a specifickou aktivitu 2,3 E FEIBA/mg proteinu při obsahu proteinu 17,4 mg/ml při 3 hodinách inkubace s detergentem.

Tím je možné ukázat, že ani prodloužená doba kontaktu s detergentem není spojena s žádnou podstatnou inaktivaci účinné látky nebo redukcí výtěžku.

Příklad 3

Ošetření FEIBA detergentem s readsorpcí na j iný gel

Feiba se vyrobí stejně, jak se popisuje v příkladu 1. Po ošetření a desorpci s detergentem se získaný roztok převede do zásobníku, do kterého bylo předloženo 15 mg DEAE-Sephadex^ A50 firmy Pharmacia, který byl předem inkubován v roztoku 30 g/1 chloridu sodného do botnání a následně pětkrát promyt vždy 1 ml pufru (9 g/1 Na2HPO4 .

H2O, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) a dále dvakrát promyt pufrem (7 g/1 citrátu trojsodného . 2 F^O, 7 g/1 NaCl) a vždy resuspendován a centrifugován. Po jednohodinové adsorpci zředěného proteinového komplexu k oddělení detergentu se provede zpracování způsobem popsaným v příkladu 1. Takto získaný konečný produkt má ve srovnání s FEIBA vyrobenou jednou ze standardních variant, to znamená bez zpracování s detergentem, výtěžek 95 % a ve specifické aktivitě je srovnatelný.

·· ·· • · · · « · · · • · « · · φ • · «· ··

Příklad 4

Ošetření aktivovaného prothrombinového komplexu FEIBA den v tergentem v přítomnosti TVEEN -80 při zvysene teplote mg DEAE-Sephadex^ A-50 firmy Pharmacia se po dobu 15 minut při teplotě místnosti inkubuje k botnání s 1 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě . Potom se gel oddělí centrifugací od nabotnaného zbytku. Následně se pětkrát provede promytí gelu vždy 1 ml pufru (9 g/1 Na₂HP0₄ .

Η₂0, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) a další dvě promytí pufrem (7 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl) a rovněž resuspendace a centrifugace.

ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se roztaví při 0 až +4 °C a vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při teplotě +2 °C. Vzniklý kryozbytek se inkubuje promytým DEAE-Sephadex , přičemž se generuje FEIBA a spolu s faktory protrombinového komplexu a inertním proteinem se adsorbuje na gel. Potom se koadsorbovaný inertní protein odstraní z DEAE-gelu promytím pufrem (9 g/1 Na₂HP0₄ . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl).

Gelový proteinový komplex vlhký pufrem se nyní suspenduje s 1,5 ml roztoku 1 mg/ml TVEEN^-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, přičemž se proteinová frakce a nespecifické adsorbované nečistoty desorbují. Následně se gel oddělí filtrací. Proteinový roztok se nyní dalším přídavkem TVEEN -80 doplní na koncentraci detergentu 150 mg/ml a následně se inkubuje za míchání k inaktivaci případně přítomných patogenů buď jednu hodinu při teplotě 26 °C nebo 1 hodinu při teplotě 40 °C. Následně se zředí přídavkem 6,5 ml vody a gel se readsorbuje na připv · · · · « · · · ··

9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

T Λ 99 · 9 9 9 ·· ·♦· ···

LU «····« · ·

9999 99 999 99 99 99 η

ravený čerstvě promytý DEAE-Sephadex A-50. Následně se pětkrát promyje vždy 1 ml roztoku 7 g/1 chloridu sodného ve vodě do odstranění detergentu a nakonec se přípravek zpracuje dále stejně jako se popisuje v příkladu 1.

Analýza obou variant ošetření při 26 °C a při 40 °C ukázala srovnatelnou specifickou aktivitu přípravku FEIBA se standardní variantou bez inaktivace viru. Výtěžky činí vždy 75 % standardní varianty.

Příklad 5

Ošetření prothrombinového komplexu FEIBA detergentem v přítomnosti TVEEN^-80 (toho času podle názoru přihlašovatelky nej lepší cesta k provedení vynálezu) ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se roztaví při 0 až +4 °C a vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při teplotě +2 °C. Vzniklý kryozbytek se smíchá s 2 IE heparinu/ml. Potom se proteiny prothrombinového komplexu adsorbují pomocí DEAE-Sephadex A-50 firmy Pharmacia v koncentraci 0,5 mg/ml. Gel-proteinový komplex se oddělí z roztoku a promyje se pufrem 1 (4 g/1 citrátu troj sodného . 2 H20, 7 g/1 NaCl, 9 g/1 Na2HPO4 . 2 F^O, 500 IE heparin/1, pH 7,5) a následně pufrem 2 (4 g/1 citrátu trojsodného . 2 H^O, 7 g/1 NaCl, 500 IE heparin/1, pH 7,5).

Promytý gel se nyní suspenduje k inaktivaci patogenů s 1,5 ml roztoku obsahujícího 150 mg TVEEN^-80/ml a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny při teplotě 26 °C. Tímto ošetřením se proteinová frakce společně s případně přítomnými patogeny nebo fragmenty patogenů desorbuje a v průběhu inkubace s detergentem se patogeny inaktivují. Následně se suspenze stejně jako v příkladu 1 zředí přidav17 φ φ · φφφφ φφφ φφφ φφφφ ΦΦ

kem 6 ml vody a jednu hodinu se proteinová frakce i s účinnými látkami readsorbuje při teplotě místnosti na iontoměničové matrici. Následně se pětkrát promyje vždy 1 ml pufru (4 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl, 500 IE heparin/1, pH 7,5) do odstranění detergentu a eluuje se roztokem 1 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 30 g/1 NaCl, 1000 IE heparinu, pH 7,0. K eluátu se přidá 1 IE heparinu/ml. Roztok obsahující prothrombinový komplex se přepufruje proti pufru obsahujícímu 4 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 8 g/1 NaCl, pH 7,0 a lyofilizuje se. V rekonstruovaném lyofilizovaném prothrombinovém komplexu se testuje obsah proteinu a obsah komplexních faktorů prothrombinu; výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Jako kontrola se vyrobí násada bez ošetření pomocí TVEEN^. Výsledky analyzy jsou uvedeny rovněž v Tabulce 1.

Tabulka 1

Srovnání aktivit faktorů prothrombinového komplexu po provedení způsobu podle vynálezu a bez tohoto způsobu

Složení	Kontrola	Přípravek podle vyn.
Protein	(mg/1)	14.7	14.4
Prothrombin	(E/ml)	22.1	19.7
Faktor VII	(E/ml)	0.9	1.0
Faktor IX	(E/ml)	21.0	22.2
Faktor X	(E/ml)	23.2	22.1
Protein C	(E/ml)	26.5	27.9

0 0 0 00 • 0· ·· ·· · 0 · · * · · • 0 · 0 0 0 * • · 0 0 00 0 0 0 0 • 0 0 0 · •·· «e ·9 ··

Ukazuje se, že ošetřením detergentem nedošlo k žádné podstatné změně složení prothrombinového komplexu.

Příklad 6 n

Oštření detergentem faktoru VII TVEEN -80 ve srovnání s inaktivaci viru faktoru VI konvenčním způsobem

Z humánní citrátové plasmy se oddělí frakce prothrombinového komplexu obsahující srážecí faktory prothrombinu, nepatrné podíly faktoru VII, faktoru IX a faktoru X, jak se popisují v příkladu 5. Větší část srážecího faktoru VII n zůstávající ve zbytku po adsorpci na DEAE-Sephadex A50 se nyní získá adsorpci na hydroxidu hlinitém. K tomu se na

1 zbytku po oddělení prothrombinového komplexu přidá 10 ml % suspenze hlinitého hydrogelu a míchá se po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Následně se centrifugací při 5000 ot/minuta při teplotě asi 4 °C s pomocí Sorvall RC3B Rotor H6000A oddělí komplex hydroxid hlinitý-protein, zbytek se odebere a sraženina se suspenduje a po dobu 30 minut míchá 3,5 % objemu zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci v roztoku 4 g/1 citrátu troj sodného . 2 F^O, g/1 NaCl, pH 7,5. Tím se desorbuje inertní protein z hydroxidu hlinitého. Faktor VII zbylý na hydroxidu hlinitém se peletuje opětovnou centrifugací stejně, jak se popisuje výše. Zbytek se odebere a sraženina se znovu použije k dalšímu zpracování. K desorpci proteinové frakce se komplex hydroxid hlinitý-faktor VII míchá po dobu 30 minut s 1 objemovým % zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci 0,3 mol/1 fosfátového pufru, pH 8,6 (53,4 g Na2HP04 . 2 H2O/I se roztokem 41,1 g NaK^PC^ . ř^O/l nastaví na pH 8,6) obsahujícího 1 % TVEEN^-80. Následně se k inaktivaci paton genů přidá detergent TVEEN -80 na konečnou koncentraci 15 % • · • · · » · · ·· ·«···· • · · · * · · · ·>·· ·Φ ··· · ·Φ ·· a dále se míchá 1 hodinu při teplotě 40 °C. Potom se roztok ochladí na asi 22 “Ca zředí se 9 díly destilované vody. Frakce faktoru VII se potom readsorbuje na 1 g/1 DEAE-Sephadex^ A50 za micháni po dobu 1 hodiny přo teplotě asi 22 °C. Následně se na sintrové nuči trojnásobně promyje komplex gel-protein vždy 100 ml na litr zředěného roztoku TVEEN^-80 s pufrem obsahujícím 4 g/1 citrátu troj sodného .

H2O, 7 g/1 NaCl, pH 7,5, obsahujícího 500 IE heparinu/1 až do nepřítomnosti detergentu. Eluce frakce faktoru VII se provádí mícháním proteinového komplexu íontoměniče a 100 ml/1 zředěného roztoku TVEEN^-80 obsahujícího roztok 85 g NaCl/1 po dobu 30 minut při teplotě 22 °C. V eluátu se následně kvantitativně stanovuje obsah faktoru VII chromogenním testem na faktor VII (Imunochrom-Faktor VII:C, Immuno AG, Vien, měřeno proti mezinárodnímu standardu prothrombinového komplexu), obsah proteinu metodou podle Bradforda [Anal.Biochem. 72:248-254 (1976)] a faktoru Vila metodou podle US 683 682 (měřeno proti mezinárodnímu standardu faktoru Vila). Výsledky uvádí Tabulka 2.

Ke srovnání se faktor VII oddělí adsorpci na hydroxidu hlinitém jako se popisuje výše od ostatních proteinů prothrombinového komplexu a v adsorbovaném stavu se ošetří podle EP 0 197 554 agenciemi inaktivujícími viry z EP 0 131 740 s TVEEN^-80 a tri-(N-butyl)-fosfátem (TNBP). K tomu se komplex alhydrogel-protein míchá ve vodném roztoku 1 %

TVEEN^-80 a 0,3 tri-(N-butyl)-fosfátu po dobu 18 hodin při teplotě 4 °C s objemem 50 ml/1 zbytku prothrombinového komplexu. Následně se centrifuguje k oddělení komplexu hydroxid hlinitý-protein jako se popisuje výše a promytím 3 x 100 ml roztoku 4 g/1 citrátu troj sodného . 2 H2O, 7 g/1 NaCl, pH 7,5 se resuspendací zbaví přebytečného TVEEN^-80 a tri-(N-butyl)-fosfátu. Mezi každým promytím se provádí

9

9999 «·

9

9 9 peletizace komplexu hydroxid hlinitý-protein centrifugací. Eluce se provádí za stejných podmínek jako v případě paralelní násady způsobem podle vynálezu. Analogicky se provádí rovněž analýzy konečného produktu. Výsledky uvádí Tabulka 2.

Tabulka 2

Aktivity faktoru Vila po provedení způsobu podle vynálezu a po provední způsobu podle EP 0 197 554

Složeni	Přípravek podle vyn.	Přípravek podle EP 0 197 554/EP 0 131 740
Aktivita F VII (E/ml)	3.2	3.8
Koncentrace proteinu (mg/ml)	0.2	0.5
Specifická aktivita (E/mg	15.2	7.6
Aktivita faktoru Vila
(E/ml)	2.7	11.9
(VlIa/VII)	0.84	3.13

Ukazuje se, že při použiti tohoto způsobu byl obsah faktoru Vila ve srovnání se způsobem podle vynálezu výrazně vyšší, přičemž přes komplexní ošetření faktoru VII se nezjistila žádná aktivace. Kromě toho byla při způsobu podle vynálezu specifická aktivita získaného produktu vyšší než u srovnávacího přípravku.

Příklad 7

Semikvantitativní stanovení G-viru Hepatitis

Z násad pro inaktivaci patogenů příkladů 1 až 6 byly vždy odebrány vzorky výchozích materiálů, zbytek po kryoprecipitaci nebo adsorpční zbytek po oddělení faktorů srážli-

• · vosti I, IX a X a rovněž odpovídající vyčištěné a koncentrované preparáty faktorů srážlivosti. 0,5 ml těchto vzorků se zředí 1+1 fyziologickým pufrem fosfát-kuchyňská sůl a případně se vyskytující viry se peletují ultracentrifugací.

RNA se z virálních pelet extrahuje metodou RNAzol-Reagens (BIOTECX, Houston, Texas) a rozpustí se ve sterilní destilované vodě.

RT-PCR na G-virus Hepatitis (HGV) nukleových kyselin se provádí primerními páry NS5a 1 a NS5a 2 (Linnen, J. a spol., Science 271: 505-508 (1996). Sekvence použitých primerů (získaných od Boehringer Mannheim, Německo) je pro NS5a 1 : 5 CTCTTTGTGGTAGTAGCCGAGAGAT 3 a pro NS5a 2 :

CGAATGAGTCAGAGGACGGGGTAT 3 . Primer se označí fluorescenčním barvivém a rutinními postupy z něj získané obvyklé PCR-protokoly fluoreskujících amplikonů se analyzují na sekvenceru ABI-377 firmy Applied Biosystems. Aby bylo možné vyloučit přítomnost RT-PCR-inhibitorů ve vzorcích, byly vzorky dotovány C-virem-RNA-Mimics Hepatitis a v jedné provedené Hepatitis C-PCR analyzovány podle EP 0 714 988. Jako vhodné extrakty vyhodnotitelné pro HGV-PCR byly odebrány výhradně extrakty, které nevykazují žádnou inhibici v HCVPCR. Jako měřítko G-viru Hepatitis byla vzata intenzita fluorescence. Ukazuje se, že výchozí materiály použité pro frakcionaci před inaktivaci patogenů způsobem podle vynálezu vykazují silně pozitivní signály, to znamená vysokou koncentraci HGV-amplifikátů nukleových kyselin, zatímco v eluátech po readsorpci a oddělení agencií inaktivujících viry nebyly HGV-RNA prokazatelné.

Při paralelních pokusech bez provedeného ošetření detergenty byly eluáty jako použité výchozí materiály HGV-PCR pozitivní.

• · · · • 9 ·

9999 99 ««rte v «>*-»··· arívofa iaíQO^pfí,^^A2* •'ⁱ-^;-^fí‘'

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob inaktivace patogenů, obzvláště virů, v biologickém materiálu inkubací s chemickým prostředkem, vyznačující se tím, že se inkubace provádí v přítomnosti eluotropní soli odpovídající koncentraci chloridu sodného nejméně 200 mmol/1, s výhodou nejméně 300 mmol/1.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako chemický prostředek použije detergent, který je s výhodou obsažen v množství nejméně 1 %, výhodněji více jak 5 % a nejvýhodněji více jak 10 %.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako eluotropní sůl použije chlorid sodný.
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se inkubace provádí po dobu mezi 10 minut a 10 hodin, nejvýhodněji mezi 1 hodina a 5 hodin.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se jako biologický materiál použije plasma nebo frakce plasmy nebo materiál buněčné kultury.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se použije biologický materiál, který obsahuje krevní faktor, obzvláště protein • 4 • 44

4··· 44

4 44 44 44

44 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4

44 44 444444

4 4 4 4 4

444 4 · 44 44 závislý na vitaminu K.
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se použije biologický materiál, který je frakcí obsahující prothrombinový komplex.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se biologický materiál adsorbuje na pevném nosiči, čistí se a inkubace se provádí po eluci vyčištěného materiálu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se eluce a inkubace provádí zároveň.
10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že se jako pevný nosič použije chromatografický materiál, obzvláště materiál vhodný pro iontoměničovou chromatografií nebo afinitní chromatografii.
11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provádí další kroky k čištění materiálu, obzvláště čištění chromatografií.
12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se provádí další krok k inaktivaci případně snížení kontaminace patogenů, obzvláště filtrace nebo ošetření teplem.
13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se jako chemický prostředek použije neionický detergent vybraný ze skupiny ··

9 99

99 99

Tween a Triton.
14. Chromatograficky čištěný přípravek, obsahující autodynamicky aktivovatelný krevní faktor s podílem méně než

50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného krevního faktoru, s výhodou méně než 40 %, výhodněji méně než 30 %, ještě výhodněji méně než 20 %, ještě více výhodněji méně než 10 %, nejvýhodněji méně než 1 %, as obsahem detergentu .
15. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že krevní faktor se vybere ze skupiny faktor VII, faktor XII, faktor XI a pre-kallikrein.
16. Přípravek podle některého z nároků 14 nebo 15, vyznačující se tím, že obsahuje prothrombinový komplex s aktivitou faktoru Vila méně než 50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktoru VII, s výhodou méně než 10 % a nejvýhodněji méně než 1 %.
17. Přípravek podle některého z nároků 14 až 15, vyznačující se tím, že přípravek neobsahuje inhibitory serinproteázy případně její kofaktory.
18. Přípravek podle některého z nároků 14 až 17, který se připraví způsobem podle některého z nároků 1 až 13.