PL203508B1 - Sposób uzyskiwania z frakcji osocza ludzkiego preparatu aktywnego hemostatycznie oraz preparat aktywny hemostatycznie otrzymany tym sposobem - Google Patents

Description

Opis wynalazku Wynalazek dotyczy uzyskiwania z frakcji osocza ludzkiego preparatu aktywnego hemostatycz- nie oraz preparatu aktywnego hemostatycznie zawieraj acego vWF, otrzymany sposobem wed lug wy- nalazku. Choroba von Willebranda jest zaburzeniem koagulacji krwi, które przeciwnie ni z hemofilia A lub B, objawia si e krwawieniem w tkankach mi ekkich, zw laszcza w b lonie sluzowej. Jak stwierdzono, przyczy- n a tej choroby jest brak czynnika von Willebranda (vWF). Obecnie czynnik ten jest dostarczany pacjen- tom za po srednictwem preparatów czynnika VIII, które zawieraj a równie z vWF. Jednak ze cz esto jako sc podawanych preparatów jest niezadowalaj aca i ilo sc podawanego vWF jest zbyt niska. Chocia z znane s a preparaty vWF uzyskanego sposobami in zynierii genetycznej, to jednak nadal istnieje pilna potrzeba opracowania wydajniejszych sposobów oczyszczania vWF z krwi lub osocza dawcy. Z europejskiego opisu patentowego nr EP 0 934 748 znany jest vWF o wysokiej czysto sci, który zawiera przynajmniej 15% multimerów vWF, sk ladaj acych si e z 13 lub wi ecej protomerów (multimery HMW-VWF). Wynik ten osi agni eto dzi eki zastosowaniu wielostopniowego oczyszczania chromatogra- ficznego, przy czym zamiast krioprecypitacji zastosowano s aczenie molekularne w trybie wydzielania grupowego. Dezaktywacj e wirusów w preparacie vWF uzyskiwano, na przyk lad, przez zastosowanie rozpuszczalników i detergentów oraz obróbki cieplnej liofilizowanego preparatu przez 72 godziny w temperaturze 80°C. W pracach Josica i wspó lautorów, „Purification of factor VIII i vWF from human plasma by anion-exchange chromatography”, Journal of Chromatography B, 662 (1994) str. 181-190; oraz Schwinna i wspó lautorów, „A Solvent/Detergent Treated, Pasteurized and Highly Purified Factor VIII Concentrate”, Arzneimittel-Forschung 1 Drug Research 44 (1), 2, 188-191 (1994) przedstawiono oczyszczanie kompleksów czynnika VIII/vWF, które realizowano na pod lo zach jonowymiennych oraz dezaktywacj e wirusów w dwóch, niezale znych od siebie, etapach. Rozpuszczalniki/detergent wprowa- dzano oraz pasteryzacj e (10 godzin w 63°C) prowadzono w obecnosci stabilizatorów. Mimo, ze w wyniku pasteryzacji czynnik VIII niemal nie ulega denaturacji (95% aktywno sci resztkowej), to vWF zmienia si e, zarówno pod wzgl edem aktywno sci, jak i typów uzyskanych multimerów (85% antygenu resztkowego), co wi ecej nast epuje znaczne zmniejszenie liczby multimerów o wysokiej masie cz a- steczkowej, prowadz ac do uzyskania preparatu o stosunku antygenu do aktywno sci vWF na poziomie 2,2 (stosunek aktywnosci do antygenu = 0,5). Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Am. P ln. nr US 5 714 590 znany jest sposób oczyszczania kompleksów czynnika VIII z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej. W tym eta- pie oczyszczania chromatograficznego zastosowano z lo ze w kolumnie EMD-TMAE-Fractogel, u zyte równie z w etapie s aczenia molekularnego. Natomiast do dezaktywacji wirusów zastosowano rozpusz- czalnik/detergent. W tym rozwi azaniu nie przedstawiono obróbki cieplnej preparatu. Otrzymany pro- dukt zawiera dodatkowo vWF, przy czym stwierdzono tylko antygenowo sc vWF. Celem wynalazku jest opracowanie takiego sposobu oczyszczania czynnika vWF z osocza ludzkiej krwi, który zapewni otrzymanie preparatu vWF o lepszej jako sci i skuteczno sci. Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania z frakcji osocza ludzkiego preparatu aktyw- nego hemostatycznie, zawieraj acego czynnik von Willebranda, vWF, obejmuj acy etap, w którym: i) oczyszcza si e chromatograficznie frakcj e osocza zawieraj ac a vWF, na pod lo zu anionowymie- nym; zawieraj acym grupy anionowymienne na szczepionych strukturach polimerowych: materia ly tentacle, zbieraj acych frakcj e zawieraj ac a vWF, charakteryzuj acy si e tym, ze nast epnie ii) oczyszcza si e uzyskan a frakcj e stosuj ac chromatografi e wykluczenia wg wymiarów, SEC, uzyskuj ac oczyszczony preparat stabilny termicznie, zawieraj acy vWF, po czym iii) liofilizowany preparat ogrzewa si e do temperatury wy zszej ni z 80°C dezaktywuj ac wirusy. Korzystnie uzyskuje si e w analizie wykluczenia wg wymiarów HPLC tylko jeden pik zarówno dla preparatu stabilnego termicznie jak i preparatu ogrzewanego. W korzystnym rozwi azaniu preparat ogrzewa si e w temperaturze wy zszej ni z 90°C, korzystnie w temperaturze 100°C. W innym korzystnym rozwi azaniu sposobu wed lug wynalazku preparat ogrzewa si e przez przy- najmniej 1 do 5 godzin, korzystnie 2-3 godziny. Korzystnie dodatkowo oczyszcza si e frakcj e stosuj ac przynajmniej jeden etap adsorpcji i/lub chromatografii powinowactwa.PL 203 508 B1 3 Korzystnie prowadzi si e etap oczyszczania stosuj ac SEC jako ostateczne oznaczenie wielko sci oczyszczanego bialka. Zgodnie z korzystnym rozwi azaniem sposobu wed lug wynalazku prowadzi si e oczyszczanie frakcji z zebranego osocza ludzkiego. W innej odmianie, przedmiotem wynalazku jest preparat aktywny hemostatycznie zawieraj acy vWF, który jest otrzymany sposobem wed lug wynalazku. Korzystnie preparat jest wolny od zaka zenia wirusami, zw laszcza HIV, HBV, HCV, HAV i parvowirusami. W korzystnym rozwi azaniu preparat zawiera vWF o wysokiej masie cz asteczkowej i wykazuje w analizie elektroforetycznej minimum 13 spo sród 16 multimerycznych pr azków. Korzystnie stosunek aktywno sci vWF mierzonej jako aktywno sc kofaktora rystocetyny do ozna- czenia antygenu vWF wynosi przynajmniej 0,8. Preparat wed lug wynalazku korzystnie zawiera ponadto czynnik VIII w postaci natywnej. W kolejnym korzystnym rozwi azaniu preparat zawiera na poziomie ni zszym ni z granica wykry- walno sci immunochemicznej: immunoglobuliny, fibrynogen, fibronektyn e i inhibitor inter- a-trypsyny. Korzystnie preparat wed lug wynalazku zawiera vWF w postaci natywnej, wolnej od fragmentów. W sród korzystnych materia lów tentacle, które mog a by c stosowane w sposobie wed lug wyna- lazku mo zna wymieni c te przedstawione w europejskim opisie patentowym nr EP 0 337 144. Korzyst- ne materia ly tentacle obejmuj a polimery poliakryloamidowe szczepione na diolach Fractogel (dostar- czane przez firm e Merck, Darmstadt, Niemcy). Wynalazek zosta l przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres stabilno sci produktu otrzymywanego sposobem wed lug wynalazku w porównaniu do produktów oczyszczonych jedynie za pomoc a chromatografii jonowymiennej. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zawartosc czynnika vWF w produkcie otrzymanym zgodnie ze sposobem wed lug wynalazku jest bardzo du za, w porównaniu do poziomu czynnika VIII. Dzi eki zasto- sowaniu etapu s aczenia molekularnego (chromatografii wykluczenia wg wymiarów), sposób wed lug wynalazku umo zliwia usuni ecie inhibitora inter- a-trypsyny, jak równie z innych czynników, które powo- dowa ly obni zenie jako sci produktów otrzymywanych znanymi sposobami. Sekwencja etapów chroma- tograficznych wed lug wynalazku zapewnia otrzymanie preparatów zawieraj acych vWF o bardzo du zej stabilno sci. Frakcja zawieraj aca vWF, otrzymywana sposobem wed lug wynalazku) okaza la si e nie- oczekiwanie bardzo stabilna przy przechowywaniu w roztworach wodnych w temperaturze otoczenia przez d lu zszy czas (pomiary by ly realizowane w okresie do tygodnia). Ponadto, preparat wed lug wy- nalazku zawiera vWF w formie natywnej, wolnej fragmentów. Zgodnie ze sposobem wed lug wynalazku, preparat stabilny termicznie mo ze by c ogrzewany. Dzi eki temu uzyskuje si e dezaktywacj e wirusów gro znych przy transfuzji krwi i preparatów kriopo- chodnych, zw laszcza wirusów bez pow loki lipidowej, takich jak parvowirusy i wirusy wywo luj ace zó l- taczk e typu A. Niespodziewanie stwierdzono, ze aktywno sc produktu otrzymanego sposobem wed lug wyna- lazku zasadniczo nie ulega obni zeniu w wyniku zastosowanej obróbki termicznej, Liczba multimerów i ich rozk lad jest miar a podobie nstwa vWF do natywnego vWF wyst epuj ace- go w osoczu. Zastosowanie kompleksów czynnika VIII i vWF do leczenia choroby Willebranda jest szczegól- nie wskazane. Wynalazek zosta l opisany bardziej szczegó lowo w poni zszych przyk ladach. P r z y k l a d y Oko lo 47 kg krioprecypitatu poddano dzia laniu 15% (udzia l masowy) 2% (udzia l masowy) roz- tworu wodorotlenku glinu. Po odwirowaniu próbk e poddano dzia laniu 0,3% TnBP /1% Triton X 100 w celu dezaktywacji wirusów. Po ekstrakcji olejowej próbk e poddano chromatografii anionowymiennej stosuj ac jako pod lo ze Fractogel ( zel tentacle dostarczony przez firm e Merck, Darmstadt, Niemcy). Zastosowano nast epuj ace bufory: Bufor AM, pierwszy etap p lukania: 120 mM NaCl, 10 mM cytrynianu sodu, 120 mM glicyny, 1 mM CaCl 2 , pH 6,9-7,1; osmolalno sc: 360-400 mosmol/kg. Bufor BM, drugi etap p lukania: 235 mM NaCl, 10 mM cytrynianu sodu, 120 mM glicyny, 1 mM CaCl 2 , pH 6,9-7,1; osmolalno sc: 570-610 mosmol/kg.PL 203 508 B1 4 Bufor CM, elucja: 700 mM NaCl, 10 mM cytrynianu sodu, 120 mM glicyny, 1 mM CaCl 2 , pH 6,9-7,1; osmolalno sc: 1380-1480 mosmol/kg. Bufor DM, trzeci etap p lukania: 1,5 M NaCl. Frakcje wykazuj ace aktywnosc vWF/FVIII poddano chromatografii wykluczenia wg wymiarów, SEC, stosuj ac jako z lo ze Fractogel EMD Bio SEC (dostarczony przez firm e Merck, Darmstadt, Niem- cy). Po ultra-/diafiltracji, uzyskano preparat o nast epuj acym sk ladzie: 400 mM NaCl, 10 mM cytrynian sodu, 1 mM CaCl 2 , 133 mM glicyna, 1% sacharoza. Nast epnie w celu sterylizacji preparatu przeprowadzono s aczenie. Preparat umieszczono w fiolkach i poddano liofilizacji, a nast epnie ogrzewaniu w temperaturze 100°C przez 120 min. Na fig. 1 wykazano stabilnosc produktu otrzymanego sposobem wed lug wynalazku w porówna- niu do produktów oczyszczanych jedynie za pomoc a chromatografii jonowymiennej. Otrzymany w wyniku chromatografii jonowymiennej, produkt wed lug wynalazku zosta l poddany chromatografii wykluczenia wg wymiarów, SEC. Stwierdzono ponadto, ze produkt wed lug wynalazku, nawet przy przechowywaniu przez 7 dni w temperaturze pokojowej, w roztworze wodnym bez heparyny, lub w obecno sci heparyny, zachowuje 80% swej aktywno sci, podczas gdy produkty niepoddane SEC, zachowuj a po tym samym czasie tylko 20% wyj sciowej aktywno sci. PL PL

Claims (14)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Sposób uzyskiwania z frakcji osocza ludzkiego preparatu aktywnego hemostatycznie, za- wierajacego czynnik von Willebranda, vWF, obejmuj acy etapy, w których: i) oczyszcza si e chromatograficznie frakcj e osocza zawieraj ac a vWF, na pod lo zu anionowymie- nym zawieraj acym grupy anionowymienne na szczepionych strukturach polimerowych: materia ly ten- tacle, zbieraj acych frakcj e zawieraj ac a vWF, znamienny tym, ze ii) oczyszcza si e uzyskan a frakcj e stosuj ac chromatografi e wykluczenia wg wymiarów, SEC, uzyskuj ac oczyszczony preparat stabilny termicznie, zawieraj acy vWF, po czym iii) liofilizowany preparat ogrzewa si e do temperatury wy zszej ni z 80°C dezaktywuj ac wirusy.

2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze uzyskuje si e w analizie wykluczenia wg wy- miarów HPLC tylko jeden pik zarówno dla preparatu stabilnego termicznie jak i preparatu ogrzewanego.

3. Sposób wed lug zastrz. 2, znamienny tym, ze preparat ogrzewa si e w temperaturze wy zszej ni z 90°C, korzystnie w temperaturze 100°C.

4. Sposób wed lug zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, ze preparat ogrzewa si e przez przynajm- niej 1 do 5 godzin, korzystnie 2-3 godziny.

5. Sposób wed lug zastrz. 1 do 4, znamienny tym, ze dodatkowo oczyszcza si e frakcj e stosu- jac przynajmniej jeden etap adsorpcji i/lub chromatografii powinowactwa.

6. Sposób wed lug zastrz. 1 do 5, znamienny tym, ze prowadzi si e etap oczyszczania stosuj ac SEC jako ostateczne oznaczenie wielko sci oczyszczanego bia lka.

7. Sposób wed lug zastrz. 1 do 6, znamienny tym, ze prowadzi si e oczyszczanie reakcji z ze- branego osocza ludzkiego.

8. Preparat aktywny hemostatycznie zawieraj acy vWF, znamienny tym, ze jest (trzymany sposobem okre slonym w zastrz. 1-7.

9. Preparat wed lug zastrz. 8, znamienny tym, ze jest wolny od zaka zenia wirusami, zw lasz- cza HIV, HBV, HCV, HAV i parvowirusami.

10. Preparat wed lug zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, ze zawiera vWF i wysokiej masie cz a- steczkowej i wykazuje w analizie elektroforetycznej minimum 3 spo sród 16 multimerycznych pr azków.

11. Preparat wed lug zastrz. 8 do 10, znamienny tym, ze stosunek aktywno sci vWF mierzonej jako aktywnosc kofaktora rystocetyny do oznaczenia antygenu vWF wynosi przynajmniej 0,8.

12. Preparat wed lug zastrz. 8 do 11, znamienny tym, ze zawiera ponadto czynnik VIII w posta- ci natywnej.

13. Preparat wed lug zastrz. 8 do 12, znamienny tym, ze zawiera na poziomie ni zszym ni z gra- nica wykrywalno sci immunochemicznej: immunoglobuliny, fibrynogen, bronektyn e i inhibitor inter- a- -trypsyny.PL 203 508 B1 5

14. Preparat wed lug zastrz. 8 do 13, znamienny tym, ze zawiera vWF w postaci natywnej, wol- nej od fragmentów. RysunekPL 203 508 B1 6 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 z l. PL PL