PL210616B1

PL210616B1 - Sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu

Info

Publication number: PL210616B1
Application number: PL374080A
Authority: PL
Inventors: Sarah Kingsland; Robert Clemmitt; David Evans; Peter Feldman
Original assignee: Nat Blood Authority
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2012-02-29
Also published as: BR0312521A; GB0216001D0; ATE449104T1; EP1519944A1; AU2003244850A1; WO2004007533A1; BRPI0312521B8; BRPI0312521B1; US20070042944A1; CA2491716C; ES2332780T3; DE60330146D1; NO20050091L; MXPA05000395A; JP2006505508A; DK1519944T3; US7816495B2; ECSP055584A; PL374080A1; EP1519944B1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu.

Fibrynogen jest białkiem osocza krwi, które uczestniczy w powstawaniu skrzepu. Fibrynogen zostaje przekształcony w monomer fibryny dzięki działaniu proteazy trombiny w osoczu. Monomery fibryny grupują się razem, tworząc słaby skrzep, a następnie są sieciowane dzięki działaniu aktywowanego czynnika XIII (tj. czynnik XIIIa), tworząc mocniejszy skrzep. Fibrynogen stosuje się do leczenia w połączeniu z trombiną w tak zwanych preparatach fibrynowych, w celu uzyskania hemostazy, zahamowania krwawienia z ran oraz w celu uzyskania kontrolowanej adhezji tkanki. Koncentraty fibrynogenu stosuje się także w terapii zastępczej u pacjentów z wrodzonym lub nabytym niedoborem fibrynogenu (afibrynogenemią).

We wszystkich zastosowaniach klinicznych istotne jest stosowanie bardzo czystego fibrynogenu w celu minimalizacji wszelkich działań niepożądanych powstających np. z powodu obecnoś ci niepożądanych białek zanieczyszczających. W szczególności pożądane jest, aby preparaty fibrynogenu do zastosowań klinicznych nie zawierały plazminogenu i plazminy (Blomback B., Blomback M., „Purification of human and bovine fibrinogen”, Arkiv for Kemi 1956; 10:415-443, i Mosesson M.W., „The prepraration of human fibrinogen free of plasminogen”, Biochim Biophys Acta 1962, 57:204-213).

Plazminogen jest nieaktywnym prekursorem plazminy, enzymu fibrynolitycznego, która trawi skrzepy fibrynowe. Zatem obecność plazminogenu w preparacie fibrynogenu przeznaczonego do zastosowania in vivo nie jest pożądana, z uwagi na to, że wytworzenie jakiejkolwiek plazminy z plazminogenu w miejscu powstawania skrzepu może spowodować destabilizację skrzepu.

Plazminogen wykazuje tendencję do oddzielania się razem z fibrynogenem, co utrudnia jego usuwanie. Zatem niektóre preparaty kliniczne fibrynogenu zawierają środki przeciwfibrynolityczne w celu zahamowania powstawania plazminy lub plazminogenu (np. aprotyninę , biał ko bydlę ce, inhibitor plazminy lub kwas traneksamowy, syntetyczny inhibitor plazminy, z którym związane jest także występowanie neurotoksycznych działań niepożądanych). Jedną z zalet oddzielenia plazminogenu od fibrynogenu jest to, że wówczas nie jest konieczne zastosowanie inhibitorów fibrynolitycznych w klinicznym preparacie fibrynogenu.

Ponadto bardzo pożądana jest obróbka preparatów fibrynogenu pochodzącego od ludzi lub zwierząt, mająca na celu inaktywację wszelkich wirusów krwiopochodnych, które mogą występować w takim preparacie, np. wirusa zapalenia wątroby lub HIV. W tej dziedzinie znane są różne sposoby inaktywacji wirusa, obejmujące pasteryzację, obróbkę cieplną na sucho oraz traktowanie układem rozpuszczalnik-detergent (Pathogen Inactivation of Labile Blood Products, Council of Europe Expert Committee and Blood Transfusion Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175).

Wiadomo, że obróbka cieplna na sucho skutecznie inaktywuje zarówno wirusy w otoczkach, jak i niektóre wirusy bez otoczek, podczas gdy obróbka z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent skutecznie inaktywuje wirusy w otoczkach (tj. w otoczkach lipidowych), takie jak wirus zapalenia wątroby typu B.

W tej dziedzinie znane są różne sposoby oczyszczania fibrynogenu. Jednakże metody oczyszczania znane w stanie techniki mają różne wady. Przykładowo, metody strąceniowe nie umożliwiają łatwego wprowadzenia etapu inaktywacji wirusa z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent (SD), jako że reagenty SD znacznie efektywniej usuwa się chromatograficznie. Metody chromatograficzne mogą nie umożliwiać oddzielenia fibrynogenu od plazminogenu w jednym etapie, co może wymagać zastosowania dodatkowej metody chromatograficznej w celu adsorpcji plazminogenu lub dodania środka przeciwfibrynolitycznego do finalnego preparatu fibrynogenu w celu dezaktywacji pozostałego plazminogenu. Ponadto nie wszystkie metody znane w stanie techniki są odpowiednie do oczyszczania fibrynogenu z wielu roztworów zawierających fibrynogen (obejmujących osocze i frakcje rekombinowane).

W publikacji US5169936 ujawniono, ż e do otrzymywania ludzkiego fibrynogenu mo ż na stosować chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC). Jednakże nie ujawniono przykładów takiej metody ani w żaden sposób nie nawiązano do ewentualnego zastosowania IMAC do oddzielania fibrynogenu od plazminogenu.

Wiadomo także, że rozpuszczenie koncentratów fibrynogenu może być trudne i często wymaga zastosowania podwyższonych temperatur lub przedłużonego mieszania (US5260420 i EP0804933). Z uwagi na nietrwałość ciekłych roztworów fibrynogenu, preparaty fibrynogenu do zastosowań kliniczPL 210 616 B1 nych sprzedaje się albo w postaci głęboko zamrożonego roztworu lub jako liofilizat. Przed użyciem produkt należy rozmrozić lub odtworzyć z liofilizatu. Oba te rozwiązania są czasochłonne i niepraktyczne.

Zatem korzystne byłoby opracowanie alternatywnych metod oczyszczania fibrynogenu, w szczególności metody odpowiedniej dla dowolnego materiału wyjściowego zawierającego fibrynogen, które umożliwiają wprowadzenie jednego lub kilku etapów inaktywacji wirusa.

Korzystne byłoby także opracowanie metody oddzielania fibrynogenu od plazminogenu. Ponadto korzystne byłoby uzyskanie liofilizowanego, a korzystnie po obróbce cieplnej, koncentratu fibrynogenu, który można łatwo ponownie rozpuścić w temperaturze pokojowej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu, obejmujący etapy, w których:

(a) wprowadza się roztwór zawierający fibrynogen i plazminogen na matrycę stosowaną w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu, w warunkach, w których fibrynogen i plazminogen łączą się z matrycą, i (b) przeprowadza się selektywną elucję fibrynogenu i plazminogenu osobno z matrycy.

Jako roztwór zawierający fibrynogen stosuje się frakcję osocza zawierającą fibrynogen. Roztwór zawierający fibrynogen może ponadto zawierać czynnik XIII, a czynnik XIII eluuje się z matrycy łącznie z fibrynogenem.

Sposób według wynalazku ponadto obejmuje etap, w którym doprowadza się do koncentracji fibrynogenu poprzez ultrafiltrację do stężenia do 15-30 mg/ml.

Sposób obejmuje też etapy, w których:

tworzy się mieszaninę fibrynogenu z mieszaniną odpowiednich stabilizatorów i uzyskuje się preparat fibrynogenu, fibrynogen sterylizuje się przez filtrację i liofilizuje się preparat fibrynogenu uzyskując liofilizowany preparat fibrynogenu.

Stabilizatory stanowią aminokwas, węglowodan, sól i detergent. Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje etap, w którym liofilizowany preparat fibrynogenu poddaje się obróbce cieplnej lub etap, w którym rozpuszcza się liofilizowany preparat fibrynogenu do stężenia co najmniej do 60 mg/ml.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oddzielania fibrynogenu od plazminogenu, obejmujący etapy, w których:

(a) wprowadza się roztwór zawierający fibrynogen i plazminogen na matrycę stosowaną w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu, w warunkach, w których przynajmniej fibrynogen łączy się z matrycą, i (b) przeprowadza się selektywną elucję fibrynogenu z matrycy.

Plazminogen i fibrynogen selektywnie wymywa się osobno z matrycy. Jako roztwór zawierający fibrynogen stosuje się frakcję osocza zawierającą fibrynogen. Korzystnie roztwór zawierający fibrynogen ponadto zawiera czynnik XIII, a czynnik XIII eluuje się z matrycy łącznie z fibrynogenem.

Korzystnie sposób według wynalazku ponadto obejmuje etap, w którym miesza się fibrynogen z mieszaniną odpowiednich stabilizatorów i uzyskuje się preparat fibrynogenu, fibrynogen sterylizuje się przez filtrację i liofilizuje się preparat fibrynogenu uzyskując liofilizowany preparat fibrynogenu.

Stabilizatory stosowane w sposobie stanowią aminokwas, węglowodan, sól i detergent.

Sposób według wynalazku ponadto obejmuje etap, w którym liofilizowany preparat fibrynogenu poddaje się obróbce cieplnej.

Korzystnie sposób obejmuje ponadto etap, w którym rozpuszcza się liofilizowany preparat fibrynogenu do stężenia co najmniej do 60 mg/ml.

Ujawniono także sposób wspólnego oczyszczania fibrynogenu i czynnika XIII, obejmujący etapy, w których:

(a) wprowadza się roztwór zawierający fibrynogen i czynnik XIII na matrycę stosowaną w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu, w warunkach, w których i fibrynogen i czynnik XIII łączą się z matrycą, i (b) przeprowadza się selektywną łączną elucję fibrynogenu i czynnika XIII z matrycy.

PL 210 616 B1

Stosowane tu terminy oddzielanie i/lub oczyszczanie fibrynogenu obejmują łączne oddzielanie i/lub łączne oczyszczanie fibrynogenu i czynnika XIII razem z materiałami wyjściowymi zawierającymi i fibrynogen i czynnik XIII.

Materiałem wyjściowym w sposobach według wynalazku może być dowolny roztwór zawierający fibrynogen, w tym ludzkie lub zwierzęce osocze lub frakcja osocza, frakcje hodowli komórkowej otrzymywane przez zastosowanie technik rekombinacji, frakcje pochodzące z mleka zwierząt transgenicznych itp. Korzystne materiały wyjściowe obejmują frakcje osocza, takie jak krioprecypitat, precypitat heparyny i precypitat zimny. Z czego szczególnie korzystne materiały wyjściowe to precypitat heparyny i krioprecypitat. Inne korzystne materiały wyjściowe obejmują te, które zawierają dodatkowo plazminogen i/lub czynnik XIII.

Materiał wyjściowy można otrzymać stosując dowolny odpowiedni sposób znany w tej dziedzinie, w tym manipulacje genami, np. w hodowli komórkowej lub gatunkach transgenicznych. Krioprecypitat można wytworzyć przykładowo sposobem opisanym przez Gunson H.H., Bidwell E., Lane R.S., Wensley R.T., Snape T.J., „Variables involved in cryoprecipitate production and their effect on Factor VIII activity”, British Journal of Haematology, 1978; 43:287-295; precypitat heparyny można wytworzyć sposobem opisanym przez Winkelman L., Owen N.E., Evans D.R., Evans H.E., Haddon M.E., Smith J.K., Prince P.J., Williams J.D., Lane R.S., „Severely heated therapeutic Factor VIII concentrate of high specific activity”. Vox Sanguinis, 1989; 57:97-103, a precypitat zimny sposobem opisanym przez Smith J.K,, Evans D.R., Stone V., Snape T.J., „A Factor VIII concentrate of intermediate purity and higer potency”. Transfusion, 1979; 19:299-306.

Niepożądane zanieczyszczenia w materiale wyjściowym, które można oddzielić od fibrynogenu stosując metody według wynalazku, mogą obejmować inne białka (np. białka osocza takie jak plazminogen), reagenty z wcześniejszych etapów przetwarzania (np. elementy pożywek do hodowli komórkowej lub reagenty układu rozpuszczalnik-detergent), wirusy i priony. Szczególnie korzystne jest usunięcie plazminogenu tak, aby nie było konieczne dodawanie inhibitorów plazminy (środków przeciw-fibrynolitycznych) do fibrynogenu.

Roztwór zawierający fibrynogen wprowadza się do matrycy IMAC. Korzystnie matrycę stanowi wypełnienie kolumny, z uwagi na łatwość obróbki. Odpowiednie do zastosowania są dowolne jony metali, np. miedzi, cynku lub niklu, korzystnie miedzi. Odpowiednie żele do chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali, do zastosowania w sposobie według wynalazku, obejmują żel metakrylanowy z wielopodstawionymi ligandami w grupach dystansujących łańcucha bocznego (np. Fractogel EMD Chelate z firmy Merck), żel metakrylanowy z pojedynczymi grupami chelatującymi w odgałęzieniu z grupami dystansującymi (np. Toyopearl Chelate z firmy Tosoh Biosep) i usieciowany żel agarozowy (np. Sepharose FF o działaniu chelatującym z firmy Amersham Biosciences). Korzystnym żelem jest Toyopearl AF Chelate 650 (M) z firmy Tosoh Biosep.

Warunki do wprowadzenia do kolumny, w tym zastosowanie buforu, należy wybrać tak, aby fibrynogen oraz czynnik XIII, jeśli występuje, w materiale wyjściowym zostały związane z żelem. Niepożądane zanieczyszczenia, które nie łączą się z żelem można następnie usunąć przez wymycie. Jeśli np. materiał wyjściowy uprzednio poddano etapowi inaktywacji z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent, dowolne pozostałe reagenty, tj. rozpuszczalnik lub detergent, nie łączą się z żelem i można je łatwo usunąć poprzez wymycie. Alternatywnie, jeś li niepożądane zanieczyszczenia łączą się z żelem, to można je usunąć przez selektywną elucję przed elucją fibrynogenu lub można je pozostawić związane na żelu podczas selektywnej elucji fibrynogenu. Ponadto, przemywanie żelu i związanego białka (białek) może także ułatwić usunięcie wszelkich wirusów, które mogą występować w materiale podawanym na kolumnę chromatograficzną.

Stwierdzono, że plazminogen łączy się mniej ściśle niż fibrynogen lub czynnik XIII z żelami chromatograficznymi zawierającymi chelatowane metale. Plazminogen występujący w materiale wyjściowym można więc usunąć przez wymycie metodą selektywnej elucji, stosując roztwór o małym stężeniu konkurencyjnego związku chelatującego o małej masie cząsteczkowej lub poprzez zmianę warunków tak, aby zmniejszyć siłę wiązania, np. zmniejszając wartość pH lub stężenie jonowe, przy pozostawieniu fibrynogenu związanego na żelu. Odpowiednie związki chelatujące obejmują aminokwasy, np. alaninę, leucynę i lizynę, imidazol, sole cytrynianowe i kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Korzystnym związkiem chelatującym do elucji plazminogenu jest alanina. Stężenie związku chelatującego należy wybrać tak, aby plazminogen eluował a fibrynogen pozostawał związany na żelu. Dokładne stężenie będzie zależeć od zastosowanego eluenta. Np. przy stężeniach <20 mM

PL 210 616 B1 powinno następować selektywne usuwanie plazminogenu w obecności związanego fibrynogenu.

Odpowiednie stężenia do elucji plazminogenu obejmują <20 mM alaniny lub leucyny, <10 mM lizyny i <10 mM imidazolu.

Fibrynogen można następnie wymyć stosując większe stężenie takiego samego lub innego związku chelatującego lub zmniejszając wartość pH lub stężenie jonowe. Korzystne związki chylatujące do elucji fibrynogenu obejmują aminokwasy, korzystnie lizynę lub argininę, i imidazol. Szczególnie korzystny eluent zawiera argininę. Np. fibrynogen można wymywać stosując >20 mM roztwór związku chelatującego. Warunki do elucji fibrynogenu (stężenie i wartość pH) należy wybrać tak, aby usuwaniu fibrynogenu z żelu nie towarzyszyło usuwanie jonów metali, w celu zminimalizowania zanieczyszczenia produktu tymi jonami.

Usunięcie plazminogenu jest korzystne, ponieważ fibrynogen można później stosować klinicznie bez konieczności dodawania do preparatu leczniczego jakiegokolwiek środka przeciwfibrynolitycznego.

Korzystny jest fakt, że plazminogen, który oddzielono od fibrynogenu metodą IMAG, można poddać dalszej obróbce, uzyskując koncentrat plazminogenu do zastosowania klinicznego. Metodę IMAG można zatem stosować do otrzymywania zarówno plazminogenu, jak i fibrynogenu z roztworu wyjściowego zawierającego oba te związki.

Korzystną własnością sposobów według wynalazku jest to, że czynnik XIII występujący w materiale wyjściowym wykazuje tendencję do eluowania łącznie z fibrynogenem. Mierzalna obecność (>1 U/ml) czynnika XIII w finalnych preparatach fibrynogenu może być korzystna, jeśli fibrynogen jest przeznaczony do stosowania klinicznego. W niektórych testach in vitro wykazano, że stężenie czynnika XIII ma wpływ na działanie preparatów fibrynowych, chociaż nie ma dowodu na to, że czynnik XIII jest niezbędny dla klinicznej skuteczności preparatu a stosowane preparaty fibrynowe, które nie zawierają czynnika XIII w mierzalnej ilości wykazują skuteczność kliniczną. Po zastosowaniu w środowisku krwi (np. dla uzyskania hemostazy), endogenny czynnik XIII pacjenta umożliwi przebieg sieciowania skrzepu. Zatem nie jest to przypadek, w którym obecność czynnika XIII w produkcie mogłaby być korzystna. Ponieważ czynnik XIII jest enzymem katalitycznym może działać skutecznie nawet w małym stężeniu.

Materiał wyjściowy zawierający fibrynogen można ewentualnie poddać inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent przed zastosowaniem chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali. Inaktywację wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent można prowadzić z zastosowaniem reagentów i metod znanych w tej dziedzinie (US4481189, US4613501 i US4540573, załączone jako odniesienie). Odpowiednie rozpuszczalniki obejmują fosforan tri-n-butylu (TnBP) i eter, korzystnie TnBP. Odpowiednie detergenty obejmują polisorbat (Tween) 80, polisorbat (Tween) 20 i Triton X-100. Korzystnym detergentem jest polisorbat 20, a szczególnie korzystną kombinację stanowi polisorbat 20 i TnBP.

Frakcję zawierającą fibrynogen można zmieszać z rozpuszczalnikiem i detergentem w odpowiedniej temperaturze i przez czas wystarczający do inaktywacji wszelkich wirusów w otoczkach, których obecność jest możliwa. Obróbkę rozpuszczalnik-detergent można np. prowadzić przez około 1 godzinę w temperaturze 25°C.

Fibrynogen odzyskany z etapu chromatografii można następnie poddać dalszej obróbce w celu otrzymania preparatu do zastosowania farmaceutycznego. Można go np. zatężyć metodą ultrafiltracji do stężenia w przybliżeniu 15-30 mg/ml i/lub poddać kolejnemu etapowi usuwania patogenów, np. nanofiltracji.

Z koncentratu można następnie przygotować preparat poprzez dodanie kombinacji odpowiednich stabilizatorów, np. aminokwasów, węglowodanów, soli i detergentów. Szczególnie korzystnie produkt komponuje się bez dodawania jakichkolwiek środków przeciw-fibrynolitycznych lub białek stabilizujących, takich jak albumina. Preparat można następnie wyjałowić przez filtrację i liofilizować w celu umożliwienia przechowywania przez dłuższy czas. Ewentualnie, liofilizowany produkt można poddać obróbce cieplnej na sucho w kolejnym etapie inaktywacji wirusów. Można go np. ogrzewać w temperaturze około 80°C przez około 72 godziny lub w temperaturze około 100°C przez około 24 godziny.

Kombinacja aminokwasu, soli, węglowodanu i detergentu zastosowana do przygotowania preparatu fibrynogenu stabilizuje preparat w czasie liofilizacji i końcowego etapu obróbki cieplnej. Ułatwia także odtworzenie liofilizowanego produktu. W szczególności stabilizatory wspomagają stabilizację czynnika XIII występującego w produkcie, który jest znany z wyjątkowej labilności.

PL 210 616 B1

Produkt po liofilizacji i obróbce cieplnej można odtwarzać wodą w temperaturze otoczenia w czasie poniżej 15 minut, korzystnie poniżej 10 minut, a najkorzystniej poniżej 5 minut, uzyskując roztwór fibrynogenu o stężeniu przynajmniej około 60 mg/ml.

Korzystną cechą sposobu według wynalazku jest usuwanie plazminogenu, co zapobiega konieczności dodawania środków przeciw-fibrynolitycznych do finalnego preparatu fibrynogenu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zatem liofilizowany, korzystnie po obróbce cieplnej, preparat fibrynogenu zawierający fibrynogen przygotowany jednym ze sposobów według wynalazku, węglowodan, bufor, sól, aminokwas i detergent, oraz ewentualnie czynnik XIII. Preparat ten można rozpuścić w wodzie w temperaturze otoczenia w czasie poniżej 15 minut, korzystnie poniżej 10 minut, a korzystniej poniżej 5 minut, uzyskując roztwór fibrynogenu. Stężenie fibrynogenu w finalnym roztworze korzystnie wynosi przynajmniej około 60 mg/ml.

Nie wiążąc się jakąkolwiek teorią przyjmuje się, że kombinacja soli, detergentu, aminokwasu i wę glowodanu uł atwia szybkie rozpuszczanie preparatu. Przyjmuje się takż e, ż e wę glowodan zabezpiecza aktywność występującego czynnika XIII. Bufor kontroluje wartość pH preparatu. Zastosowanie kombinacji węglowodanu, buforu, soli, aminokwasu i detergentu stabilizuje także fibrynogen i czynnik XIII, jeśli występuje, bez konieczności dodawania jakichkolwiek innych stabilizatorów, np. innych białek takich jak albumina. Jest to korzystne, ponieważ dodanie innych białek może być źródłem wirusowych lub innych zanieczyszczeń produktu. Zatem, preparaty fibrynogenu według wynalazku nie zawierają białek stabilizujących, w szczególności albuminy. Korzystnie preparaty fibrynogenu według wynalazku nie zawierają również środków przeciw-fibrynolitycznych.

Odpowiednie aminokwasy obejmują argininę, odpowiednie węglowodany obejmują sacharozę, trehalozę i rafinozę, korzystnie sacharozę, odpowiednie bufory obejmują sole cytrynianowe (np. cytrynian sodu) i sole fosforanowe (np. fosforan sodu), odpowiednie sole obejmują chlorek sodu, a odpowiednie detergenty obejmują polisorbat 20.

Korzystnie, detergent stosowany w finalnym preparacie jest taki sam, jak detergent użyty w którymkolwiek z wcześniejszych etapów inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent, aminokwas jest taki sam, jak użyty do elucji fibrynogenu z kolumny zawierającej chelatowane metale, a sól i bufor są takie same, jak użyte podczas oczyszczania, co tym samym likwiduje potrzebę usuwania śladowych ilości tych składników z produktu. Pożądane jest także zminimalizowanie ekspozycji produktu na wiele różnych reagentów stosowanych podczas wytwarzania, jako że każdy użyty reagent jest źródłem możliwych zanieczyszczeń lub niepożądanej modyfikacji produktu. Zatem korzystne jest, aby substancje pomocnicze w finalnych produktach obejmowały reagenty użyte już podczas wytwarzania.

Odpowiednie stężenia różnych składników będą zależeć od dokładnych własności i źródła fibrynogenu, i można je określić stosując rutynowo metody prób i błędów. Odpowiednie zakresy stężeń przed liofilizacją obejmują:

węglowodan (korzystnie sacharoza):około 0,5-2,5% wag., detergent (korzystnie polisorbat 20): około 0,1-0,5% wag., sól (korzystnie chlorek sodu): około 50-250 mM, korzystnie około 50 mM, aminokwas (korzystnie arginina): około 50-120 mM, korzystnie około 110 mM.

Odpowiedni bufor dodaje się w celu kontroli wartości pH jeśli jest to pożądane, np. około 7,5. Korzystne preparaty zawierają około 0,5-2,5% wag. sacharozy, około 0,1-0,5% wag. polisorbatu 20, około 50-250 mM, korzystniej około 50 mM, chlorku sodu i około 50-120 mM argininy, i mają wartość pH około 7,5.

Preparaty fibrynogenu według wynalazku otrzymuje się poprzez przygotowanie roztworu zawierającego wszystkie składniki i następnie jego liofilizację. Po liofilizacji, suchy preparat korzystnie poddaje się finalnej obróbce cieplnej w celu inaktywacji wirusów w otoczkach i bez otoczek. Można go np. ogrzewać w temperaturze około 80°C przez około 72 godziny lub w temperaturze około 100°C przez około 24 godziny. Wiadomo, że obróbka cieplna może powodować denaturację białek, co z kolei może powodować agregację i zmniejszenie rozpuszczalności produktu po obróbce cieplnej. Inne składniki w preparatach według wynalazku wspomagają stabilizację fibrynogenu i czynnika XIII, jeśli występuje, podczas etapu obróbki cieplnej.

Omówiono bardziej szczegółowo korzystne rozwiązania według wynalazku:

Odzyskiwanie krioprecypitatu z osocza

Zamrożone ludzkie osocze można kondycjonować w temperaturze około -11°C, rozmrozić w temperaturze od -0,5 do 2°C, i uzyskany krioprecypitat odzyskać przez odwirowanie. Krioprecypitat

PL 210 616 B1 można przemyć w temperaturze <4°C i ponownie odzyskać przez odwirowanie. Krioprecypitat można przechowywać zamrożony.

Wytrącanie

Krioprecypitat można rozmrozić, stosując bufor (tj. ponownie rozpuścić), aby odzyskać zawarte w nim biał ka. Fibrynogen, fibronektynę i czynnik XIII można nastę pnie wytrą cić stosując odpowiedni środek chemiczny, np. heparynę, glikol polietylenowy (PEG) lub etanol, lub odpowiednio ustawiając temperaturę i wartość pH. Precypitat następnie odzyskuje się np. przez odwirowanie. Ten precypitat można przechowywać zamrożony.

Powtórne utworzenie zawiesiny z osadu

Heparynę lub inny precypitat można następnie ponownie zawiesić stosując odpowiedni bufor i mieszanie przez odpowiedni czas i w odpowiedniej temperaturze. Uzyskany preparat moż na następnie sklarować, np. metodą filtracji ultradźwiękowej lub przez odwirowanie, przed przepuszczeniem przez filtr 0,45 μm lub drobniejszy, w celu usunięcia wszelkich agregatów, które mogą występować i które mogą osłaniać wirusy przed działaniem reagentów z etapu inaktywacji metodą rozpuszczalnik-detergent.

Obróbka metodą rozpuszczalnik-detergent

Do przesączu można następnie dodać rozpuszczalnik i detergent i mieszaninę mieszać w odpowiedniej temperaturze tak, aby inaktywować wirusy w otoczkach. Rozpuszczalnikiem jest korzystnie fosforanu tri-n-butylu (TnBP), podczas gdy detergentem może być polisorbat 20, polisorbat 80 lub Triton X-100, korzystnie polisorbat 20.

Chromatografia

Materiał po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent można następnie bezpośrednio wprowadzić do kolumny chromatograficznej z chelatowanymi metalami, w której jonem metalu może być jon miedzi lub dowolny inny odpowiedni jon. Warunki buforowania i obciążania kolumny są takie, aby rozpuszczalnik i detergent nie wiązały się z adsorbentem, natomiast fibrynogen tak. Dowolny związany plazminogen można następnie selektywnie wymywać stosując w małym stężeniu związek chelatujący o małej masie cząsteczkowej, np. alaninę. Frakcję eluatu zawierającą plazminogen można następnie poddać dalszej obróbce, z wytworzeniem koncentratu plazminogenu, który można stosować klinicznie. Fibrynogen można następnie wymywać z dużą wydajnością, stosując większe stężenie takiego samego lub innego związku chelatującego, np. argininy. Czynnik XIII eluuje łącznie z fibrynogenem. Fibrynogen na ogół występuje w eluacie w stężeniu około 3-20 mg/ml.

Elucję z kolumny można monitorować dowolną odpowiednią metodą, np. przez pomiar absorbancji UV przy długości fali 280 nanometrów. Jest to miara stężenia białka w eluacie i można ją stosować do sterowania zbiorem frakcji i/lub zmianą buforu.

Stężenie

Eluat fibrynogenu można ewentualnie zatężyć stosując ultrafiltrację, uzyskując stężenia końcowe około 15-30 mg/ml, korzystnie około 20-25 mg/ml.

Preparat

Koncentrat fibrynogenu można komponować przez dodanie kombinacji aminokwasu, węglowodanu, buforu, soli i detergentu. Preparat można następnie wyjałowić przez przepuszczenie przez filtr 0,2 μm i podzielić na dawki. Taka filtracja może usuwać lub zmniejszać liczbę wirusów i innych patogenów, np. będących przyczyną pasażowalnej gąbczastej encefalopatii (TSE), za co odpowiedzialne są priony, jak się uważa obecnie. Bufor (i warunki liofilizacji) korzystnie wybiera się tak, aby masa fibrynogenu była odtwarzalna w wodzie w temperaturze pokojowej w czasie poniżej 10 minut. Korzystny preparat zawiera 110 mM argininy, 1,5% wag. sacharozy, 0,1% wag. polisorbatu 20, 50 mM NaCl, 10 mM cytrynianu trisodowego.

Liofilizacja i obróbka cieplna

Produkt liofilizuje się i następnie ewentualnie poddaje obróbce cieplnej w podwyższonych temperaturach w celu inaktywacji wirusów w otoczkach i bez otoczek.

Procesowe zanieczyszczenia mikrobiologiczne są minimalizowane poprzez odpowiednią sanityzację medium IMAC i przez filtrację buforów w celu usunięcia zanieczyszczeń bakteryjnych (np. z zastosowaniem filtrów 0,2 μm).

Fibrynogen wytworzony sposobem według wynalazku można stosować klinicznie, osobno lub w połączeniu z trombiną w zestawie.

Opis wynalazku zilustrowano poprzez przykłady wykonania.

PL 210 616 B1

Fibrynogen zmierzono stosując następujące metody:

Test wytrącania na gorąco - w oparciu o metodę opublikowaną przez Desvignes, P. i Bonnet, P., „Direct Determination of Plasma Fibrinogen levels by Heat Precipitation. A comparison of the Technique aqainst Thrombin Clottable Fibrinogen with Spectrophotometry and Radial Immune Diffusion”, Clinica Chimica Acta, 110 (1981), 9-17.

Test czasu krzepnięcia - w oparciu o metodę Claussa (Clauss, A., Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haematol 1957; 17:234-46).

Test krzepnięcia całkowitego - w oparciu o metodę Blomback i Blomback, Arkiv fur Chemi., 1956, Rozdział 10, 415-443.

Czynnik XIII zmierzono metodą fotometryczną (standard - prawidłowe osocze ludzkie), Metodę zaczerpnięto z następujących pozycji literatury:

Fickenscher, K., Aab, A., Stiiber, W., „A Photometric Assay for Blood Coagulation Factor XIII”, Thromb. Haemostas. 65 (1991), 535-540 i Solleder, E., Demuth, D., Pfeiffer, C, Bomhard, M., Mayer, J., Eller, T., Brauer, P., Keller, F., Grun, J., Fickenscher, K., Wagner, C., „Klinische Prufung eines neuen fotometrischen Tests zur Bestimmung der Factor XIII Aktivitat im Plasma”, Lab Med. 16 (1992), 48-53.

Plazminogen i czynnik XIII zmierzono testem ELISA.

P r z y k ł a d 1

Odzyskiwanie krioprecypitatu z osocza

Osocze przechowywano w temperaturze poniżej -30°C aż do użycia. Wymaganą ilość osocza następnie kondycjonowano w temperaturze -11°C przed usunięciem opakowania. Zebrane osocze następnie rozmrożono w temperaturze <2,5°C w celu odzyskania fibrynogenu, czynnika VIII, czynnika von Willebranda (vWF) i krioprecypitatu fibronektyny z osocza. Ten precypitat odzyskano przez odwirowanie i przechowywano zamrożony.

P r z y k ł a d 2

Wytrącanie

Krioprecypitat otrzymany według przykładu 1 ponownie zawieszono w 20 mM Tris/HCl o pH 6,7 w proporcji 0,024x masy netto zebranego osocza i rozmrożono przez ogrzewanie w temperaturze 20-40°C przez >20 minut. Następnie wartość pH ustalono na pH 6,55 z zastosowaniem 0,1 M HCl. Następnie dodano roztwór podstawowy heparyny, uzyskując stężenie końcowe 0,88 mg/ml i uzyskaną mieszaninę mieszano przez >2 minuty. W następstwie tych działań z roztworu wytrąciły się: fibrynogen, czynnik VIII uwalniający fibronektynę, i vWF. Precypitat heparyny następnie odzyskano przez odwirowanie. Ten precypitat można przechowywać zamrożony.

P r z y k ł a d 3

Powtórne utworzenie zawiesiny precypitatu

Precypitat heparyny otrzymany według przykładu 2 ponownie zawieszono w 20 mM

NaH2PO4/Na2HPO4, 10 mM cytrynianu trisodowego, 0,5 M NaCl o pH 6,0, w proporcji 1 część precypitatu na 5 części buforu. Tę zawiesinę następnie ogrzano do temperatury 40°C i inkubowano mieszając przez >1 godzinę. Ponownie zawieszony precypitat heparyny następnie sklarowano przez filtrację poprzez dwa filtry ultradźwiękowe (Cuno 05SP i Cuno SOLA) oraz filtr membranowy (Sartobran 0,65/0,45 μm) w celu usunięcia agregatów, które mogą osłaniać wirusy, zmniejszając skuteczność późniejszej obróbki metodą rozpuszczalnik-detergent.

P r z y k ł a d 4

Obróbka metodą rozpuszczalnik-detergent

Następnie do przesączu dodano roztwór podstawowy rozpuszczalnik-detergent 20% objętościowych polisorbatu 20 i 6% objętościowych TnBP, uzyskując stężenie końcowe 1% objętościowy polisorbatu 20 i 0,3% objętościowych TnBP. Uzyskaną mieszaninę następnie mieszano nie krócej niż przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 5

Chromatografia

Precypitat heparyny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent według przykładu 4 wprowadzono do kolumny Toyopearl AF Chelate 650 (M) z wypełnieniem miedziowym, którą wcześniej stabilizowano nie mniej niż 5 objętościami złoża buforu 1 (EW1: 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 10 mM cytrynianu trisodowego, 0,5 M NaCl, o pH 6,0). Do kolumny następnie wprowadzono 3 objętości złoża precypitatu heparyny po obróbce. Szybkość wprowadzenia była nie większa niż 77 cm/godzinę. Złoże następnie przemyto 18 objętościami złoża buforu 1. Związany plazminogen wymyto stosując 15 objętości złoża buforu 2 (EW2: 20 mM Na2HPO4, 15 mM alaniny, 0,5 M NaCl, o pH 7,5). Odmyty plazmiPL 210 616 B1 nogen można poddać dalszej obróbce, uzyskując koncentrat, który można stosować klinicznie. Następnie ustalono warunki buforowania, stosując 5 objętości złoża buforu 3 (EW3: 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, pH 7,0). Związany fibrynogen następnie eluowano stosując taką ilość buforu 4 (EW4: 50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,5), aby wartość A280 nm (absorbancja UV przy długości fali 280 nm) wróciła do linii bazowej. Jony miedzi następnie odłączono od żywicy stosując 5 objętości złoża mieszaniny 20 mM Na2HPO4, 0,25 M NaCl, 50 mM EDTA, o pH 7,0.

P r z y k ł a d 6

Zatężanie

Fibrynogen otrzymany według przykładu 5 zatężono stosując membranę o punkcie odcięcia 100 kDa (Sartocon Sartorius). Membranę wstępnie przemyto mieszaniną 50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,5. Docelowe stężenie fibrynogenu wynosiło 22 mg/ml.

P r z y k ł a d 7

Preparat

Ze stężonego roztworu fibrynogenu otrzymanego według przykładu 6 przygotowano preparat przez dodanie 710 mM argininy, 16,5% wag. sacharozy, 1,1% wag. polisorbatu 20, 50 mM NaCl, 10 mM cytrynianu trisodowego, o pH 7,5 w proporcji 1:10. Preparat finalny zawierał 110 mM argininy, 1,5% wag. sacharozy, 0,1% wag. polisorbatu 20, 50 mM NaCl, 10 mM cytrynianu trisodowego. Preparat następnie przesączono przez filtr 0,2 μm (Sartobran 0,45/0,2 μm, Sartorius).

P r z y k ł a d 8

Liofilizacja i obróbka cieplna

Produkt uzyskany według przykładu 7 wprowadzono aseptycznie do fiolek szklanych w ilości 15 ml na fiolkę i następnie liofilizowano, fiolki zamknięto i uszczelniono. Fiolki poddano obróbce cieplnej w temperaturze 80°C trwającej nie dłużej niż 72 godziny w celu inaktywacji wirusów bez otoczek i w otoczkach.

P r z y k ł a d 9

Chromatografia koncentratu fibrynogenu w skali pilotowej

1274 g precypitatu heparyny (otrzymanego według przykładu 2) zawieszono w 5-krotnej objętości mieszaniny 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 10 mM cytrynianu trisodowego, 0,5 M NaCl, o pH 6,0, w temperaturze 40°C w łaźni wodnej, stale mieszając co najmniej 1 godzinę. Uzyskany roztwór przesączono przez układ filtrujący Cuno 05SP, Cuno 30LA i Sartobran P 0,65/0,45 μm. Następnie wprowadzono mieszaninę rozpuszczalnik-detergent, uzyskując stężenie końcowe 1% objętościowego polisorbatu 20 i 0,3% objętościowych TnBP. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

6391 g precypitatu heparyny potraktowanego mieszaniną rozpuszczalnik-detergent wprowadzono do 2123 ml żywicy Toyopearl AF Chelate 650 (M) stanowiącej wypełnienie kolumny Amicon Vantage 130, uzyskując wysokość wypełnienia 16 cm. Kolumnę chromatograficzną poddano sanityzacji stosując 5 objętości złoża 0,5 M NaOH i poddano stabilizacji z zastosowaniem w przybliżeniu 5 objętości złoża buforu 1 (EW1, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 10 mM cytrynianu trisodowego, 0,5 M NaCl, o pH 6,0). Kolumnę przemyto w przybliżeniu 5 objętościami złoża wody destylowanej. Następnie żywicę napełniono jonami metalu, stosując w przybliżeniu 5 objętości złoża roztworu 3 mg/ml siarczanu miedzi. Luźno związane jony metalu usunięto stosując w przybliżeniu 5 objętości złoża mieszaniny 50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,5 i następnie w przybliżeniu 10 objętości złoża buforu 1. Następnie wprowadzono obciążenie i złoże przemyto w przybliżeniu 18 objętościami złoża buforu 1. Związany plazminogen wymyto stosując w przybliżeniu 16 objętości złoża buforu 2 (EW2: 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 15 mM alaniny, 0,5 M NaCl, o pH 7,5). Następnie ustalono warunki buforowania stosując w przybliżeniu 5 objętości złoża buforu 3 (EW3: 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,0). Związany fibrynogen następnie eluowano stosując w przybliżeniu 5 objętości złoża buforu 4 (EW4: 50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,5). Następnie odłączono od żywicy jony miedzi, stosując w przybliżeniu 5 objętości złoża mieszaniny 20 mM Na2HPO4, 0,25 M NaCl, 50 mM EDTA, o pH 7,0.

Dane stężenia i odzysku fibrynogenu, plazminogenu i czynnika XIII podano w tabeli 1.

Klirens TnBP i polisorbatu 20 podano w tabeli 2.

PL 210 616 B1

T a b e l a 1

Próbka	Objętość ml	Fibrynogen	Czynnik XIII	Plazminogen
mg/ml	%	U/ml	%	μg/ml	%
Obciążenie	6391	11,81	(100)	0,8	(100)	43,9	(100)
FT	6407	<1	<8,49			0,01	0,02
EW1	31971	<1	<42,36	0,01	6,25	0,03	0,34
EW2	33800	<1	<44,78	0,05	33,06	7,74	93,25
EW3	10674	<1	<14,14	0,05	10,44	0,20	0,76
EP1	680
EP2	8943	6,45	76,43	0,32	55,98	4,00	12,75
EPS	2060
EDTA	9155	<1	<12,13			0,01	0,03

Zastosowane skróty:

FT = przepływ

EW1 = faza ruchoma 1

EW2 = faza ruchoma 2

EW3 = faza ruchoma 3

EP1 = pik elucyjny 1 (część przednia piku elucyjnego) EP2 = pik elucyjny 2 (główny pik elucyjny)

EP3 = pik elucyjny 3 (ogon piku elucyjnego).

T a b e l a 2

Próbka	Objętość (ml)	TnBP	Polisorbat 20
Stężenie (mg/l)	Odzysk(%)	Stężenie (mg/l)	Odzysk(%)
Obciążenie	6391	2900	(100)	13700	(100)
EP2	8943	6,9	0,3	38	0,4

Zastosowane skróty:

EP2 = pik elucyjny 2 (główny pik elucyjny).

Wyniki wskazują, że trzy białka: fibrynogen, plazminogen i czynnik XIII, są efektywnie wiązane z Toyopearl z wprowadzonymi Cu²⁺, a następnie 93% wprowadzonego plazminogenu jest selektywnie usuwanych przez wymywanie 15 mM buforem alaninowym (EW2). Wymywany produkt fibrynogenu zawierał odpowiednio 76% i 56% wprowadzonego fibrynogenu i czynnika XIII. Klirens środków chemicznych stosowanych jako rozpuszczalnik i detergent był także efektywny: tylko odpowiednio 0,3 i 0,4% stosowanego TnBP i polisorbatu 20 pozostało w produkcie po chromatografii.

P r z y k ł a d 10

Ultrafiltracja fibrynogenu w skali pilotowej ₂

Dwie polisulfonowe pojedyncze kasety Sartorius (0,1 m² każda) załadowano do obsady na filtry Sartorius i przepłukano 7 l wody dejonizowanej. Zestaw poddano sanityzacji przepuszczając przez niego 1l 1 M NaOH ogrzanego do temperatury 40°C, a następnie 5 l NaOH recyrkulowano w tym układzie przez 1 godzinę. Układ następnie przepłukano 10 l wody dejonizowanej z prędkością przepływu krzyżowego 880 ml/minutę. Membranę potraktowano 5 l EW4 (50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, 50 mM NaCl, o pH 7,5) bez stosowania przeciwciśnienia, przy takiej samej prędkości przepływu krzyżowego.

8960 ml wymytej frakcji fibrynogenu o początkowym stężeniu fibrynogenu 5,24 mg/ml wprowadzono do urządzenia przy maksymalnym ciśnieniu wlotowym i ciśnieniu na filtrach odpowiednio 1,4 i 0,7 bara (140000 i 70000 Pa). Ultrafiltracja trwał a 1 godzinę 36 minut i da ł a w wyniku 1227 ml cieczy pofiltracyjnej i 23,8 mg/ml fibrynogenu. Średni strumień wyniósł 28,8 l/m²/godzinę i przewidywana wartość stężeń żelujących wyniosła 31,0 mg/ml.

PL 210 616 B1

P r z y k ł a d 11

Wybór żeli IMAC do oczyszczania fibrynogenu

Zbadano zdolność kilku żeli chromatograficznych z chelatowanymi metalami do wiązania i uwalniania póź niej fibrynogenu.

Opisano je w poniższej tabeli 3:

T a b e l a 3

Żel	Producent	Matryca podstawowa	Grupa chelatująca
Toyopearl Chelate AF	Tosoh Biosep	Metakrylano	Kwas iminodioctowy
Toyopearl Chelate AF (zmodyfikowane odgałęzienie dystansujące)	Tosoh Biosep	Metakrylan	Kwas iminodioctowy
Fractogel EMD Chelate	Merck	Metakrylan	Kwas iminodioctowy
Chelating Sepharose FF	Amersham Biosciences	Usieciowana agaroza	Kwas iminodioctowy

Materiałem wyjściowym był krioprecypitat, który zawierał fibrynogen. Ten precypitat ponownie rozpuszczono w buforze I (20 mM fosforan sodu zawierający albo 250 mM chlorku sodu, lub 500 mM chlorku sodu, o pH 7). Chelatujący żel obciążono jonami metali (miedzi, niklu lub cynku), a następnie poddano stabilizacji z zastosowaniem buforu I. Ponownie rozpuszczony krioprecypitat wprowadzono do pakowanej kolumny zawierającej naładowany, ustabilizowany żel. Po wprowadzeniu wszystkich składników kolumnę przemyto buforem I. Fibrynogen eluowano przez przemywanie kolumny buforem II (20 mM fosforanu sodu, 0,05 M buforu EDTA zawierającego albo 250 mM chlorku sodu, lub 500 mM chlorku sodu, o pH 7) lub buforem III (20 mM fosforanu sodu, 50 mM argininy, 250 mM chlorku sodu, o pH 7,5) lub buforem IV (20 mM fosforanu sodu, 200 mM argininy, 250 mM chlorku sodu, o pH 7,0).

Wyniki przedstawiono w tabeli 4

T a b e l a 4

Żel	Jon metalu	Ilość wymytego fibrynogenu, mg na ml żelu	Ilość wymytego czynnika XIII, U na mg fibrynogenu
Toyopearl Chelate AF (Tosoh Biosep)	miedź	38,7^a	0,3
Toyopearl Chelate AF (Tosoh Biosep)	miedź	24,1^b	0,1
Toyopearl Chelate AF (zmodyfikowane odgałęzienie dystansujące) (Tosoh Biosep)	miedź	35,6^b	0,08
Fractogel EMD Chelate (Merck)	miedź	30,8^a	0,26
Chelating Sepharose FF (Amersham Biosciences)	miedź	16,1^a	nie badano
Toyopearl Chelate AF (Tosoh Biosep)	cynk	23,5^a	0,22
Fractogel EMD Chelate (Merck)	cynk	31^a	0,27
Chelating Sepharose FF (Amersham Biosciences)	cynk	11,5^a	nie badano
Toyopearl Chelate AF (Tosoh Biosep)	nikiel	23,7^c	nie badano

^a Eluowano buforem II. ^b Eluowano buforem III. ^c Eluowano buforem IV.

PL 210 616 B1

Wyniki wskazują, że fibrynogen i czynnik XIII można wydzielić z roztworu zawierającego fibrynogen stosując chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC) o rozmaitych matrycach podstawowych IMAC i przy zastosowaniu różnych jonów metali.

P r z y k ł a d 12

Wybór substancji wyjściowych

Zbadano możliwość zastosowania chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC) do oczyszczenia fibrynogenu z różnych roztworów zawierających fibrynogen.

Roztwory zawierające fibrynogen:

A. Ponownie rozpuszczony krioprecypitat otrzymany z rozmrożonego osocza ludzkiego (według przykładu 1).

B. Ponownie rozpuszczony precypitat heparyny otrzymano z ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu, który zmieszano z heparyną (według przykładu 2).

C. Ponownie rozpuszczony precypitat zimny otrzymano przez schłodzenie ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu.

D. Roztwór zawierający fibrynogen chromatograficznie zubożony o czynnik VIII, czynnik von Willebranda (vWF) i fibronektynę, otrzymany z ludzkiego osocza.

Precypitat zimny użyty w punkcie C otrzymano następująco: krioprecypitat, otrzymany według przykładu 1, ponownie rozpuszczono w stanowiącym czterokrotność jego masy 50 μM roztworze chlorku wapnia w temperaturze 28°C. Wartość pH ustalono na pH 6,8 stosując 1 M kwas octowy i roztwór schłodzono do temperatury 10°C. Po wymieszaniu przez >10 minut, utworzony precypitat zebrano przez odwirowanie.

Każdy z roztworów A-D, zawierający w przybliżeniu 1-20 mg fibrynogenu na 1 ml, inkubowano z rozpuszczalnikiem i detergentem w celu inaktywacji wirusów, następnie wprowadzono do kolumny wypełnionej żywicą Toyopearl Chelate IMAC, którą obciążono jonami miedzi i poddano stabilizacji z zastosowaniem mieszaniny 20 mM fosforanu sodu, 250 mM chlorku sodu, o pH 7,0. Po napełnieniu, żywicę przemyto takim samym buforem. Fibrynogen eluowano stosując 25 mM imidazolu (Bufor X) lub mieszaniny 50 mM argininy, 20 mM fosforanu sodu, 250 mM chlorku sodu, o pH 7,5 (Bufor Y).

Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5

Materiał wyjściowy	Fibrynogen w materiale wyjściowym, mg/ml	Bufor eluujący	Fibrynogen w eluacie, mg per ml żywicy
A: krioprecypitat	14,1	X	29,8
C: precypitat zimny	21,6	X	29,0
D: roztwór fibrynogenu	0,73	X	38,7
A: krioprecypitat	11,1	Y	32,5
B: precypitat heparyny	14,8	Y	29,9
C: precypitat zimny	20,9	Y	31,4

Wyniki wskazują, że IMAC można stosować do otrzymywania fibrynogenu z różnych materiałów wyjściowych zawierających fibrynogen.

P r z y k ł a d 13

Preparat fibrynogenu umożliwiający szybkie rozpuszczanie po liofilizacji i obróbce cieplnej Fibrynogen, który wymyto z żywicy IMAC według przykładów 9 i 10 i zatężono do w przybliżeniu mg/ml w mieszaninie 50 mM argininy, 20 mM fosforanu, o pH 7,5 (tabele 6 i 8) lub 50 mM argininy, 10 mM cytrynianu trisodowego, o pH 7,5 (tabela 7) skomponowano z różnymi związkami dodatkowymi, wprowadzono do fiolek szklanych (20 ml na fiolkę) i liofilizowano. Na zakończenie liofilizacji, fiolki szczelnie zamknięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano obróbce cieplnej w temperaturze 80°C przez 72 godziny w celu inaktywacji wirusów. Zawartość fiolek odtworzono wodą (5 ml na fiolkę) w temperaturze pokojowej (18°C-25°C). Zmierzono czas rozpuszczania, jako czas pomiędzy dodaniem wody i uzyskaniem klarownego homogenicznego roztworu bez widocznych pozostałości stałych.

PL 210 616 B1

Wyniki przedstawiono w tabelach 6, 7 i 8.

T a b e l a 6

Arg mM	Polis %	NaCl mM	Cyt mM	Sach %	Czas rozp., minuty	Fib po rozp., mg/ml	Czynnik XIII po rozp., U/ml
50	0,5	250	10	1,5	4,5	44,3	<1
50	0,1	250	10	1,5	8,1	49,3	<1
50	0,5	250	0	0	4,1	40,0	<0,5
50	0,5	250	10	1,5	6,5	37,0	<0,5
50	0,5	250	0	1,5	5,8	33,1	<0,5
50	0,25	250	0	1,5	4,9	35,4	<0,5
50	0,1	250	0	1,5	3,9	39,9	<0,5
50	0,5	230	0	1,5	4,5	36,6	<0,5
50	0,5	200	0	1,5	3,6	37,5	<0,5
50	0,5	180	0	1,5	4,9	35,0	<0,5
50	0,5	150	0	1,5	4,2	37,9	<0,5
50	0,5	130	0	1,5	5,7	36,8	<0,5
50	0,5	100	0	1,5	7,1	36,9	<0,5
50	0,5	80	0	1,5	7,8	36,9	<0,5
50	0,5	50	0	1,5	12,2	41,3	1,2
50	0,5	50	10	1,5	8,6	43,3	1,3
50	0,5	50	0	2,5	7,6	40,7	1,2

T a b e l a 7

Arg mM	Polis %	NaCl mM	Fos mM	Sach %	Czas rozp., minuty	Fib po rozp., mg/ml	Czynnik XIII po rozp., U/ml
50	0,5	250			6,3	63,7	<1,5
50	0,5	50		1,5	4,5	67	2,4
50	0,5	50	20	1,5	2,1	63	1,9
50	0,25	50		1,5	1,4	71,7	1,8
50	0,1	50		1,5	1,6	61,9	1,8
50	0,25	50	20	1,5	2,0	62,1	1,8
50	0,1	50	20	1,5	2,6	70,8	1,7
50	0,5	50		1	4,3	70,1	2,0
50	0,5	50		0,75	2,7	69,1	2,0
50	0,5	50		0,5	2,6	73,3	1,7
50	0,25	50		0,75	3,0	71,7	1,8
100	0,1	50		1,5	8,8	54,8	1,3
50	0,1	250			7,2	53,7	<1
120	0,1	50		1,5	5,7	55,4	<1

PL 210 616 B1

T a b e l a 8

Arg	Poli	NaCl	Citt	Węglowodan	Czas	Fib	Czynnik XIII
tnM	%	mM	nM	%	rozp., minuty	po rozp., mg/ml	po rozp. U/ml
50	0,5	50	0	sacharoza 1,5%	12,2	41,3	1,2
50	0,5	50	0	trehaloza 1,5%	14,5	41,1	1,2
50	0,5	50	0	rafinoza 1,5%	13,9	42,5	1,3

Zastosowane skróty w tabelach 6 - 8:

Arg = arginina

Poli = polisorbat 20

Cyt = cytrynian

Sach = sacharoza

Fib = fibrynogen

Rozp = rozpuszczenie

Fos = fosforan

Wyniki wskazują, że skuteczne zakresy stężeń substancji pomocniczych wynoszą:

Sacharoza: 0,5-2,5%

Polisorbat 20: 0,1-0,5%

Chlorek sodu: 50-250 mM (50 mM dla zatrzymania czynnika XIII)

Arginina: 50-120 mM

Duże stężenia chlorku sodu (250 mM) w połączeniu z zastosowaniem argininy, polisorbatu 20 i soli buforującej umożliwia szybkie odtworzenie liofilizowanego fibrynogenu po obróbce cieplnej, jednak przy jednoczesnej utracie aktywności czynnika XIII. Zmniejszenie zawartości chlorku sodu wspólnie z dodaniem sacharozy zapewnia i szybkie odtwarzanie i zachowanie aktywności czynnika XIII.

Selektywne kombinacje argininy, polisorbatu 20, chlorku sodu, odpowiedniej soli buforującej i węglowodanu pozwalają na uzyskanie preparatu fibrynogenu i czynnika XIII, z którego można uzyskać liofilizowany produkt po obróbce cieplnej szybko odtwarzalny w temperaturze pokojowej, zawierający fibrynogen i z zachowaną aktywnością czynnika XIII.

P r z y k ł a d 14

Ultrafiltracja, komponowanie, liofilizacja i obróbka cieplna

W czterech niezależnych doświadczeniach (A-D), precypitat heparyny ponownie zawieszono według przykładu 3 i potraktowano układem rozpuszczalnik-detergent według przykładu 4. Uzyskany roztwór rozdzielono metodą chromatografii według przykładu 9, uzyskując eluat bogaty w fibrynogen i czynnik XIII. Ten eluat następnie zatężono według przykładu 10. Koncentrat skomponowano w preparat zawierający 110 mM argininy, 1,5% wag. sacharozy, 0,1% wag. polisorbatu 20, 50 mM NaCl, 10 mM cytrynianu trisodowego i przesączono przez filtr wyjaławiający 0,2 μm według przykładu 7. Przesączonym koncentratem następnie napełniono aseptycznie fiolki, przeprowadzono liofilizację i obróbkę cieplną według przykładu 8, uzyskując produkt po podwójnej inaktywacji wirusów.

Eluaty, przesączone koncentraty i produkty zbadano na obecność białka krzepliwego i aktywność czynnika XIII, a wyniki przedstawiono w tabeli 9.

T a b e l a 9

Frakcja	Właściwość	A	B	C	D
Eluat	białko krzepliwe (mg/ml)	5,8	5,6	4,4	4,52
aktywność czynnika XIII (U/ml)	0,19	0,41	0,18	0,18
Przesączony koncentrat	białko krzepliwe (mg/ml)	21,2	20,4	22,1	18,2
aktywność czynnika XIII (U/ml)	0,61	1,43	0,68	0,65
Produkt	białko krzepliwe (mg/ml)	63,3	45,9	48,8	46,3
aktywność czynnika XIII (U/ml)	1,19	1,64	1,25	1,17
czas rozpuszczania (minuty)	9,05	5,35	8,72	11,22

PL 210 616 B1

Wyniki wskazują, że fibrynogen można zatężyć do w przybliżeniu 20 mg/ml stosując ultrafiltrację. Wskazują one także, że warunki komponowania preparatu pozwalają na uzyskanie produktu o stężeniu czynnika XIII >1 U/ml i czasie rozpuszczania % <<15 minut.

P r z y k ł a d 15

Wpływ stężenia i wartości pH bufora eluującego na wymywanie fibrynogenu i miedzi z chelatowanej żywicy

Krioprecypitat ponownie rozpuszczono w buforze 1 (20 mM bufor fosforanowy zawierający 0,25 M NaCl, o pH 6,0) i potraktowano układem rozpuszczalnik-detergent według przykładu 4. Chelatowaną żywicę (Toyopearl AF Chelate 650 (M)) obciążono jonami miedzi, wstępnie przemyto odpowiednim buforem eluującym i następnie poddano stabilizacji z zastosowaniem buforu 1. Ten materiał wprowadzono do pakowanej żywicy obciążonej jonami miedzi. Po wprowadzeniu całości materiału, kolumnę przemyto od piętnastu do dwudziestu objętościami buforu 1. Kolumnę przemyto następnie pięć do siedmiu objętościami złoża buforu 2 (20 mM bufor fosforanowy zawierający 0,25 M NaCl, o pH 7,0). Kolumnę eluowano buforem zawierającym 20 mM fosforanu, 0,25 M NaCl i oraz zmienną ilość argininy, o różnej wartości pH. Wyniki przedstawiono w tabeli 10.

T a b e l a 10

Stężenie argininy w buforze eluującym	Wartość pH buforu eluującego	Stężenie wymytego fibrynogenu mg/ml	Ilość wymytego fibrynogenu mg/ml żywicy	Stężenie wymytej miedzi mg/l	Ilość wymytej miedzi gg/irig wymytego fibrynogenu
200	7	4,5	32,3	8	1,8
100	7	4,8	35,7	4,6	0,95
50	7	2,5	17,5	2	0,8
50	6,0	1,9	17,6	1,4	0,74
50	7,5	4,4	33,3	2	0,46
50	8,0	3,96	35,3	2,5	0,63

Wyniki wskazują, że zmniejszenie stężenia argininy w buforze eluującym powoduje spadek stężenia miedzi w eluacie fibrynogenu, ale jednocześnie zmniejsza odzysk fibrynogenu. Zwiększenie wartości pH buforu eluującego zawierającego 50 mM argininy do 7,5 daje w wyniku wysoki odzysk fibrynogenu, a jednocześnie znacznie zmniejsza się ilość wymywanej razem z nim miedzi.

P r z y k ł a d 16

Obróbka precypitatu heparyny

Zamrożony precypitat heparyny rozpuszczono ponownie w mieszaninie 20 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu, 10 mM cytrynianu trisodowego, o pH 6,0, w proporcji wagowo 1 : 5.

Porównano dwie metody rozdziału:

Metoda 1. Precypitat heparyny dodano do buforu w temperaturze otoczenia. Mieszaninę następnie ogrzano do temperatury 40°C i inkubowano w tej temperaturze przez 1 godzinę.

Metoda 2. Bufor wstępnie ogrzano do temperatury 40°C i następnie dodano precypitat heparyny z szybkością pozwalającą na utrzymanie temperatury >36°C. Po dodaniu całości precypitatu, mieszaninę następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 40°C.

Zbadano trzy różne serie precypitatu. W każdym przypadku. Metoda rozdziału 2 zapewniała znacznie większą wydajność filtrowania.

Masa przesączu końcowego i stężenie fibrynogenu były także bezsprzecznie większe, co w efekcie skutkowało większymi wydajnościami fibrynogenu (patrz tabela 11).

PL 210 616 B1

T a b e l a 11

Seria	Metoda rozdziału	Skala filtracji¹	Przepustowość filtra² Cuno 05SP (kgm^-2)	Przepustowość filtra² Cuno SOLA (kgm^-2)	Przepustowość filtra² Sartobran 0,65/0,45 mm (kgm^-2)	Wydajność fibrynogenu³ (%)
A	1	lab	10,66	4,57	3,57	64
A	2	lab	26,31	26,10	17,51	nie badano
A	2	pilot	>23,57	>23,72	>13,96	82
B	1	lab	4,33	4,57	3,47	29
B	2	lab	13,40	13,16	11,69	nie badano
C	1	lab	9,63	8,73	8,48	58
C	2	pilot	>21,66	>22,92	>13,96	81

Uwagi:

₂

1. Powierzchnia filtra w skali lab (laboratoryjnej) = 0,00173 m²;

powierzchnia filtra w skali pilot (pilotowej) = 0,3 m². Początkowe ciśnienie powietrza podczas filtracji 0,25 bara (25000 Pa) w skali lab i 0,1-0,2 bar (10000-20000 Pa) w skali pilot.

2. Wydajność filtra obliczono przez podzielenie maksymalnej ilości przefiltrowanego materiału przez powierzchnię filtra. W przykładach, w których pojemności określono jako „powyżej”, nie nastąpiło zablokowanie filtra w warunkach doświadczenia.

3. Wydajność fibrynogenu obliczono w tym przypadku przez podzielenie ilości fibrynogenu odzyskanej z filtra w mg (= stężenie odzysku mg/ml^-1 x ml zebranego przesączu) przez ilość fibrynogenu w mg, która znajdowała się w tej objętości materiału wyjściowego (= użyte stężenie mg/ml^-1 x ml zebranego przesączu) x 100 (%).

Claims

1. Sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roztwór zawierający fibrynogen stosuje się frakcję osocza zawierającą fibrynogen.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że roztwór zawierający fibrynogen ponadto zawiera czynnik XIII, a czynnik XIII eluuje się z matrycy łącznie z fibrynogenem.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym doprowadza się do koncentracji fibrynogenu poprzez ultrafiltrację do stężenia do 15-30 mg/ml.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że ponadto obejmuje etapy, w których tworzy się mieszaninę fibrynogenu z mieszaniną odpowiednich stabilizatorów i uzyskuje się preparat fibrynogenu, fibrynogen sterylizuje się przez filtrację i liofilizuje się preparat fibrynogenu uzyskując liofilizowany preparat fibrynogenu.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stabilizatory stanowią aminokwas, węglowodan, sól i detergent.

7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym liofilizowany preparat fibrynogenu poddaje się obróbce cieplnej.

8. Sposób według zastrz. 5 albo 6, albo 7, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym rozpuszcza się liofilizowany preparat fibrynogenu do stężenia co najmniej do 60 mg/ml.

PL 210 616 B1

9. Sposób oddzielania fibrynogenu od plazminogenu, znamienny tym, ż e obejmuje etapy, w których:

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że plazminogen i fibrynogen selektywnie wymywa się osobno z matrycy.

11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że jako roztwór zawierający fibrynogen stosuje się frakcję osocza zawierającą fibrynogen.

12. Sposób według zastrz. 9, 10, albo 11, znamienny tym, że roztwór zawierający fibrynogen ponadto zawiera czynnik XIII, a czynnik XIII eluuje się z matrycy łącznie z fibrynogenem.

13. Sposób według zastrz. 9, 10, 11 albo 12, znamienny tym, ż e ponadto obejmuje etap, w którym doprowadza się do koncentracji fibrynogenu poprzez ultrafiltrację do stężenia do 15-30 mg/ml.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym miesza się fibrynogen z mieszaniną odpowiednich stabilizatorów i uzyskuje się preparat fibrynogenu, fibrynogen sterylizuje się przez filtrację i liofilizuje się preparat fibrynogenu uzyskując liofilizowany preparat fibrynogenu.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stabilizatory stanowią aminokwas, węglowodan, sól i detergent.

16. Sposób według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym liofilizowany preparat fibrynogenu poddaje się obróbce cieplnej.

17. Sposób według zastrz. 14, 15 albo 16, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym rozpuszcza się liofilizowany preparat fibrynogenu do stężenia co najmniej do 60 mg/ml.