ES2332780T3 - Procedimientos para la fabricacion de fibrinogeno. - Google Patents
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Abstract
Un método para la separación y purificación de fibrinógeno y plasminógeno, que comprende las etapas de: (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la matriz, y (b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el plasminógeno separadamente de la matriz.
Description
Procedimientos para la preparación de
fibrinógeno.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la purificación del fibrinógeno, y a preparados
de fibrinógeno fácilmente solubles.
El fibrinógeno es una proteína del plasma
sanguíneo que está implicada en la formación de coágulos. Se
convierte en el monómero fibrina por la acción de la proteasa del
plasma trombina. Los monómeros de fibrina se agrupan para formar un
coágulo débil y después se entrecruzan por la acción del factor XIII
activado (es decir, el factor XIIIa) para formar un coágulo más
fuerte. El fibrinógeno se usa en terapia en combinación con trombina
en los llamados sellantes de fibrina, para conseguir la hemostasis,
para cerrar las heridas y para la adhesión controlada del tejido.
Los concentrados de fibrinógeno se usan también para el tratamiento
de terapia de reemplazo de pacientes con déficit de fibrinógeno
(afibrinogenemia), que puede ser heredado o adquirido.
Para todas las aplicaciones clínicas, es
importante tener fibrinógeno muy puro con el fin de minimizar
cualquier posible efecto secundario no deseable resultante, por
ejemplo, de la presencia de proteínas contaminantes no deseadas. En
particular, es deseable que los preparados de fibrinógeno para uso
clínico estén exentos de plasminógeno y plasmina (Blomback B.,
Blomback M., "Purification of human and bovine fibrinogen",
Arkiv for Kemi 1956; 10: 415-443, y Mosesson M. W.,
"The preparation of human fibrinogen free of plasminogen",
Biochim Biophys Acta 1962, 57: 204-213). El
plasminógeno es el precursor inactivo de la plasmina, una enzima
fibrinolítica que digiere los coágulos de fibrina. Por
consiguiente, la presencia de plasminógeno en un preparado de
fibrinógeno destinado a ser usado in vivo es indeseable a
causa de que cualquier posible plasmina generada a partir del
plasminógeno en el sitio de la formación del coágulo puede entonces
desestabilizar el coágulo.
El plasminógeno tiende a copurificarse con el
fibrinógeno y su eliminación puede ser dificultosa. Algunos
preparados clínicos de fibrinógeno contienen por tanto agentes
antifibrinolíticos para inhibir cualquier posible plasmina o
plasminógeno presentes (p. ej. aprotinina, una proteína bovina
inhibidora de la plasmina; o ácido tranexámico, un inhibidor
sintético de la plasmina asociado también con efectos secundarios
neurotóxicos). Una ventaja de separar el plasminógeno del
fibrinógeno es que entonces no hay necesidad de usar tales
inhibidores fibrinolíticos en el preparado clínico de
fibrinógeno.
Además, es muy deseable que el fibrinógeno
derivado de fuentes humanas o animales sea tratado para inactivar
cualquier virus de la sangre que puede estar presente, por ejemplo
virus de la hepatitis o HIV. Se conocen en la técnica varios
métodos de inactivación de virus, incluyendo pasteurización,
tratamiento térmico en seco y tratamiento con
disolvente-detergente (Pathogen Inactivation of
Labile Blood Products, Council of Europe Expert Committee and Blood
Transfusion Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood
Products, Transfusion Medicine, 2001, 11,
149-175).
Se sabe que el tratamiento térmico en seco es
eficaz para la inactivación tanto de virus envueltos como de
algunos no envueltos, mientras que el tratamiento con
disolvente-detergente es conocido por ser eficaz
para la inactivación de virus envueltos (es decir, recubiertos con
lípidos) tales como el virus de la hepatitis B.
Se conocen en la técnica varios métodos para la
purificación de fibrinógeno. Sin embargo, los métodos de
purificación de la técnica anterior adolecen de varios
inconvenientes. Por ejemplo, los métodos de precipitación no
permiten la fácil incorporación de una etapa de inactivación de
virus mediante disolvente-detergente (SD:
Solvent-Detergent), ya que la eliminación de los
reactivos de SD se lleva a cabo mucho más eficazmente mediante
cromatografía. Los métodos de cromatografía pueden no separar el
fibrinógeno del plasminógeno en una sola etapa, lo que puede
conducir a la necesidad de una cromatografía adicional para adsorber
el plasminógeno, o a la necesidad de añadir un agente
antifibrinolíco al preparado final de fibrinógeno para combatir el
plasminógeno residual. Además, no todos los métodos de la técnica
anterior son adecuados para la purificación del fibrinógeno a partir
de una amplia gama de soluciones que contienen fibrinógeno
(incluyendo plasma y fracciones recombinantes).
La patente de EE.UU. nº 5.169.936 ha sugerido
previamente que la cromatografía de afinidad por iones metálicos
inmovilizados (IMAC: immobilised metal ion affinity chromatography)
podría usarse en la preparación de fibrinógeno humano. Sin embargo,
no se describen ejemplos de tal método, ni hay ninguna sugerencia de
que podría usarse la IMAC para la separación de fibrinógeno del
plasminógeno.
La gama de cromatografía ProSep® de Millipore
ofrece absorbentes desarrollados para la purificación de moléculas
biológicas usando IMAC. Se ha anunciado que Prosep Chelating III es
adecuado para la separación de moléculas grandes tales como
fibrinógeno.
Se sabe también que la disolución de
concentrados de fibrinógeno puede ser difícil, y que con frecuencia
requiere el uso de temperaturas elevadas o una agitación prolongada
(veánse la patente de EE.UU. nº 5.260.420 y el documento
EP-A 0804933). Debido a la inestabilidad de las
soluciones líquidas de fibrinógeno a lo largo del tiempo, los
preparados de fibrinógeno para uso clínico se comercializan en forma
de solución congelada a baja temperatura o bien como liofilizado
(es decir, un preparado secado congelado). Antes de su uso, el
producto comercial ha de ser descongelado o bien reconstituido a
partir del liofilizado. Las dos medidas requieren un tiempo y un
esfuerzo significativos.
Por tanto, sería conveniente proporcionar
métodos alternativos para la purificación del fibrinógeno, en
particular un método que sea aplicable a cualquier material de
partida que contenga fibrinógeno y que permita la incorporación de
una o más etapas de inactivación de virus. También sería ventajoso
proporcionar un método para la separación de fibrinógeno del
plasminógeno. Además, sería ventajoso proporcionar un concentrado de
fibrinógeno liofilizado, y preferentemente tratado térmicamente,
que pueda ser fácilmente redisuelto a temperatura ambiente.
En un aspecto, la presente invención proporciona
por tanto un método para la separación y purificación de
fibrinógeno y plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende
fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones
tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la
matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el
plasminógeno separadamente de la matriz. El fibrinógeno y el
plasminógeno pueden recogerse por separado y ser tratados cada uno
de ellos según se requiera.
Preferentemente, la solución que comprende
fibrinógeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para la separación de fibrinógeno de
plasminógeno, que comprende el uso de cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados. Preferentemente, el método comprende
las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende
fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones
tales que al menos el fibrinógeno se une a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la
matriz. Preferentemente, el plasminógeno se une también a la matriz
y el plasminógeno y el fibrinógeno pueden ser eluidos de la matriz
selectivamente por separado.
Como se usa en el presente texto, las
referencias a la separación y/o a la purificación de fibrinógeno
incluyen la separación conjunta y/o la copurificación de
fibrinógeno y factor XIII juntos a partir de materiales de partida
que comprenden tanto fibrinógeno como factor XIII.
El material de partida para los métodos de la
presente invención puede ser cualquier solución que contenga
fibrinógeno, incluyendo plasma humano o animal, o una fracción del
plasma, fracciones de cultivo de células de la tecnología
recombinante, fracciones derivadas de leche de animales
transgénicos, etc. Los materiales de partida preferidos son
fracciones de plasma tales como crioprecipitado, precipitado de
heparina y precipitado en frío. Los materiales de partida más
preferidos incluyen precipitado de heparina y crioprecipitado. Otros
materiales de partida preferidos incluyen aquellos que comprenden
plasminógeno y/o factor XIII.
El material de partida puede prepararse por
cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo el
empleo de la manipulación de genes, por ejemplo en cultivo de
células o especies transgénicas. Por ejemplo, puede prepararse el
crioprecipitado de acuerdo con el método de Gunson H. H., Bidwell
E., Lane R. S., Wensley R. T., Snape T. J., "Variables involved
in crioprecipitate production and their effect on Factor VIII
activity", British Journal of Haematology, 1978; 43:
287-295; el precipitado de heparina puede prepararse
de acuerdo con el método de Winkelman L., Owen N. E., Evans D. R.,
Evans H. E., Haddon M. E., Smith J. K., Prince P. J., Williams J.
D., Lane R. S., "Severely heated therapeutic Factor VIII
concentrate of high specific activity", Vox Sanguinis, 1989; 57:
97-103; y el precipitado en frío de acuerdo con el
método de Smith J. K., Evans D. R., Stone V., Snape T. J., "A
Factor VIII concentrate of intermediate purity and higher
potency", Transfusion, 1979; 19: 299-306.
Los contaminantes no deseados en el material de
partida, que pueden ser separados del fibrinógeno usando los
métodos de la presente invención, pueden incluir otras proteínas
(por ejemplo proteínas del plasma tales como el plasminógeno),
reactivos de las etapas iniciales de tratamiento (por ejemplo
elementos del medio de cultivo de células o reactivos de
disolvente-detergente), virus y priones. Se prefiere
de un modo particular eliminar el plasminógeno, de forma que puede
evitarse la adición de inhibidores de plasmina (agentes
antifibrinolíticos) al fibrinógeno.
La solución que contiene fibrinógeno se carga en
una matriz de IMAC. Preferentemente, la matriz está presente en una
columna para facilitar el proceso. Puede usarse cualquier ion
metálico adecuado, por ejemplo cobre, zinc o níquel,
preferentemente cobre. Los geles de cromatografía de afinidad por
iones metálicos adecuados, que se pueden usar en el procedimiento
de la presente invención, incluyen gel de metacrilato con ligandos
multi-sustituidos en los espaciadores de cadena
lateral (p. ej. Fractogel EMD Chelate de Merck), gel de metacrilato
con grupos quelantes simples en el brazo espaciador (p. ej.
Toyopearl Chelate de Tosoh Biosep) y gel de agarosa entrecruzada
(p. ej., Sepharose Chelant FF de Amersham Biosciences). Un gel
preferido es quelato Toyopearl AF 650(M) de Tosoh
Biosep.
Las condiciones de carga, incluyendo el tampón
usado, deben elegirse de forma que el fibrinógeno, y cualquier
posible factor XIII si está presente, del material de partida se
unan al gel. Los contaminantes no deseados que no se unen al gel
pueden entonces ser eliminados por lavado. Por ejemplo, si el
material de partida ha sido previamente sometido a una etapa de
inactivación por disolvente y detergente, cualquier reactivo de
disolvente o detergente que quede no se une al gel y se elimina
fácilmente por lavado. Alternativamente, si los contaminantes no
deseados se unen al gel, pueden ser eliminados por elución selectiva
antes de eluir el fibrinógeno, o pueden permanecer unidos al gel
mientras el fibrinógeno se eluye selectivamente. Adicionalmente, el
lavado del gel y de la proteína o las proteínas unidas puede
contribuir también a eliminar cualquier virus que pueda estar
presente en los materiales de cromatografía.
Se ha encontrado que el plasminógeno se une
menos estrechamente que el fibrinógeno o el factor XIII a los geles
de cromatografía de quelato metálico. El plasminógeno presente en
el material de partida puede ser eliminado por tanto mediante
lavado, mediante elución selectiva usando una solución de baja
concentración de compuesto quelante competitivo de bajo peso
molecular, o cambiando las condiciones para reducir la fuerza de
unión, por ejemplo reduciendo el pH o la fuerza iónica, mientras el
fibrinógeno permanece unido. Los compuestos quelantes adecuados
incluyen aminoácidos, por ejemplo alanina, leucina y lisina,
imidazol, sales citrato y ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Un
compuesto quelante preferido para la elución de plasminógeno es la
alanina. La concentración del compuesto quelante debe elegirse de
forma que el plasminógeno se eluye mientras el fibrinógeno permanece
unido al gel. La concentración exacta dependerá del eluyente usado.
Por ejemplo, concentraciones de aproximadamente
< 20 mM deben eliminar selectivamente el plasminógeno en presencia de fibrinógeno unido. Las concentraciones adecuadas para la elución del plasminógeno incluyen \leq 20 mM de alanina o leucina, \leq 10 mM de lisina y < 10 mM de
imidazol.
< 20 mM deben eliminar selectivamente el plasminógeno en presencia de fibrinógeno unido. Las concentraciones adecuadas para la elución del plasminógeno incluyen \leq 20 mM de alanina o leucina, \leq 10 mM de lisina y < 10 mM de
imidazol.
El fibrinógeno puede entonces ser eluido usando
una concentración más alta del mismo compuesto quelante o de otro
distinto, o reduciendo el pH o la fuerza iónica. Los compuestos
quelantes preferidos para la elución del fibrinógeno son los
aminoácidos, preferentemente lisina o arginina, y el imidazol. Un
eluyente más preferido comprende arginina. Por ejemplo, el
fibrinógeno puede ser eluido usando una solución > 20 mM del
compuesto quelante. Las condiciones para la elución del fibrinógeno
(concentración y pH) deben elegirse de forma que el fibrinógeno sea
eliminado del gel pero que no lo sea el ion metálico, con el fin de
minimizar la contaminación del producto con iones metálicos.
La eliminación del plasminógeno es ventajosa ya
que el fibrinógeno puede entonces ser usado clínicamente sin
necesidad de añadir ningún agente antifibrinolítico al preparado
clínico. Otros aspecto ventajoso es que el plasminógeno que ha sido
separado del fibrinógeno mediante IMAC puede entonces seguir siendo
procesado para dar un concentrado de plasminógeno para uso clínico.
La IMAC puede usarse por tanto para preparar tanto plasminógeno
como fibrinógeno a partir de una solución de partida que comprende
plasminógeno y fibrinógeno.
Un aspecto ventajoso del procedimiento de la
presente invención es que cualquier posible factor XIII en el
material de partida tiende a coeluir con el fibrinógeno. La
presencia de una cantidad medible (> 1 u/ml) de factor XIII en
los preparados finales de fibrinógeno puede ser beneficiosa si el
fibrinógeno se va a usar clínicamente. Se ha demostrado que la
concentración de factor XIII tiene efecto en algunas pruebas in
vitro de sellantes de fibrina, aun cuando no hay ninguna
evidencia de que el factor XIII sea necesario para la eficacia
clínica, y se han usado con efecto clínico productos sellantes de
fibrina sin una actividad mensurable de factor XIII. Cuando se usa
en un entorno sanguíneo (p. ej. para hemostasis), el factor XIII
endógeno del paciente estará presente para efectuar el
entrecruzamiento del coágulo. Si no es así, es posible que la
presencia de factor XIII en el producto pudiera ser beneficiosa.
Como el factor XIII es una enzima catalítica, puede operar
efectivamente incluso a baja concentración.
Opcionalmente, el material de partida que
contiene fibrinógeno puede ser sometido a un tratamiento de
inactivación de virus por disolvente-detergente
antes de la cromatografía de afinidad por iones metálicos
inmovilizados. La inactivación de virus por disolvente y detergente
puede llevarse a cabo usando reactivos y métodos conocidos en la
técnica (véanse por ejemplo la patente de EE.UU. nº 4.481.189, la
patente de EE.UU. nº 4.613.501 y la patente de EE.UU. nº 4.540.573,
todas las cuales se incorporan al presente texto como referencia).
Los disolventes adecuados incluyen fosfato de
tri-n-butilo (TnBP) y éter,
preferentemente TnBP. Los detergentes adecuados incluyen
polisorbato (Tween) 80, polisorbato (Tween) 20 y Triton
X-100. Un detergente preferido es el polisorbato 20
y una combinación particularmente preferida es polisorbato 20 y
TnBP.
La fracción que contiene fibrinógeno puede
agitarse con reactivos de disolvente y detergente a una temperatura
y durante un tiempo suficientes para inactivar cualquier posible
virus envuelto que pueda estar presente. Por ejemplo, el
tratamiento con disolvente y detergente puede llevarse a cabo
durante aproximadamente 1 hora a 25ºC.
El fibrinógeno recuperado de la etapa de
cromatografía puede entonces seguir siendo procesado con el fin de
formularlo para uso farmacéutico. Por ejemplo, puede ser concentrado
mediante ultrafiltración hasta una concentración de aproximadamente
15 - 30 mg/ml, y/o ser sometido a una posterior etapa de reducción
de agentes patógenos, por ejemplo una etapa de nanofiltración.
El concentrado puede entonces ser formulado
mediante la adición de una combinación de estabilizantes adecuados,
por ejemplo un aminoácido, un hidrato de carbono, una sal, y un
detergente. De forma particularmente preferible, el producto se
formula sin añadir ningún agente antifibrinolíco ni proteínas
estabilizantes tales como albúmina. El producto formulado puede
entonces ser esterilizado mediante filtración y liofilizado para un
almacenamiento de larga duración. Opcionalmente, el producto
liofilizado puede ser sometido a un tratamiento térmico en seco en
otra etapa de inactivación de virus. Por ejemplo, puede ser
calentado a aproximadamente 80ºC durante aproximadamente 72 horas,
o a aproximadamente 100ºC durante aproximadamente 24 horas.
La combinación del aminoácido, la sal, el
hidrato de carbono y el detergente usada para formular el producto
de fibrinógeno contribuye a estabilizarlo a través de la etapa de
liofilización y tratamiento térmico terminal. También facilita la
reconstitución del producto liofilizado. En particular, los
estabilizantes ayudan a estabilizar cualquier factor XIII presente
en el producto, que como se sabe es muy lábil.
El producto liofilizado y tratado térmicamente
puede ser reconstituido con agua a temperatura ambiente en menos de
15 minutos, preferentemente menos de 10 minutos, y lo más
preferentemente menos de 5 minutos, para proporcionar una solución
de fibrinógeno con una concentración de al menos aproximadamente 60
mg/ml.
Un aspecto ventajoso de la presente invención es
que se elimina el plasminógeno, evitándose así la necesidad de
añadir agentes antifibrinolíticos al preparado final de
fibrinógeno.
El fibrinógeno preparado de acuerdo con uno de
los métodos de la presente invención puede seguir siendo procesado
para formar un preparado de fibrinógeno liofilizado, preferentemente
tratado térmicamente, que comprende además un hidrato de carbono,
un tampón, una sal, un aminoácido y un detergente, y opcionalmente
factor XIII, siendo capaz el preparado de disolverse en agua a
temperatura ambiente en menos de 15 minutos, preferentemente menos
de 10 minutos y más preferentemente menos de 5 minutos, para dar una
solución de fibrinógeno. Preferentemente la concentración de
fibrinógeno en la solución final es al menos aproximadamente 60
mg/ml.
Sin el deseo de vincularse a ninguna teoría, se
cree que la combinación de la sal, el detergente, el aminoácido y
el hidrato de carbono facilita la disolución rápida del preparado.
También se cree que el hidrato de carbono ayuda a preservar
cualquier posible actividad del factor XIII presente. El tampón
controla el pH de la formulación. El uso de una combinación de un
hidrato de carbono, un tampón, una sal, un aminoácido y un
detergente en el preparado también estabiliza al fibrinógeno, y
cualquier factor XIII presente, sin necesidad de añadir ningún otro
estabilizante, por ejemplo otras proteínas tales como la albúmina.
Esto es una ventaja ya que la adición de otras proteínas puede ser
una fuente de contaminación vírica o de otro tipo del producto. Los
preparados de fibrinógeno de la presente invención están por tanto
exentos de proteínas estabilizantes, en particular albúmina.
Preferentemente, los preparados de fibrinógeno de la presente
invención están también libres de agentes antifibrinolíticos.
Los aminoácidos adecuados incluyen arginina, los
hidratos de carbono adecuados incluyen sacarosa, trehalosa y
rafinosa, preferentemente sacarosa, los tampones adecuados incluyen
sales citrato (p. ej. citrato sódico) y sales fosfato (p. ej.
fosfato sódico), las sales adecuadas incluyen cloruro sódico y los
detergentes adecuados incluyen polisorbato 20.
Preferentemente, el detergente usado en la
formulación final es el mismo detergente que se usa para cualquier
otra etapa anterior de inactivación de virus por disolvente
detergente, el ingrediente aminoácido es el mismo que se usa para
eluir el fibrinógeno de la columna de quelato metálico, y los
componentes de sal y tampón son los mismos que se usan durante la
purificación, evitándose así la necesidad de eliminar elementos
traza de estos compuestos del producto. Es también deseable
minimizar la exposición del producto a una diversidad de reactivos
durante la elaboración, ya que cada reactivo que se usa es una
fuente de posible contaminación o de modificación no deseada del
producto. Así pues, es preferible que los ingredientes del producto
final sean reactivos que ya hayan sido usados durante el
proceso.
Las concentraciones adecuadas de los diversos
componentes dependerán de la naturaleza exacta y de la fuente de
fibrinógeno, y pueden determinarse usando experimentos de tanteo
rutinarios. Los intervalos de concentración adecuados antes de la
liofilización incluyen:
- \quad
- hidrato de carbono (preferentemente sacarosa): aproximadamente 0,5 - 2,5% p/p;
- \quad
- detergente (preferentemente polisorbato 20): aproximadamente 0,1 - 0,5% p/p;
- \quad
- sal (preferentemente cloruro sódico): aproximadamente 50 - 250 mM, preferentemente aproximadamente 50 mM;
- \quad
- aminoácido (preferentemente arginina): aproximadamente 50 - 120 mM, preferentemente aproximadamente 110 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade tampón suficiente para controlar el pH
según se desee, por ejemplo en un pH de aproximadamente 7,5.
Las formulaciones preferidas comprenden
aproximadamente 0,5 - 2,5% p/p de sacarosa, aproximadamente 0,1
-
0,5% p/p de polisorbato 20, aproximadamente 50 - 250 mM, más preferentemente aproximadamente 50 mM, de cloruro sódico, y aproximadamente 50 - 120 mM de arginina a aproximadamente pH 7,5.
0,5% p/p de polisorbato 20, aproximadamente 50 - 250 mM, más preferentemente aproximadamente 50 mM, de cloruro sódico, y aproximadamente 50 - 120 mM de arginina a aproximadamente pH 7,5.
Los preparados de fibrinógeno de la presente
invención se elaboran formando una solución de los componentes y
después liofilizando la solución. Después de la liofilización, el
preparado seco se somete preferentemente a una etapa final de
tratamiento térmico con el fin de inactivar los virus envueltos y no
envueltos. Por ejemplo, puede calentarse a aproximadamente 80ºC
durante aproximadamente 72 horas, o a aproximadamente 100ºC durante
aproximadamente 24 horas. Se sabe que el tratamiento térmico puede
desnaturalizar las proteínas, lo que puede causar agregación y
reducir la solubilidad de producto tratado térmicamente. Los otros
ingredientes de los preparados ayudan a estabilizar el fibrinógeno,
y cualquier posible factor XIII presente, durante la etapa de
tratamiento térmico.
A continuación se da una descripción más
detallada de las realizaciones preferidas de la presente
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
El plasma humano congelado puede ser
acondicionado a aproximadamente -11ºC, descongelado a una
temperatura entre -0,5 y 2ºC, y el crioprecipitado resultante puede
ser recuperado mediante centrifugación. El crioprecipitado puede
lavarse a < 4ºC y recuperarse mediante centrifugación. El
crioprecipitado puede almacenarse congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
El crioprecipitado puede ser descongelado con
tampón (esto es, redisuelto) para recuperar las proteínas contenidas
en el mismo. El fibrinógeno, la fibronectina y el factor XIII
pueden entonces ser precipitados usando un agente químico adecuado,
por ejemplo heparina, polietilenglicol (PEG) o etanol, o ajustando
la temperatura y el pH. Después se recupera el precipitado, por
ejemplo mediante centrifugación. Este precipitado puede ser
almacenado congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
El precipitado de heparina o cualquier otro
precipitado puede entonces ser resuspendido usando un tampón
apropiado y agitando durante un tiempo suficiente y a una
temperatura adecuada. El preparado resultante puede entonces ser
clarificado, por ejemplo mediante filtración profunda o
centrifugación, antes de la filtración por 0,45 \mum o menos,
para eliminar cualquier agregado que pueda estar presente y que
podría proteger a los virus frente a los reactivos de inactivación
por disolvente-detergente.
\vskip1.000000\baselineskip
Entonces puede añadirse disolvente y detergente
al filtrado, y la mezcla se agita a una temperatura adecuada para
inactivar los virus envueltos. El disolvente es preferentemente
fosfato de tri-n-butilo (TnBP),
mientras que el detergente puede ser polisorbato 20, polisorbato 80
o Triton X-100, preferentemente polisorbato 20.
\vskip1.000000\baselineskip
El material tratado con disolvente y detergente
puede entonces ser aplicado directamente a una columna de
cromatografía de quelato metálico, en la que el ion metálico puede
ser cobre o cualquier otro ion adecuado. Las condiciones del tampón
y de la carga son tales que los componentes de disolvente y
detergente no son retenidos por el adsorbente mientras que el
fibrinógeno sí lo es. Cualquier plasminógeno que esté unido puede
entonces ser eluido selectivamente usando una baja concentración de
un compuesto quelante de bajo peso molecular, por ejemplo alanina.
La fracción de lavado del eluido que contiene el plasminógeno puede
entonces seguir siendo procesada para dar un concentrado de
plasminógeno, que puede ser usado clínicamente. Entonces el
fibrinógeno puede ser eluido con alto rendimiento usando una
concentración más alta del mismo compuesto quelante, u otro, por
ejemplo arginina. El factor XIII es coeluido con el fibrinógeno. El
fibrinógeno está generalmente presente en el eluido a
concentraciones de aproximadamente 3 - 20 mg/ml.
La elución de la columna puede ser monitorizada
por cualquier método adecuado, por ejemplo por absorbancia de UV a
una longitud de onda de 280 nanómetros. Esto da una medida de la
concentración de proteína en el eluido, y puede usarse para el
rastreo de la recogida de las fracciones y/o cambios de tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, el eluido de fibrinógeno puede
ser concentrado usando ultrafiltración, para dar concentraciones
finales de aproximadamente 15 - 30 mg/ml, preferentemente
aproximadamente 20 - 25 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El concentrado de fibrinógeno puede ser
formulado mediante la adición de una combinación de un aminoácido,
un hidrato de carbono, un tampón, una sal y un detergente. El
producto formulado puede entonces esterilizarse mediante filtración
por 0,2 \mum y envasarse. Tal filtración puede eliminar o reducir
los virus u otros agentes patógenos, por ejemplo el agente causante
de encefalopatías espongiformes transmisibles (Transmissible
Spongiform Encephalopathies: TSE), que actualmente se cree que es un
prión. El tampón de formulación (y las condiciones de la
liofilización) se eligen preferentemente de forma que el tapón de
fibrinógeno pueda ser reconstituido en agua a temperatura ambiente
en menos de 10 minutos. Una formulación preferida es arginina 110
mM, 1,5% p/p de sacarosa, 0,1% p/p de polisorbato 20, NaCl 50 mM,
citrato trisódico 10 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto se liofiliza y después opcionalmente
se somete a tratamiento térmico a temperaturas elevadas con el fin
de inactivar los virus envueltos y no envueltos.
La contaminación microbiológica durante el
proceso se reduce al mínimo mediante la adecuada higienización del
medio de IMAC y por filtración de los tampones para eliminar la
contaminación bacteriana (p. ej. usando filtros de
0,2 \mum).
0,2 \mum).
El fibrinógeno preparado usando el procedimiento
de la presente invención puede ser usado clínicamente, bien sea
solo o en combinación con trombina en un kit sellante de
fibrina. La presente invención proporciona también fibrinógeno
obtenido de acuerdo con el procedimiento de la invención, para su
uso en terapia, y kits farmacéuticos que comprenden
fibrinógeno obtenido de acuerdo con el procedimiento de la presente
invención en combinación con trombina. Se prefieren los kits
que comprenden fibrinógeno preparado de acuerdo con el
procedimiento de la invención y trombina preparada de acuerdo con la
solicitud PCT de los solicitantes, pendiente en común con la
presente nº (desconocido), que lleva el título "Process for the
preparation of thrombin" presentada el 7 Julio de 2003 que
reivindica la prioridad de la solicitud de patente de GB No.
0216002.6 presentada el 10 de Julio de 2002, cuya descripción se
incorpora al presente texto como referencia.
La invención se ilustrará con más detalle con
referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
El fibrinógeno se midió usando los métodos
siguientes: Ensayo de Precipitación Térmica basado en un método
publicado por Desvignes, P. y Bonnet, P., "Direct Determination of
Plasma Fibrinogen levels by Heat Precipitation. A comparison of the
Technique against Thrombin Clottable Fibrinogen with
Spectrophotometry and Radial Immune Diffusion", Clinica Chimica
Acta, 110 (1981), 9-17. Ensayo del Tiempo de
Coagulación basado en el método de Clauss (Clauss, A.,
Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des
Fibrinogens. Acta Haematol 1957; 17: 234-46).
Ensayo Coagulable Total (Total Clottable Assay) basado en un método
de Blomback y Blomback, Arkiv fur Chemi., 1956, Capítulo 10,
415-443.
El factor XIII se midió por determinación
fotométrica (plasma humano estándar - normal). El método estaba
basado en las siguientes referencias:
Fickenscher, K., Aab, A.,
Stuber, W., "A Photometric Assay for Blood Coagulation
Factor XIII", Thromb. Haemostas. 65 (1991),
535-540 y Solleder, E., Demuth, D.,
Pfeiffer, C., Bomhard, M., Mayer, J.,
Eller, T., Brauer, P., Keller, F.,
Grun, J., Fickenscher, K., Wagner, C.,
"Klinische Prüfung eines neuen photometrischen Tests zur
Bestimmung der Factor XIII Aktivität im Plasma", Lab Med.
16 (1992), 48-53.
El plasminógeno y el factor XIII fueron medidos
mediante ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
El plasma fue almacenado a una temperatura por
debajo de -30ºC hasta su uso. Después el peso de plasma requerido
se acondicionó a -11ºC antes de desmontar el envase. La agrupación
de plasma se descongeló después a una temperatura por debajo de
2,5ºC con el fin de recuperar el crioprecipitado de fibrinógeno,
factor VIII, factor de von Willebrand (vWF) y fibronectina del
plasma. Este precipitado se recuperó mediante centrifugación y se
almacenó congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
El crioprecipitado preparado de acuerdo con el
Ejemplo 1 fue resuspendido en Tris/HCl 20 mM pH 6,7 a razón de
0,024 veces el peso neto de la agrupación de plasma, y se descongeló
calentando a una temperatura entre 20 y 40ºC durante más de 20
minutos. Después se ajustó el pH en 6,55 con HCl 0,1 M. Después se
añadió una solución madre de heparina para dar una concentración
final de 0,88 mg/ml y la mezcla resultante se agitó durante más de
2 minutos. Esto tuvo por resultado la precipitación de fibrinógeno y
fibronectina dejando el factor VIII y el vWF en solución. El
precipitado de heparina se recuperó después mediante centrifugación.
Este precipitado puede ser almacenado congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
El precipitado de heparina preparado de acuerdo
con el Ejemplo 2 se resuspendió en
NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM, citrato trisódico 10 mM,
NaCl 0,5 M, pH 6,0 en una relación de 1 parte de precipitado por 5
partes de tampón. Esta suspensión se calentó después a 40ºC y se
incubó con agitación durante más de 1 hora. El precipitado de
heparina resuspendido se clarificó después mediante filtración a
través de dos filtros de profundidad (Cuno 05SP y Cuno 30LA) y un
filtro de membrana (Sartobran 0,65/0,45 \mum) para asegurar la
eliminación de agregados que podrían proteger a los virus del
subsiguiente tratamiento con disolvente detergente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución madre de disolvente detergente 20%
v/v de polisorbato 20 y 6% v/v de TnBP se añadió después al
filtrado para dar una concentración final de 1% v/v de polisorbato
20 y 0,3% v/v de TnBP. La mezcla resultante se agitó después
durante no menos de 1 hora a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El precipitado de heparina tratado con
disolvente y detergente preparado de acuerdo con el Ejemplo 4 se
cargó en una columna de quelato 650(M) cargada con cobre
Toyopearl AF que había sido preequilibrada con no menos de 5
volúmenes del lecho de tampón 1 (EWI:
NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM, citrato trisódico 10 mM,
NaCl 0,5 M pH 6,0). La columna se cargó después con 3 volúmenes de
lecho de precipitado de heparina tratado. La velocidad de carga no
fue superior a 77 cm/hr. El lecho se lavó después con 18 volúmenes
de lecho de tampón 1. El plasminógeno unido se retiró por lavado
usando 15 volúmenes de lecho de tampón 2 (EW2: Na_{2}HPO_{4} 20
mM, alanina 15 mM, NaCl 0,5 M pH 7,5). El plasminógeno eluido puede
seguir siendo procesado para dar un concentrado que puede ser usado
clínicamente. Las condiciones del tampón se ajustaron usando 5
volúmenes de lecho de tampón 3 (EW3: citrato trisódico 10 mM, NaCl
50 mM pH 7,0). El fibrinógeno unido se eluyó después usando
suficientes volúmenes de lecho de tampón 4 (EW4: arginina 50 mM,
citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,5) de forma que el valor
de la A280 nm (absorbancia de UV a una longitud de onda de 280 nm)
volvió a la línea base. Los iones de cobre se retiraron de la
resina usando 5 volúmenes de lecho de Na_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl
0,25 M, EDTA 50 mM pH 7,0.
\vskip1.000000\baselineskip
El fibrinógeno eluido preparado de acuerdo con
Ejemplo 5 se concentró usando una membrana con un corte de 100 kDa
de peso molecular (Sartocon Sartorius). La membrana fue prelavada
usando arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,5.
La concentración objetivo de fibrinógeno fue 22 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución concentrada de fibrinógeno preparada
de acuerdo con el Ejemplo 6, fue formulada mediante la adición de
arginina 710 mM, 16,5% p/p de sacarosa, 1,1% p/p de polisorbato 20,
50 mM NaCl, 10 mM citrato trisódico pH 7,5 a una relación de 1:10.
Las concentraciones finales de la formulación fueron arginina 110
mM, 1,5% p/p de sacarosa, 0,1% p/p de polisorbato 20, NaCl 50 mM,
citrato trisódico 10 mM. El producto formulado se filtró después en
0,2 \mum (Sartobran 0,45/0,2 \mum, Sartorius).
\vskip1.000000\baselineskip
El producto del Ejemplo 7 se envasó
asépticamente en viales de vidrio a razón de 15 ml por vial y luego
se liofilizó, se tapó y se selló. Los viales se trataron
térmicamente a 80ºC durante un tiempo no inferior a 72 horas, con
el fin de inactivar los virus no envueltos y envueltos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendieron 1274 g precipitado de heparina
(preparado de acuerdo con el Ejemplo 2) en 5 veces su volumen de
NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM, citrato trisódico 10 mM,
NaCl 0,5 M pH 6,0 a 40ºC en un baño de agua con agitación constante
durante más de 1 hora. La solución resultante se filtró por 0,45
\mum con el tren de filtración Cuno OSSP, Cuno 30LA y Sartobran P
0,65/0,45 \mum. La mezcla de disolvente y detergente se añadió
después para dar las concentraciones finales de 1% v/v de
polisorbato 20 y 0,3% v/v de TnBP. Después se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante 1 hora.
Se cargaron 6391 g de precipitado de heparina
tratado con disolvente y detergente en 2123 mL de resina Toyopearl
AF Chelate 650(M) empaquetada en una columna Amicon Vantage
130 para dar una altura una vez sedimentada de 16 cm. La columna de
cromatografía fue higienizada usando 5 volúmenes de lecho de NaOH
0,5 M, y se equilibró con aproximadamente 5 volúmenes de lecho de
tampón 1 (EWI, NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM, citrato
trisódico 10 mM, NaCl 0,5 M pH 6,0). Esto se lavó intensamente con
aproximadamente 5 volúmenes de lecho de agua destilada. La resina
se cargó después con iones metálicos usando aproximadamente 5
volúmenes de lecho de una solución de 3 mg/ml de sulfato de cobre.
Los iones metálicos unidos ligeramente se eliminaron usando
aproximadamente 5 volúmenes de lecho de arginina 50 mM, citrato
trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,5, y después aproximadamente 10
volúmenes de lecho de tampón 1. Después se aplicó la carga, y el
lecho se lavó después con aproximadamente 18 volúmenes de lecho de
tampón 1. El plasminógeno unido se eliminó por lavado usando
aproximadamente 16 volúmenes de lecho de tampón 2 (EW2:
NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM, alanina 15 mM, NaCl 0,5
M pH 7,5). Las condiciones del tampón se ajustaron después usando
aproximadamente 5 volúmenes de lecho de tampón 3 (EW3: citrato
trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,0). El fibrinógeno unido se eluyó
entonces usando aproximadamente 5 volúmenes de lecho de tampón 4
(EW4: arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,5).
Los iones cobre se eliminaron después de la resina usando
aproximadamente 5 volúmenes de lecho de Na_{2}HPO_{4} 20 mM,
NaCl 0,25 M, EDTA 50 mM pH 7,0.
Las concentraciones y los datos de recuperación
para fibrinógeno, plasminógeno y Factor XIII se dan en la Tabla 1.
El aclaramiento de TnBP y polisorbato 20 se dan en la Tabla 2.
Abreviaturas usadas: FT = caudal; EW1 = lavado
de equilibrado 1; EW2 = lavado de equilibrado 2; EW3 = lavado de
equilibrado 3; EP1 = pico de elución 1 (borde delantero del pico de
elución); EP2 = pico de elución 2 (pico de elución principal); EP3
= pico de elución 3 (borde trasero del pico de elución).
\vskip1.000000\baselineskip
Abreviaturas usadas: EP2 = pico de elución 2
(pico de elución principal)
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indicaron que las tres proteínas,
fibrinógeno, plasminógeno y factor XIII, eran capturadas
eficazmente sobre el Toyopearl cargado con Cu^{2+} y después el
93% del plasminógeno cargado era eliminado selectivamente mediante
lavado con el tampón de alanina 15 mM (EW2). El producto de
fibrinógeno eluido contenía el 76% y 56% del fibrinógeno y del
factor XIII aplicados respectivamente. El aclaramiento de los
productos químicos de disolvente y detergente fue también
eficiente: solamente el 0,3 y el 0,4% del TNBP y del polisorbato 20
aplicados, respectivamente, se quedaron en el producto después de la
cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Se montaron dos cassettes slice de polisulfona
Sartorius (0,1 m^{2} cada una) en un portamembranas Sartorius, y
se lavaron con 7 l de agua desionizada. El conjunto se higienizó con
un lavado de 1 L de NaOH 1 M calentada a 40ºC y después 5 L de
NaOH, recirculado durante 1 hora. Después se lavó el sistema con 10
L de agua desionizada a una velocidad de flujo transversal de 880
ml/min. La membrana se preparó con 5 L de EW4 (arginina 50 mM,
citrato trisódico 10 mM, NaCl 50 mM pH 7,5) sin aplicar
contrapresión a la misma velocidad de flujo transversal.
Se aplicaron 8960 ml de fracción eluida de
fibrinógeno a una concentración inicial de fibrinógeno de 5,24
mg/ml a una presión de entrada máxima y una presión transmembrana de
1,4 y 0,7 bares (140.000 y 70.000 Pa) respectivamente. La
ultrafiltración llevó 1 hora y 36 minutos y dio un retentato de 1227
ml y 23,8 mg/ml de fibrinógeno. El flujo medio fue 28,8 L/m^{2}/h
y las concentraciones de gelificación previstas fueron 31,0
mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios geles de cromatografía de quelato
metálico fueron ensayados en relación con su capacidad para unir y
subsiguientemente liberar fibrinógeno. Estos se describen en la
Tabla 3 que sigue:
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\vskip1.000000\baselineskip
El material de partida era un crioprecipitado
que contenía fibrinógeno. Este precipitado fue redisuelto en tampón
I (tampón de fosfato sódico 20 mM que contiene cloruro sódico 250 mM
o bien cloruro sódico 500 mM, pH 7). El gel quelante fue cargado
con iones metálicos (cobre, níquel o zinc) y luego se equilibró con
Tampón I. El crioprecipitado redisuelto se aplicó a una columna
empaquetada que contenía el gel cargado equilibrado. Una vez
aplicado todo el material, la columna fue lavada con Tampón I. El
fibrinógeno fue eluido lavando la columna con Tampón II (fosfato
sódico 20 mM, tampón de EDTA 0,05 M que contiene cloruro sódico 250
mM o bien cloruro sódico 500 mM, pH 7) o Tampón III (fosfato sódico
20 mM, arginina 50 mM, cloruro sódico 250 mM, pH 7,5) o Tampón IV
(fosfato sódico 20 mM, arginina 200 mM, cloruro sódico 250 mM pH
7,0).
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
- \quad
- ^{a} Eluido con Tampón II.
- \quad
- ^{b} Eluido con Tampón III.
- \quad
- ^{c} Eluido con Tampón IV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que el fibrinógeno y el
factor XIII pueden ser aislados de una solución que contiene
fibrinógeno usando cromatografía de afinidad por iones metálicos
inmovilizados (IMAC) con una diversidad de características químicas
de la matriz de base y de iones metálicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de la cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar el fibrinógeno
de diferentes soluciones que contienen fibrinógeno ha sido
investigada.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Crioprecipitado redisuelto obtenido de plasma humano descongelado (preparado de acuerdo con el Ejemplo 1).
- B.
- Precipitado de heparina redisuelto obtenido de crioprecipitado redisuelto que había sido mezclado con heparina (preparado de acuerdo con el Ejemplo 2).
- C.
- Precipitado en frío redisuelto obtenido por enfriamiento rápido de crioprecipitado redisuelto.
- D.
- Solución que contiene fibrinógeno empobrecida cromatográficamente en factor VIII, factor de von Willebrand (vWF) y fibronectina, obtenida a partir de plasma humano.
El precipitado en frío usado en C fue preparado
de la forma siguiente: el crioprecipitado, preparado como en el
Ejemplo 1, fue redisuelto en cuatro veces su peso de solución de
cloruro cálcico 50 \muM a 28ºC. El pH se ajustó en 6,8 con ácido
acético 1 M y la solución se enfrió a 10ºC. Después de agitar
durante más de 10 minutos, el precipitado que se formó se recogió
mediante centrifugación.
Cada solución A-D, conteniendo
aproximadamente 1 a 20 mg de fibrinógeno por ml, fue incubada con
disolvente y detergente para inactivar los virus, después se aplicó
a una columna de resina para IMAC Toyopearl Chelate que había sido
cargada con iones cobre y equilibrada con fosfato sódico 20 mM,
cloruro sódico 250 mM pH 7,0. Después de cargar, la resina se lavó
con el mismo tampón. El fibrinógeno fue eluido mediante la
aplicación de imidazol 25 mM (Tampón X) o arginina, 50 mM fosfato
sódico 20 mM, cloruro sódico 250 mM pH 7,5 (Tampón Y).
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que la IMAC puede ser
usada para preparar fibrinógeno a partir de distintos materiales de
partida que contienen fibrinógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
El fibrinógeno que había sido eluido de la
resina de IMAC de acuerdo con los Ejemplos 9 y 10, y concentrado
hasta aproximadamente 15 mg/ml en arginina 50 mM, fosfato 20 mM pH
7,5 (Tablas 6 y 8) o arginina 50 mM, citrato trisódico 10 mM pH 7,5
(Tabla 7), fue formulado con diversos compuestos añadidos,
introducido en viales de vidrio (20 ml por vial) y liofilizado. Al
final de la liofilización, los viales se sellaron bajo vacío, y
después de trataron térmicamente a 80ºC durante 72 horas para
inactivar los virus. Los viales fueron después reconstituidos con
agua (5 ml por vial) a temperatura ambiente (18ºC a 25ºC). El tiempo
de redisolución se midió como el tiempo entre la adición de agua y
el tiempo para el cual se observó una solución homogénea clara sin
materia sólida residual.
Los resultados se muestran en las Tablas 6, 7 y
8.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Abreviaturas usadas en las Tablas 6 a 8:
- \quad
- Arg = arginina
- \quad
- Poli = polisorbato 20
- \quad
- Cit = citrato
- \quad
- Sac = sacarosa
- \quad
- Fib = fibrinógeno
- \quad
- Recons = reconstitución
- \quad
- Carbo = hidrato de carbono
- \quad
- Fos = fosfato
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indicaron que los márgenes de
concentración efectivos de los formulantes eran:
- \quad
- Sacarosa: 0,5 - 2,5 %
- \quad
- Polisorbato 20: 0,1 - 0,5%
- \quad
- Cloruro sódico: 50 a 250 mM (50 mM para retención de factor XIII)
- \quad
- Arginina: 50 - 120 mM
Las elevadas concentraciones de cloruro sódico
(250 mM) en combinación con la arginina, el polisorbato 20 y una
sal tampón permitieron la rápida reconstitución del fibrinógeno
liofilizado tratado térmicamente, pero se perdió la actividad del
factor XIII. La reducción del contenido de cloruro sódico acompañada
por la adición de sacarosa permitió tanto la reconstitución rápida
como la retención de la actividad del factor XIII.
Las combinaciones selectivas de arginina,
polisorbato 20, cloruro sódico, una sal de tamponamiento adecuada y
un hidrato de carbono, proporcionaron una formulación para
fibrinógeno y factor XIII que permitió la reconstitución rápida a
temperatura ambiente del producto liofilizado y tratado
térmicamente, con retención de la actividad de fibrinógeno y del
factor XIII.
En cuatro experimentos independientes (A a D),
un precipitado de heparina fue resuspendido de acuerdo con el
Ejemplo 3 y se trató con disolvente y detergente de acuerdo con el
Ejemplo 4. La solución resultante se separó mediante cromatografía
de acuerdo con el Ejemplo 9 para dar un eluido rico en fibrinógeno y
factor XIII. Este eluido se concentró después de acuerdo con el
Ejemplo 10. El concentrado fue formulado hasta un objetivo de
arginina 110 mM, 1,5% p/p de sacarosa, 0,1% p/p de polisorbato 20,
NaCl 50 mM, citrato trisódico 10 mM, y sometido a filtración
esterilizante a 0,2 \mum de acuerdo con el Ejemplo 7. El
concentrado filtrado se envasó después asépticamente, se liofilizó
y se sometió a tratamiento térmico de acuerdo con el Ejemplo 8 para
dar un producto doble inactivado víricamente. Los materiales
eluidos, los concentrados filtrados y los productos fueron
ensayados en relación con la proteína coagulable y la actividad de
factor XIII, y los resultados se muestran en la Tabla 9.
Los resultados indican que el fibrinógeno puede
ser concentrado a aproximadamente 20 mg/mL usando ultrafiltración.
También indican que las condiciones de formulación dan un producto
con una concentración de factor XIII superior a 1 U/mL y tiempos de
reconstitución muchos menores que 15 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se redisolvió el crioprecipitado en tampón 1
(tampón de fosfato 20 mM que contiene NaCl 0,25 M pH 6,0) y se
trató con disolvente y detergente como en el Ejemplo 4. Se cargó
resina de quelato (Toyopearl AF Chelate 650 (M)) con iones cobre,
se sometió a un prelavado con el tampón de elución apropiado y
después se equilibró con tampón 1. Este material se cargó en la
resina cargada con cobre empaquetada. Una vez aplicado todo el
material, la columna se lavó con quince a veinte volúmenes de tampón
1. Después la columna se lavó con cinco a siete volúmenes de lecho
de tampón 2 (tampón de fosfato 20 mM que contiene NaCl 0,25 M pH
7,0). La columna fue eluida con un tampón que contiene fosfato 20
mM, NaCl 0,25 M y arginina en un margen de concentraciones y de
pH.
Los resultados se muestran en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indicaron que una reducción en la
concentración de arginina en el tampón de elución redujo la
concentración de cobre en el material eluido de fibrinógeno, pero
tenía un efecto adverso sobre la recuperación del fibrinógeno. Un
aumento del pH del tampón de elución de arginina 50 mM a 7,5 tuvo
por resultado una elevada recuperación de fibrinógeno y los niveles
de cobre co-eluido se redujeron sustancialmente.
El precipitado de heparina congelado se
redisolvió en fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, citrato
trisódico 10 mM pH 6,0, en una relación de 1:5 en peso. Se
compararon dos métodos de redisolución:
Método 1. El precipitado de heparina se añadió
al tampón a temperatura ambiente. Después se calentó la mezcla a
40ºC y se incubó a 40ºC durante 1 hora.
Método 2. El tampón se precalentó a 40ºC y
después se añadió el precipitado de heparina a una velocidad tal
que permite que se mantenga a una temperatura de más de 36ºC.
Después de la adición de todo el precipitado, la mezcla se incubó
durante 1 hora a 40ºC.
Se ensayaron tres tandas de precipitado
distintas. En cada caso, el método 2 de redisolución tuvo por
resultado una capacidad de filtración significativamente más alta.
El peso final de filtrado y la concentración de fibrinógeno fue
también más alta de una forma consistente, lo que tiene por
resultado mejores rendimientos de fibrinógeno (véase la Tabla
11).
Notas:
^{1} Área de filtración a escala pequeña =
0,00173 m^{2}; área de filtración a escala piloto = 0,3 m^{2}.
La presión de aire inicial aplicada durante la filtración fue 0,25
bares (25.000 Pa) a escala pequeña y 0,1 - 0,2 bares (10.000 -
20.000 Pa) a escala piloto.
^{2} La capacidad de filtración se calcula
como la cantidad máxima de material resolubilizado dividida por el
área del filtro. Los ejemplos que indican capacidades "mayores
que" no bloquearon el filtro bajo las condiciones
experimentales.
^{3} El rendimiento de fibrinógeno se calcula
en este caso como los mg de fibrinógeno recuperado del filtro (=
concentración recuperada mgmL^{-1} x mL de filtrado recogido)
dividido por los mg de fibrinógeno que había en este volumen de
material de partida (= concentración aplicada mgmL^{-1} x mL de
filtrado recogido) x 100(%).
Claims (11)
1. Un método para la separación y purificación
de fibrinógeno y plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende
fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones
tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la
matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el
plasminógeno separadamente de la matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método para la separación de fibrinógeno
de plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende
fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones
tales que al menos el fibrinógeno se une a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la
matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que el plasminógeno y el fibrinógeno son eluidos de la matriz
selectivamente por separado.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la solución que comprende
fibrinógeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la solución que comprende
fibrinógeno comprende además factor XIII, y el factor XIII es
co-eluido de la matriz con el fibrinógeno.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de
concentrar el fibrinógeno mediante ultrafiltración hasta una
concentración de 15 a 30 mg/ml.
7. El método según la reivindicación 6ª, que
comprende además las etapas de:
- \quad
- combinar el fibrinógeno con una combinación de estabilizantes adecuados para formar una formulación de fibrinógeno;
- \quad
- esterilizar el fibrinógeno mediante filtración; y
- \quad
- liofilizar la formulación de fibrinógeno para formar una formulación de fibrinógeno liofilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El método según la reivindicación 7ª, en el
que los estabilizantes incluyen un aminoácido, un hidrato de
carbono, una sal y un detergente.
9. El método según la reivindicación 7ª o la
reivindicación 8ª, que comprende además la etapa de someter la
formulación de fibrinógeno liofilizada a un tratamiento térmico en
seco.
10. El uso de cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados, para la separación de fibrinógeno
del plasminógeno.
11. El uso de cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados, para la separación y purificación de
fibrinógeno y plasminógeno.
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