CS256705B1

CS256705B1 - Method of f(ab)2 fragment separation from f ab, f c,f c fragments obtained by blood gamma-globulin's pepsin-cleavage

Info

Publication number: CS256705B1
Application number: CS854411A
Authority: CS
Inventors: Ivan Stepanek
Original assignee: Ivan Stepanek
Priority date: 1985-06-17
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 1988-04-15
Also published as: CS441185A1

Description

Vynález sa týká separácie fragmentu F(ab‘)2 od fragmentov Fab, Fc a Fc‘ získaných proteblytickým štiepením krvného gama-globulínu pepsínom. Gama-globulín mSže byť připravený z norraálnej alebo hyperimúnnej plazmy, z normálneho 'alebo retroplacentárneho, připadne hyperimňnneho séra 1’udí 'alebo zvlerat. Fragment F(ab‘)2 připravený pódia navrhovaného postupu je určený pre diagnostické alebo terapeutické účely.The invention relates to the separation of F (ab ‘) 2 fragment from Fab, Fc, and Fc‘ fragments obtained by pepsin proteblytic cleavage of blood gamma-globulin. Gamma globulin may be prepared from norraal or hyperimmune plasma, from normal 'or retroplacental or hyperimmune serum 1' or 'from animals'. The F (ab ‘) 2 fragment prepared according to the proposed procedure is intended for diagnostic or therapeutic purposes.

Ma precipitáciu gama-globulínu zo zmesi plazmatických alebo sérových bielkovín bol použitý síran amonný a hydroxid hlinitý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Bohriugwerke Mitt. 28, 9, 1945; Schultze Η. E., Schonenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol (Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K., Leikhim R. J.: J. Immunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Lewin J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Pnoc. 17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.:Ammonium sulfate and aluminum hydroxide were used to precipitate gamma-globulin from a mixture of plasma or serum proteins (Schultze, E., Matheka HD: Bohriugwerke Mitt. 28, 9, 1945; Schultze, E., Schonenberger M., Matheka HD: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol (Horejsi J., Smetana R .: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), sodium sulfate (Amiraian K., Leikhim RJ: J. Immunol. 87, 301, 1961), aluminum chloride (Lewin J .: Therapie 9, 523, 1954), DEAE cellulose (Sober HA, Peterson EA: Fed. Pnoc. 17, 1116, 1958; Peterson EA, Sober HA:

J. Am. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L., Herbertt A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, rok 19*59; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, rok 1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D‘etud. Clin. Biol. 14, 1054, 1969), ionty Z· a AI (Rejnek J.,J. Am. Chem. Soc. 78, 756 (1956); Fahey J.L., Herbertt A.P .: J. Biol. Chem. 234, 2645, 19 * 59; Stanworth DH: Nature 188, 156, 1960), caprylic acid (Steinbuch M., Audran R .: Rev. Franc. D'etud. Clin. Biol. 14, 1054, 1969), Z · and AI ions (Rejnek J .

Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1489, 1957; Rejnek J., Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 23, 773, 1958; Krauze R., Naimski K., Ztakrewski K.: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961), polymetafostát (Nitschman H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960), éter (Pennell Η. B. v Putnám F. W.) od (The Plasma proteine vol I Academie Press New York 1960, str. 9) a etanol (Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., DerouauxŠkvařil F .: Coll. Czechloslov. Chem. Commun. 22, 1489 (1957); Rejnek J., Skvaril F .: Coll. Czechloslov. Chem. Commun. 23, 773 (1958); Krauze, R., Naimski, K., Ztakrewski, K .: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961), polymetaphostate (Nitschman HS, Rickli R., Kistler P .: Vox Sang. 5, 232, 1960), ether (Pennell, B. in Putnam FW), by (The Plasma Protein Vol I Academic Press) New York 1960, p. 9) and ethanol (Cohn EJ, Gurd FNR, Surgenor DM, Barnes BA, Brown RK, Derouaux

G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F., Schmid K., UrOma E.: J. Am. Chem. Soc. 72, 465, 1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., Alberty R. A., Williams J. W.: f. Biol. Chem. 164, 109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M.: J. Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., Kistler P., Lergier W.: Helv. Chim. Octa 37, 866, 1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L., Bloom F. C., McCall Κ. B., Hyndman L. A., Anderson H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, rok 1956).G., Gillespie, J. M., Kahnt, F. W., Lever, W. F., Liu, C. H., Mittelman, D., Mouton, R. F., Schmid, K., UrOma, E., J. Am. Chem. Soc. 72, 465 (1950); Deutsch H.F., Gostling G.L., Alberty R.A., Williams J.W .: f. Biol. Chem. 164, 109 (1946); Oncley JL, Melin M, Rickert D A., Cameron J W., Gross P. M .: J. Am. Chem. Soc. 71, 541 (1949); Nitschman, H. S., Kistler, P., Lergier, W., Helv. Chim. Octa 37, 866 (1954); Kistler P., Nitschman H. S .: Vox Sang. 7, 414 (1962); Taylor H. L., Bloom F. C., McCall Κ. B., Hyndman, L. A., Anderson, H. D., J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, year 1956).

Preparáty gama-globulínu připravené pódia doposial platných kritérií pre intramuskulárne podanie majú spravidla dokazatelný obsah histamínu, dalej hypotenzívny a antikomplementárny účinok, čo je pre kva256705 litu intravenóznych preparátov nepřípustné.The gamma-globulin preparations prepared according to the current criteria for intramuscular administration generally have a detectable histamine content, further a hypotensive and anticomplementary effect, which is unacceptable for the intravenous preparation kva256705.

Podanie intramuskulárneho preparátu týchto kvalit intravenózne može v důsledku náhlého- poklesu krvého tlaku pacienta ohroziť a v důsledku antikomplementárneho účinku oslabit jeho nešpecifickú imúnologickú obranu.Administration of an intramuscular preparation of these qualities intravenously may compromise the patient due to a sudden drop in blood pressure and, due to the anti-complementary effect, weaken his non-specific immune defense.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok pri intramuskulárnom podaní nemá taký priebeh ako pri intravenóznom, možno ho označit spolu s vysokým antikomplementárnym účinkom za vlastnosti nežiadúce pre gama-glóbulínové preparáty určené pre terapeutické účely.Although the hypotensive effect of intramuscular administration does not have the same course as intravenous administration, it can be described, along with a high anti-complementary effect, as undesirable for gamma-globulin preparations intended for therapeutic purposes.

Znižovanie antikomplementárnej aktivity gama-globulínového roztoku pomocou proteolytického štiepenia bolo realizované pepsínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch. med. Wschr. 87, 1643, 1962) a plazmínom (Sgouris J. T.: Vox Sang. 13, 71, 1967; Barandun S., Castel V., Makula M. F., MorellThe reduction of the anti-complementary activity of the gamma-globulin solution by proteolytic cleavage was realized by pepsin (Schultze, E., Schwick, G .: Dtsch. Med. Wschr. 87, 1643, 1962) and plasmin (Sgouris JT: Vox Sang. 13, 71, 1967). Barandun S., Castel V., Makula MF, Morell

A., Pian R., Škvařil F.: Vox Sang.: 28, 157, 1975).A., Pian R., Skvaril F .: Vox Sang .: 28, 157 (1975).

Zpočiatku boli činěné pokusy využit pre terapeutické účely zmes všetkých fragmentov, vzniklých pri proteolytickom štiepení gama-globulínu spolu s použitým pepsínom, ale od tejto tendencie sa pre výskyt klinických reakcií, najma po opakovanom podaní upustilo. Fragment F(ab‘)2 purifikoval pomocou DEAE Sephadexu A-50 (Szégli G., Torna E., Gartner M.: Arch. Roumaines de Pathol. Exper. Microbiologie 22, 792, 1963).Initially, attempts have been made to use for therapeutic purposes a mixture of all the fragments resulting from the proteolytic cleavage of gamma-globulin together with the pepsin used, but this tendency has been abandoned for the occurrence of clinical reactions, in particular after repeated administration. F (ab ‘) 2 fragment was purified using DEAE Sephadex A-50 (Szegli G., Torna E., Gartner M., Arch. Roumaines de Pathol. Exper. Microbiologie 22, 792, 1963).

Antikomplementárna aktivita bola testovaná na základe úbytku aktivity komplementu. Obytok známej hodnoty aktivity komplimentu po přidaní známého množstva roztoku lyofilizovaného gama-globulínového preparátu ako východzieho preparátu ako aj separovaného fragmentu F(ab‘)2 bol stanovený metodou podl'a Kabata a Mayera (Rabat E. A., Mayer M..M.: Experimentální ímunochemie ČSAV, Praha 1965, str. 180). Antikomplementárný účinok fragmentu F(ab‘)2, připraveného pódia navrhovaného postupu vykazoval u 10 experimentálnych šarží zníženie o 95 až 98 °/o, v porovnaní s antikompiementárnym účinkom východzieho gama-globulínu před proteolytickým štiepením pepsínom.Anti-complement activity was tested for complement activity loss. The remainder of the known value of the compliment activity after addition of a known amount of the lyophilized gamma-globulin preparation solution as a starting preparation as well as the separated F (ab ') 2 fragment was determined by the method of Kabat and Mayer (Rabat EA, Mayer M..M .: Experimental immunochemistry Czechoslovak Academy of Sciences, Prague 1965, p. 180). The anticomplementary effect of the F (ab ‘) 2 fragment prepared from the proposed procedure showed a 95-98% reduction in 10 experimental batches compared to the anti-complementary effect of the starting gamma-globulin prior to proteolytic cleavage by pepsin.

Hypotenzívny účinok bol testovaný na základe poklesu krvného tlaku králíka priamou krvnou metodou podl-a ČSL 3 (ČSL 3, svazok I, vydanie III, Avlcenum Praha, 1970, str. 149) s tým, že králíkovi o hmotnosti 2 až 3 kg sa aplikujú 2 ml roztoku fragmentu F(ab‘)2 na kg hmotnosti. Obsah bielkovín v aplikovanom roztoku je 50 gramov na .1 000 mililitrov. U preparátov F(ab‘)2 připravených podlá navrhovaného postupu sa hypotenzivna aktivita nevyskytovala v tak výraznej miere, ako vo východzom gama-globulíne. Túto skutočnosť je možné dokumentovat údajom, že z 10 experimentálnych šarží připravených podlá předloženého vynálezu bol stanovený pokles systolického krvného tlaku maximálně o 4 až 8 % v porovnaní s východzím gama-globulínom v tej istej dávke, kde bol stanovený pokles systolického krvného tlaku od 20 do 30 %.The hypotensive effect was tested by decreasing rabbit blood pressure by a direct blood method according to CSL 3 (CSL 3, Volume I, Edition III, Avlcenum Praha, 1970, p. 149), with rabbits weighing 2 to 3 kg being administered 2 ml solution of fragment F (ab ') 2 per kg of weight. The protein content of the applied solution is 50 grams per 1000 milliliters. In the F (ab ‘) 2 preparations prepared according to the proposed procedure, hypotensive activity did not occur as significantly as in the starting gamma-globulin. This can be documented by indicating that, of the 10 experimental batches prepared according to the present invention, a systolic blood pressure drop of a maximum of 4-8% was determined compared to the starting gamma-globulin at the same dose where the systolic blood pressure drop was determined from 20 to 30%.

Obsah histamínu bol testovaný Gadumovou modifikáciou (G-adum J. H.: J. Physiol. 8, 467, 1949] Magnusonovej metódy (Magnus R.: Arch. 102, 123, 1904).Histamine content was tested by Gadum modification (G-adum J.H .: J. Physiol. 8, 467, 1949) by the Magnuson method (Magnus R .: Arch. 102, 123, 1904).

U preparátov připravených podlá navrhovaného postupu sa kontraktácie morčacieho čreva nevyskytovali, čo je možné dokumentovat’ údajom, že z 10 experimentálně připravených šarží podlá předloženého vynálezu bolo stanovené 0,0 míkrogramu histamínu na 100 gramov fragmentu F(ab‘)2 v porovnaní s východzím gama-globulínom, kde bol stanovený obsah histamínu v koncentrácii 20 až 40 mikrogramov na 100 gramov. lyofilizovaného gama-globulínu.The preparations prepared according to the proposed procedure were free from guinea pig intestinal contraction, which can be documented by indicating that from 10 experimentally prepared batches of the present invention 0.0 histamine was determined per 100 grams of F (ab ') 2 fragment compared to the starting gamma -globulin, where the histamine content was determined at a concentration of 20 to 40 micrograms per 100 grams. lyophilized gamma-globulin.

Podstatou vynálezu je sposob separácie protilátkove aktivneho fragmentu označovaného ako F(ab‘)2 od pepsínu použitého na proteolytické štiepenie a od ostatných proteolytických fragmentov s nižšími hodnotami sedimentačných konštant. Separácia sa prevádza pomocou molekulárnych sít s maximálnou hodnotou priepustnosti do molekulárně] hmotnosti 80 000, pričom molekulárna hmotnost fragmentu F(ab‘ )2 je 100 000. Separácia F(ab‘)2 od ostatných fragmentov je možná z toho důvodu, že hodnoty sedimentačných konštant ostatných fragmentov a pepsínu sú rozdielné a majú tieto numerické hodnoty:The subject of the invention is a method of separating the antibody active fragment referred to as F (ab p) 2 from pepsin used for proteolytic cleavage and from other proteolytic fragments with lower values of sedimentation constants. Separation is carried out using molecular sieves with a maximum permeability up to a molecular weight of 80,000, the molecular weight of the F (ab ') 2 fragment being 100,000. Separation of the F (ab') 2 from the other fragments is possible because sedimentation values other fragment and pepsin constants are different and have the following numerical values:

pepsín 3,3 S (Philpot J. St. L.: Biochem. j. 29, 2 458, 1935; Bovey F. A., Yanari S. S.: The Enzymes 4, 63, 1960; Cunningham L.: Comprehensive Biochemistry 16, 173, 1965) Fab 3,6 S; Fc 3,7 S; Fc‘ 2,7 S a F[ab‘)2 5,3 S (Škvařil F., Brummelová V.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 33, 2 316, 1968; Novotný J., Škvařil F.: Goll. Czechoslov. Chem. Commun. 35, 2 472, 1970),pepsin 3.3 S (Philpot J.L. L .: Biochem. J. 29, 2458, 1935; Bovey FA, Yanari SS: The Enzymes 4, 63, 1960; Cunningham L .: Comprehensive Biochemistry 16, 173, 1965 ) Fab 3.6 S; Fc 3.7 S; Fc '2.7 S and F [ab') 2 5.3 S (Skvaril F., Brummelova V .: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 33, 2 316, 1968; Novotny J., Skvaril F .: Goll Chem. Commun. 35, 2 472 (1970),

Pepsín na proteolytické štiepenie je možné použiť či už v podobě roztoku, alebo naviazaný na pevný nosič (Antonjan R. K., Nikitenko A. A., From A. A.: Probl. Gematol. 14, 12, 55, 1971; Valentová O., Turková J., Lapka R„, Zima j., Coupek J.: Biochim. Biophys. Acta 403, 192, 1975). Pokial' používáme pepsín imobilizovaný na pevnom nosiči jeho proteolytická aktivita naviazaním klesá přibližné o 50 %.Pepsin for proteolytic cleavage can be used either as a solution or bound to a solid support (Antonjan RK, Nikitenko AA, From AA: Probl. Gematol. 14, 12, 55, 1971; Valentova O., Turkova J., Lapka R ", Winter et al., Coupek J .: Biochim. Biophys. Acta 403, 192, 1975). When using pepsin immobilized on a solid support, its proteolytic activity by binding decreases by approximately 50%.

Východziou surovinou může byť gama-globulín z frakcie II izolovanej etanolom metodou podá Cohna a Oncleya z normálnej alebo hyperimúnnej plazmy, připadne z normálneho alebo retroplacentárneho, připadne hyperimúnneho séra 1'udí alebo zvierat. Taktiež můžu byť použité bielkovinné gama-globulínové preparáty izolované pomocou iných metod.The starting material may be gamma-globulin from fraction II isolated by ethanol by the method of Cohn and Oncley from normal or hyperimmune plasma, optionally from normal or retroplacental or hyperimmune serum of humans or animals. Protein gamma-globulin preparations isolated using other methods may also be used.

Bielkovinný gama-globulínový materiál, zbavený etanolu a chloroformu, sa rozpúšťa alebo nariecfuje v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody, aby sa hodnota koncentrácie bielkovín nachádzala v roz6The protein-gamma-globulin material, free of ethanol and chloroform, is dissolved or diluted in an amount of distilled pyrogen-free water such that the protein concentration value is within

236705 medzi 5 až 180 gramov na liter. Rozpúšfanie sa urýchfuje miešaním. Po rozpuštění sa gama-globulínový roztok vyčíri například filtráciou, stanoví sa obsah chloridu sodného a jeho obsah sa upraví na koňcentráciu 3,0 až 9,0 gramu chloridu sodného na liter.236705 between 5 to 180 grams per liter. Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the gamma-globulin solution is clarified, for example, by filtration, the sodium chloride content is determined and adjusted to a concentration of 3.0 to 9.0 grams of sodium chloride per liter.

Proteolytické štiepenie prebieha pri teplete 37 °C pri pH 3,2 až 4,2, pri době inkubácie 60 minút až 24 hodin. Proteolytické štiepenie sa zastavuje úpravou hodnoty pH na 7,0 až 8 0 a ochladením roztoku na teplotu 0 °C až +5 °'C. Množstvo použitého pepsínu závisí od jeho kvality a pohybuje sa v rozmedzí od 1 až po 25 mg na 100 mg neštiepeného gama-globulínu. Ku proteolytickému štiepeniu je možné použit aj pepsín imobílizováný na pevnom nosiči.Proteolytic cleavage occurs at 37 ° C at pH 3.2 to 4.2, with an incubation time of 60 minutes to 24 hours. Proteolytic cleavage is stopped by adjusting the pH to 7.0-80 ° C and cooling the solution to 0 ° C to + 5 ° C. The amount of pepsin used depends on its quality and ranges from 1 to 25 mg per 100 mg of uncleaved gamma-globulin. Pepsin immobilized on a solid support can also be used for proteolytic cleavage.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou a fragmenty s nižšou sedimentačnou konstantou sa od fragmentu F(ab‘)2 spolu s pepsínom separujú, například gélovou filtráciou, dialýzou, uitrafiltráciou alebo diafiltráciou pomocou eiúcie alebo narieďovania s destilovanou vodou alebo s vodným roztokom chloridu sodného o koncentrácii maximálně do 30 gramov na liter, s optimom 3,0 až 9,0 na liter, o teplote 0 °C až +6 ^CC s hodnotou pH v rozmedzí 4,0 až 9,0. Purifikovaný roztok F(ab‘)2 sa po oddělení pepsínu a fragmentov s nižšou sedimentačnou konstantou do molekulárnej hmotnosti 80 000 sterilizuje například filtráciou, alebo pomocou iných metod, a potom sa zakoncentrováva například lyofilizáciou alebo pomocou membrán, vákuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami a v případe potřeby sa podrobí čřalšiemu spracovaniu.The proteolytically cleaved gamma-globulin solution is clarified, for example, by filtration, and fragments with a lower sedimentation constant are separated from the F (ab ') 2 fragment together with pepsin, for example by gel filtration, dialysis, uitrafiltration or diafiltration by elution or distillation with distilled water. sodium chloride at a concentration of up to 30 grams per liter, with an optimum of 3.0 to 9.0 per liter, at a temperature of 0 ° C to + 6 ^° C with a pH in the range of 4.0 to 9.0. The purified solution of F (ab ') 2 is sterilized, for example by filtration or other methods, after separation of pepsin and fragments with a lower sedimentation constant to a molecular weight of 80,000, and then concentrated, for example, by lyophilization or membranes, vacuum distillation, freeze drying or other methods. if necessary, undergo further processing.

Vynález je ďalej objasněný na príkladoch prevedenia, ktorými jeho rozsah nie je ani obmedzený ani vyčerpaný.The invention is further elucidated by means of exemplary embodiments in which its scope is neither limited nor exhausted.

Příklady prevedeniaExamples of design

Příklad 1Example 1

Východziou surovinou može byť lyofilizovaná frakcia II, izolovaná metodou podfa Cohna a Oncleya alebo pasta frakcie II po oddělení etanolu a chloroformu v roztoku. Frakcia II može byť izolovaná z normálnej alebo hyperimúnnej plazmy, připadne z normálneho alebo retroplacentárneho, připadne hyperimúnneho séra 1’udí alebo zvierat s definovanou antibakteriálnou alebo antitoxickou, připadne antivirovou protilátkovou aktivitou.The starting material may be a lyophilized fraction II, isolated by the Cohn and Oncley method, or a fraction II paste after separation of the ethanol and chloroform in solution. Fraction II can be isolated from normal or hyperimmune plasma, optionally from normal or retroplacental, optionally hyperimmune serum 1 'or animals with defined antibacterial or antitoxic, or antiviral antibody activity.

Rielkovinný gama-globulínový materiál sa rozpúšía alebo narieďuje v ta kom množstve destilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 ^QC až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachádzala v rozmedzí 5 až 180 gramov na liter, s optimom 20 až 60 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urýchfuje miešaním. Po rozpuštění sa gama-globulínový roztok vyčíri například filtráciou a stanoví sa obsah chloridu sodného a jeho obsah sa upraví na koňcentráciu 3,0 až 9,0 gramov na liter roztoku.Rielkovinný gamma-globulin was soluble material or diluted in whom the amount of distilled pyrogen-free water at 0 ^Q C to + 6 ° C, the value of the protein concentration was in a range of 5-180 grams per liter, the optimum of 20-60 grams per liter . Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the gamma-globulin solution is clarified, for example, by filtration, and the sodium chloride content is determined and adjusted to a concentration of 3.0 to 9.0 grams per liter of solution.

V technologických pomeroch sú vyššie uvedené podmienky spravidla zachované vtedy, ak rozpúšťame 1 kg gama-globulínovej pasty v 3 000 mg destilovanej apyrogénnej vodě o teplote 0 °C až +6 °C. Hodnota pH gama-globulínového roztoku bývá spravidla v rozmedzí 4,0 až 9,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí 20 až 60 gramov na liter.In technological conditions, the above conditions are generally maintained when dissolving 1 kg of gamma-globulin paste in 3000 mg of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C. The pH of the gamma-globulin solution is generally in the range of 4.0 to 9.0 and the protein concentration in the range of 20 to 60 grams per liter.

Takto připravený roztok purifikovaného gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou. Proteolytické štiepenie prebieha pri teplote 37 °C při pH 3,2 až 4,2 pri době inkubácie 60 minút až 24 hodin. Je veřmi Vhodné používať pepsín viackrát prekryštalizovaný a pokial to nie je možné, tak aspoň pepsín purifikovaný například na Sephadexe G-50 (Gelotte B., Krantz A. B.: Acta Chem. Scand. 13, 2 127, 1959j. Proteolytické štiepenie sa zastavuje úpravou hodnoty pH na 7,0 až 8,0 a ochladením roztoku na teplotu 0 C až +5 °C. Množstvo krystalického pepsínu sa pohybuje v rozmedzí od 1 až 25 mg na 100 mg neštiepeného gama-globulínu. Optimálně množstvo pepsínu sa pohybuje v množstve 3 až 6 mg na 100 mg gama-gíubulínu. Ku proteolytickému štiepeniu gama-globulínu je možné použit aj pepsín imobilizovaný na pevnom nosiči.The purified gamma-globulin solution thus prepared is clarified, for example, by filtration. Proteolytic cleavage takes place at 37 ° C at pH 3.2 to 4.2 with an incubation time of 60 minutes to 24 hours. It is well desirable to use pepsin recrystallized multiple times and, if this is not possible, at least pepsin purified on, for example, Sephadex G-50 (Gelotte B., Krantz AB: Acta Chem. Scand. 13, 2 127, 1959j). Proteolytic cleavage is stopped by adjusting the value. pH to 7.0 to 8.0 and cooling the solution to 0 ° C to + 5 ° C. The amount of crystalline pepsin ranges from 1 to 25 mg per 100 mg of uncleaved gamma-globulin. Up to 6 mg per 100 mg of gamma-globulin Pepsin immobilized on a solid support can also be used for proteolytic cleavage of gamma-globulin.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou a proteolýzou, vzniknuté fragmenty gama-globulínu s nižšou sedimentačnou konstantou a pepsínom sa od fragmentu F(ab‘]2 separujú pomocou molekulárnych sít s maximálnou hodnotou priepustnosti do molekulárnej hmotnosti 80 000, pričom molekulárna hmotnost fragmentu F(ab‘)2 je 100 000. Separáciu fragmentu F(ab‘]2 od ostatných fragmentov a pepsínov je možné previesť:The proteolytically digested gamma-globulin solution is clarified by, for example, filtration and proteolysis, the resulting gamma-globulin fragments with a lower sedimentation constant and pepsin are separated from the F (ab ') 2 fragment by molecular sieves with a maximum permeability up to 80,000 molecular weight. F (ab ') 2 fragment is 100,000. Separation of F (ab') 2 fragment from other fragments and pepsins can be accomplished by:

A. Gélovou filtráciouA. Gel filtration

B. DialýzouB. Dialysis

C. UitrafiltráciouC. Uitrafiltration

D. DiafiltráciouD. Diafiltration

A.A.

V súčasnosti existuje celá rada komerčných materiálov pre gélovú filtráciu na báze dextránových gélov, pod označením Sephadex, polyakrylamídových gélov, pod označením Biogél, hydroxyalkylmetakrylátových gélov, pod označením Spheron, polystyrénových gélov, pod označením Styrágél, polyvinylacetátových gélov, pod označením Merckogel, poréznych silikátov, pod Označením Porasil, a poréznych skiel pod označením Bioglas, ktoré majú odstupňované velkosti pórov v gélových časticiach a umožňujú gélovú filtráciu v poměrně širokých rozmedziach molekulárnych hmotností.There are currently a variety of commercial dextran gel filtration materials under the designation Sephadex, polyacrylamide gels, under the designation Biogel, hydroxyalkylmethacrylate gels, under the designation Spheron, polystyrene gels, under the designation Styragel, polyvinyl acetate gels, under the name Porasil, and porous glasses under the name Bioglas, which have graduated pore sizes in the gel particles and allow gel filtration over relatively wide molecular weight ranges.

Odstránenie fragmentov s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu sa prevádza elučnou gélovou filtráciou s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogěnnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 °C, pri pH 4.0 až 9,0 š vylučovacou medzou gélu vyjádřenou molěkulárnou hmotnosťou do 80 000, pričom je potřebné uvedené materiály používat v óptimálnom zrnění zaručujúcom prietok v technologických podmienkách.Removal of fragments with a lower sedimentation constant and pepsin is accomplished by elution gel filtration with distilled pyrogen-free water or sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water at a concentration of up to 30 grams per liter at 0 ° C to + 6 ° C, at pH 4.0 to 9 A gel exclusion limit, expressed as a molecular weight of up to 80,000, is required to use the said materials in an δ-optimum grain to guarantee flow through the process conditions.

Do kolony naplnenej s napučaným gólovým materiálom necháváme nasávať proteolýticky naštiepený gama-globulínový roztok takou rýchlostou, aby prietok spodnou plochou kolony sa pohyboval medzi 0,01 ml áž 3,0 ml za mihútu na plochu 1 cm². Množstvo proteolyticky naštiepeného gamia-globulínového roztoku nasadeného na kolónu nemá překročit. 25 až 30 % objemu gélovej časti kolony.Let the proteolytically digested gamma-globulin solution be sucked into the column packed with the swollen goal material at a rate such that the flow through the bottom surface of the column is between 0.01 ml and 3.0 ml per minute for an area of 1 cm ² . The amount of proteolytically cleaved gamma-globulin solution mounted on the column should not exceed. 25 to 30% of the gel column volume.

Pokiat by nedošlo ku dokonalému oddeleniu, je potřebné zmenšit objem vkládaného proteolyticky natrávoného gama-globulínového roztoku na kolonu a spomaliť prietok. Zachytáváme frakciu s molěkulárnou hmotnosťou okolo 100 000, ktorú ďalej spracovávame, pričom ostatně frakcie predstavujú v prevažnej váčšine prípadov odpad.Unless complete separation is required, it is necessary to reduce the volume of the proteolytically loaded gamma-globulin solution loaded onto the column and slow the flow. We collect a fraction with a molecular weight of about 100,000, which we further process, while the fractions are, in most cases, waste.

B.B.

- Dialýza sa v poslednom desafročí znovu začína uplatňovat, najmá pri výrobě liečiv ako technologická metóda separácie tých zmesí prírodných alebo syntetických látok, ktorých molekuly majú rozdielnú hmotnosť.- Dialysis has been re-applied in the last decade, especially in the manufacture of pharmaceuticals as a technological method of separating those mixtures of natural or synthetic substances whose molecules have different masses.

V súčasnosi existuje celá rada komerčných membrán pre dialýzu či už v podobě rovinnej membrány, alebo v poďobe potrubia o menlivom priemere a menlivej velkosti pórov na báze regenerovanej celulózy alebo jej derivátov, připadne na báze kolodia a taktiež na báze vinylových polýmérov.Currently, there are a number of commercial dialysis membranes, either in the form of a planar membrane or in the form of a pipe of varying diameter and pore size based on regenerated cellulose or its derivatives, possibly on a collodium basis and also on a vinyl polymer radius basis.

Sterilný roztok proteolyticky natráveného gama-globulínu sa opatrné přesaje do sterilného dialyzačného potrubia, ktoré sa před zahájením presávanla v sponej časti uzatvorí uzlom a po přesáti sa vrchná časť uzatvorí uzlom so slučkou, za ktorú sa naplněné potrubie zavěsí na háčik, ktorý je umiestnený tak, aby roztok v dialyzačnom potrubí bol v styku s pretekajúcou destilovanou apyrogénnou vodou, alebo s roztokem chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 ^qC až +6 °C, při pH 4,0 až 9,0. Velkost pórov v dialyzačnej membráně by rnala byť tak velká, aby umožnila separáciu fragmentov a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000. Po skončení dialýzy sa dialyzačné potrubie opatrné zve•sí z háčika, opatrné sa vyberie a po rozstrihmutí sa roztok fragmentu F(ab‘)2 preleje do zbejnej pádoby a ďalej sa spracováva.The sterile proteolytically digested gamma-globulin solution is carefully transferred to a sterile dialysis tubing, which is closed with a knot before starting to pass through the clamp and, after sieving, the top is closed with a loop knot, after which the filled tubing hangs on a hook placed the dialysis solution in the pipe engaging a flowing distilled pyrogen-free water, or saline, pyrogen-free distilled water at a concentration of 30 grams per liter at 0 ^q C to + 6 ° C, at a pH of 4.0 to 9.0 . The pore size in the dialysis membrane should be large enough to allow separation of fragments and pepsin to a molecular weight of 80,000. After dialysis, the dialysis tubing is carefully removed from the hook, carefully removed and the F (ab ') fragment is sheared. 2 is poured into the same case and further processed.

C.C.

Separácia fragmentov s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 sa móže uskutočniť aj pomocou ultrafiltrácie, ktorú možno realizovat jednak v poďobe dutých nití, pričom proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu preteká pod tlakom do 800 kPa vo vnútri niťovéj membrány a cez póry v stene nifovej membrány prestupujú pepsín a fragmenty gama-globulínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 do zbernej nádoby.Separation of fragments with a lower sedimentation constant and pepsin to a molecular weight of 80,000 can also be carried out by ultrafiltration, which can be carried out in a hollow yarn fashion, with the proteolytically cleaved gamma-globulin solution flowing under pressure up to 800 kPa inside the yarn membrane. in the wall of the nif membrane, pepsin and gamma-globulin fragments transfer to a molecular weight of 80,000 into a collection vessel.

Vzhladom na to, že proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa pri ultrafiltrácii jednak purifikuje a jednak zakoncentrováva prevedierne opiitovné nariedenie s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě v koncentrácii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a narieďovanie na póvodný objem, prevádzame dovtedy, pokiat sú v roztoku proteolyticky natráveného gama-globulínu přítomné bielkoviny s molekulárnou hmotnosťou do 80 000.Because the proteolytically digested gamma-globulin solution is ultrafiltrated and purified by ultrafiltration, it is predominantly reconstituted with distilled pyrogen-free water or sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water at a concentration of up to 30 grams per liter and such a concentration dilution to the original volume is carried out until proteins of molecular weight up to 80,000 are present in the proteolytically digested gamma-globulin solution.

Ultrafiltráciu je možno realizovat aj v poďobe kazetového systému, kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána, alebo doska z umelej hmoty s definovanými vefkosťami pórov. Proteolyticky na.trávený gama-globulínový roztok pod tlakom do 800 kPa preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány, alebo došky z umelej hmoty prestupujú proteolytické fragmenty gama-globulínu a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 do odpadu. Purifikovaný fragment F(ab‘]2 sa v případe potřeby ďalej spracováva.Ultrafiltration can also be carried out in the form of a cassette system where a replaceable diaphragm or a plastic plate with defined pore sizes is or is in a planar configuration. For example, a proteolytically digested gamma-globulin solution under a pressure of up to 800 kPa flows above the membrane and through pores in the wall of the planar membrane, or thatch of plastic, the proteolytic fragments of gamma-globulin and pepsin transfer to a molecular weight of 80,000. The purified F (ab ‘12) fragment is further processed if necessary.

Sterilizácia ultrafiltračného zariadenia sa prevádza alebo parou, alebo chemickou cestou, například propláchnutím aparatúry vodným roztokom formalínu o koncentrácii do 50 gramov na liter a následným vymytím formalínu sterilnou destilovanou apyrogénnou vodou.Sterilization of the ultrafiltration device is carried out either by steam or by chemical means, for example by rinsing the apparatus with an aqueous solution of formalin at a concentration of up to 50 grams per liter and subsequently washing the formalin with sterile distilled pyrogen-free water.

D.D.

Odstraňovanie fragmentov gama-globulínu s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 je možno, uskutočniť aj pomocou diiafiltrácie, čo je kombinácia dialýzy a ultrafiltrácie.Removal of gamma-globulin fragments with a lower sedimentation constant and pepsin to a molecular weight of 80,000 can also be accomplished by diiafiltration, a combination of dialysis and ultrafiltration.

Diafiltráciu je možné realizovat jednak v podobě dutých nití, pričom proteolyticky naštiepený gama-globulínový roztok preteká pod mierným tlakom do 200 kPa vo vnútri nifovej membrány a cez póry v stene niiovej membrány prestupujú fragmenty a pepsín do z vonkajšej strany pretekajúceho roztoku destilovanej apyrogénnej vody alebo do roztoku chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 ^C’C, pri pH 4.0 až 9,0, ktorý fragmenty a pepsín odplavuje od niťovej membrány do odpadu.Diafiltration can be carried out in the form of hollow threads, where the proteolytically cleaved gamma-globulin solution flows under moderate pressure up to 200 kPa inside the nif membrane and fragments and pepsin pass through the pores in the wall of the nium membrane into the externally flowing solution of distilled apyrogen solution of sodium chloride in distilled pyrogen-free water at a concentration of up to 30 grams per liter at a temperature of 0 ° C to + 6 ^° C, at a pH of 4.0 to 9.0, which washes the fragments and pepsin from the yarn membrane into waste.

Diafiltráciu je možné realizovat aj v podobě kazetového systému, kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána připadne doska z umelej hmoty s definován o z. velkosťou pórov. Proteolyticky našíiepený gama-globulínový roztek pod mierným tlakom do 200 kPa preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány alebo poréznej došky préstupujíí reálne vefmi pomalým prietokom fragmenty gama-globulínu a pepsín do molekulárnej hmotností 80 000 do pretekajúceho roztoku apynogénnej destilovanej vody alebo vodného roztoku chloridu sodného v dsstilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter, ktoré pretekajú například pod doskou alebo membránou a odplavujú fragmenty a pepsín do molekulárnej hmotnosti 80 000 do odpadu.The diafiltration can also be realized in the form of a cassette system, in which in a planar arrangement there is or a replaceable membrane or a plastic plate with a defined z. pore size. Proteolytically grafted gamma-globulin solution under moderate pressure up to 200 kPa flows above the membrane, for example, through pores in the wall of a planar membrane or porous thatch, through very slow flow through fragments of gamma-globulin and pepsin to molecular weight of 80,000 and running water solution. solution of sodium chloride in distilled pyrogen-free water at a concentration of up to 30 grams per liter, which, for example, flow under a plate or membrane and wash away fragments and pepsin to a molecular weight of 80,000 to waste.

Vzhfadom na to, že roztok naštiepeného gama-globulínu sa pri diafiltrácii jednak purifikuje ale aj zakoncentrováva prevedieroe opatovné nariedenie s destilovanou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v desíilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a uariedovanie na póvodný objem prevádzame dovtedy, pokial’ sú v roztoku proteolyticky naštiepeného gama-globulínu přítomné bielkoviny s molekulárnou hmotnesfou do 80 000. Roztok fragmentu F(ab j2 po skončení purifikácie sa preleje do zbernej nádoby a ďalej sa spracováva.Since the cleaved gamma-globulin solution is both purified and concentrated during diafiltration, it is also concentrated to dilute carefully with distilled water or sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water at a concentration of up to 30 grams per liter and concentrating for example to half volume and boiling The original volume is transferred as long as proteins of molecular weight up to 80,000 are present in the proteolytically cleaved gamma-globulin solution. The fragment solution F (ab j2) after the purification is transferred to a collection vessel and further processed.

Sterillzácia diafiltračného zariedenía sa prevádza alebo parou alebo chemickou cestou, například prepláchnutím aparatúry vodným roztokom formalínu o koncentrácii do 50 gramov na liter s následným vymytím formalínu sterilnou destilovanou vodou.Sterilization of the diafiltration device is carried out either by steam or by chemical means, for example by rinsing the apparatus with an aqueous solution of formalin up to 50 grams per liter, followed by washing the formalin with sterile distilled water.

Roztok fragmentu F(ab‘)2 po oddělení pepsínu a fragmentov s molekulárnou hmotnosťou do 80 000 sa sterilizuje například filtráciou alebo inými metodami, potom sa zakoncentrováva například filtráciou alebo pomocou membrán, vakuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami a v prí páde potřeby sa podrobí rozpínaníu ni o jo ďalšiemu spracovaniu.The solution of F (ab ') 2 fragment after separation of pepsin and fragments of molecular weight up to 80,000 is sterilized, for example, by filtration or other methods, then concentrated, for example, by filtration or membranes, vacuum distillation, freeze drying or other methods, and expanded if necessary ni ooo further processing.

Optimálně technologické podmienky sú aritmetickým priemerom udávaných hodnot.Optimal technological conditions are the arithmetic mean of the values given.

Příklad 2Example 2

Východziou surovinou móže byt bielkovinná pasta gama-globulínu alebo bielkoviuný roztok gama-globulínu, ktoré holi izolované pomocou iných metod. Bielkovinná pasta alebo bielkovinný roztok sa spracovávajú v ďalšom postupe podobné ako v příklade č. 1.The starting material may be a gamma-globulin protein paste or a gamma-globulin protein-white solution, which are isolated by other methods. The protein paste or protein solution is processed in a further procedure similar to that of Example 1. First

Claims

A method for separating an F (ab ') 2 fragment from Fab, Fc, Fc' fragments obtained by pepsin cleavage of blood gamma-globulin, characterized in that the proteinaceous material containing purified gamma-globulin is suspended under aseptic conditions, in such a manner a quantity of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C to obtain a protein concentration of between 5 and 180 grams nta liter, subjected to proteolytic digestion with pepsin, separating the F (ab ') 2 fragment. (iab ') 2 is sterilized, for example, by filtration, followed by concentration, for example, by lyophilization or by means of membranes, vacuum distillation, freeze-drying.

2. The method of claim 1, wherein the separation of F (ab ') 2 fragment from Fab, Fc, Fc ' and pepsin fragments to a molecular weight of 80,000 is carried out with distilled water or sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water. 30 grams per liter, at a temperature of 0 C to + 6 ^and ^C C, pH 4.0 and elution .9,0 using the gel filtration and removed the zu dialysis or using a zakoncenírovávanía narieďovania using ultrafiltration and diafiltration.

3. The method of claim 1, wherein the proteolytic digestion with pepsin is carried out at 37 [deg.] C., at a pH of 3.2 to 4.2, at a sodium chloride content of 3.0 to 9.0 grams per liter, at the time of incubation. 80 minutes to 24 hours, using pepsin, preferably crystalline, in a ratio of 1 mg to 25 mg of pepsin per 100 mg of uncleaved starting gamma-globulin, it is also preferable to use pepsin immobilized on a written carrier and stopping proteolytic cleavage by adjusting the pH to 7.0 to 3.0 while c-cooling the solution to 0 ^° C to 5 ^° C.

4. The method according to claim 1, characterized by. gamma-globulin from which the fragment F (nb'j2) is isolated after preteolytic cleavage can be prepared from normal or bimperimum plasma, or normal, retroplacental or hyperimmune serum of humans or animals, with defined anti-bacterial, anti-toxic or anti-toxic or anti-toxic ! weft activity.