CS256705B1 - Method of f(ab)2 fragment separation from f ab, f c,f c fragments obtained by blood gamma-globulin's pepsin-cleavage - Google Patents

Description

9 ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA POPIS VYNALEZU K AUTORSKÉMU 0SVEDČEM1U 256705 (Π) (BIÍ (51) Int. Cl.4 C 12 P 21/08 fiei (22) Přihlášené 17 06 85(21) (PV 4411-85) OftAD PKO VYNÁLEZY (40) Zvere jnené 17 09 87 (45) Vydané 15 11 88 a objevy (75)

Autor vynálezu ŠTĚPÁNEK IVAN ing. CSc., ŠARIŠSKÉ MICHAEANY (54) Sposob separácle F (ab‘)2 fragmentu od fragmentov F ab, F c, Fc‘získaných štiepením krvného gama-globulínu pepsínom 1

Vynález sa týká separácle fragmentuF(ab‘)2 od fragmentov Fab, Fc a Fc‘ získa-ných proteOlytickým štiepením krvného ga-mia-globulínu pepsínom. Gama-globulín mS-že byť připravený z norraálnej alebo hyper-imúnnej plazmy, z normálneho 'alebo retro-placentárneho, připadne hyperimňnneho sé-ra 1’udí 'alebo zvierat. Fragment F(ab‘)2 při-pravený pódia navrhovaného postupu je ur-čený pre diagnostické alebo terapeutickéúčely.

Na precipitáciu gama-globulínu zo zmesiplazmatických alebo sérových bielkovín bolpoužitý síran amonný a hydroxid hlinitý(Schultze Η. E., Matheka H. D.: Bohringwer-ke Mitt. 28, 9, 1945; Schultze Η. E., Scho-nenberger M., Matheka H. D.: Behringwer-ke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol {Hořejší J.,Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956),síran sodný [Amiraian K., Leikhim R. J.: J.Immunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Le-win J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celu-lóza [Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Proč.17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.: J. Am. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L.,Herbertt A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, rok19*59; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, rok1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M.,Audran R.: Rev. Franc. D‘etud. Clin. Biol.14, 1054, 1969), ionty Z· a AI" (Rejnek J., 2 Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun.22, 1489, 1957; Rejnek J., Škvařil F.: Coll.Czechoslov. Chem. Commun. 23, 773, 1958;Krauze R., Naimski K., Ztakrewski K.: ActaBiochim. Pol. 8, 209, 1961), polymetafostát(Nitschman H. S., Rickli R., Kistler P.: VoxSang. 5, 232, 1960), éter (Pennell Η. B. vPutnám F. W.) od (The Plasma proteine volI Academie Press New York 1960, str. 9) aetanol (Cohn E. J., Gurd F. N. R., SurgenorD. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derouaux G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W.F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F.,Schtnid K., UrOma E.: J. Am. Chem. Soc. 72,465, 1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., Al-berty R. A., Williams J. W.: f. Biol. Chem.164, 109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Ric-kert D. A., Cameron J. W., Gross P. M.: J.Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., Kistler P., Lergier W.: Helv. Chim. Octa37, 866, 1954; Kistler P., Nitschman H. S.:Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L., BloomF. C., McCall K. B., Hyndman L. A., Ander-son H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, rok1956).

Preparáty gama-globulínu připravené pó- dia doposiai platných kritérií pre intramus- kulárne podanie majú spravidla dokazatel- ný obsah histamínu, dalej hypotenzívny a antikomplementárny účinok, čo je pre kva- 256705 256705 litu intravenóznych preparátov nepřípustné.

Podanie intramuskulárneho preparátutýchto kvalit intravenózne může v důsledkunáhlého- poklesu krvého tlaku pacienta o-hroziť a v důsledku antikomplementárnehoúčinku oslabit jeho nešpecifickú imúnolo-gickú obranu.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok přiintramuskulárnom podaní nemá taký prie-beh ako pri intravenóznom, možno ho ozna-čit spolu s vysokým antikomplementárnymúčinkom za vlastnosti nežiadúce pre gama--glóbulínové preparáty určené pre terapeu-tické účely.

Znižovanie antikomplementárnej aktivitygama-globulínového roztoku pomocou pro-teolytického štiepenia bolo realizované pep-sínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch.med. Wschr. 87, 1643, 1962) a plazmínom(Sgouris J. T.: Vox Sang. 13, 71, 1967; Ba-randun S., Castel V., Makula M. F., Morell A., Pian R., Škvařil F.: Vox Sang.: 28, 157,1975).

Zpočiatku boli činěné pokusy využit preterapeutické účely zmes všetkých fragmen-tov, vzniklých pri proteolytickom štiepenígama-globulínu spolu s použitým pepsínom,ale od tejto tendencie sa pre výskyt klinic-kých reakcií, najmá po opakovanom podaníupustilo. Fragment F(ab‘)2 purifikoval po-mocou DEAE Sephadexu A-50 (Szégli G., To-rna E., Gartner M.: Arch. Roumaines de Pa-thol. Exper. Microbiologie 22, 792, 1963).

Antikomplementárna aktivita bola testo-vaná na základe úbytku aktivity komplemen-tu. Obytok známej hodnoty aktivity kom-plimentu po přidaní známého množstva roz-toku lyofilizovaného gama-globulínovéhopreparátu ako východzieho preparátu akoa) separovaného fragmentu F(ab‘)2 bol sta-novený metodou podl'a Kabata a Mayera (Ra-bat E. A., Mayer M..M.: Experimentální imu-nochemie ČSAV, Praha 1965, str. 180). Anti-komplementárný účinok fragmentu F(ab‘)2,připraveného pódia navrhovaného postupuvykazoval u 10 experimentálnych šarží zní-ženie o 95 až 98 °/o, v porovnaní s antikom-piementárnym účinkom východzieho gama--globulínu před proteolytickým štiepenímpepsínom.

Hypotenzívny účinok bol testovaný na zá-klade poklesu krvného tlaku králíka pria-mou krvnou metodou podl-a ČSL 3 (ČSL 3,svazok I, vydanie III, Avicenum Praha, 1970,str. 149) s tým, že králíkovi o hmotnosti 2až 3 kg sa aplikujú 2 ml roztoku fragmentuF(ab‘)2 na kg hmotnosti. Obsah bielkovín vaplikovanom roztoku Je 50 gramov na .1 000mililitrov. U preparátov F(ab‘)2 připrave-ných podlá navrhovaného postupu sa hypo-tenzívna aktivita nevyskytovala v tak výraz-né] miere, ako vo východzom gama-globu-líne. Túto skutočnosť je možné dokumento-vat údajom, že z 10 experimentálnych šaržípřipravených podlá předloženého vynálezubol stanovený pokles systolického krvnéhotlaku maximálně o 4 až 8 % v porovnaní s východzím gama-globulínom v tej istej dáv-ke, kde bol stanovený pokles systolickéhokrvného tlaku od 20 do 30 %.

Obsah histamínu bol testovaný Gadumo-vou modifikáciou (G-adum J. H.: J. Physiol.8, 467, 1949) MagnusonoveJ metody (Mag-nus R.: Arch. 102, 123, 1904). U preparátov připravených podlá navrho-vaného postupu sa kontraktácie morčacie-ho čreva nevyskytovali, čo je možné doku-mentovat’ údajom, že z 10 experimentálněpřipravených šarží podl'a předloženého vy-nálezu bolo stanovené 0,0 mikrogramu his-tamínu na 100 gramov fragmentu F(ab‘)a vporovnaní s východzím gama-globulínom,kde bol stanovený obsah histamínu v kon-centrácii 20 až 40 mikrogramov na 100 gra-mov lyofilizovaného gama-globulínu.

Podstatou vynálezu je sposob separácieprotilátkove aktívneho fragmentu označo-vaného ako F(ab‘)2 od pepsínu použitého naproteolytické štiepenie a od ostatných pro-teolytických fragmentov s nižšími hodnota-mi sedimentačných konstant. Separácia saprevádza pomocou molekulárnych sít s ma-ximálnou hodnotou priepustnosti do mole-kulárně] hmotnosti 80 000, pričom moleku-lárna hmotnost fragmentu F(ab‘ )2 je 100 000.Separácia F(ab‘)2 od ostatných fragmentovje možná z toho důvodu, že hodnoty sedi-mentačných konštant ostatných fragmentova pepsínu sú rozdielné a majú tieto nume-rické hodnoty: pepsín 3,3 S (Philpot J. St. L.: Biochem. J.29, 2 458, 1935; Bovey F. A., Yanari S. S.: TheEnzymes 4, 63, 1960; Cunningham L.: Com-prehensive Biochemistry 16, 173, 1965) Fab 3,6 S; Fc 3,7 S; Fc‘ 2,7 S a F[ab‘)2 5,3 S(Škvařil F., Brummelová V.: Coll. Czecho-slov. Chem. Commun. 33, 2 316, 1968; Novot-ný J., Škvařil F.: Goll. Czechoslov. Chem.Commun. 35, 2 472, 1970),

Pepsín na proteolytické štiepenie je mož-né použit či už v podobě roztoku, alsbo na-viazaný na pevný nosič (Antonjan R. K., Ni-kitenko A. A., From A. A.: Probl. Gematol.14, 12, 55, 1971; Valentová O., Turková J.,Lapka R„, Zima j., Coupek J.: Biochim. Bio-phys. Acta 403, 192, 1975). Pokial' používá-me pepsín imobilizovaný na pevnom nosičijeho proteolytická aktivita naviazaním kle-sá přibližné o 50 %. Východziou surovinou může byť gama-glo-bulín z frakcie II izolovanej etanolom me-todou podá Cohna a Oncleya z normálnejalebo hyperimúnnej plazmy, připadne z nor-málneho alebo retroplacentárneho, připadnehyperimúnneho séra l'udí alebo zvierat. Tak-tiež můžu byť použité bielkovinné gama-glo-bulínové preparáty izolované pomocou inýchmetod.

Bielkovinný gama-globulínový materiál,zbavený etanolu a chloroformu, sa rozpúš-ťa alebo narieduje v takom množstve desti-lovanej apyrogénnej vody, aby sa hodnotakoncentrácie bielkovín nachádzala v roz- 256705 6 medzí 5 až 180 gramov na liter. Rozpúšfa-nie sa urýchfuje miešaním. Po rozpuštěnísa gama-globulínový roztok vyčíri napříkladfiltráciou, stanoví sa obsah chloridu sodné-ho a jeho obsah sa upraví na koncentráciu3,0 až 9,0 gramu chloridu sodného na li-ter.

Protec!ytické štiepenie prebieha pri tep-lete 37 °C pri pH 3,2 až 4,2, pri době inku-bácie 60 minút až 24 hodin. Proteolytickéštiepenie sa zastavuje úpravou hodnoty pHna 7,0 až 8 0 a ochladením roztoku na tep-lotu 0 °C až +5 °'C. Množstvo použitého pep-sínu závisí od jeho kvality a pohybuje sav rozmedzí od 1 až po 25 mg na 100 mg ne-štiepeného gama-globulínu. Ku proteolytic-kému štiepeniu je možné použit aj pepsínimobilizovaný na pevnom nosiči.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-glo-bulínu sa vyčíri například filtráciou a frag-menty s nižšou sedimentačnou konstantousa od fragmentu F(ab‘)2 spolu s pepsínomseparujú, například gélovou filtráciou, dia-lýzou, ultrafiltráciou alebo diafiltráciou po-močen eiúcie alebo narieďovania s destilo-vanou vodou alebo s vodným roztokem chlo-ridu sodného o koncentrácii maximálně do30 gramov na liter, s optimom 3,0 až 9,0 naliter, o teplete 0 °C až +6 CC s hodnotou pHv rozmedzí 4,0 až 9,0. Purifikovaný roztokF(ab‘)2 sa po oddělení pepsínu a fragmen-tov s nižšou sedimentačnou konstantou domolekulárnej hmotnosti 80 000 sterilizujenapříklad filtráciou, alebo pomocou inýchmetod, a potom sa zakoncentrováva napří-klad lyofilizáciou alebo pomocou membrán,vákuovou destiláciou, vymrazovaním aleboinými metodami a v případe potřeby sa po-drobí čřalšiemu spracovaniu.

Vynález je ďalej objasněný na príkladochprevedenia, ktorýmí jeho rozsah níe je aniobmedzený ani vyčerpaný. Příklady prevedenia Příklad 1 Východziou surovinou može byť lyofilizo-vaná frakcia II, izolovaná metodou podláCohna a Qncleya alebo pasta frakcie II pooddělení etanolu a chloroformu v roztoku.Frakcia II može byť izolovaná z normálnejalebo hyperimůnnej plazmy, připadne z nor-málneho alebo retroplacentárneho, připadnehyperimúnnebo séra 1’udí alebo zvierat s de-finovanou antibakteriálnou alebo antitoxic-kou, připadne antivirovou protilátkovou ak-tivitou.

Bielkovinný gama-globulínový materiál sarozpásla alebo narieďuje v ta kom množstvedestilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 QCaž +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielko-vín sa nachádzala v rozmedzí 5 až 180 gra-mov na liter, s optimom 20 až 60 gramov naliter. Rozpušťanie sa urýchfuje miešaním.Po rozpuštění sa gama-globulínový roztokvyčíri například filtráciou a stanoví sa ob- sah chloridu sodného a jeho obsah sa upravína koncentráciu 3,0 až 9,0 gramov na literroztoku. V technologických pomeroch sú vyššie u-vedené podmienky spravidla zachované vte-dy, ak rozpúšťame 1 kg gama-globulínovejpasty v 3 000 mg destilovanej apyrogénnejvodě o teplote 0 °C až +6 °C. Hodnota pHgama-globulínového roztoku bývá spravidlav rozmedzí 4,0 až 9,0 a koncentrácia bielko-vin v rozmedzí 20 až 60 gramov na liter.

Takto připravený roztok purifikovanéhogama-globulínu sa vyčíri například filtrá-ciou. Proteolytické štiepenie prebieha priteplote 37 °C při pH 3,2 až 4,2 pri době in-kubácie 60 minút až 24 hodin. Je veřmi Vhod-né používať pepsín viackrát prekryštalizo-vaný a pokial to nie je možné, tak aspoňpepsín purifikovaný například na Sephade-xe G-50 (Gelotte B., Krantz A. B.: Acta Chem.Scand. 13, 2 127, 1959j. Proteolytické štie-penie sa zastavuje úpravou hodnoty pH na7,0 až 8,0 a ochladením roztoku na teplotu0 "C až +5 °C. Množstvo krystalického pepsí-nu sa pohybuje v rozmedzí od 1 až 25 mgna 100 mg neštiepeného gama-globulínu. Op-timálně množstvo pepsínu sa pohybuje vmnožstve 3 až 6 mg na 100 mg gama-gíubu-línu. Ku proteolytickému štiepeniu gama--globulínu je možné použit aj pepsín imo-bilizovaný na pevnom nosiči.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-glo-bulínu sa vyčíri například filtráciou a pro-teolýzou, vzniknuté fragmenty gama-globu-línu s nižšou sedimentačnou konstantou apepsínom sa od fragmentu F(ab‘]2 separu-jú pomocou molekulárnych sít s maximál-nou hodnotou priepustnosti do molekulár-nej hmotnosti 80 000, pričom molekulárnahmotnost fragmentu F(ab‘)2 je 100 000. Se-parácin fragmentu F(ab‘]2 od ostatných frag-mentov a pepsínov je možné previesť: A. Gélovou filtráciou B. Dialýzou C. Ultrafiltráciou D. Diafiltráciou A. V súčasnosti existuje celá rada komerč-ných materiálov pre gélovú filtráciu na bá-ze dextránových gélov, pod označením Se-phadex, polyakrylamídových gélov, pod o-značením Biogél, hydroxyalkylmetakryláto-vých gélov, pod označením Spheron, poly-styrénových gélov, pod označením Styrágél,polyvinylacetátových gélov, pod označenímMerckogel, poréznych silikátov, pod Ozna-čením Porasil, a poréznych skiel pod ozna-čením Bioglas, ktoré majú odstupňované vel-kosti pórov v gélových časticiach a umož-ňujú gélovú filtráciu v poměrně širokýchrozmedziach molekulárnych hmotností.

Odstránenie fragmentov s nižšou hodno- tou sedimentačnej konstanty a pepsínu sa 256705 prévádza elučnou gélovou filtráciou s desti-lovanou apyrogénnou vodou alebo s rozto-kom chloridu sodného v destilovanej apy-rogěnnej vodě o koncentrácii do 30 gramovna liter pri teplote 0 °C až +6 °C, při pH 4.0až 9,0 š vylučovacou medzou gélu vyjádře-nou molěkulárnou hmotnosťou do 80 000,pričom je potřebné uvedené materiály po-užívat v óptimálnom zrnění zaručujúcomprietok v technologických podmienkách.

Do kolony naplnenej s napučaným gólo-vým materiálom necháváme nasávat prote-olýticky naštiepený gama-globulínový roztoktakou rýchlosťou, aby prietok spodnou plo-chou kolony sa pohyboval medzi 0,01 mláž 3,0 ml za mihútu na plochu 1 cm2. Množ-stvo proteolyticky naštiepeného gamia-glo-bulínového roztoku nasadeného n,a kolónunemá překročit 25 až 30 % objemu gélovejčasti kolony.

Pokial by nedošlo ku dokonalému oddele-niu, je potřebné zmenšit objem vkládanéhoproteolyticky natráveného gama-globulíno-vého roztoku na kolonu a spomaliť prietok.Zachytáváme frakciu s molěkulárnou hmot-nosťou okolo 100 000, ktorú ďalej spracová-vame, pričom ostatně frakcie predstevujú vprevažnej váčšine prípadov odpad. B. - Dialýza sa v poslednom desatročí znovuzačína uplatňovat, niajmá pri výrobě liečivako technologická metóda separácie týchzmesí prírodných alebo syntetických látok,ktorých molekuly majú rozdielnú hmotnost'. V súčasnosi existuje celá rada komerč-ných membrán pre dialýzu či už v podoběrovinnej membrány, alebo v podobě potru-bia o menlivom priemere a menlivej velkos-ti pórov na báze regenerovanej celulózy a-lebo jej derivátov, připadne na báze kolo-dia a taktiež na báze vlnylových polýmérov.

Sterilný roztok proteolyticky natrávenéhogama-globulínu sa opatrné přesaje do ste-rilného dialyzačného potrubia, ktoré sa předzahájením presávania v sponej časti uza-tvorí uzlom a po přesátí sa vrchná část u-zatvorí uzlom so slučkou, za ktorú sa na-plněné potrubie zavěsí na háčik, ktorý jeumiestnený tak, aby roztok v dialyzačnompotrubí bol v styku s pretekajúcou destilo-vanou apyrogénnou vodou, alebo s rozto-kem chloridu sodného v destilovanej apyro-génnej vodě o koncentrácii do 30 gramovna liter pri teplote 0 qC až +6 °C, při pH4,0 až 9,0. Velkost pórov v dialyzačnej mem-bráně by mala byť tak velká, aby umožni-la separáciu fragmentov a pepsínu do mo-lekulárnej hmotnosti 80 000. Po skončenídialýzy sa dialyzačné potrubie opatrné zve-•sí z háčika, opatrné sa vyberie a po rozstrih-mutí sa roztok fragmentu F(ab‘)2 preleje do zbe.rnej pádoby a ďalej sa spracováva. C.

Separácia fragmentov s nižšou hodnotousedimentačnej konstanty a pepsínu do mo-lekulárnej hmotnosti 80 000 sa móže usku-točniť aj pomocou ultrafiltrácie, ktorú mož-no realizovat jednak v podobě dutých nití,pričom proteolyticky naštiepený roztok ga-ma-globulínu preteká pod tlakom do 800kPa vo vnutri niťovéj membrány a cez pó-ry v stene nifovej membrány prestupujúpepsín a fragmenty gama-globulínu do mo-lekulárnej hmotnosti 80 000 do zbernej ná-doby.

Vzhfadom na to, že proteolyticky naštie-pený roztok gama-globulínu sa pri ultrafilt-rácii jednak purifikuje a jednak zakoncen-trováva prevedierne opětovné nariedenie sdestilovanou apyrogénnou vodou alebo sroztokom chloridu sodného v destilovanejapyrogénnej vodě v koncentrácii do 30 gra-mov na liter a toto zakoncentrovávanie na-příklad na polovičný objem a narieďovaniena póvedný objem, prevádzame dovtedy, po-kial' sú v rozteku proteolyticky natrávenéhogama-globulínu přítomné bielkoviny s mo-lekulárnou hmotnosťou do 80 000.

Ultrafiltráciu je možno realizovat aj v po-době kazetového systému, kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na, alebo doska z umelej hmoty s definova-nými vefkostami pórov. Proteolyticky na.trá-vený gama-globulínový roztok pod tlakomdo 800 kPa preteká například nad membrá-nou a cez póry v stene rovinnej membrány,alebo došky z umelej hmoty prestupujú pro-teolytické fragmenty gama-globulínu a pep-sínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 doodpadu. Purifikovaný fragment F(ab‘]2 sav případe potřeby ďalej spracováva.

Sterilizácia ultrafiltračného zariadenia saprévádza alebo parou, alebo chemickou ces-tou, například propláchnutím aparatúry vod-ným roztokom formalínu o koncentrácii do50 gramov na liter a následným vymytímformalínu sterilnou destilovanou apyrogén-nou vodou. D.

Odstraňovanie fragmentov gama-globulí-nu s nižšou hodnotou sedimentačnej kon-stanty a pepsínu do molekulárnej hmotnos-ti 80 000 je možnoi uskutočniť aj pomocoudiiafiltrácie, čo je kombinácia dialýzy a ultra-filtrácie.

Diafiltráciu je možné realizovat jednak vpodobě dutých nití, pričom proteolyticky na-štiepený gama-globulínový roztok pretekápod mierným tlakom do 200 kPa vo· vnútrinifovej membrány a cez póry v stene nifo-vej membrány prestupujú fragmenty a pep-sín do z vonkajšej strany pretekajúceho roz-toku destilovanej apyrogénnej vody alebo

Claims (4)

10 do roztoku chloridu sodného v destilovanejapyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gra-mov na liter při teplete 0 °C až +6 C’C, připH 4.0 až 9,0, ktorý fragmenty a pepsín od-plavuje od niťovej membrány do odpadu. Diaíiltráciu je možné realizovat aj v po-době kazetového systému, kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na připadne doska z umelej hmoty s defi-nován o z. velkosťou pórov. Proteolyticky na-šíiepený gama-globulínový roztok pod úder-ným tlakom do 200 kPa preteká napříkladnad membránou a cez póry v stene rovin-nej membrány alebo poréznej došky přestu-pují! reálne velmi pomalým prietokom frag-menty gama-globulínu a pepsín do moleku-lárnej hmotnosti 80 000 do pretekajúcehoroztoku apyrogénnej destilovanej vody alebovodného roztoku chloridu sodného v dssti-lovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do30 gramov na liter, ktoré pretekajú napří-klad pod doskou alebo membránou a odpla-vujú fragmenty a pepsín do molekulárnejhmotnosti 80 000 do odpadu. Vzhfadom na to, že roztok naštiepenéhogama-globulínu sa pri diafiltrácii jednak pu-rifikuje ale aj zakoncentrováva prevedieraeopatovné nariedenie s destilovanou vodoualebo s roztokom chloridu sodného v dssti-lovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do30 gramov na liter a toto zakoncentrováva-nie například na polovičný objem a uarie-dovanie na póvodný objem prevádzame do- vtedy, pokial’ sú v roztoku proteolyticky na-štiepeného gama-globulínu přítomné bielko-viny s molekulárnou hmotnesfou do 80 000.Roztok fragmentu F(ab j2 po skončení puri-fikácie sa preleje do zbernej nádoby a ďa-lej sa spracováva. Sterilizácia diafiltračného zariedenía saprevádza alebo parou alebo chemickou ces-tou, například prepláchnutím aparatúry vod-ným roztokom formalínu o koncentrácii do50 gramov na liter s následným vymytímformalínu sterilnou destilovanou vodou. Roztok fragmentu F(ab‘)2 po oddělení pep-sínu a fragmentov s molekulárnou hmotnos-ťou do 80 000 sa sterilizuje například filtrá-ciou alebo inými metodami, potom sa zakon-centrováva například filtráciou alebo po-mocou membrán, vakuovou destiláciou, vy-mrazovaním alebo inými metodami a v prí-páde petreby sa podrobí rczplneniu nickoďalšiemu spracovaniu. Optimálně technologické podmienky súaritmetickým priemerom udávaných hodnot. Příklad 2 Východziou surovinou móže by!' bielko-vinná pasta gama-globulínu alebo bielkoviu-ný roztok gama-globulínu, které bolí izo-lované pomocou iných metod. Bielkovinnápasta alebo bielkovinný roztok sa spracová-vajú v ďalšom postupe podobné oko v pří-klade č. 1. PREDMET

1. Sposob separácie F(ab‘j2 fragmentu odfragmentov Fab, Fc, Fc' získaných štiepením krvného gama-globulínu pepsínom, vy-značujúci sa tým, že bielkovinný materiál ob-sahu júci purifikovaný gama-globulín sa sus-penduje za aseptických podmienok, v takommnoížstve destilovanej apyrogénnej vodě oteplote 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncen-trácie bielkovín bola v rozmedzí 5 až 180gramov nta liter, podrobí sa proteolytickémuštiepeniu pepsínom, prevedie sa separáciafragmentu F(ab‘)2. pricom roztok fragmen-tu F(iab‘)2 sa sterilizuje například filtráciou,následné sa zakoncentrováva například lyo-filizóciou alebo pomocou membrán, vákuo-vou dastiláciou, vymrazením.

2. Sposob podta bodu 1, vyznačujúci satým, že separácia fragmentu F(ab‘ ]2 odfragmentov Fab, Fc, Fc‘ a pepsínu. do mo-lekulárnej hmotnosti 80 000 sa prevádza po-mocou destilovanej vody alebo roztokomchloridu sodného v destilovanej apyrogén-nej vodě o koncentrácii do 30 gramov na li-ter, pri teplote 0 aC až +6 CC, pri pI-J 4,0 až.9,0 za použitia elúcie pri gélovej filtrácii a vynAle zu dialýze alebo pri použití zakoncenírováva-nia ia narieďovania pri použití ultrafiltráciea diafiltrácie.

3. Sposob podlá bodu 1, vyznačujúci satým, že proteolytické štiepenie pepsínom pre-bieha pri teplote 37 °C, pri pH 3,2 až 4,2, priobsahu chloridu sodného 3,0 až 9,0 gramuna liter, pri době inkubácie 80 minut až 24hodin, za použitia pepsínu, s výhodou krys-talického, v pomere 1 mg až 25 mg pepsí-nu na 100 mg neštiepeného východiskovéhogama-globulínu, pricom je výhodné použitaj pepsín imobilizovaný na psvncm nosiči azastavenje proteolytického šíiepenia sa pre-vádza úpravou hodnoty pH na 7,0 až 3,0 příc-chladení roztoku na teplotu 0 CC až ú 5 G.

4. Sposob podlá bodu 1, vyznačujúci sa.tým, že gama-globulín, z kterého sa po pro-teolytickom štiepeuí izoluje fragment F(ab‘)2móže byt připravený z normólnej alebo bv-perimúnaej plazmy, připadne normálneho,retroplacentárneho alebo hyperimúnnéhoséra l'udí alebo zvierat, s definovanou aníi-bakteriálnou, antitoxickou alebo antivirovouproti!útkovou aktivitou.