CS256705B1 - Sposob separácie F (ab‘)2 fragmentu od fragmentov F ab, F c, Fc‘ získaných štiepením krvného gama globulínu pepsínom - Google Patents

Description

Vynález sa týká separácie fragmentu F(ab‘)2 od fragmentov Fab, Fc a Fc‘ získaných proteblytickým štiepením krvného gama-globulínu pepsínom. Gama-globulín mSže byť připravený z norraálnej alebo hyperimúnnej plazmy, z normálneho 'alebo retroplacentárneho, připadne hyperimňnneho séra 1’udí 'alebo zvlerat. Fragment F(ab‘)2 připravený pódia navrhovaného postupu je určený pre diagnostické alebo terapeutické účely.

Ma precipitáciu gama-globulínu zo zmesi plazmatických alebo sérových bielkovín bol použitý síran amonný a hydroxid hlinitý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Bohriugwerke Mitt. 28, 9, 1945; Schultze Η. E., Schonenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol (Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K., Leikhim R. J.: J. Immunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Lewin J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Pnoc. 17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.:

J. Am. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L., Herbertt A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, rok 19*59; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, rok 1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D‘etud. Clin. Biol. 14, 1054, 1969), ionty Z· a AI (Rejnek J.,

Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1489, 1957; Rejnek J., Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 23, 773, 1958; Krauze R., Naimski K., Ztakrewski K.: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961), polymetafostát (Nitschman H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960), éter (Pennell Η. B. v Putnám F. W.) od (The Plasma proteine vol I Academie Press New York 1960, str. 9) a etanol (Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derouaux

G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F., Schmid K., UrOma E.: J. Am. Chem. Soc. 72, 465, 1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., Alberty R. A., Williams J. W.: f. Biol. Chem. 164, 109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M.: J. Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., Kistler P., Lergier W.: Helv. Chim. Octa 37, 866, 1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L., Bloom F. C., McCall Κ. B., Hyndman L. A., Anderson H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, rok 1956).

Preparáty gama-globulínu připravené pódia doposial platných kritérií pre intramuskulárne podanie majú spravidla dokazatelný obsah histamínu, dalej hypotenzívny a antikomplementárny účinok, čo je pre kva256705 litu intravenóznych preparátov nepřípustné.

Podanie intramuskulárneho preparátu týchto kvalit intravenózne može v důsledku náhlého- poklesu krvého tlaku pacienta ohroziť a v důsledku antikomplementárneho účinku oslabit jeho nešpecifickú imúnologickú obranu.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok pri intramuskulárnom podaní nemá taký priebeh ako pri intravenóznom, možno ho označit spolu s vysokým antikomplementárnym účinkom za vlastnosti nežiadúce pre gama-glóbulínové preparáty určené pre terapeutické účely.

Znižovanie antikomplementárnej aktivity gama-globulínového roztoku pomocou proteolytického štiepenia bolo realizované pepsínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch. med. Wschr. 87, 1643, 1962) a plazmínom (Sgouris J. T.: Vox Sang. 13, 71, 1967; Barandun S., Castel V., Makula M. F., Morell

A., Pian R., Škvařil F.: Vox Sang.: 28, 157, 1975).

Zpočiatku boli činěné pokusy využit pre terapeutické účely zmes všetkých fragmentov, vzniklých pri proteolytickom štiepení gama-globulínu spolu s použitým pepsínom, ale od tejto tendencie sa pre výskyt klinických reakcií, najma po opakovanom podaní upustilo. Fragment F(ab‘)2 purifikoval pomocou DEAE Sephadexu A-50 (Szégli G., Torna E., Gartner M.: Arch. Roumaines de Pathol. Exper. Microbiologie 22, 792, 1963).

Antikomplementárna aktivita bola testovaná na základe úbytku aktivity komplementu. Obytok známej hodnoty aktivity komplimentu po přidaní známého množstva roztoku lyofilizovaného gama-globulínového preparátu ako východzieho preparátu ako aj separovaného fragmentu F(ab‘)2 bol stanovený metodou podl'a Kabata a Mayera (Rabat E. A., Mayer M..M.: Experimentální ímunochemie ČSAV, Praha 1965, str. 180). Antikomplementárný účinok fragmentu F(ab‘)2, připraveného pódia navrhovaného postupu vykazoval u 10 experimentálnych šarží zníženie o 95 až 98 °/o, v porovnaní s antikompiementárnym účinkom východzieho gama-globulínu před proteolytickým štiepením pepsínom.

Hypotenzívny účinok bol testovaný na základe poklesu krvného tlaku králíka priamou krvnou metodou podl-a ČSL 3 (ČSL 3, svazok I, vydanie III, Avlcenum Praha, 1970, str. 149) s tým, že králíkovi o hmotnosti 2 až 3 kg sa aplikujú 2 ml roztoku fragmentu F(ab‘)2 na kg hmotnosti. Obsah bielkovín v aplikovanom roztoku je 50 gramov na .1 000 mililitrov. U preparátov F(ab‘)2 připravených podlá navrhovaného postupu sa hypotenzivna aktivita nevyskytovala v tak výraznej miere, ako vo východzom gama-globulíne. Túto skutočnosť je možné dokumentovat údajom, že z 10 experimentálnych šarží připravených podlá předloženého vynálezu bol stanovený pokles systolického krvného tlaku maximálně o 4 až 8 % v porovnaní s východzím gama-globulínom v tej istej dávke, kde bol stanovený pokles systolického krvného tlaku od 20 do 30 %.

Obsah histamínu bol testovaný Gadumovou modifikáciou (G-adum J. H.: J. Physiol. 8, 467, 1949] Magnusonovej metódy (Magnus R.: Arch. 102, 123, 1904).

U preparátov připravených podlá navrhovaného postupu sa kontraktácie morčacieho čreva nevyskytovali, čo je možné dokumentovat’ údajom, že z 10 experimentálně připravených šarží podlá předloženého vynálezu bolo stanovené 0,0 míkrogramu histamínu na 100 gramov fragmentu F(ab‘)2 v porovnaní s východzím gama-globulínom, kde bol stanovený obsah histamínu v koncentrácii 20 až 40 mikrogramov na 100 gramov. lyofilizovaného gama-globulínu.

Podstatou vynálezu je sposob separácie protilátkove aktivneho fragmentu označovaného ako F(ab‘)2 od pepsínu použitého na proteolytické štiepenie a od ostatných proteolytických fragmentov s nižšími hodnotami sedimentačných konštant. Separácia sa prevádza pomocou molekulárnych sít s maximálnou hodnotou priepustnosti do molekulárně] hmotnosti 80 000, pričom molekulárna hmotnost fragmentu F(ab‘ )2 je 100 000. Separácia F(ab‘)2 od ostatných fragmentov je možná z toho důvodu, že hodnoty sedimentačných konštant ostatných fragmentov a pepsínu sú rozdielné a majú tieto numerické hodnoty:

pepsín 3,3 S (Philpot J. St. L.: Biochem. j. 29, 2 458, 1935; Bovey F. A., Yanari S. S.: The Enzymes 4, 63, 1960; Cunningham L.: Comprehensive Biochemistry 16, 173, 1965) Fab 3,6 S; Fc 3,7 S; Fc‘ 2,7 S a F[ab‘)2 5,3 S (Škvařil F., Brummelová V.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 33, 2 316, 1968; Novotný J., Škvařil F.: Goll. Czechoslov. Chem. Commun. 35, 2 472, 1970),

Pepsín na proteolytické štiepenie je možné použiť či už v podobě roztoku, alebo naviazaný na pevný nosič (Antonjan R. K., Nikitenko A. A., From A. A.: Probl. Gematol. 14, 12, 55, 1971; Valentová O., Turková J., Lapka R„, Zima j., Coupek J.: Biochim. Biophys. Acta 403, 192, 1975). Pokial' používáme pepsín imobilizovaný na pevnom nosiči jeho proteolytická aktivita naviazaním klesá přibližné o 50 %.

Východziou surovinou může byť gama-globulín z frakcie II izolovanej etanolom metodou podá Cohna a Oncleya z normálnej alebo hyperimúnnej plazmy, připadne z normálneho alebo retroplacentárneho, připadne hyperimúnneho séra 1'udí alebo zvierat. Taktiež můžu byť použité bielkovinné gama-globulínové preparáty izolované pomocou iných metod.

Bielkovinný gama-globulínový materiál, zbavený etanolu a chloroformu, sa rozpúšťa alebo nariecfuje v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody, aby sa hodnota koncentrácie bielkovín nachádzala v roz6

236705 medzi 5 až 180 gramov na liter. Rozpúšfanie sa urýchfuje miešaním. Po rozpuštění sa gama-globulínový roztok vyčíri například filtráciou, stanoví sa obsah chloridu sodného a jeho obsah sa upraví na koňcentráciu 3,0 až 9,0 gramu chloridu sodného na liter.

Proteolytické štiepenie prebieha pri teplete 37 °C pri pH 3,2 až 4,2, pri době inkubácie 60 minút až 24 hodin. Proteolytické štiepenie sa zastavuje úpravou hodnoty pH na 7,0 až 8 0 a ochladením roztoku na teplotu 0 °C až +5 °'C. Množstvo použitého pepsínu závisí od jeho kvality a pohybuje sa v rozmedzí od 1 až po 25 mg na 100 mg neštiepeného gama-globulínu. Ku proteolytickému štiepeniu je možné použit aj pepsín imobílizováný na pevnom nosiči.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou a fragmenty s nižšou sedimentačnou konstantou sa od fragmentu F(ab‘)2 spolu s pepsínom separujú, například gélovou filtráciou, dialýzou, uitrafiltráciou alebo diafiltráciou pomocou eiúcie alebo narieďovania s destilovanou vodou alebo s vodným roztokom chloridu sodného o koncentrácii maximálně do 30 gramov na liter, s optimom 3,0 až 9,0 na liter, o teplote 0 °C až +6 ^CC s hodnotou pH v rozmedzí 4,0 až 9,0. Purifikovaný roztok F(ab‘)2 sa po oddělení pepsínu a fragmentov s nižšou sedimentačnou konstantou do molekulárnej hmotnosti 80 000 sterilizuje například filtráciou, alebo pomocou iných metod, a potom sa zakoncentrováva například lyofilizáciou alebo pomocou membrán, vákuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami a v případe potřeby sa podrobí čřalšiemu spracovaniu.

Vynález je ďalej objasněný na príkladoch prevedenia, ktorými jeho rozsah nie je ani obmedzený ani vyčerpaný.

Příklady prevedenia

Příklad 1

Východziou surovinou može byť lyofilizovaná frakcia II, izolovaná metodou podfa Cohna a Oncleya alebo pasta frakcie II po oddělení etanolu a chloroformu v roztoku. Frakcia II može byť izolovaná z normálnej alebo hyperimúnnej plazmy, připadne z normálneho alebo retroplacentárneho, připadne hyperimúnneho séra 1’udí alebo zvierat s definovanou antibakteriálnou alebo antitoxickou, připadne antivirovou protilátkovou aktivitou.

Rielkovinný gama-globulínový materiál sa rozpúšía alebo narieďuje v ta kom množstve destilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 ^QC až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachádzala v rozmedzí 5 až 180 gramov na liter, s optimom 20 až 60 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urýchfuje miešaním. Po rozpuštění sa gama-globulínový roztok vyčíri například filtráciou a stanoví sa obsah chloridu sodného a jeho obsah sa upraví na koňcentráciu 3,0 až 9,0 gramov na liter roztoku.

V technologických pomeroch sú vyššie uvedené podmienky spravidla zachované vtedy, ak rozpúšťame 1 kg gama-globulínovej pasty v 3 000 mg destilovanej apyrogénnej vodě o teplote 0 °C až +6 °C. Hodnota pH gama-globulínového roztoku bývá spravidla v rozmedzí 4,0 až 9,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí 20 až 60 gramov na liter.

Takto připravený roztok purifikovaného gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou. Proteolytické štiepenie prebieha pri teplote 37 °C při pH 3,2 až 4,2 pri době inkubácie 60 minút až 24 hodin. Je veřmi Vhodné používať pepsín viackrát prekryštalizovaný a pokial to nie je možné, tak aspoň pepsín purifikovaný například na Sephadexe G-50 (Gelotte B., Krantz A. B.: Acta Chem. Scand. 13, 2 127, 1959j. Proteolytické štiepenie sa zastavuje úpravou hodnoty pH na 7,0 až 8,0 a ochladením roztoku na teplotu 0 C až +5 °C. Množstvo krystalického pepsínu sa pohybuje v rozmedzí od 1 až 25 mg na 100 mg neštiepeného gama-globulínu. Optimálně množstvo pepsínu sa pohybuje v množstve 3 až 6 mg na 100 mg gama-gíubulínu. Ku proteolytickému štiepeniu gama-globulínu je možné použit aj pepsín imobilizovaný na pevnom nosiči.

Proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa vyčíri například filtráciou a proteolýzou, vzniknuté fragmenty gama-globulínu s nižšou sedimentačnou konstantou a pepsínom sa od fragmentu F(ab‘]2 separujú pomocou molekulárnych sít s maximálnou hodnotou priepustnosti do molekulárnej hmotnosti 80 000, pričom molekulárna hmotnost fragmentu F(ab‘)2 je 100 000. Separáciu fragmentu F(ab‘]2 od ostatných fragmentov a pepsínov je možné previesť:

A. Gélovou filtráciou

B. Dialýzou

C. Uitrafiltráciou

D. Diafiltráciou

A.

V súčasnosti existuje celá rada komerčných materiálov pre gélovú filtráciu na báze dextránových gélov, pod označením Sephadex, polyakrylamídových gélov, pod označením Biogél, hydroxyalkylmetakrylátových gélov, pod označením Spheron, polystyrénových gélov, pod označením Styrágél, polyvinylacetátových gélov, pod označením Merckogel, poréznych silikátov, pod Označením Porasil, a poréznych skiel pod označením Bioglas, ktoré majú odstupňované velkosti pórov v gélových časticiach a umožňujú gélovú filtráciu v poměrně širokých rozmedziach molekulárnych hmotností.

Odstránenie fragmentov s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu sa prevádza elučnou gélovou filtráciou s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogěnnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 °C, pri pH 4.0 až 9,0 š vylučovacou medzou gélu vyjádřenou molěkulárnou hmotnosťou do 80 000, pričom je potřebné uvedené materiály používat v óptimálnom zrnění zaručujúcom prietok v technologických podmienkách.

Do kolony naplnenej s napučaným gólovým materiálom necháváme nasávať proteolýticky naštiepený gama-globulínový roztok takou rýchlostou, aby prietok spodnou plochou kolony sa pohyboval medzi 0,01 ml áž 3,0 ml za mihútu na plochu 1 cm². Množstvo proteolyticky naštiepeného gamia-globulínového roztoku nasadeného na kolónu nemá překročit. 25 až 30 % objemu gélovej časti kolony.

Pokiat by nedošlo ku dokonalému oddeleniu, je potřebné zmenšit objem vkládaného proteolyticky natrávoného gama-globulínového roztoku na kolonu a spomaliť prietok. Zachytáváme frakciu s molěkulárnou hmotnosťou okolo 100 000, ktorú ďalej spracovávame, pričom ostatně frakcie predstavujú v prevažnej váčšine prípadov odpad.

B.

- Dialýza sa v poslednom desafročí znovu začína uplatňovat, najmá pri výrobě liečiv ako technologická metóda separácie tých zmesí prírodných alebo syntetických látok, ktorých molekuly majú rozdielnú hmotnosť.

V súčasnosi existuje celá rada komerčných membrán pre dialýzu či už v podobě rovinnej membrány, alebo v poďobe potrubia o menlivom priemere a menlivej velkosti pórov na báze regenerovanej celulózy alebo jej derivátov, připadne na báze kolodia a taktiež na báze vinylových polýmérov.

Sterilný roztok proteolyticky natráveného gama-globulínu sa opatrné přesaje do sterilného dialyzačného potrubia, ktoré sa před zahájením presávanla v sponej časti uzatvorí uzlom a po přesáti sa vrchná časť uzatvorí uzlom so slučkou, za ktorú sa naplněné potrubie zavěsí na háčik, ktorý je umiestnený tak, aby roztok v dialyzačnom potrubí bol v styku s pretekajúcou destilovanou apyrogénnou vodou, alebo s roztokem chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 ^qC až +6 °C, při pH 4,0 až 9,0. Velkost pórov v dialyzačnej membráně by rnala byť tak velká, aby umožnila separáciu fragmentov a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000. Po skončení dialýzy sa dialyzačné potrubie opatrné zve•sí z háčika, opatrné sa vyberie a po rozstrihmutí sa roztok fragmentu F(ab‘)2 preleje do zbejnej pádoby a ďalej sa spracováva.

C.

Separácia fragmentov s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 sa móže uskutočniť aj pomocou ultrafiltrácie, ktorú možno realizovat jednak v poďobe dutých nití, pričom proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu preteká pod tlakom do 800 kPa vo vnútri niťovéj membrány a cez póry v stene nifovej membrány prestupujú pepsín a fragmenty gama-globulínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 do zbernej nádoby.

Vzhladom na to, že proteolyticky naštiepený roztok gama-globulínu sa pri ultrafiltrácii jednak purifikuje a jednak zakoncentrováva prevedierne opiitovné nariedenie s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě v koncentrácii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a narieďovanie na póvodný objem, prevádzame dovtedy, pokiat sú v roztoku proteolyticky natráveného gama-globulínu přítomné bielkoviny s molekulárnou hmotnosťou do 80 000.

Ultrafiltráciu je možno realizovat aj v poďobe kazetového systému, kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána, alebo doska z umelej hmoty s definovanými vefkosťami pórov. Proteolyticky na.trávený gama-globulínový roztok pod tlakom do 800 kPa preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány, alebo došky z umelej hmoty prestupujú proteolytické fragmenty gama-globulínu a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 do odpadu. Purifikovaný fragment F(ab‘]2 sa v případe potřeby ďalej spracováva.

Sterilizácia ultrafiltračného zariadenia sa prevádza alebo parou, alebo chemickou cestou, například propláchnutím aparatúry vodným roztokom formalínu o koncentrácii do 50 gramov na liter a následným vymytím formalínu sterilnou destilovanou apyrogénnou vodou.

D.

Odstraňovanie fragmentov gama-globulínu s nižšou hodnotou sedimentačnej konstanty a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 je možno, uskutočniť aj pomocou diiafiltrácie, čo je kombinácia dialýzy a ultrafiltrácie.

Diafiltráciu je možné realizovat jednak v podobě dutých nití, pričom proteolyticky naštiepený gama-globulínový roztok preteká pod mierným tlakom do 200 kPa vo vnútri nifovej membrány a cez póry v stene niiovej membrány prestupujú fragmenty a pepsín do z vonkajšej strany pretekajúceho roztoku destilovanej apyrogénnej vody alebo do roztoku chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 ^C’C, pri pH 4.0 až 9,0, ktorý fragmenty a pepsín odplavuje od niťovej membrány do odpadu.

Diafiltráciu je možné realizovat aj v podobě kazetového systému, kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána připadne doska z umelej hmoty s definován o z. velkosťou pórov. Proteolyticky našíiepený gama-globulínový roztek pod mierným tlakom do 200 kPa preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány alebo poréznej došky préstupujíí reálne vefmi pomalým prietokom fragmenty gama-globulínu a pepsín do molekulárnej hmotností 80 000 do pretekajúceho roztoku apynogénnej destilovanej vody alebo vodného roztoku chloridu sodného v dsstilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter, ktoré pretekajú například pod doskou alebo membránou a odplavujú fragmenty a pepsín do molekulárnej hmotnosti 80 000 do odpadu.

Vzhfadom na to, že roztok naštiepeného gama-globulínu sa pri diafiltrácii jednak purifikuje ale aj zakoncentrováva prevedieroe opatovné nariedenie s destilovanou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v desíilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a uariedovanie na póvodný objem prevádzame dovtedy, pokial’ sú v roztoku proteolyticky naštiepeného gama-globulínu přítomné bielkoviny s molekulárnou hmotnesfou do 80 000. Roztok fragmentu F(ab j2 po skončení purifikácie sa preleje do zbernej nádoby a ďalej sa spracováva.

Sterillzácia diafiltračného zariedenía sa prevádza alebo parou alebo chemickou cestou, například prepláchnutím aparatúry vodným roztokom formalínu o koncentrácii do 50 gramov na liter s následným vymytím formalínu sterilnou destilovanou vodou.

Roztok fragmentu F(ab‘)2 po oddělení pepsínu a fragmentov s molekulárnou hmotnosťou do 80 000 sa sterilizuje například filtráciou alebo inými metodami, potom sa zakoncentrováva například filtráciou alebo pomocou membrán, vakuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami a v prí páde potřeby sa podrobí rozpínaníu ni o jo ďalšiemu spracovaniu.

Optimálně technologické podmienky sú aritmetickým priemerom udávaných hodnot.

Příklad 2

Východziou surovinou móže byt bielkovinná pasta gama-globulínu alebo bielkoviuný roztok gama-globulínu, ktoré holi izolované pomocou iných metod. Bielkovinná pasta alebo bielkovinný roztok sa spracovávajú v ďalšom postupe podobné ako v příklade č. 1.

Claims (4)

1. Sposob separácie F(ab‘}2 fragmentu od fragmentov Fab, Fc, Fc' získaných šiiepe ním krvného gama-globulínu pepsínom, vyznačujúci sa tým, že bielkovinný materiál obsahu júci purif ikovaný gama-globulín sa suspenduje za aseptických podmienok, v takom množstve destilovanej apyrogénnej vodě o teplote 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín bola v rozmedzí 5 až 180 gramov nta liter, podrobí sa proteolytickému štiepeniu pepsínom, prevedie sa separácia fragmentu F(ab‘)2. pričom roztok fragmentu F(iab‘)2 sa sterilizuje například filtráciou, následné sa zakoncentrováva například lyofilizóciou alebo pomocou membrán, vákuovou dastiláciou, vymrazením.

2. Spósob podfa bodu 1, vyznačujúci sa tým, že separácia fragmentu F(ab‘]2 od fragmentov Fab, Fc, Fc‘ a pepsínu do molekulárnej hmotnosti 80 000 sa prevádza pomocou destilovanej vody alebo roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter, pri teplote 0 ^aC až +6 ^CC, pri pH 4,0 až .9,0 za použitia elúcie pri gélovej filtrácii a vynAle z u dialýze alebo pri použití zakoncenírovávanía a narieďovania pri použití ultrafiltrácie a diafiltrácie.

3. Sposob podfa bodu 1, vyznačujúci sa tým, že proteolytické štiepenie pepsínom prebieha pri teplote 37 °C, pri pH 3,2 až 4,2, pri obsahu chloridu sodného 3,0 až 9,0 gramu na liter, pri době inkubácie 80 minút až 24 hodin, za použitia pepsínu, s výhodou krystalického, v pomere 1 mg až 25 mg pepsínu na 100 mg neštiepeného východiskového gama-globulínu, pričom je výhodné použit aj pepsín imobillzovaný na psvncm nosiči a zastaveníe proteolytického šíiepenia sa prevádza úpravou hodnoty pH na 7,0 až 3,0 při c-chladení roztoku na teplotu 0 ^CC až ú 5 G.

4. Spósob podlá bodu 1, vyznačujúci sa. tým, že gama-globulín, z kterého sa po preteolytickom štiepení izoluje fragment F(nb‘j2 može byt připravený z normólnej alebo bvperimúnnej plazmy, připadne normálneho, retroplacentárneho alebo hyperimúnného séra l'udí alebo zvierat, s definovanou aníibakteriálnou, antitoxickou alebo antivirovou proti!útkovou aktivitou.