CN114249812A - 一种降低vWF制品中IgM含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种降低vWF制品中IgM含量的方法和采用该方法制备vWF冻干制剂的方法以及制得的vWF冻干制剂，属于血液制品领域，该方法包括使血浆及其衍生物通过包含多孔球状核心以及多孔惰性壳层的复合模式色谱树脂的层析柱，收集通过层析柱而没有与所述复合模式色谱树脂结合的含有vWF的流穿液；所述复合模式色谱树脂的多孔惰性壳层的排阻分子量为400‑700kDa。通过本发明公开的方法分离纯化vWF，能明显降低所得vWF样品中的IgM含量，且IgM去除效果明显优于现有Capto heparin、Q‑Sepharose层析方法，因此通过本发明公开的方法得到的vWF制品临床安全性更高。

Description

一种降低vWF制品中IgM含量的方法

技术领域

本发明涉及血液制品领域，具体涉及一种降低vWF制品中IgM含量的方法和采用该方法制备vWF冻干制剂的方法以及制得的vWF冻干制剂。

背景技术

血管性血友病因子(vWF，von Willebrand Factor)，是一种多聚体糖蛋白，单体分子量约为250千道尔顿(kD)，多聚体分子量为500～20000kD，是目前血浆中已知的分子量最大的蛋白。vWF单体分子在体内合成后，经多聚化形成一系列大小不等的多聚体，最大可包含1000个单体分子，其多聚化程度对于维持正常的生物学活性具有重要意义。vWF主要有2个功能，首先，它与凝血因子Ⅷ(FⅧ)非共价结合，防止其被蛋白C和凝血因子Xa激活，使FⅧ稳定而不易被降解，同时也是FⅧ的运输载体；其次，血浆vWF在原发性止血中起着重要作用，负责血小板与受损伤血管表面的黏附，由此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白凝固的形成。

vWF制剂分为两种，一种是vWF/FⅧ复合物，另一种是高纯的vWF制剂。欧美发达国家vWD的日常治疗中，约占75％的I型患者首选DDAVP(1-脱氨基-8-D-精氨酸血管加压素)进行治疗，治疗无效的使用vWF制剂；约占25％的Ⅱ型和Ⅲ型患者主要使用vWF制剂。I型和Ⅱ型的vWD患者(占95％)按需治疗，即只有在患者发病出血的时候才需要注射药物，通常临床使用的药物是vWF/FⅧ复合物。Ⅲ型的vWD患者(占5％)需要进行预防治疗，即定期注射，通常临床使用的药物是高纯的vWF制剂。血液来源的vWF/FⅧ复合物其全球药品供应商仅有Grifols、CSL、Octapharma和Bio Products Laboratory 4家，血液来源的高纯vWF制剂，目前市场上仅有LFB公司生产的

这一种高纯vWF制剂，因此亟需开发其他同类药品以解决治疗vWD用药品的可及性问题。

血液制品不同于一般药物，生产原料是健康人血浆，因此各大血液制品企业主要的研究方向为如何从原料血浆中尽可能地提取更多的血浆蛋白以提高血浆的综合利用率。因此从FⅧ生产废料中纯化vWF具有重要的经济价值，有利于提高血浆综合利用率，节约珍贵的血浆资源。

血浆中的大多数FⅧ与vWF以复合物形式存在，因此这两种蛋白质通常是共纯化的，从血浆及其衍生物中分离FⅧ或vWF非常困难。FⅧ或vWF通常以冷沉淀为原料，经过凝胶吸附和层析分离得到。由于部分vWF与FⅧ形成复合物并随着FⅧ的分离而被分离，FⅧ生产废料中的vWF含量大幅降低，而杂蛋白由于层析过程而富集，因此与从冷沉淀中分离纯化vWF相比，从FⅧ生产废料中纯化vWF难度更大。

专利US5760183报道了以FⅧ生产废料为原料，纯化vWF的工艺，具体包括：冷沉淀→氢氧化铝凝胶吸附→FⅧ的粗溶液→阴离子交换层析→FⅧ生产废料→Q-Sepharose。该专利公开的从FⅧ生产废料中纯化vWF的工艺再现性好，可在工业规模级别放大，生产成本低，但是该工艺无法有效去除vWF中的IgA和IgM，而IgM和IgA是vWF制剂中常见的杂蛋白，尤其是IgM杂蛋白，严重影响vWF制剂的临床安全性。

IgM是迄今为止实际发现的在人体循环系统中的最大抗体，IgM的分子量约900kDa，是一个五聚体。IgM具有强大的激活补体和凝集作用，也参与某些自身免疫病及超敏反应的病理过程，其凝集作用比IgG高500-1000倍。因此含有较多IgM的vWF产品可能会引起补体系统的异常激活和异常的凝集反应。高强度的凝集反应有可能进一步的引发溶血风险，而补体系统的异常激活，不仅会消耗大量补体成分，使机体抗感染能力下降，而且在激活过程中产生的大量衍生物活性物质，会使机体发生剧烈的炎症反应或造成组织损伤，引起病理过程。肾脏是补体异常活化最易受累的器官之一，多种肾小球肾炎可见异常补体活化证据，包括狼疮肾炎、急性链球菌感染后肾炎(APSGN)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、膜性肾病和IgA肾病等(补体异常活化与肾脏疾病，2011，第十届全国免疫学学术大会，北京大学第一医院肾内科，赵明辉)。

因此降低vWF产品中的IgM含量可以避免由于补体系统的异常激活引起的副作用。研究表明，血清中IgM和vWF之间会形成复杂的复合物，因此vWF与IgM难以分离，vWF制剂中IgM难去除(Mechanisms underlying acquired von Willebrand syndrome associatedwith an IgMparaprotein.European journal of clinical investigation.2009，39.833-6.)。

制备vWF制剂的另一个常见问题是vWF的活性降低，vWF活性回收率不高。有文献报道，从冷沉淀通过三步层析过程制备高纯vWF的活性回收率仅为40％(应用层析法从冷沉淀制备一种治疗用高纯vWF浓缩物.国际输血及血液学杂志[J]，1992(04):37.)。而CN109705208A报道的从“冷沉淀→Sephadex A50凝胶→S/D病毒灭活→弱阴离子交换→提取凝血因子Ⅷ之后的废料→低电负性明胶”的单步层析法制备高纯度血管性血友病因子的工艺，vWF的活性回收率在51％-83％，vWF活性回收率有提高，但是无法去除其中的IgA和IgM。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的上述技术问题。为此，本发明提出了一种降低vWF制品中IgM含量的方法和采用该方法制备vWF冻干制剂的方法及制得的vWF冻干制剂以及所采用凝胶在去除vWF制品中残留IgM的应用；该方法可有效去除血浆及其衍生物中、尤其是凝血因子Ⅷ生产废料中的IgM相关物质且vWF活性回收率高，从而在提高vWF制品临床安全性的同时，有利于提高血浆综合利用率，具有重要的经济价值。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

Capto Core 700、Capto Core 400凝胶是含多孔球状核心以及多孔惰性壳层的复合模式色谱树脂。这种复合模式色谱树脂含有的多孔惰性壳层，其上分布有能够容纳小于400kDa或小于700kDa分子通过的通道，而大于400kDa或大于700kDa的分子则直接发生流穿；内层为多孔球状核心，对于通过孔道进入内层的分子实现吸附。血浆中的vWF活性由vWF的多聚体产生，分子量约500kDa～20000kDa，IgM的分子量约900kDa，IgA的分子量约160kDa，在采用含有上述色谱树脂的层析柱纯化多聚化的vWF的过程中，按上述原理预测，IgM将与多聚化的vWF一起发生流穿，IgA则通过惰性壳层的孔道进入内层多孔球状核心发生吸附，从而实现vWF与IgA的分离。实际研究结果发现，这种复合模式结构的层析介质对IgM有预想不到的分离效果，能明显降低所得vWF多聚体中的IgM含量，单步层析的IgM去除率约50％。

为此，在本发明的一方面，本发明提供一种降低vWF制品中IgM含量的方法，该方法包括使血浆及其衍生物通过包含多孔球状核心以及多孔惰性壳层的复合模式色谱树脂的层析柱，收集通过层析柱而没有与所述复合模式色谱树脂结合的含有vWF的流穿液；所述复合模式色谱树脂的多孔惰性壳层的排阻分子量为400-700kDa。

优选地，多孔球状核心内包含有辛胺配基。辛胺配基兼具疏水作用和离子交换作用，对通过孔道进入内层的分子比如IgA、人血白蛋白等残留血浆蛋白实现吸附。

在一种实施方式中，所述复合模式色谱树脂为Capto Core 700和/或Capto Core400凝胶。

在一种实施方式中，所述复合模式色谱树脂优选Capto Core 700凝胶。

根据本发明的实施例，所述血浆及其衍生物为凝血因子FⅧ生产废料，所述凝血因子Ⅷ生产废料选自：以血浆冷沉淀为原料通过离子交换层析分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的层析洗涤液，和/或以血浆冷沉淀为原料通过PEG沉淀分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的上清液。

根据本发明的实施例，所述血浆及其衍生物为血浆冷沉淀的溶解物及其纯化vWF的中间品。

进一步地，所述方法还包括使用平衡液冲洗所述复合模式色谱树脂层析柱，所述平衡液中包含5-10mM钙离子；通过所述复合模式色谱树脂层析柱的血浆及其衍生物含有5-10mM钙离子。

根据本发明实施例，所述平衡液和/或血浆及其衍生物含有80-130mMα-氨基乙酸。

根据本发明的具体实施例，以血浆冷沉淀为原料通过离子交换层析分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的层析洗涤液为原料，通过上述层析方法所得的含有vWF的流穿液，其FⅧ/vWF:CB效价比值、IgA含量和IgM含量明显降低；vWF:CB活性收率高，超过97％。而当α-氨基乙酸和/或钙离子浓度不在此范围内时，vWF:CB的活性收率会从97％左右降至70％左右，IgM的去除率从50％左右降至30％左右。因此当α-氨基乙酸的浓度在80-130mM范围内并且氯化钙浓度在2.5-5.5mM的范围内时，有利于提高层析流穿液中的vWF:CB的活性收率，增加IgM的去除率。

在本发明的另一方面，本发明提供复合模式色谱树脂为Capto Core 700和/或Capto Core400凝胶在去除vWF制品中残留IgM的应用。

根据本发明实施例，复合模式色谱树脂Capto Core 700或Capto Core 400凝胶或Capto Core 700与Capto Core 400的混合物可用于去除vWF制品中的残留IgM，进一步用于制备低IgM含量的vWF制品。

在本发明的再一方面，本发明提供一种制备vWF冻干制剂的方法，采用上述方法制备含有vWF的流穿液经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装、冻干，得到vWF冻干制剂。

根据本发明的实施例，按物质的量浓度或质量体积比计，所述稳定剂的配方为：10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.015-0.03％聚山梨酯80，pH 6.9。采用本发明方法制备得到的vWF冻干制剂复溶后无乳光、无析出物。

在本发明的再一方面，本发明提供一种根据上述方法制得的vWF冻干制剂。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、出乎发明人预料，具有多孔球状核心以及多孔惰性壳层的复合模式色谱树脂，如Capto core 700和Capto core 400凝胶用于分离血浆及其衍生物中vWF多聚体，均能明显降低所得vWF样品中的IgM含量，单步Capto core 700和Capto core 400层析IgM去除率在50％左右。根据本发明实施例，本发明公开的从FⅧ生产废料中分离纯化vWF的方法，IgM的去除率在50％以上，明显优于本领域常用去除IgM的Capto heparin(IgM去除率：13.4％)和Q-Sepharose层析(IgM去除率：23.2％)方法；同时本发明公开的方法层析后所得vWF中IgA含量低于0.285mg/L。因此，通过本发明公开的方法制得的vWF制品临床安全性更高。

2、在实现所得vWF样品FⅧ/vWF:CB低效价比的同时，本发明公开的单步Captocore 700或Capto core 400层析法vWF活性回收率高。尤其是当选用Capto core 700凝胶时，vWF:CB活性收率超过97％，显著高于专利CN109705208A从FⅧ生产废料作为起始原料、经低电负性明胶层析工艺51％-83％的vWF活性收率。

3、进一步研究发现，通过Capto core 700、Capto core 400层析，可进一步制得复溶后无乳光的vWF冻干制剂；经Capto core 700层析，并采用本发明的稳定剂配方，可制得复溶后无乳光、无析出物的vWF冻干制剂。因此在本发明的一种具体实施方式中，优选Captocore 700凝胶从血浆及其衍生物中分离纯化vWF。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在具体实施方式中，本发明所述“血浆及其衍生物”可以是血浆冷沉淀的溶解物及其纯化vWF的中间品。

进一步地，可以是血浆冷沉淀的溶解物经Al(OH)₃或DEAE SephadexA-50凝胶吸附，取上清液进行S/D病毒灭活后的中间品；在一种具体的实施方式中，血浆冷沉淀的溶解物凝胶吸附前，还包括pH预沉淀步骤，在一种具体的实施方式中，pH预沉淀步骤还可以在S/D病毒灭活前进行。

进一步地，可以是血浆冷沉淀的溶解物经PEG沉淀，取上清液进行S/D病毒灭活后的中间品。在一种具体的实施方式中，S/D病毒灭活后的中间品还可以进行第二次PEG沉淀。

在本发明实施例中，“FⅧ生产废料”等同于“凝血因子Ⅷ生产废料”，其来源包括不限于：以血浆冷沉淀为原料分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的层析洗涤液，和/或以血浆冷沉淀为原料通过PEG沉淀分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的上清液。利用FⅧ生产废料进一步制备高纯的vWF，可实现废料的回收利用，提高血浆利用率。

进一步地，本发明还对FⅧ生产废料的制备方法进行举例，具体可采用如下方法制备所得：

方法1：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经Al(OH)₃或DEAE SephadexA-50凝胶吸附，取上清液进行S/D病毒灭活，阴离子交换层析，层析洗涤液即为FⅧ生产废料。

方法1-1：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，将溶解液通过调节pH进行预沉淀，并滤去沉淀部分，得上清液；经Al(OH)₃或DEAE SephadexA-50凝胶吸附，取上清液进行S/D病毒灭活，阴离子交换层析，层析洗涤液即为FⅧ生产废料。

方法2：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经PEG沉淀，取上清液进行S/D病毒灭活，阴离子交换层析，层析洗涤液即为FⅧ生产废料。

方法3：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经氢氧化铝凝胶吸附，取上清液进行S/D病毒灭活，阴离子交换层析，疏水柱层析，层析洗涤液即为FⅧ生产废料。

方法4：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经氢氧化铝凝胶吸附，酸沉淀，取上清液进行S/D病毒灭活，阴离子交换层析，层析洗涤液即为FⅧ生产废料。

方法5：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经一次PEG沉淀，取上清液进行S/D病毒灭活，二次PEG沉淀，上清液即为FⅧ生产废料。

本发明所述的“vWF制品”特指含有vWF活性成分的制品，包括不限于vWF/FⅧ复合物，或高纯vWF制剂，或含有相对vWF/FⅧ复合物，低的vWF：FⅧ活性比的FⅧ制剂。vWF制品通常以冷沉淀为原料，经过凝胶吸附和层析分离得到，高纯vWF制剂可以进一步分离纯化得到，也可以通过凝血因子Ⅷ生产废料进一步分离纯化获得。

如未特别说明，本发明所述的“高纯vWF”或“高纯vWF制剂”指FⅧ含量可忽略不计的，具有vWF活性的vWF多聚体或其制剂。临床上发现，vWD患者输注含有FⅧ的vWF浓缩物后，在内源性释放的FⅧ的联合作用下，会导致血浆中FⅧ水平非常高，可能诱发深静脉血栓或心血管疾病，存在血栓栓塞的潜在风险，FⅧ的积累是vWD临床关注的问题，而低FⅧ：vWF效价比的vWF/FⅧ浓缩物可以防止FⅧ积累(Utility of a high VWF:FⅧratio inpreventing FⅧaccumulation:a study in VWF-deficient mice.Blood CoagulFibrinolysis.2015；26(5):515-521)。对于血浆FⅧ浓度正常的患者，更适合使用FⅧ含量可忽略不计的高纯vWF。因此开发FⅧ/vWF:CB效价比进一步降低的vWF的纯化方法具有重要的临床价值。

本发明技术方案基于发明人在实验室中的意外发现：

本发明实施例采用的Capto core 700凝胶的结构为双层结构：外层为5μm厚度的惰性壳层，其上分布有能够容纳小于700kDa分子通过的通道，而大于700kDa的分子则直接发生流穿；内层为多孔球状核心，其上分布有复合模式配基——辛胺基，兼具疏水作用和离子交换作用，对于通过孔道进入内层的分子实现吸附。Capto core 400凝胶结构同上，惰性壳层上分布有小于400kDa分子通过的通道，大于400kDa的分子则直接发生流穿。血浆中的vWF活性由vWF的多聚体产生，分子量约500kDa～20000kDa，IgM的分子量约900kDa，IgA的分子量约160kDa，在采用Capto core 700或Capto core 400纯化多聚化的vWF的过程中，按上述原理预测，IgM将与多聚化的vWF一起发生流穿，IgA和非复合物形式的FⅧ则通过孔道进入内层核心发生吸附，从而实现vWF与IgA和非复合物形式的FⅧ的分离。而发明人研究发现，Capto core 700和Capto core 400对IgM有预想不到的分离效果。与本领域常用去除IgM的Capto heparin(IgM单步去除率：13.4％)和Q-Sepharose(IgM单步去除率：23.2％)层析方法相比，去除效果更优。

基于上述发现，以及发明人对Capto core 700和Capto core 400凝胶结构的分析，合理推测具有下述双层结构的复合模式色谱树脂对血浆及其衍生物中的IgM具有特定的分离效果：包含多孔球状核心以及多孔惰性壳层，多孔球状核心含有辛胺配基，兼具疏水作用和离子交换作用，对于通过孔道进入内层的分子实现吸附；多孔惰性壳的排阻分子量在400-700kD之间。

在本发明实施例中，凝胶层析过程中使用到的平衡液对于提高层析效果也是必要的。

根据本发明实施例，血浆及其衍生物以及层析平衡液中的Ca²⁺浓度对于IgM的去除是重要的，过低或过高都不利于IgM去除。优选地，5-10mM的Ca²⁺对于保持Capto core 700和/或Capto core 400层析对IgM的单步去除率在50％以上是必要的。

根据本发明实施例，合适浓度的α-氨基乙酸对于维持vWF:CB高的活性收率和高的IgM去除率是有益的。进一步地，α-氨基乙酸优选80-130mM。

根据《中国药典》对血液制品外观的规定，注射液或冻干产品复溶后应无乳光、无析出物。因此，发明人进一步考察了Capto core 700和/或Capto core 400层析工艺对vWF制品外观的影响。根据本发明实施例，稳定剂的配方对冻干后的产品复溶后的质量有影响，层析工艺对冻干后的产品复溶后的质量也有影响。优选地，在稳定剂配方为“10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.02％聚山梨酯80，pH 6.9”时，经Capto core 700层析后的vWF制品不仅无乳光，而且无析出物。

在本发明实施例中，本发明所述的“析出物”通常指析出蛋白质，在中国药典中等同的表述为“可见异物”。本发明实施例中的“析出物”依药典通则0904第一法检查。

在一些实施方式中，本发明公开的采用具有多孔球状核心以及多孔惰性壳层结构的复合模式色谱树脂，例如Capto core 700和/或Capto core 400凝胶分离纯化vWF的工艺，只需要进行一步层析纯化步骤，就能进一步制得符合药典要求的vWF冻干制剂，纯化工艺简单，提高了血浆vWF制剂的生产效率。

为了更好地解释本发明，本发明实施例血浆及其衍生物选用FⅧ生产废料。血浆中的大多数FⅧ与vWF以复合物形式存在，因此这两种蛋白质通常是共纯化的，从血浆及其衍生物中分离FⅧ或vWF非常困难。而由于部分vWF与FⅧ形成复合物并随着FⅧ的分离而被分离，FⅧ生产废料中的vWF含量大幅降低，而杂蛋白由于层析过程而富集，因此与从冷沉淀中分离纯化FⅧ或vWF相比，从FⅧ生产废料中纯化vWF难度更大。

由于血浆中含有柠檬酸钠，出于不引入新的杂质的角度考虑，本发明实施例平衡液优选柠檬酸钠缓冲体系。本领域技术人员可以理解的是，选用其他的缓冲体系比如磷酸盐缓冲体系、Tris盐酸缓冲体系也是可行的。

下面是本发明的具体实施例。需要说明的是，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

制备FⅧ生产废料：

生产FⅧ有多种方法，本发明以其中一种方法为例进行说明制备FⅧ生产废料方法。

以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经2％Al(OH)₃吸附，调节pH至6.5-6.6，离心，取上清液进行S/D病毒灭活，DEAE阴离子交换层析吸附经病毒灭活后的样品，洗涤色谱柱，所得洗涤液即为FⅧ生产废料，可进一步用于纯化vWF。

发明人进一步考察了Capto core 400、Capto core 700、Q-Sepharose、Captoheparin 4种层析介质对vWF的分离纯化效果。

实施例2

FⅧ生产废料上样前先经过平衡液超滤，同时在FⅧ生产废料施加之前，依次用3.5倍柱体积的注射用水，5倍柱体积的平衡液平衡Capto core 400层析柱，向柱中加入FⅧ生产废料，然后再用4倍柱体积的平衡液冲洗，收集vWF流穿液。

平衡液配方为20mM柠檬酸钠、0.15M NaCl、100mMα-氨基乙酸、5.2mM CaCl2，pH6.8-7.2。取上样液、vWF洗脱液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB活性、蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM的含量。

实施例3

凝胶介质采用Capto core 700，其他条件同实施例2。

实施例4

凝胶介质采用Q-Sepharose，具体层析步骤及条件如下：

FⅧ生产废料上样前先经过平衡液超滤，同时在FⅧ生产废料施加之前，先用平衡缓冲液平衡Q-Sepharose层析柱，FⅧ生产废料上样后，用平衡缓冲液洗涤，用洗脱液洗脱vWF，收集vWF洗脱液。

平衡缓冲液配方为NaCl 100-150mM，Tris 20mM，100mMα-氨基乙酸，5.2mM CaCl₂，pH6.6。洗脱液配方为NaCl 350mM，Tris 20mM，100mMα-氨基乙酸，5.2mM CaCl₂，pH6.8～7.2。取上样液、vWF洗脱液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB活性、蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM的含量。

实施例5

凝胶介质采用Capto heparin 4，层析操作同实施例4。

平衡缓冲液配方为磷酸氢二钠15mM、氯化钠0.4M、100mMα-氨基乙酸、5.2mMCaCl₂，pH6.8～7.2。洗脱液配方为磷酸氢二钠20mM、氯化钠2.0M，100mMα-氨基乙酸、5.2mMCaCl₂，pH6.8～7.2。取上样液、vWF洗脱液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB活性、蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM的含量。

实施例2-5 FⅧ效价、vWF:CB效价和IgM检测结果见下表：

从实施例2-5实验结果可以看出，Capto heparin层析、Q-Sepharose层析，Captocore 700层析和Capto core 400层析可以不同程度降低以FⅧ生产废料为原料制备得到的vWF中间品的IgM的含量，但是Capto core 700和Capto core 400层析IgM去除效果明显更优。

与Capto heparin层析、Q-Sepharose层析相比，经Capto core 700和Capto core400层析后的vWF中间品的FⅧ/vWF:CB效价比值均降低40％左右；而经Capto core 700层析后的vWF:CB活性收率也明显高于其他层析方法的收率。

进一步地，发明人考察了采用Capto core 700凝胶层析，平衡液中Ca²⁺和α-氨基乙酸浓度对纯化结果的影响，尤其对IgM去除效果的影响。

实施例6

凝胶介质采用Capto core 700，具体层析步骤同实施例2。

平衡液配方：20mM柠檬酸钠、0.15M NaCl、100mMα-氨基乙酸、1.2mM CaCl₂，pH6.8-7.2。

取上样液和流穿液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB活性，蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgA和IgM的含量。实验结果：层析前FⅧ生产废料中FⅧ/vWF:CB效价比值为0.0463，层析后FⅧ/vWF:CB效价比值为0.0061，vWF:CB活性收率为95.75％，层析前IgA含量为0.726mg/L，层析后IgA含量为<0.285mg/L，IgM去除率22.3％。

本实施实验结果表明，采用Capto core 700凝胶分离纯化vWF时，Ca²⁺对于IgM的去除是重要的，过低的(1.2mM)的Ca²⁺浓度严重影响IgM去除率，22.3％的去除率明显低于实施例3中56.6％的去除率。

实施例7

凝胶介质采用Capto core 700，具体层析步骤同实施例2。

平衡液配方：20mM柠檬酸钠、0.15M NaCl、100mMα-氨基乙酸、10mM CaCl₂，pH 6.8-7.2。

取上样液和流穿液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB，蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM和IgA的含量。实验结果：层析后FⅧ/vWF:CB效价比值为0.0154，vWF:CB活性收率为99.33％，层析后IgA含量为<0.285mg/L，IgM去除率48.4％。

实施例8

凝胶介质采用Capto core 700，具体层析步骤同实施例2。

平衡液配方为20mM柠檬酸钠、0.15M NaCl、100mMα-氨基乙酸、30mM CaCl₂，pH6.8-7.2。

取上样液和流穿液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB，蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM和IgA含量。实验结果：层析后FⅧ/vWF:CB效价比值为0.0068，vWF:CB活性收率为82.21％，层析后IgA含量为<0.285mg/L，IgM去除率24.9％。

本实施例实验结果表明，采用Capto core 700凝胶分离纯化vWF时，过高的(30mM)Ca²⁺浓度同样影响IgM去除率，24.9％的去除率远低于实施例3中56.6％的去除率。发明人推测，Ca²⁺作为螯合剂，如果浓度过高，可能促进IgM聚合成复合物，进一步地，IgM与残留的IgG以及vWF进一步形成更复杂的复合物，从而与多聚化的vWF一起发生流穿。

实施例2、实施例6、实施例7、实施例8实验结果表明，血浆及其衍生物以及层析平衡液中的Ca²⁺浓度对于IgM的去除是重要的，过低或过高都不利于IgM去除。5-10mM的Ca²⁺对于保持Capto core 700和/或Capto core 400层析对IgM的单步去除率在50％以上是必要的。

实施例9

凝胶介质采用Capto core 700，具体层析步骤同实施例2。

平衡液配方为20mM柠檬酸钠、0.15M NaCl、5.2mM CaCl₂，pH 6.8-7.2。

取上样液和流穿液，参考《欧洲药典》检测vWF:CB，蛋白含量和FⅧ活性，采用散射比浊法检测IgM和IgA的含量。实验结果：层析后FⅧ/vWF:CB效价比值为0.0130，vWF:CB活性收率为70.36％，层析后IgA含量为<0.285mg/L，IgM去除率42.1％。

实施例2、实施例9实验结果表明：合适浓度的α-氨基乙酸对于维持vWF:CB高的活性收率和高的IgM去除率是有益的。100mM左右的α-氨基乙酸对于维持vWF:CB高的活性收率和高的IgM去除率是较优的。

实施例10

取实施例3制得的vWF中间品，经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装。灌装完后立即冻干，冻干工艺：制品室温进柜，从常温降至－45℃保持8h，开始抽真空，升温到－28℃保持9h，升温到0℃保持10h，升温到10℃保持4h，升温到30℃保持6h，当制品、隔板、真空等曲线趋于相对恒定时，结束冻干。压塞，出柜，轧盖，即得冻干后产品。

稳定剂为10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.02％聚山梨酯80，pH 6.9。

通过本实施例制得的冻干后的产品复溶后无乳光、无析出物。

实施例11

取实施例3制得的vWF中间品，经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装。灌装完后立即冻干，冻干工艺：制品室温进柜，从常温降至-45℃保持8h，开始抽真空，升温到-28℃保持9h，升温到0℃保持10h，升温到10℃保持4h，升温到30℃保持6h，当制品、隔板、真空等曲线趋于相对恒定时，结束冻干。压塞，出柜，轧盖，即得冻干后样品。

稳定剂为10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸，pH 6.9。

通过本实施例制得的冻干后的产品复溶后有乳光，有析出物。

从实施例10和实施例11可以看出，稳定剂的配方对冻干后的产品复溶后的质量有影响，采用本发明的稳定剂配方能使冻干后的产品复溶后无乳光，无析出物

实施例12

实施例2制得的vWF中间品，经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装。灌装完后立即冻干，冻干工艺：制品室温进柜，从常温降至-45℃保持8h，开始抽真空，升温到-28℃保持9h，升温到0℃保持10h，升温到10℃保持4h，升温到30℃保持6h，当制品、隔板、真空等曲线趋于相对恒定时，结束冻干。压塞，出柜，轧盖，即得冻干后样品。

稳定剂为10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.02％聚山梨酯80，pH 6.9。

通过本实施例制得的冻干后的产品复溶后无乳光、但是有蛋白析出物。

从实施例10和实施例12可以看出，层析介质对冻干后的产品复溶后的质量也有影响，经Capto core 700层析后的vWF制品不仅无乳光，而且蛋白无析出物。

在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种降低vWF制品中IgM含量的方法，其特征在于：该方法包括使血浆及其衍生物通过包含多孔球状核心以及多孔惰性壳层的复合模式色谱树脂的层析柱，收集通过层析柱而没有与所述复合模式色谱树脂结合的含有vWF的流穿液；所述复合模式色谱树脂的多孔惰性壳层的排阻分子量为400-700kDa。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合模式色谱树脂的多孔球状核心内含有辛胺配基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述复合模式色谱树脂为Capto Core 700和/或Capto Core 400凝胶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血浆及其衍生物为凝血因子Ⅷ生产废料，所述凝血因子Ⅷ生产废料选自：以血浆冷沉淀为原料通过离子交换层析分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的层析洗涤液，和/或以血浆冷沉淀为原料通过PEG沉淀分离纯化凝血因子Ⅷ过程中产生的含有vWF的上清液；

或所述血浆及其衍生物为血浆冷沉淀的溶解物及其纯化vWF的中间品。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法还包括使用平衡液冲洗所述复合模式色谱树脂层析柱，所述平衡液中包含5-10mM钙离子；通过所述复合模式色谱树脂层析柱的血浆及其衍生物含有5-10mM钙离子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述平衡液和/或血浆及其衍生物含有80-130mMα-氨基乙酸。

7.权利要求3所述凝胶在去除vWF制品中残留IgM的应用。

8.一种制备vWF冻干制剂的方法，其特征在于：采用权利要求1-6任一项所述的方法制备含有vWF的流穿液，经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装、冻干，得到vWF冻干制剂。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：按物质的量浓度或质量体积比计，所述稳定剂的配方为：10mM枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.015-0.03％聚山梨酯80，pH 6.9。

10.如权利要求9所述的方法制得的vWF冻干制剂。