CN108017710A - 一种人纤维蛋白原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人纤维蛋白原的制备方法，本发明通过对乙醇沉淀和第一次抽提条件进行优化，得到最佳的条件，通过对溶解液1进行筛选，得到最适的溶解条件，使得其在后续的吸附时能较好的去除杂质，流穿液中的Fg纯度和收率均较高，高达96.3％。在甘氨酸、氯化钠沉淀时，在两次沉淀中采用不同浓度的甘氨酸和氯化钠，及在不同的温度下进行溶解，使得得到的Fg收率较高，进一步对冻干保护剂配方和冻干工艺，使得得到的冻干制品外观均匀疏松，无大晶体，其复溶时间在5‑6min范围内，复溶后溶液澄清透明，无可见异物，并且制品水分含量复合药典规定。

Description

一种人纤维蛋白原的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人纤维蛋白原的制备方法。
背景技术
人纤维蛋白原(Human Fibrinogen，Fg)(简称纤原)，也称人凝血因子Ⅰ(Humancoagulation factorⅠ，FⅠ)，主要由肝脏实质细胞合成，是血浆蛋白的主要成分之一，血浆中纤原含量丰富，正常人血浆中约为2～4g/L，是凝血系统中的“中心”蛋白质之一，是凝血过程中凝血因子相继激活的最终底物，具有止血功能，除直接参与凝血过程后期阶段，还介导血小板聚集、影响血液黏度。
提取和纯化纤原的方法有低温乙醇沉淀法和甘氨酸沉淀法，二者单独或组合应用，层析技术可进一步提高产品纯度。但是由于低温乙醇工艺是利用等电点、蛋白质浓度、温度、pH、离子强度五种因素来实现蛋白分离，在蛋白质沉淀时会伴随共沉现象，导致目前生产的产品纯度在左右，存在的一定量的纤维结合蛋白，制品在干热灭活时纤维结合蛋白会发生变性，致使制品在干热后缩轮、复溶时间长，一般都大于20min，复溶后出现絮状等问题。为了解决低温乙醇工艺存在的缺陷采用了吸附式离子交换法来制备制品，该工艺产品纯度能够达到90％以上，成品外观和复溶时间得到了极大的改善，但是由于采用了凝胶吸附法，导致凝胶使用体积巨大，而且收率仅有每吨血装200瓶。法国LFB公司以从新鲜冰冻血浆分离出冷沉淀凝血因子后剩余的血浆再冰冻而成的冷上清为原料，从低温乙醇沉淀获得的F1沉淀中制备纤原，其工艺引入DEAE凝胶层析法捕获纤原，以S/D法、纳米膜过滤技术和干热灭活法(80℃/72h)三种方法进行病毒灭活和去除，使得制品安全性提升，但该工艺中使用的冷沉淀血浆(CRP)已除去60％纤原，使得收率较低。德国CSL公司以冷沉淀为起始原料，经多次甘氨酸沉淀和氢氧化铝吸附，巴氏灭活法制备纤原，获得了纯度高，安全性好的制品，但工艺中大量引入Al3+，使患者致老年痴呆的风险。
CN201510748334.1公开了《一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法》，本发明工艺将两种原料均含有的FVIII与Fg同时提取出来，大大提高了两种产品的得率，其中人凝血因子VIII可达20万IU/吨血浆，人纤维蛋白原超过2000瓶/吨血浆，均远高于传统工艺,其得到的产品纯差，复溶时间较长，产率差，对血浆造成了浪费。
Fg的制备工艺在国内也实现了规模化生产，但是与国外产品对比，我国制品工艺水平落后。纯度低，热稳定性性不高，复溶时间长等质量水平明显落后。因此本发明意在发明一种可以同时解决制备方法简单，收率高，产品纯度好的制造工艺。
发明内容
本发明为了解决以上技术问题，本发明提供了一种Fg先进的制备工艺，得到纯度高、耐干热、速溶的Fg产品，且该产品具有好的临床耐受性和安全性。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括以下制备步骤：
1)融浆：血浆在0-6℃下融化完全；
2)乙醇沉淀：用醋酸缓冲液把反应的血浆调pH至7.0-7.5，反应液蛋白浓度调整为5.2％-5.5％，降温至-1-1℃，加入95％乙醇至反应液最终乙醇浓度为8％，温度调至-2℃±1℃,乙醇加完后继续搅拌30分钟以上，离心分离收集FI沉淀；
3)第一次抽提：FI沉淀用溶解液1溶解，滤芯过滤,得澄清滤液；
4)层析：将步骤3)得到澄清滤液用Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附，上样流速为1.3-1.5cm/min，过紫外检测器，检测到蛋白峰后，取流穿蛋白液过0.5μm滤芯；此前Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附用溶解液1进行平衡5-6个柱体积，待出液电导率与pH与进液一致时结束；
5)S/D灭活病毒处理：流穿蛋白液、S/D灭活剂按10:1比例加入11％S/D溶液使最终混合液中Tween80为1±0.3％、TNBP为0.3±0.1％，升温至23℃开始计时，在24±0.5℃下保温、搅拌6小时，随后降温至10-20℃，得灭活蛋白液；
6)甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤5)得到的灭活蛋白液用甘氨酸/氯化钠沉淀，离心收集沉淀，用10-12倍沉淀质量的溶解液2在26～32℃搅拌溶解，得溶液1；
7)二次甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤6)得到的溶液用甘氨酸/氯化钠二次沉淀，离心，收集沉淀；
8)超滤：将溶解液3溶解步骤7)所得的沉淀，进行超滤，使得最终浓缩后液体蛋白浓度不小于2.4％，得原液；
9)成品制备：原液配置陈半成品，除菌过滤，分装，冻干，出柜、轧盖，干热病毒灭活，包装，既得。
进一步，所述的95％乙醇，其温度为-22℃。
进一步，所述的溶解液1，含1.5％枸橼酸钠、2％NaCl、1.0％蔗糖、0.20％Tris、0.40％赖氨酸盐酸盐，pH7.5-7.8。
进一步，所述的溶解，溶解液的加入倍数为FI沉淀的25倍，溶解温度为27-29℃。
进一步，所述的甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.5mol/L，氯化钠浓度为2.3mol/L，沉淀时温度为24℃。
进一步，所述的溶解液2，1.5％枸橼酸钠，1.0％氯化钠，1.0％蔗糖，0.20％Tris，pH6.8-7.2。
进一步，所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
进一步，所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，1.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH6.8-7.2。
进一步，所述的冻干，是在-5℃保温50-60min，-30～-35℃，开始预冻5-5.5h开始升华，2-3h升温至-25℃控温30-35h，1-1.5h升温至-20～-15℃控温2-3h，1h升温至-5℃控温12-16h，0℃控温5-8h，升温到10℃控温1h，升温至15-20℃控温2h，升温至25℃控温3-5h,30℃恒温18-22h。
进一步，制备人纤维蛋白原的原料还可以是血浆冷沉淀，制备FVⅢ的酸沉淀，制备冷沉淀后的血浆。
1)有益效果，通过对乙醇沉淀和第一次抽提条件进行优化，得到最佳的条件，通过对溶解液1进行筛选，得到最适的溶解条件，使得其在后续的吸附时能较好的去除杂质，流穿液中的Fg纯度和收率均较高，高达96.3％。
2)在甘氨酸、氯化钠沉淀时，在两次沉淀中采用不同浓度的甘氨酸和氯化钠，及在不同的温度下进行溶解，使得得到的Fg收率较高，沉淀时均匀的糊状或细小颗粒。研究发现，低温乙醇沉淀工艺形成的沉淀形态往往是具有薪性的大团蛋白质块，而且原液放置一段时间会出现细小蛋白质颗粒或沉淀。由于沉淀形成后在工业生产中需要连续流离心机将固液分离，沉淀的形成状态直接影响离心过程的顺畅度。因此，本发明通过工艺改进得到的沉淀交均匀，使得生产效率极大提高。
3)发现本发明通过特殊的冻干保护剂配方和冻干工艺，使得得到的冻干制品外观均匀疏松，无大晶体，其复溶时间在5-6min范围内，复溶后溶液澄清透明，无可见异物，并且制品水分含量复合药典规定。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括以下制备步骤：
1)融浆：血浆在0℃下融化完全；
2)乙醇沉淀：用醋酸缓冲液把反应的血浆调pH至7.0，反应液蛋白浓度调整为5.2％，降温至-1℃，加入95％乙醇至反应液最终乙醇浓度为8％，温度调至-1℃,乙醇加完后继续搅拌30分钟以上，离心分离收集FI沉淀；
3)第一次抽提：FI沉淀用溶解液1溶解，滤芯过滤,得澄清滤液；
4)层析：将步骤3)得到澄清滤液用Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附，上样流速为1.3cm/min，过紫外检测器，检测到蛋白峰后，取流穿蛋白液过0.5μm滤芯；此前ToyopealDEAE-650M凝胶吸附用溶解液1进行平衡5个柱体积，待出液电导率与pH与进液一致时结束；
5)S/D灭活病毒处理：流穿蛋白液、S/D灭活剂按10:1比例加入11％S/D溶液使最终混合液中Tween80为0.7％、TNBP为0.2％，升温至23℃开始计时，在23.5℃下保温、搅拌6小时，随后降温至10℃，得灭活蛋白液；
6)甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤5)得到的灭活蛋白液用甘氨酸/氯化钠沉淀，离心收集沉淀，用10倍沉淀质量的溶解液2在26℃搅拌溶解，得溶液1；
7)二次甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤6)得到的溶液用甘氨酸/氯化钠二次沉淀，离心，收集沉淀；
8)超滤：将溶解液3溶解步骤7)所得的沉淀，进行超滤，使得最终浓缩后液体蛋白浓度不小于2.4％，得原液；
9)成品制备：原液配置陈半成品，除菌过滤，分装，冻干，出柜、轧盖，干热病毒灭活，包装，既得。
所述的95％乙醇，其温度为-22℃。
所述的溶解液1，含1.5％枸橼酸钠、2％NaCl、1.0％蔗糖、0.20％Tris、0.40％赖氨酸盐酸盐，pH7.5。
所述的溶解，溶解液的加入倍数为FI沉淀的25倍，溶解温度为27℃。
所述的甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.5mol/L，氯化钠浓度为2.3mol/L，沉淀时温度为24℃。
所述的溶解液2，1.5％枸橼酸钠，1.0％氯化钠，1.0％蔗糖，0.20％Tris，pH6.8。
所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，1.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH6.8。
所述的冻干，是在-5℃保温50min，-30℃，开始预冻5h开始升华，2h升温至-25℃控温30h，1h升温至-20℃控温2h，1h升温至-5℃控温12h，0℃控温5h，升温到10℃控温1h，升温至15℃控温2h，升温至25℃控温3h，30℃恒温18h。
实施例2
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括以下制备步骤：
1)融浆：血浆在3℃下融化完全；
2)乙醇沉淀：用醋酸缓冲液把反应的血浆调pH至7.3，反应液蛋白浓度调整为5.3％，降温至0℃，加入95％乙醇至反应液最终乙醇浓度为8％，温度调至-2℃,乙醇加完后继续搅拌30分钟以上，离心分离收集FI沉淀；
3)第一次抽提：FI沉淀用溶解液1溶解，滤芯过滤,得澄清滤液；
4)层析：将步骤3)得到澄清滤液用Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附，上样流速为1.4cm/min，过紫外检测器，检测到蛋白峰后，取流穿蛋白液过0.5μm滤芯；此前ToyopealDEAE-650M凝胶吸附用溶解液1进行平衡5-6个柱体积，待出液电导率与pH与进液一致时结束；
5)S/D灭活病毒处理：流穿蛋白液、S/D灭活剂按10:1比例加入11％S/D溶液使最终混合液中Tween80为1％、TNBP为0.3％，升温至23℃开始计时，在24℃下保温、搅拌6小时，随后降温至15℃，得灭活蛋白液；
6)甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤5)得到的灭活蛋白液用甘氨酸/氯化钠沉淀，离心收集沉淀，用10-12倍沉淀质量的溶解液2在28℃搅拌溶解，得溶液1；
7)二次甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤6)得到的溶液用甘氨酸/氯化钠二次沉淀，离心，收集沉淀；
8)超滤：将溶解液3溶解步骤7)所得的沉淀，进行超滤，使得最终浓缩后液体蛋白浓度不小于2.4％，得原液；
9)成品制备：原液配置陈半成品，除菌过滤，分装，冻干，出柜、轧盖，干热病毒灭活，包装，既得。
所述的95％乙醇，其温度为-22℃。
所述的溶解液1，含1.5％枸橼酸钠、2％NaCl、1.0％蔗糖、0.20％Tris、0.40％赖氨酸盐酸盐，pH7.6。
所述的溶解，溶解液的加入倍数为FI沉淀的25倍，溶解温度为28℃。
所述的甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.5mol/L，氯化钠浓度为2.3mol/L，沉淀时温度为24℃。
所述的溶解液2，1.5％枸橼酸钠，1.0％氯化钠，1.0％蔗糖，0.20％Tris，pH7.0。
所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，1.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH7.0。
所述的冻干，是在-5℃保温55min，-32℃，开始预冻5.3h开始升华，2.3h升温至-25℃控温33h，1.2h升温至-18℃控温2.3h，1h升温至-5℃控温14h，0℃控温7h，升温到10℃控温1h，升温至18℃控温2h，升温至25℃控温4h,30℃恒温20h。
实施例3
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括以下制备步骤：
1)融浆：血浆在0-6℃下融化完全；
2)乙醇沉淀：用醋酸缓冲液把反应的血浆调pH至7.5，反应液蛋白浓度调整为5.5％，降温至1℃，加入95％乙醇至反应液最终乙醇浓度为8％，温度调至-3℃,乙醇加完后继续搅拌30分钟以上，离心分离收集FI沉淀；
3)第一次抽提：FI沉淀用溶解液1溶解，滤芯过滤，得澄清滤液；
4)层析：将步骤3)得到澄清滤液用Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附，上样流速为1.5cm/min，过紫外检测器，检测到蛋白峰后，取流穿蛋白液过0.5μm滤芯；此前ToyopealDEAE-650M凝胶吸附用溶解液1进行平衡6个柱体积，待出液电导率与pH与进液一致时结束；
5)S/D灭活病毒处理：流穿蛋白液、S/D灭活剂按10:1比例加入11％S/D溶液使最终混合液中Tween80为1.0.3％、TNBP为0.4％，升温至23℃开始计时，在24.5℃下保温、搅拌6小时，随后降温至20℃，得灭活蛋白液；
6)甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤5)得到的灭活蛋白液用甘氨酸/氯化钠沉淀，离心收集沉淀，用12倍沉淀质量的溶解液2在32℃搅拌溶解，得溶液1；
7)二次甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤6)得到的溶液用甘氨酸/氯化钠二次沉淀，离心，收集沉淀；
8)超滤：将溶解液3溶解步骤7)所得的沉淀，进行超滤，使得最终浓缩后液体蛋白浓度不小于2.4％，得原液；
9)成品制备：原液配置陈半成品，除菌过滤，分装，冻干，出柜、轧盖，干热病毒灭活，包装，既得。
所述的95％乙醇，其温度为-22℃。
所述的溶解液1，含1.5％枸橼酸钠、2％NaCl、1.0％蔗糖、0.20％Tris、0.40％赖氨酸盐酸盐，pH7.8。
所述的溶解，溶解液的加入倍数为FI沉淀的25倍，溶解温度为27-29℃。
所述的甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.5mol/L，氯化钠浓度为2.3mol/L，沉淀时温度为24℃。
所述的溶解液2，1.5％枸橼酸钠，1.0％氯化钠，1.0％蔗糖，0.20％Tris，pH6.8-7.2。
所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，1.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH7.2。
所述的冻干，是在-5℃保温60min，-35℃，开始预冻5.5h开始升华，3h升温至-25℃控温35h，1.5h升温至-15℃控温3h，1h升温至-5℃控温16h，0℃控温8h，升温到10℃控温1h，升温至20℃控温2h，升温至25℃控温5h,30℃恒温22h。
实施例4-12第一次抽提条件如表1所示。
表1
溶解液1 溶解倍数 溶解温度℃
氯化钠％ pH
实施例4 2 7.0 25 27
实施例5 2 6.7 25 27
实施例6 1 7.5 25 29
实施例7 1.5 7.5 25 29
实施例8 2 7.8 25 32
实施例9 2 7.8 25 20
实施例10 2 7.8 25 15
实施例11 2 7.5 20 27
实施例12 2 7.8 17 29
实施例4-12其它提取步骤如实施例1。
实施例13-20甘氨酸/氯化钠沉淀条件如表2所示。
表2
实施例13-20其它提取步骤如实施例1。
进一步，所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
实施例21-26二次甘氨酸/氯化钠沉淀条件如表3所示。
表3
氯化钠mol/L 甘氨酸mol/L 温度℃
实施例21 1 1.2 20
实施例22 1.5 1.2 20
实施例23 1.8 0.5 20
实施例24 1.8 0.8 20
实施例25 1.8 1.2 10
实施例26 1.8 1.2 25
实施例21-26其它制备步骤与实施例1相同。
实施例27
实施例27所述的所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，2.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH6.8，其它制备步骤与实施例1相同。
实施例28
实施例28所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，2％甘氨酸，2.7％精氨酸盐酸盐，1.5％甘露醇，pH7.2，其它制备步骤与实施例1相同。
实施例29
实施例29所述的冻干，是在5℃预冷1h、-40℃冻结3h、-15℃退火2h、-40℃冻结3h、0℃升华20h、20℃升温干燥20h，其它的制备步骤与实施例1相同。
实验例
1、第一次抽提对人纤维蛋白原纯度其收率的影响
按照实施例1-12的方法对进行纯化，计算层析后得到的流穿蛋白液进行检测Fg的纯度和收率，检测方法参考文献(巩建朋.Cohn FⅠ及FⅠ+Ⅲ中纤维蛋白原的纯化与鉴定[D].武汉生物制品研究所,2010.)，其中每个实施例测量3次，求平均值。
表4不同的第一次抽提对Fg的纯度和收率的影响
2)甘氨酸/氯化钠沉淀条件对Fg的收率的影响
表5甘氨酸/氯化钠沉淀条件对Fg的收率的影响
4)Fg原液测定
将实施例1-29制备的Fg原液进行测定，结果如表6所示
表6Fg原液质量检测
凝固活力是衡量制品有效性的重要质量指标之一。在人体内在凝血酶的作用下迅速凝固从而达到止血的目的。凝固时间越短，表明产品的凝固活力越高，体现了更高的生理活性，以上分析说明本发明得到的制品其凝固活力均较好，最低可在13s凝固。
5)冻干工艺研究
对实施例1-3、27-29冻干后的制品进行检测，发现本发明通过特殊的冻干保护剂配方和冻干工艺，使得实施例1-3得到的冻干制品外观均匀疏松，无大晶体，其复溶时间在5-6min范围内，复溶后溶液澄清透明，无可见异物，并且制品水分含量复合药典规定。与实施例1-3对比，实施例27-29由于冻干保护剂的不同和冻干工艺的不同，导致制品外观疏松，有少量的大晶体，复溶时间较长15-20min，复溶后，液体含有少量颗粒。将供试品复溶后置30-37℃水浴中保温60分钟，应无凝块或纤维蛋白析出。
6)病毒灭活效果
对实施例1-29制备的人纤维蛋白原病毒灭活进行检测，结果表明，29个实施例均为检测到PRV和Sindbis，即可使PRV和Sindbis的滴度下降4个log以上。对于未能检测到病毒滴度的样品，在敏感细胞上盲传代，未观察到特异性细胞病变。这说明人Fg中间品溶液经过S/D灭活，灭活病毒有效。
通过以上分析发现，本发明与现有技术相比，具有以下优点：通过对乙醇沉淀和第一次抽提条件进行优化，得到最佳的条件，通过对溶解液1进行筛选，得到最适的溶解条件，使得其在后续的吸附时能较好的去除杂质，流穿液中的Fg纯度和收率均较高，高达96.3％。
在甘氨酸、氯化钠沉淀时，在两次沉淀中采用不同浓度的甘氨酸和氯化钠，及在不同的温度下进行溶解，使得得到的Fg收率较高，沉淀时均匀的糊状或细小颗粒。研究发现，低温乙醇沉淀工艺形成的沉淀形态往往是具有薪性的大团蛋白质块，而且原液放置一段时间会出现细小蛋白质颗粒或沉淀。由于沉淀形成后在工业生产中需要连续流离心机将固液分离，沉淀的形成状态直接影响离心过程的顺畅度。因此，本发明通过工艺改进得到的沉淀交均匀，使得生产效率极大提高。
发现本发明通过特殊的冻干保护剂配方和冻干工艺，使得得到的冻干制品外观均匀疏松，无大晶体，其复溶时间在5-6min范围内，复溶后溶液澄清透明，无可见异物，并且制品水分含量复合药典规定。

Claims (9)

1.一种人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
1)融浆：血浆在0～6℃下融化完全；
2)乙醇沉淀：用醋酸缓冲液把反应的血浆调pH至7.0-7.5，反应液蛋白浓度调整为5.2％-5.5％，降温至-1-1℃，加入95％乙醇至反应液最终乙醇浓度为8％，温度调至-2℃±1℃,乙醇加完后继续搅拌30分钟以上，离心分离收集FI沉淀；
3)第一次抽提：FI沉淀用溶解液1溶解，滤芯过滤，得澄清滤液；
4)层析：将步骤3)得到澄清滤液用Toyopeal DEAE-650M凝胶吸附，上样流速为1.3-1.5cm/min，过紫外检测器，检测到蛋白峰后，取流穿蛋白液过0.5μm滤芯；此前ToyopealDEAE-650M凝胶吸附用溶解液1进行平衡5-6个柱体积，待出液电导率与pH与进液一致时结束；
5)S/D灭活病毒处理：流穿蛋白液、S/D灭活剂按10:1比例加入11％S/D溶液使最终混合液中Tween80为1±0.3％、TNBP为0.3±0.1％，升温至23℃开始计时，在24±0.5℃下保温、搅拌6小时，随后降温至10-20℃，得灭活蛋白液；
6)甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤5)得到的灭活蛋白液用甘氨酸/氯化钠沉淀，离心收集沉淀，用10-12倍沉淀质量的溶解液2在26～32℃搅拌溶解，得溶液1；
7)二次甘氨酸/氯化钠沉淀：将步骤6)得到的溶液用甘氨酸/氯化钠二次沉淀，离心，收集沉淀；
8)超滤：将溶解液3溶解步骤7)所得的沉淀，进行超滤，使得最终浓缩后液体蛋白浓度不小于2.4％，得原液；
9)成品制备：原液配置陈半成品，除菌过滤，分装，冻干，出柜、轧盖，干热病毒灭活，包装，既得。
2.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的95％乙醇，其温度为-22℃。
3.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解液1，含1.5％枸橼酸钠、2％NaCl、1.0％蔗糖、0.20％Tris、0.40％赖氨酸盐酸盐，pH7.5-7.8。
4.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解，溶解液的加入倍数为FI沉淀的25倍，溶解温度为27-29℃。
5.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.5mol/L，氯化钠浓度为2.3mol/L，沉淀时温度为24℃。
6.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解液2，1.5％枸橼酸钠，1.0％氯化钠，1.0％蔗糖，0.20％Tris，pH6.8-7.2。
7.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的二次甘氨酸/氯化钠沉淀，甘氨酸的终浓度为1.2mol/L，氯化钠浓度为1.8mol/L，沉淀时温度为20℃。
8.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解液3，1.2％枸橼酸钠，0.20％氯化钠，1.5％甘氨酸，3.2％精氨酸盐酸盐，2.5％甘露醇，pH6.8-7.2。
9.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的冻干，是在-5℃保温50-60min，-30～-35℃，开始预冻5-5.5h开始升华，2-3h升温至-25℃控温30-35h，1-1.5h升温至-20～-15℃控温2-3h，1h升温至-5℃控温12-16h，0℃控温5-8h，升温到10℃控温1h，升温至15-20℃控温2h，升温至25℃控温3-5h,30℃恒温18-22h。
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