KR20240044450A - 피브리노겐 조성물 및 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액 약품의 분야, 특히 피브리노겐 및 피브리노겐 의약품에 관한 것이다. 본 발명은 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는 건조 형태, 예를 들어 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품을 제공한다. 본 발명자들은 상기 수분 함량이 건열에 의한 바이러스 불활성화에 유리하며, 이에 따라 감염성 바이러스에 대한 안전 마진이 높은 안정한 약품 및 상기 의약품을 포함하는 용기가 얻어진다는 것을 발견했다. 본 발명은 추가로 특히 작은 수의 눈으로 보이지 않는 입자(SVP)를 갖는 건조 형태, 예를 들어 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품, 및 상기 의약품을 포함하는 용기를 제공한다. 또한 이러한 용기 또는 의약품의 배치도 제공된다. 상기 의약품은 예를 들어, 주사용수와 같은 수용액에 상기 의약품의 1g의 피브리노겐을 포함하는 하나의 용기를 재구성하여 10 내지 100 ㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP 및 25 내지 100 ㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액을 얻는데 적합하다. 본 발명의 의약품의 제조 방법뿐만 아니라 피브리노겐 결핍증의 치료에 사용하기 위한 이들 의약품도 개시된다.
Description
본 발명은 혈액 약품의 분야, 특히 피브리노겐 및 피브리노겐 의약품에 관한 것이다. 본 발명은 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는 건조 형태, 예를 들어 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품을 제공한다. 본 발명자들은 상기 수분 함량이 건열에 의한 바이러스 불활성화에 유리하며, 이에 따라 감염성 바이러스에 대한 안전 마진이 높은 안정한 약품 및 상기 의약품을 포함하는 용기가 얻어진다는 것을 발견했다. 본 발명은 추가로 특히 작은 수의 눈으로 보이지 않는 입자(SVP)를 갖는 건조 형태, 예를 들어 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품, 및 상기 의약품을 포함하는 용기를 제공한다. 또한 이러한 용기 또는 의약품의 배치도 제공된다. 상기 의약품은 예를 들어, 주사용수와 같은 수용액에 상기 의약품의 1g의 피브리노겐을 포함하는 하나의 용기를 재구성하여 10 내지 100 ㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100 ㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액을 얻는데 적합하다. 본 발명의 의약품의 제조 방법뿐만 아니라 피브리노겐 결핍증의 치료에 사용하기 위한 이들 의약품도 개시된다.
피브리노겐은 혈전의 형성에 관여하는 혈액 중의 주요한 구조 단백질이다. 조직 및 혈관 손상 중에, 피브리노겐은 트롬빈에 의해 효소적으로 피브린으로 전환된 다음, 혈전의 기초를 형성하는 피브린 기반 망목 구조로 전환된다. 피브린 응고는 주로 손상된 혈관을 막아 출혈을 멈추는 역할을 한다. 피브린은 또한 트롬빈에 결합하여 그의 활성을 감소시킨다. 이 활성은 과도한 응고를 제한하는 피드백 메커니즘을 제공한다. 피브린은 또한 혈소판 및 내피 세포의 확산, 조직 섬유아세포의 증식, 모세관 형성 및 혈관 신생을 매개하여 혈관 재생 및 상처 치유를 촉진한다. 지혈 장애의 치료에 사용할 수 있다.
피브리노겐 분자는 두 개의 삼량체로 구성된 가용성 혈장 당단백질로서 순환하며, 상기 삼량체는 각각 피브리노겐 알파 사슬, 피브리노겐 베타 사슬, 피브리노겐 감마 사슬의 세 가지 다른 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 피브리노겐의 전형적인 분자량은 ~340kDa이다. 인간 혈장 중의 피브리노겐의 정상 농도는 150~400mg/dl이며, 이 범위보다 상당히 낮거나 높은 수준은 병리학적 출혈 및/또는 혈전증과 관련이 있다(Wikipedia).
피브리노겐 결핍증의 경우 혈액의 혈전 형성 능력이 손상되어 심각한 출혈의 위험이 크게 증가하고 추가로 지혈이 지연된다.
심각한 선천성 피브리노겐 결핍증의 경우, 충분한 수준의 기능성 피브리노겐을 생산하는 환자의 능력이 손상되거나 결핍된다. 이들 환자는 피브리노겐 농축액의 빈번한 주사가 필요하다. 후천성 피브리노겐 결핍증의 경우, 환자는 내인성 피브리노겐을 잃게 되어 조절되지 않는 출혈이 발생할 수 있다. 빈번한 원인은 복잡한 수술 중의 대량의 혈액 손실이지만, 심각한 외상으로 인한 결과이기도 하다. 이 경우 피브리노겐을 임계 수준 이상으로 증가시켜 출혈을 멈추기 위해 피브리노겐을 정맥 내로 투여해야 한다.
따라서, 피브리노겐 생성물 및 이의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Haemocomplettan®은 CSL Behring(독일 마르부르크)에서 제조된다. WO 00/47621 A1은 피브리노겐 및 피브로넥틴을 포함하는 조성물의 제조 방법을 교시하고 있다. WO 2018/115800 A1, WO 2008/117746 A1, EP 0 085923 A1, EP 0 804 933 A2, WO 95/26749 A1, WO 98/55105 A1 및 EP 0 345 246 A2는 상이한 안정화제를 갖는 피브리노겐 조성물에 관한 것이다.
WO 01/48016 A1, WO 2004/007533 A1, WO 2012/038410 A1, WO 2009/155626 A2는 피브리노겐 조성물을 제조하는 방법을 교시한다. 예를 들어, 피브리노겐은 응집체를 형성하는 경향이 있는 다소 민감한 단백질이므로, WO 2006/015704는 응집체의 형성이 최소화되는 피브리노겐 생성물의 열처리에 관한 것이다.
일반적으로, 단백질 함유 제형은 입자상 물질을 함유할 수 있으며, 여기서 제형의 단백질은 자가 응집되어 입자를 형성할 수 있다 (Carpenter et al., J Pharm Sci. 2009 Apr: 98(4): 1201 - 1205). 입자는 눈으로 보이는 것 또는 눈으로 보이지 않는 것일 수 있다. 눈으로 보이지 않는 입자(SVP, subvisible particle)는 일반적으로 최대 100μm의 직경을 갖는다. 상한 크기는 육안으로 감지할 수 있는 한계를 나타낸다. 따라서 100μm 이하의 입자를 "눈에 보이지 않는 것"(subvisible)이라고 한다.
따라서 약품 안정성과 품질의 한 측면은 SVP의 존재이다(Abraham et al., 2011. BioPharm International 24(4)). 응집된 단백질로 구성될 수 있는 이러한 입자, 및/또는 프로세스 재료나 용기 밀폐 시스템에서 유출하는 성분은 의약품의 효능과 면역원성에 직접 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이들은 종종 추가의 단백질 응집을 위한 핵 생성 부위로 작용하거나 또는 응집에 의해 더 큰 입자의 발생을 유도한다. 제형 내의 SVP의 크기와 농도를 측정하는 것은 효과적인 제어를 위한 필수적인 전단계이며, 업계가 '결함 제로(zero defect)' 및 '본질적으로 입자 불함유(essentially particle-free )' 약품을 향해 노력함에 따라 그의 중요성이 점점 높아지고 있다(Carpenter et al., 2015, www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/35952/meeting-biopharmaceutical-analytical-requirements-for-subvisible-particle-sizing-and-counting/). 차광성 테스트 <788>, SVP 분석을 위한 표준 테스트에 대한 현재 미국 약전(USP) 요건은 크기가 10㎛를 초과하는 미립자는 6000개/용기 이하로 제어되고 25㎛를 초과하는 입자는 600개/용기 이하로 제한된다고 명시하고 있다. 이러한 제한은 주입 시 입자가 모세혈관(평균 직경 약 7㎛)을 차단하는 것에 대한 우려와 관련이 있다. 면역원성 증가와 같은 다른 건강 문제도 모든 규모의 SVP에 추가로 존재할 수 있다 (Carpenter et al. 2009. Journal of Pharmaceutical Sciences 98(4):1201-1205).
현재 혈장 단백질과 근육내 및 피하 투여용 단백질에는 예외가 있으며, 이는 더 많은 수의 SVP를 포함할 수 있다. 그러나 이는 우려가 없기 때문이 아니라, 충분히 적은 수의 SVP로 구성된 혈장 약품을 재현 가능하고 일상적으로 생산하는 것이 지금까지 불가능했기 때문임이 분명하다.
WO 2013/106772 A2는 입자 분석장치를 이용하여 입자 집단을 특성 평가 방법을 개시하고, SVP의 생성이 제조 및/또는 포장 프로세스의 조건에 의해 유발될 수 있음을 기술하고 있다.
WO 2016/057739 A1, WO 2014/100143 A2 및 WO 2019/060062 A1에는 적은 수의 SVP 및 폴리소르베이트 및/또는 계면활성제 등의 지방산 에스테르를 포함하는 항체 조성물이 교시되어 있다.
그럼에도 불구하고, 적은 수의 SVP를 포함하는 혈장 의약품, 예를 들면 피브리노겐 의약품에 대한 수요가 높다.
피브리노겐은 일반적으로 엄격한 기증자 선별 및 기증 테스트 요건에도 불구하고 감염성 바이러스가 함유되어 있지 않다는 것을 보장할 수 없는 혈장으로부터 정제되며, 또 하나의 일반적인 문제는 바이러스에 의한 오염이다. 이를 위해서는 제조 프로세스에 바이러스 제거 또는 바이러스 비활성화 단계를 통합할 필요가 있다. 제거는 예를 들어 나노여과에 의해 수행할 수 있으며 (예를 들어, 프랑스 Courtaboeuf Cedex 소재 LFB SA의 Fibclot®의 경우), 이는 필터가 비싸고 종종 막히는 단점이 있다. 크로마토그래피도 사용할 수 있다. 바이러스 불활성화는 용매/세제(S/D) 처리, 저온살균 또는 열 처리(예를 들면, WO 97/42980 A1), 산성 pH 또는 방사선 조사, 예를 들어 UV 광에 의한 불활성화를 기반으로 할 수 있다. CSL Behring 약품 Haemocomplettan®에 대해 수행되는 바와 같은 사카로스의 존재 하의 열불활성화는 당뇨병 환자에게 문제가 발생하기 때문에 바람직하지 않은 것으로 간주될 수 있다. 바이러스 불활성화/제거를 위한 효과적인 방법의 조합도 지질 외피 바이러스에 대하여 유럽 의약품청(EMA)에서 의무사항이기 때문에 당업계에서 자주 사용되고 있다.
VIII 인자 약품 중의 바이러스는 예를 들어 EP 0 844 005 A1의 동결건조 조성물을 0.8%의 잔류 수분 함량으로 열처리하여 불활성화된다. JPS6289628 A에는 잔류 수분 함량이 0.05 내지 3%가 될 때까지 피브리노겐을 건조하고 이당류의 존재 하에 60°C에서 65 내지 90시간 동안 열처리하는 방법이 기재되어 있다. WO 93/05067 A1는 국소 피브리노겐 복합체에서의 항바이러스 물질 및 가용화제로서 폴리소르베이트 80을 교시하고 있다. 바이러스 불활성화의 성공 여부는 의약품 구성 및 준비의 여러 요인에 따라 달라지며, 바이러스 스파이킹 실험 등을 통해 실험적으로 검증할 필요가 있다.
최신 기술을 고려하여, 본 발명자들은 이들 문제 중 하나 이상을 대처하는 유리한 피브리노겐 의약품을 제공하는 과제를 해결했다. 특히, 본 발명자들은 활성이고 장기간 안정하며 바이러스에 안전한 피브리노겐 약품인, 예를 들어 정맥 투여용으로, 특히 안전한 약품을 제공하기 위한 과제를 해결했다. 바람직하게는, 피브리노겐 약품은 우수한 용해도, 매우 낮은 SVP 함량이 매우 낮은 것을 특징으로 하며, 안정화 등을 위해 2차 단백질이 실질적으로 함유하지 않아야 한다. 더욱이, 혈액 의약품은 잘 표준화된 프로세스에서 잘 재현 가능한 방법으로 생산될 수 있어야 한다.
본 발명의 피브리노겐 의약품
본 과제는 본 발명의 주제, 예를 들어 청구범위의 주제에 의해 해결된다. 유리하게는, 본 발명은 바이러스 안전성 및/또는 SVP의 수, 또는 이들 둘 다와 관련하여 사용하기에 특히 안전한 피브리노겐 의약품, 및 이러한 의약품을 포함하는 용기를 제공한다.
통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 의약품은 약제학적 조성물, 즉, 필요에 따라 용매 중에서 추가로 재구성한 후, 의약품으로서 환자에게 투여할 수 있고, 및/또는 환자 또는 의사에게 판매 및/또는 배포할 수 있는 최종 투여 형태이다. 일반적으로 의약품은 원약(bulk drug substance)으로부터 제조된다. 본 개시에 있어서, 본 발명의 의약품 또는 이를 포함하는 용기는 또한 본 발명의 약품으로도 지칭된다.
본 발명에 따르면, 의약품은 건조되지만, 이는 물이 완전히 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것이 아니라, 오히려 약품이 고체 형태이고 전형적으로 건조되어 있음을 의미한다. 최신 기술의 다른 피브리노겐 의약품과 비교하여, 상기 명시된 바와 같이 2 내지 5%(w/w)의 상대적으로 높은 수분 함량을 가지고 있다. 동결건조는 바람직한 건조 옵션이지만, 약품을 분무 건조 또는 분무 동결 건조할 수도 있다. 수분은 물을 지칭한다. 의약품은 임의의 다른 용매를 유의미한 양으로 포함하지 않으며, 특히 약제학적 용도, 예를 들어 정맥내 투여와 양립할 수 없는 양의 용매(또는 기타 성분)를 포함하지 않는다.
본 발명자들은 놀랍게도 건열에 의한 바이러스 불활성화의 효능, 특히 외피가 없는 바이러스에 대한 바이러스 불활성화의 효능이 지정된 수분 함량에 따라 크게 증가하며, 또한 상기 바이러스에 의해 생산된 특정 수분 함량의 의약품은 여전히 높은 안정성과 우수한 용해도를 가지고 있다는 것을 밝혀냈다. 특히 효율적인 바이러스 불활성화와 높은 안정성 및 용해도는 이하의 실시예와 도면에서 입증된다. 따라서, 본 발명의 의약품은 특히 바이러스에 안전하고 안정성이 높으며 재구성시 용해도가 양호하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "피브리노겐(fibrinogen)"은 혈장 중에 존재하는 혈전의 형성에 관여하는 주요한 구조 단백질을 지칭하며, 바람직하게는 피브리노겐의 전체 당단백질 형태를 지칭한다. 바람직하게는 이는 혈장 피브리노겐, 즉 혈장에서 유래하는 피브리노겐을 지칭한다. 더욱 바람직하게는, 피브리노겐은 인간 혈장 피브리노겐이다. 대안적으로, 본 발명에 사용되는 피브리노겐은 재조합에 의해 생산될 수 있다.
바람직하게는, 의약품은 투여 단위 형태로 포장된다. 일반적으로 피브리노겐의 경우 이는 약 1g의 피브리노겐이 포장되어 있음을 의미한다. 환자에게 투여하기 전, 건조형태, 예를 들어 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품은 일반적으로 용매, 특히 수성 용매 중에서 재구성되어 용액이 얻어진다. 1g의 피브리노겐은 예를 들어 주사용수, 완충액 또는 혈장 중에서, 일반적으로 50mL로 재구성되어 전체 단백질, 주로 약 20g/L의 피브리노겐 용액을 제공할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기로서, 상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수로 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함한다. "재구성에 적합한(suitable for reconstitution)"는 용매, 특히 주사용수 중에서 하나의 용기의 내용물을 재구성할 때 크기가 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다는 것을 의미한다. 여기서, SVP의 양은 용기 내의 각각의 투여량 단위(예를 들어, 50mL 또는 50 내지 100mL) 내에서 SVP의 절대량을 의미한다.
전형적으로, 피브리노겐 의약품은 약 50 내지 98%(w/w), 바람직하게는 70 내지 95%, 예를 들어 80 내지 90%의 활성 피브리노겐을 포함한다. 따라서, 많은 경우, 1g의 (활성) 피브리노겐을 포장하려는 경우, 1g 초과의 의약품, 예를 들어 약 1.5 내지 2g의 피브리노겐 의약품이 용기에 포함된다. 의약품은 일반적으로 예를 들어 이하에 기재하는 바와 같은 부형제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 언급된 SVP의 최대 농도는 예를 들어 1g의 피브리노겐을 포함하는 피브리노겐 의약품의 하나의 용기를 재구성할 때 적용된다. 상기 SVP의 최대 농도는 예를 들어 2g 이상의 피브리노겐, 선택적으로 3g 또는 5g의 피브리노겐을 포함하는 피브리노겐 의약품의 한 용기를 재구성할 때 적용될 수도 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖고, 선택적으로 2.5 내지 3.5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는, 건조 형태, 바람직하게는 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품으로서, 상기 의약품이 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액이 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 피브리노겐 의약품을 제공한다.
Ph. Eur. 2.9.19 및 USP 788 (주사제 중의 입자상 물질에 대한 기준을 제공)에 따른 SVP에 대한 공식적 요건은 본 발명의 약품을 갖는 피브리노겐 의약품에 대해 처음으로 충족되었다. Ph. Eur. 2.9.19 및 USP 788는 일반적으로 입자 ≥ 10 ㎛의 경우 50 mL 용기당 ≤6000 입자, ≥25 ㎛ 입자의 경우 50 mL 용기당 ≤600 입자를 요구하며, 이는 120개의 입자(mL당 ≥10 ㎛) 및 12개의 입자(mL당 ≥25 ㎛)에 해당한다.
길이가 0.05㎛인 피브리노겐 분자(재구성된 의약품(DP)의 피브리노겐 농도: 20g/L, 분자량 약 340kDa, 농도 약 60μmol/L)의 수(Hall et al, 1959)는 예를 들어 mL당 약 17.7*1018일 수 있다. 재구성은 약리학적으로 허용되는 용매, 일반적으로 수성 용매를 사용하여 수행된다.
재구성은 약리학적으로 허용되는 용매, 일반적으로 수성 용매를 사용하여 수행된다. 바람직하게는 주사용수를 사용하지만, 예를 들어 생리식염수 또는 PBS와 같은 완충액 중에서 재구성할 수도 있다. 재구성 중, 피브리노겐 의약품은 용매에 용해된다. 재구성은, 필요에 따라 예를 들어 혼합, 예들 들어 볼텍스 믹서에 의한 혼합, 진탕, 주사기에 넣음을 포함하여, 용매를 용기에 첨가함으로써 필요에 따라 반복적으로 수행될 수 있다. SVP수의 분석을 목적으로 한 재구성에는 여과는 포함되지 않는다.
Ph. Eur. 2.9.19 및 USP 788에 따라, SVP의 양은 예를 들어 2 내지 400 ㎛ 크기 범위의 Hiac 모델 HRLD-400 센서가 장착된 입자 계수기 Hiac 모델 9703+(Beckman, Krefeld, Germany)에 의해 광 차폐에 의해 측정된다. 각 측정마다 단백질 용액 5mL를 모세관을 통해 흡인하여 센서를 통과시킨다. 최초의 측정은 시스템을 세척하는 데 사용되며 결과는 폐기된다. 다음 4개의 측정값의 평균은 용액 중의 SVP 수를 결정하는데 사용된다. 측정 전에 단백질 용액이 여과하지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요한다.
최종 피브리노겐 의약품(DP)의 경우, ≥ 10㎛ 및 ≥ 25㎛의 SVP 수를 결정하는 것이 바람직하다. 이를 위해 동결건조 DP를 주사용수(WFI) 50ml로 재구성하는 것이 바람직한다. 재구성된 용액은 추가 여과 없이 입자 계수기로 옮겨진다. 모든 샘플은 바람직하게는 3회 측정된다. 용기당 총 입자량의 평균값이 보고된다. SVP ≥ 25 ㎛도 SVP ≥10 ㎛ 그룹에 포함되므로, SVP ≥10㎛의 수는 항상 SVP ≥25㎛의 수보다 높다.
본 발명의 의약품에 포함되는 SVP의 수가 적기 때문에, 사전 여과 없이 해당 의약품을 안전하게 투여하는 것이 가능하다. 이는 시간이 중요한 경우에 특히 유리하다. 그러나 여과는 예를 들어 거품의 형성을 회피하는 방식으로 건조 생성물의 용액에 대해 계속 수행될 수 있다.
본 발명은 이러한 피브리노겐 의약품과 이를 포함하는 용기를 제조하는 재현 가능한 방법을 처음으로 제공한다. 따라서, 본 발명은 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치(batch)로서, 상기 배치로부터 10개 이상의 용기에 대해, 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수로 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻은 피브리노겐 용액은 10 내지 100μm의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100μm의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기의 배치도 제공한다. 바람직하게는, 이들 조건은 본 발명의 배치로부터 적어도 100개의 용기에 적용되고, 선택적으로 200개 이상의 용기에 적용된다. 또한, 이 제한은 본 발명의 배치로부터 최소한 500개의 용기에 대해서도 충족될 수 있고, 선택적으로 상기 배치의 실질적으로 모든 용기에 대해서도 충족될 수 있다. 용기는 배치로부터 무작위로 선택될 수 있으며, 바람직하게는 처음에 용기에 채워진 배치의 절반과 그 다음 용기에 채워진 배치의 절반 중에서 바람직하게는 동일하거나 대략 동일하게 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치로서, 상기 배치로부터의 적어도 최종 10%의 용기, 바람직하게는, 상기 배치로부터의 적어도 최종 20%의 용기, 선택적으로, 상기 배치의 실질적으로 모든 용기의 경우, 상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수로 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP 및 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기의 배치를 제공한다. 이 맥락에서 최종(Final)은 최후에 채워진 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 피브리노겐 의약품은 훨씬 더 적은 SVP를 함유한다. 예를 들어, 이는 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하는데 적합할 수 있다. 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻은 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP 및 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 60개 이하의 SVP를 포함한다. 선택적으로, 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하다. 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP 및 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 35개 이하의 SVP를 포함한다. 본 발명자들은 본 발명이 또한 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액이 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 2500개 이하의 SVP 및 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 30개 이하의 SVP를 포함하는 본 발명의 피브리노겐 의약품을 제공한다는 것을 보여줄 수 있었다.
본 발명이 본 발명의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치에 관한 한, 상기 피브리노겐 의약품은 2 내지 5%(w/w), 바람직하게는 2.5 내지 3.5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는다. 이는 배치내의 각 의약품에 상기 잔류 수분을 포함하고 있음을 의미한다.
본 발명의 피브리노겐 의약품은 바이알, 예를 들어 글래스 바이알 또는 플라스틱(예를 들어 폴리에틸렌) 바이알과 같은 용기에 포장된다. 바람직하게는, 용기는 유리 용기이다. 용기는 예를 들어 적어도 50mL의 용액을 첨가할 수 있는 용적을 가질 수 있다. 바람직하게는 용기는 100mL의 공칭 충전 용적(nominal filling volume)을 갖는다. 용기는 또한 주사기, 예를 들어 단일 챔버 주사기일 수 있다. 이는 또한 챔버 중 하나에 피브리노겐 의약품을 포함하는 이중 챔버 주사기일 수도 있다.
본 발명은 적합한 용기, 예를 들어 바이알 및/또는 적합한 전달 장치내에 본 발명의 의약품을 포함하는 키트를 제공한다. 더욱 바람직하게는, 상기 전달 장치는 상기 용매를 포함하는 용기로부터 의약품을 포함하는 용기로 적합한 용매(예: 주사용수)의 청정 또는 무균 전달을 용이하게 하는 장치이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 전달 장치는 또한 용해된 생성물을 투여용 장치, 예를 들어 주사기로 전달하는 것을 용이하게 한다. 이러한 전달 장치는 시판되어 있으며(예를 들어 Mix2Vial®(West), Nextaro®(SFM)), 통상의 기술자에게 알려져 있다. 상기 전달 장치는 선택적으로 하나 이상의 필터, 예를 들어 박테리아를 제거하거나 용매 및/또는 약품 중에 있는 입자를 제거할 수 있는 필터를 포함한다. 이러한 필터는 예를 들어 용기의 마개에 침투한 결과로서 의약품 또는 용매에 들어간 입자(예: 바늘로 침투하여 고무 마개에서 나온 물질)를 확실히 제거하는데 사용된다. 메쉬 필터나 막 필터는 적절하다고 판단되면 사용할 수 있다. 이러한 필터(들)의 기공 크기는 3㎛ 내지 25㎛ 범위, 바람직하게는 4㎛ 내지 10㎛ 범위일 수 있다. "기공 크기(pore size)"라는 용어는 공칭 기공 크기와 관련이 있다.
용해된 의약품이 통과하는 필터의 경우 바람직하게는 막 필터를 사용한다. 바람직하게는, 상기 필터는 3 내지 10㎛, 보다 바람직하게는 4 내지 9㎛, 예를 들어 5 또는 8㎛의 기공 크기를 갖는다. 본 발명자들은 아크릴 공중합체로 제조된 멤브레인 필터를 사용하면 특히 양호한 결과를 얻을 수 있음을 발견했다.
따라서, 본 발명은 또한 적합한 용기(예를 들어, 바이알) 내에 본 발명의 의약품, 및 상술한 바와 같은 적합한 전달 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 키트는 의약품을 용해시키기 위한 수성 용매(예를 들어, 주사용수)를 포함하는 적합한 용기를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 (i) 적합한 용기(예를 들어, 바이알)내의 본 발명의 의약품, (ii) 3 내지 10㎛의 기공 크기를 갖는 의약품을 여과하기 위한 필터를 포함하며, 바람직하게는 막이 아크릴 공중합체 막인, 적합한 전달 장치, 및 (iii) 수성 용매(예를 들어, 주사용수)를 포함하는 적합한 용기;를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 용기는 전형적으로 1g의 피브리노겐을 함유하는 피브리노겐 의약품을 함유하지만, 이는 다른 양, 예를 들어 0.5 내지 10g 또는 1 내지 5g, 예를 들어 2g 또는 5g의 피브리노겐을 포함할 수도 있다.
바람직하게는, 용기, 예를 들어 바이알은 주사용수 50mL에 20g 피브리노겐/L의 농도로 재구성하는데 적합하다. 본 명세서에서 정의되는 SVP의 수를 측정하기 위한 재구성은 또한 전형적으로 상기 농도에서 수행된다.
본 발명의 피브리노겐 의약품은 건조되고, 바람직하게는 동결건조 된다. 분무건조 또는 분무 동결건조 할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은 피브리노겐 및 명시된 잔류 수분 이외에,이하를 포함할 수 있다:
a) 폴리소르베이트,
b) 선택적으로 증량제(bulking agent),
c) 선택적으로 아미노산 및/또는
d) 선택적으로 소금.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은, 발명자들이 폴리소르베이트가 바람직한 잔류 수분 함량에서 건열 처리 시 바이러스량 감소에 기여한다는 것을 증명할 수 있는 바와 같이, 바람직하게는 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 80을 포함하며, SVP를 감소시키는데 더욱 유용할 수 있다. 폴리소르베이트 20이 대체 약품이다.
본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치(batch)는 또한 증량제(bulking agent), 선택적으로 트레할로스를 포함할 수 있다. 바람직하게는 증량제는 또한 동결보호제로서도 작용한다. 만노스가 대안적으로 사용될 수 있지만, 발명자들은 트레할로스가 더 양호한 케이크 및 더욱 양호한 가용화 특성을 초래한다는 것을 발견했다.
본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 아미노산, 선택적으로 아르기닌을 추가로 포함할 수 있다. 아미노산은 바람직하게는 안정화 효과를 갖는다. 라이신은 대안적으로 사용할 수 있지만, 발명자들은 아르기닌이 더 양호한 케이크와 더 양호한 가용화 특성을 초래한다는 것을 발견했다.
또한, 본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 염, 바람직하게는 염화나트륨, 시트르산나트륨, 또는 이들의 조합, 선택적으로 염화나트륨 및 시트르산나트륨을 포함할 수 있다. 염은 예를 들어 완충제 및/또는 등장성 용액을 제공하는 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 독성으로 인해 상당한 양의 칼륨을 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은 예를 들어 이하를 포함할 수 있다:
a) 폴리소르베이트 80,
b) 트레할로스,
c) 아르기닌 및
d) 염, 바람직하게는 염화나트륨, 시트르산나트륨 및 이들의 조합.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은 폴리소르베이트 80, 트레할로스, 아르기닌, 나트륨, 염화물, 시트레이트 및 잔류 수분을 포함한다. 이는 바람직하게는 1mM 미만의 농도로 칼슘을 추가로 포함할 수 있다. 칼슘 농도가 높을수록 원하지 않는 복합체 형성에 기여할 수 있다. 본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 알부민, 피브로넥틴, α2-마크로글로불린, IgG, IgA 또는 IgM 등의 면역글로불린, 폰 빌레브란트 인자(vWF), 피브리노펩티드 A 및 D-이량체를 포함하는 군으로부터 선택되는 추가 혈장 단백질을, 예를 들어 이들의 미량, 바람직하게는 이하의 실시예에 제공되는 대략적인 농도로 추가로 포함한다.
본 발명에 사용되는 바람직한 피브리노겐 의약품은 실질적으로 언급된 성분, 즉 피브리노겐, 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트레할로스 등의 증량제, 아르기닌 등의 아미노산, 염화나트륨 및/또는 구연산나트륨 등의 염, 또는 알부민, 피브로넥틴, α2-마크로글로불린, IgG, IgA 또는 IgM 등의 면역글로불린, 폰 빌레브란트 인자, 피브리노펩티드 A 및 D-이량체, 및 잔류 수분을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질로 실질적으로 이루어진다.
예를 들어, 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품은, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 주사용수 중에 20g/L로 재구성할 때, 95 내지 135mmol/L Na, 1mmol/L 미만 Ca, 100 내지 160mmol Cl, 3 내지 7mmol/L 시트레이트, 25 내지 55mmol/L 아르기닌, 22 내지 38mmol/L 트레할로스 및 0.03 내지 0.07% 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.
특히, 바람직하게는, 본 발명의 의약품은 언급된 것보다 현저하게 더 많은 알부민을 포함하지 않으며, 예를 들어, 이는 바람직하게는 20g/L 피브리노겐으로 재구성 시 0.5g/L 미만의 알부민, 바람직하게는 0.15g/L 미만의 알부민을 포함한다. 따라서 환자에게 적절한 용량의 피브리노겐과 알부민을 별도로 투여할 수 있으며, 또한, 피브리노겐과 알부민 모두에 대한 품질관리 공정을 수행할 필요가 없다. 바람직하게는, 상기 언급된 비피브리노겐 혈장 단백질은 별도의 투여를 허용하기 위해 20g/L 피브리노겐으로 재구성 시 0.5g/L보다 높은 농도로 함유되지 않는다.
본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 사카로스 및/또는 글루타메이트, 바람직하게는 사카로스 또는 글루타메이트를 포함하지 않는 것이 추가로 바람직하다. 사카로스는 특히 당뇨병과 관련하여 문제가 된다. 글루타메이트에 대한 우려는 "중국 레스토랑 증후군"이라는 맥락에서 논의되고 있다.
본 발명자들은 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품이 매우 안정하다는 것을 발견했다. 본 발명자들은 유리하게는, 본 발명의 의약품이 건조 형태로 보관될 때 2 내지 25℃에서 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 1년 동안, 선택적으로 적어도 5년 동안 안정하다는 것을 발견했다. 또한, 이하의 예시와 같이 재구성 후 2 내지 8℃에서 적어도 8주 동안 현저한 열화 없이 보관할 수 있다. 안정하다는 것은 바람직하게는 의약품이 원래 함유되어 있던 특정 피브리노겐 활성의 80% 이상, 선택적으로 90% 이상을 유지한다는 것을 의미한다.
본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 바람직하게는 20% 미만의 응집체, 바람직하게는 10% 미만의 응집체를 포함한다. 응집체는 일반적으로 피브리노겐의 다량체, 예를 들어 이량체, 삼량체 등이다. 응집체의 비율은 HP-SEC 분석을 통해 확인할 수 있다. 비율은 피브리노겐의 총량과 비교하여 응집체 형태로 존재하는 피브리노겐의 검출량으로 지정된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 건조 의약품을 수성 용매, 특히 주사용수 중에서 재구성함으로써 얻을 수 있는 본 발명의 피브리노겐 용액을 제공하며, 여기서 상기 용액은 본 명세서에 정의되는 적은 수의 SVP를 포함한다. 또한, 주사용수 또는 다른 수성 용매를 본 발명의 건조 의약품에 첨가하는 것을 포함하는, 상기 피브리노겐 용액을 재구성하는 방법도 제공된다.
본 발명의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 제조 방법
다른 실시형태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 본 발명의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 제조 방법을 제공한다:
a) 피브리노겐 원약의 벌크 용액을 무균 여과하는 단계,
b) 선택적으로 교반 수단을 갖는 교반기를 포함하는 수용 탱크에 무균 여과된 벌크 용액을 수용하는 단계,
c) 선택적으로, 교반 수단이 상기 벌크 용액 중에 침지되어 있을 때 수용 탱크의 벌크 용액을 교반하는 단계,
d) 예를 들어 펌프를 이용하여, 소정량의 용액을 용기에 충전하는 단계,
e) 상기 용기내의 용액을 동결건조하여 동결건조 의약품을 얻는 단계,
f) 상기 동결건조 의약품을 건열로 처리하는 단계,
g) 선택적으로, 상기 의약품을 포함하는 용기를 포장하는 단계.
하나의 실시형태에서, 방법은 이하의 단계를 포함한다:
a) 피브리노겐 원약 물질의 벌크 용액을 무균 여과하는 단계,
b) 무균 여과된 벌크 용액을 수용 탱크에 수용하는 단계,
c) 상기 수용 탱크내에서 벌크 용액을 교반하지 않는 단계,
d) 예를 들어 펌프를 이용하여, 소정 량의 용액으로 용기를 충전하는 단계,
e) 용기 내에서 용액을 동결건조 하여 동결건조 의약품을 얻는 단계, 및
f) 동결건조 의약품을 건열로 처리하는 단계,
g) 선택적으로, 의약품을 포함하는 용기를 포장하는 단계.
본 발명자들은 놀랍게도 충전 단계 전 및/또는 충전 단계 중에 벌크 용액을 교반할 필요가 없다는 것을 발견했다. 용액은 전체 충전 공정 동안, 예를 들어 교반하지 않고 2 내지 3시간에 걸쳐 균질하게 유지된다. 충전 중에 채취한 샘플은 교반이 없는 경우에도 전체 충전 과정에서 피브리노겐 및 기타 성분의 일정한 농도를 보여준다. 본 발명자들은 또한 교반 공정의 감소 또는 회피에 의해 SVP의 양이 감소한다는 것을 발견했다.
의약품의 불균일 위험을 더욱 회피하기 위해 짧은 시간 동안 및/또는 온화한 조건 하에서 교반하는 것도 본 발명의 방법에 포함될 수 있다. 따라서 일반적으로 이 방법은 이하의 단계를 포함한다.
a) 피브리노겐 의약품의 벌크 용액을 무균 여과하는 단계,
b) 교반 수단을 갖는 교반기를 포함하는 수용 탱크에 무균 여과된 벌크 용액을 수용하는 단계,
c) 교반 수단이 상기 벌크 용액에 침지되어 있을 때 수용 탱크의 벌크 용액을 교반하는 단계,
d) 예를 들어 펌프를 이용하여, 소정량의 용액으로 용기를 충전하는 단계,
e) 용기 내에서 용액을 동결건조 하여 동결건조 의약품을 얻는 단계, 및
f) 상기 동결건조 의약품을 건열로 처리하는 단계,
g) 선택적으로, 의약품을 포함하는 용기를 포장하는 단계.
교반은 용액의 불균일성 및 그에 따른 불균일한 포장을 매우 확실하게 회피할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 발명자들은 교반하지 않아도 용액이 충분히 균일하다는 것을 발견했다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 충전 라인을 도 1에 도시한다.
상기 a) 단계의 무균 여과는 0.2㎛의 메쉬 크기를 갖는 필터를 사용하여 수행하는 것이 바람직하며, 이에 따라 용액은 무균 여과된다. 피브리노겐 원약 물질의 용액은 일반적으로 스테인리스 스틸 탱크 또는 예를 들어 80 L를 담을 수 있는 플라스틱 용기(백 등)일 수 있는 공급 탱크로부터 상기 필터를 통과한다. 용액은 압력 라인에 의해 필터를 통해 압착된다. 전달 압력은 최대 600mbar(600hPa)이다. 선택적으로, 무균 여과 후 용액을 수용 탱크로 직접 통과시킨다(단계 b).
단계 b)에서, 무균 여과된 벌크 용액은 수용 탱크, 예를 들어 스테인리스강 탱크에 수용된다. 용적은 예를 들어 50L일 수 있다. 수용 탱크는 선택적으로 교반 수단, 바람직하게는 교반 막대 또는 봉을 갖는 교반기를 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "a"는 "적어도 하나"를 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 교반 탱크는 2개 이상의 교반기를 포함할 수도 있다. 교반기는 적어도 하나의 교반 수단, 예를 들어 하나의 교반 날개를 가질 수도 있다. 바람직하게는 2개 이상의 교반 수단, 예를 들어 교반 날개를 갖는다. 2개의 날개가 있는 교반기에서 날개는 일반적으로 서로 반대편을 향하고 있다. 교반 수단, 예를 들어 교반 날개는 바람직하게는 수평 방식으로 회전하여 용액을 혼합한다. 교반 날개는 일반적으로 회전하는 중앙 구동 샤프트에 부착되어 교반 날개를 이동시킬 수 있다. 교반 수단은 또한 교반 막대, 예를 들어 자석 교반 막대일 수 있다. 교반 수단은 스윙 플레이트일 수도 있고, 복수의 스윙 플레이트일 수도 있다.
선택적인 단계 c)에서, 교반 수단이 상기 벌크 용액에 침지되어 있을 때, 수용 탱크에서 벌크 용액이 교반된다. 따라서, 교반 날개 또는 기타 교반 수단(여러 개의 교반 수단 또는 날개가 있는 경우 모든 교반 수단 또는 날개)이 물에 침지되기 전에는 용액을 교반하지 않는다. 결과적으로, 종래 기술 방법과 대조적으로, 교반 수단이 침지된 수용 탱크에 충분한 용액이 수용되기 전에는 용액을 교반하지 않는다. 이는 상기 벌크 용액의 표면이 교반 시 교반 수단에 의해 깨지지 않는 효과를 갖는다. 따라서 거품 형성이 방지되고 용액이 받는 전단력이 최소화된다. 충전 중에 용액을 교반하면, 수용 탱크의 용액이 용기에 충전되고 수용 탱크의 용액 수위가 다시 떨어질 때에, 용액의 수위가 교반 수단 아래로 떨어지기 전에 교반을 중단하고, 따라서 교반 시 교반 수단에 의해 상기 벌크 용액의 표면이 깨지지 않도록 한다.
교반 시간은 전단 응력에 대한 노출을 더욱 최소화하기 위해 50L 수용 탱크에 대해 바람직하게는 최대 1시간, 보다 바람직하게는 최대 10분, 가장 바람직하게는 최대 5분으로 제한된다. 시간은 용액과 탱크의 부피에 따라 조정될 수 있으며, 예를 들어 탱크가 큰 경우 및/또는 용액의 량이 많은 경우 교반 시간이 더 길어질 수 있다.
소규모 실험에서는 교반 속도나 교반 시간, 교반기의 기하학적 특성이 형성된 SVP의 수에 영향을 미칠 수 있음을 보여주고 있다.
바람직하게는, 상기 교반기, 예를 들어 전술한 바와 같이 회전하는 수직 구동축에 고정된 두 개의 수평 교반 날개를 갖는 교반기는 최대 150rpm, 예를 들어 30 내지 100rpm 또는 50 내지 80rpm의 속도로 회전시킨다. 바람직하게는, 용액이 노출되는 전단력은 50 L의 원통형 스테인리스강 수용 탱크 내의 용액이 최대 150rpm, 예를 들어 80rpm의 속도로 회전되는 상기 정의된 바와 같은 2개의 교반 날개를 갖는 바람직한 교반기에 의해 노출되는 전단력보다 높지 않다.
특히 바람직한 실시형태에서, 50L의 원통형 스테인레스 스틸 수용 탱크, 예를 들어 충전 라인 KS 1025, 예를 들어 독일 Ilshofen 소재 Bausch & Strbel의 모델 AS18.3에서는, 0 내지 5분 동안 150rpm 이하, 예를 들어 80rpm의 교반 속도가 SVP 형성을 최소화하는 것으로 나타났다.
또한 충전 중에 교반이 필요하지 않은 것으로 나타났다. 수용 탱크에 추가로 벌크 약물 용액을 추가하는 경우, 상술한 바와 같이 제한된 시간 동안 교반을 다시 시작할 수 있다. 이 경우, 약물 용액이 너무 오랫동안 교반되지 않도록 전체 교반에 최대 교반 시간이 적용된다. 추가 용액을 추가해야 하는 경우, 수용 탱크내에 용액이 아직 너무 많아서 교반 날개가, 존재하는 경우, 회전시켜도 용액의 표면이 깨지지 않도록 하는 것이 유리하다.
본 발명자들은 놀랍게도 이러한 원활하거나 온화한 교반 및 그에 따른 피브리노겐 용액에 노출되는 전단력의 최소화가 본 발명에 사용되는 의약품에 유리하게 포함되는 SVP의 수를 낮추는 결과를 가져온다는 것을 발견했다. 본 발명자들에 의해 수행된 시험은 무균 여과 후 피브리노겐 용액이 노출되는 전단력이 재구성된 약품 중 SVP 수의 상당한 증가를 초래할 수 있음을 보여주었다. 특히, 수용 탱크내의 교반은 중요한 공정이다. 균일한 약품을 얻기 위해서는 교반이 중요할 수 있지만, 지나치게 교반하거나, 용액의 표면이 깨지거나 거품이 발생하는 등 잘못된 조건에서 교반하는 경우, SVP의 수가 높아지게 되는 것으로 나타났다.
단계 d)에서는 펌프나 다른 수단을 사용하여 용기에 소정량의 용액을 충전한다. 펌프는 최대 300rpm, 예를 들어 200 내지 290rpm, 예를 들어 최대 270rpm의 속도로 사용되는 연동 펌프일 수 있다. 용기 내의 피브리노겐의 소정 량은 바람직하게는 1 내지 5g, 선택적으로 1g, 2g 또는 3g, 예를 들어 1g이다.
단계 e)에서, 충전된 용기, 예를 들어 바이알내의 원약 물질을 동결건조 한다. 바람직하게는, 용기는 미리 냉각된 동결 건조기에 로딩된다. 이에 따라, 단백질 용액의 급속 동결이 가능하게 되고, 양호한 다공질 케이크 구조가 얻어지며, 물의 승화가 향상한다. 본 발명의 방법에서, 동결건조 조건은 바람직하게는 동결건조 후 2 내지 5%(w/w), 선택적으로 2.5 내지 4%, 또는 2.5 내지 3.5%(w/w), 예를 들어 약 3%(w/w)의 잔류 수분 함량을 얻도록 선택된다.
본 발명에 사용되는 동결건조 의약품의 잔류 수분 함량은 주로 동결건조 조건에 따라 달라진다. 제형의 성분, 예를 들어 폴리소르베이트 80은 원하는 잔류 수분 함량을 얻기 위해 동결건조 조건을 조정해야 하는 한 잔류 수분 함량에 영향을 미칠 뿐이다.
본 발명의 바람직한 의약품의 상대적으로 높은 잔류 수분 함량의 특별한 이점은 잔류 수분 함량이 높기 때문에 바이러스 불활성화가 동결건조 후 수행되는 건열 처리 중에 특히 효과적이라는 것을 발명자들이 발견했다는 것이다. 일반적으로 높은 잔류 수분 함량은 약품의 완전성에 유해하지만, 본 발명자들은 놀랍게도 규정된 잔류 수분 함량을 갖는 본 발명의 약품이 매우 안정하다는 것을 발견했다. 2.5 내지 3.5%의 잔류 수분 함량을 갖는 약품이 두 매개변수 모두에서 최적인 것으로 나타났다.
건열 처리에 의한 바이러스 불활성화의 개선은 돼지 파보바이러스(Porcine Parvovirus, PPV)의 예와 같이 외피가 없는 바이러스에 대해 나타날 수 있다. HIV(인간 면역결핍 바이러스) 또는 BVDV(소 바이러스-설사 바이러스)와 같은 외피 바이러스에 대한 연구에서는 이러한 효과가 그렇게 명확하게 나타나 있지 않다. 이는 다른 바이러스 불활성화 효과, 예를 들어, 본 발명의 약품에 바람직하게 포함된 폴리소르베이트로 인해 동결건조 시, 즉 건열 처리 전, 모든 공정에서 이미 외피 바이러스의 매우 우수한 바이러스 불활성화를 초래하기 때문일 수 있다. 즉, 잔류 수분 함량이 더 낮은 경우에도 잔류 수분 함량을 분석했다. 따라서 피브리노겐 의약품의 제조에 있어서, 외피가 없는 바이러스는 선택적으로 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 80의 존재 하에 2 내지 5% 잔류 수분 함량을 함유하도록 동결건조된 피브리노겐 용액의 건열 처리에 의해 비활성화되는 것이 바람직하다. 외피 바이러스는 바람직하게는 본 명세서에 기술된 바와 같이 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 80의 존재 하에 피브리노겐 용액의 동결건조 및/또는 UV-C 처리에 의해 불활성화된다. 바람직하게는 이러한 모든 조치가 수행되어 바이러스에 안전한 약품의 제공에 기여한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 동결건조 방법은 이하의 단계를 포함한다:
a) 29℃ 이하에서 적어도 4시간 동안, 바람직하게는 -50℃ 이하에서 약 8시간 동안 동결건조 (바람직하게는 급속 냉동) 하는 단계,
b) -10℃ 이하 및 적어도 40 μbar(4 Pa)에서 1차 단계적으로 건조하는 단계, 여기서 바람직하게는, -25℃미만 및 적어도 200μbar(20Pa), 바람직하게는 280μbar(29Pa)에서 시작하여 각 단계에서 온도가 증가함,
c) 17 내지 23℃에서 적어도 2시간 동안 2차 건조하는 단계,
상기 명시한 바와 같이, 바람직하게는 상기 동결건조 후 잔류 수분 함량은 2 내지 5%(w/w)이다.
동결건조 방법은 보다 구체적으로 이하의 단계를 포함할 수 있다:
a) -52℃ 이하에서 8시간 이상 동결하는 단계,
b) 1차 단계적으로 건조하는 단계, 이때 제1 단계는 약 -36℃, 약 280 μbar(28 Pa)에서 약 5 내지 48시간 동안 수행되며, 제2 단계는 약 -23℃, 약 70 μbar에서 약 25 내지 45시간 동안 수행되며, 제3 단계는 약 -10℃, 약 40 μbar(4 Pa)에서 약 45 내지 84시간 동안 수행되며, 예를 들어, 상기 제1 단계는 약 -36℃, 약 280 μbar(28 Pa)에서 약 45시간 동안 수행되며, 상기 제2 단계는 약 -23℃, 약 70 μbar에서 약 45시간 동안 수행되며, 상기 제3 단계는 약 -10℃, 약 40 μbar(4 Pa)에서 약 45시간 동안 수행됨,
c) 약 20℃, 약 10 μbar(1 Pa)에서 약 3 내지 4시간 동안 2차 건조하는 단계.
대안적으로, 단계 b)의 1차 단계적으로 건조하는 단계는 예를 들어,약 -36℃에서 약 5시간 동안 약 280μbar에서 수행되는 제1 단계, 약 -23℃, 약 70 μbar에서 약 25시간 동안 수행되는 제2 단계, 및 -10℃, 약 40μbar에서 약 78시간 동안 수행되는 제3 단계로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 f)에서는 건열 처리를 수행한다. 건열에 의한 처리는 예를 들어 의약품을 100℃±1.5℃, 예를 들어 99 내지 100℃로 가열하는 것을 포함할 수 있다. 건열 처리는 20 내지 60분, 바람직하게는 20 내지 40분 동안 수행할 수 있다. 30 +/- 3분으로 양호한 결과를 얻었다. 건열에 의한 처리는 바람직하게는 증기 오토클레이브에서 수행되고, 예를 들어 관통될 수 있는 고무 마개로 용기를 폐쇄한 후 수행된다.
의약품은 단계 g)에서 선택적으로 포장된다. 예를 들어, 의약품이 20g 피브리노겐/L의 주사용수에 용해된다는 것, 및/또는 이것이 정맥 투여용인 것을 명시하는 패키지 삽입물이 추가될 수 있다. 필터는 의약품 용기와 함께 포장될 수 있다.
본 발명의 의약품을 포함하는 용기를 제조하는 바람직한 방법은 이하의 단계를 포함할 수 있다:
원약 물질(drug substance), 즉 제형화 약품을 무균 여과(sterile filtration, 0.2μm)한 후, 바이알 등의 용기에 충전된다. 충전의 경우, 바람직하게는 원약 물질을 수용 탱크에 수용하고 선택적으로 거품 형성을 회피하면서 조심스럽게 교반하는 한편, 교반기의 교반 날개 또는 기타 교반 수단을 예를 들어 최대 5분 동안 원약 용액으로 덮거나 전혀 교반하지 않는다. 교반기는 150rpm 이하, 바람직하게는 80rpm 이하로 작동된다. 이어서 원약을 바람직하게는 290rpm 이하, 예를 들어 270rpm 이하의 연동 펌프를 사용하여 용기에 충전한다. 일반적으로, 예를 들어 약 1g의 피브리노겐에 해당하는 32ml가 용기에 충전한다. 이어서 잔류 수분 함량이 2 내지 5%가 되도록 동결건조한 다음 추가 바이러스 불활성화를 위해 약 30분, 99 내지 100℃에서 건열 처리를 수행한다. 이어서, 의약품을 포함하는 용기를 포장할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 단계 a) 전에 피브리노겐 원약을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 피브리노겐은 이하에 또는 실시예에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 이는 또한 다른 방법, 예를 들어 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수도 있다.
피브리노겐을 제조하기 위한 출발 물질은 일반적으로 인간 혈장이다. 인간 혈장의 동결 침전 제제는 냉동 혈장을 0 내지 4℃에서 해동하고 원심분리 또는 기타 분리기를 사용하여 침전물을 분리함으로써 얻을 수 있다.
동결 침전 제제 1kg당 물(WFI) 2.91kg, 에탄올 25%(v/v) 114g 및 헤파린 9,000IU의 혼합물을 제조할 수 있다. 동결 침전 제제는 교반하면서 WFI/에탄올/헤파린 용액에 첨가될 수 있다. pH 값은 7.0으로 조정될 수 있다.
사용된 동결 침전 제제 kg당 2% 수산화알루미늄 현탁액 108g을 첨가하고, 혼합물을 22.5℃에서 교반할 수 있다. pH 값을 6.55로 조정한 후 원심분리기를 계속 작동하여 원심분리 할 수 있다.
1% 폴리소르베이트 80 및 0.3% 트리-n-부틸 포스페이트를 교반하면서 첨가할 수 있다. 단백질 용액은 25.0℃에서 적어도 8시간에 걸쳐 교반될 수 있다.
음이온 교환 겔 Toyopearl TSK DEAE-650 (디에틸아미노에틸기를 갖는 매트릭스 물질로서의 수산화 메타크릴 중합체 비드)를 컬럼 크로마토그래피로 추가 정제하는데 사용할 수 있다. 단백질 로딩량은 음이온 교환 겔 mL 당 단백질 약 50 ± 10 mg일 수 있다.
단백질 용액의 염화물 함량은 NaCl 용액을 첨가하여 120mmol/L로 조정할 수 있다. 단백질 용액을 컬럼에 적용할 수 있다. 플로우 스루 분획(flow through fraction)에는 피브리노겐이 포함되어 있고, 이는 추가 처리를 위해 수집될 수 있다.
생성된 피브리노겐 용액(플호우 스루)은 글리신 침전을 할 수 있다. 피브리노겐을 침전시키기 위해 글리신을 최종 농도 1.2M로 첨가할 수 있다. NaCl을 최종 농도 2M까지 첨가할 수 있다. 침전물을 함유한 피브리노겐은 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 피브리노겐 페이스트는 -70℃ 이하의 온도에서 보관할 수 있다.
침전물은 완충액(15 mM 구연산 삼나트륨 이수화물, pH 값: 6.9 +/-0.1, 전도도: 3.3 +/- 0.5 mS/cm)에 재현탁할 수 있다. 다른 단백질(예: 0.7 내지 0.9 U/mg vWF) 외의 조성물은 TnBP, 폴리소르베이트 80, 글리신 및 NaCl을 포함한다. 조성물을 여과하고 UVivatec 장치(Sartorius Stedim Biotech)와 같은 장치를 이용하여 바이러스 불활성화를 위한 UV-C 처리를 할 수 있다. 조사는 125 내지 200 J/m2를 사용하여 254 nm ±1 nm에서 수행하는 것이 바람직하다.
이하의 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 경우, 컬럼(POROS™ 50 HS)은 평형 완충액 (15 mM 구연산 삼나트륨 이수화물, 65 mM 염화나트륨, pH 값: 6.5 +/- 0.1, 전도도: 9.0 +/- 1.5 mS/cm, 2 내지 5 컬럼 용적)으로 평형화 할 수 있다.
UV 조사 단계에서 생성된 피브리노겐을 함유한 액체 상은 상기 조성물을 15 mM 구연산 삼나트륨, pH 값: 6.5 +/- 0.1 및 전도도: 9.0 +/- 1.5 mS/cm로 조절하여 제조할 수 있다. 컬럼에는 겔 체적 리터당 10~20g/l의 단백질을 로딩할 수 있다.
컬럼은 세척 완충액(15 mM 구연산 삼나트륨 이수화물, 65 mM 염화나트륨, pH 값: 6.5 +/- 0.1, 전도도: 9.0 +/- 1.0 mS/cm, 2-5 컬럼 체적)으로 헹굴 수 있다.
다음에, 용출 완충액(7.5 mM 구연산 삼나트륨 이수화물, 150 mM 염화나트륨, 75 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, pH 값: 7.0 +/- 0.1, 전도도: 19.5 +/- 1.5 mS/cm)을 사용하여 피브리노겐을 용출할 수 있다. 이 단계에서 피브리노겐은 컬럼에서 용출된다. vWF의 대부분은 여전히 칼럼에 결합된다.
다음에 컬럼을 더 높은 염 농도의 완충액(15 mM 구연산 삼나트륨 이수화물; 1.5 M 염화나트륨, pH 값: 6.5 +/- 0.1, 전도도: 113.5 +/- 5.0 mS/cm)으로 헹구어 컬럼에서 vWF를 용출할 수 있다. 다음에 1M 수산화나트륨을 사용하여 컬럼을 세척할 수 있다.
이 방법에서는 알부민과 IgG의 대부분이 침전단계에서 이미 피브리노겐으로부터 분리되어 있는 반면, 이들은 CEX 물질에 결합하지도 않는다. 이 방법을 사용하면 피브리노겐을 함유한 액체 상에 존재하는 vWF의 50% 이상을 제거할 수 있다.
원약의 제조에서는, 용출 분획을 한외여과법을 이용하여 농축하고, 시트레이트 완충액을 이용하여 단백질 농도를 리터당 피브리노겐 33g으로 조정한다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 추가 성분을 첨가하여 최종 원약을 형성할 수 있다.
단계 a)와 이후의 단계에서 설명되어 있는 바와 같이, 이어서 원약을 바람직하게는 상술한 조건 하에서 다양한 용기, 예를 들어 바이알에 여과(0.2㎛)한다. 잔류 수분 함량이 2 내지 5%(w/w)가 될 때까지 건조, 바람직하게는 동결건조 한다. 이어서, 바람직하게는 추가 바이러스 불활성화 단계로서 증기 오토클레이브에서의 최종 열처리(예를 들어, 약 100℃, 30분)를 수행한다. 얻어진 약품은 놀라울 정도로 안정적이다.
본 발명의 방법에서는 SVP의 수를, 특히 본 명세서에 기술된 한계까지 감소시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 이를 위해서는 온화한 충전 조건이 특히 중요하다. 본 발명의 방법은 또한 바이러스, 예를 들어 외피 없는 바이러스의 수를 감소시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 이를 위해, 바람직하게는 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 80의 존재 하에 2 내지 5%의 잔류 수분 함량에서의 건열 처리가 특히 중요하다. 조합하면, 본 발명의 방법은 환자에게 특히 안전한 약품을 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명의 방법으로부터 얻을 수 있는 본 발명의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치를 제공한다.
용도, 특히 의료 용도
다른 실시형태에서, 본 발명은 피브리노겐 결핍증의 치료에 사용하기 위한 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기를 제공한다. 예를 들어, 피브리노겐 의약품은 유전적 피브리노겐 관련 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 의약품은 선천성 피브리노겐 결핍증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 피브리노겐 결핍증은 예를 들어 선천성 무섬유소원혈증, 선천성 저섬유소원혈증, 피브리노겐 축적병, 선천성 섬유소원이상증, 유전성 피브리노겐 Aα 사슬 아밀로이드증, 선천성 저섬유소원혈증 또는 저온섬유소원혈증일 수 있다.
본 발명의 피브리노겐 의약품은 또한 후천성 섬유소원혈증 또는 후천성 저섬유소원혈증과 같은 후천성 피브리노겐 관련 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
피브리노겐 결핍증이 후천성인 경우, 의약품은 선택적으로 (심각한) 수술 과정 중의 혈액 손실 또는 출혈을 치료하는데 사용하는 것이 바람직하다. 혈액 손실이나 출혈은 외상으로 인한 것일 수도 있다.
본 발명의 의약품은 신선 냉동 혈장과 같은 혈장 제제 대신에 투여될 수 있다. 본 약제에서는 혈장 단백질을 환자의 필요에 따라 별도로 투여할 수 있기 때문에, 이러한 혈장 약품 대신에, 또는 알부민과 같은 다른 혈장 단백질을 다량으로 포함하는 피브리노겐 약품 대신에, 본 발명의 피브리노겐 의약품을 투여하는 것이 유리하다. 특히, 피브리노겐 투여는, 출혈이 있는 경우, 즉 출혈 치료를 위해 또는 피브리노겐 결핍이 있는 경우 출혈의 방지를 위해 필요하게 된다. 본 발명의 의약품은 또한 특히 바이러스에 안전하다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 피브리노겐 의약품을 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 상술한 증상 중 하나를 앓고 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피브리노겐 결핍증을 치료하는 방법을 제공한다. 의약품이 투여되는 환자는 바람직하게는 인간 환자이다.
전형적으로, 본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 재현탁 후 환자에게 정맥내 투여하는데 사용하기 위해 제제화된다. 본 명세서에 정의된 SVP의 수가 적기 때문에, 본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 유리하게는 재현탁 후 사전 여과 없이 환자에게 투여하기에 적합하다. 이에 따라 특히 긴급 상황에서 시간이 절약된다. 그러나 피브리노겐 의약품은 재현탁 및 여과 후에 사용할 수도 있다. 필터는 본 발명의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기와 필터, 바람직하게는 전달 장치 또는 주사기 상부 필터를 포함하는 본 발명의 키트의 일부일 수 있다. 여과는 특히 거품의 형성을 회피하거나 감소시키기 위해 본 발명의 생성물을 재현탁시키는데 유용할 수 있다. 또는 거품 형성을 회피하기 위해 가볍게 흔들어 재현탁할 수도 있다.
본 발명의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 또한 피브린 글루, 예를 들어 붕대로 사용될 수 있다. 대체 용도는 세포 배양 배지의 일부이거나 장기 인쇄, 예를 들어 3차원 장기 인쇄이다.
본 발명의 실시형태
본 발명은 예를 들어 이하의 실시형태를 제공한다:
실시형태 1은 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기이다. 실시형태 2에서, 실시형태 1의 의약품을 포함하는 용기는 2.5 내지 3.5%(w/w), 예를 들어 약 3%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는다.
실시형태 3에 있어서, 실시형태 1 또는 2 중 어느 하나의 용기 내의 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수로 재구성하기에 적합하며, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻은 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함한다. 실시형태 4에서, 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 용기 내의 의약품의 경우, 하나의 용기를 용매, 특히 주사용수 중에서 재구성할 때, 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25~100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다.
실시형태 5에 있어서, 본 발명은 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기로서, 상기 피브리노겐 의약품이 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액이 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기를 제공한다. 실시형태 6에서, 실시형태 5의 용기 내의 의약품의 경우, 하나의 용기를 용매, 특히 주사용수에 재구성할 때, 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다.
실시형태 7에 있어서, 본 발명은 건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치로서, 상기 배치로부터 적어도 10개의 용기의 경우, 상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기의 배치를 제공한다. 실시형태 8에 있어서, 이들 조건은 실시형태 7의 배치로부터의 적어도 100개의 용기, 선택적으로 적어도 200개의 용기에 적용된다. 실시형태 9에 있어서, 이들 조건은 실시형태 7의 배치로부터의 적어도 500개의 용기에 적용되고, 선택적으로 상기 배치의 실질적으로 모든 용기에 적용된다. 실시형태 10에 있어서, 이들 조건은 실시형태 7 내지 9 중 임의의 배치로부터의 적어도 최종 10%의 용기, 바람직하게는 상기 배치로부터의 적어도 최종 20%의 용기, 선택적으로 상기 배치의 실질적으로 모든 용기에 적용된다.
실시형태 11에 있어서, 실시형태 5 내지 10 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치는 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는다. 실시형태 12에 있어서, 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 실시형태 5 내지 11 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치는 2.5 내지 3.5%(w/w), 예를 들어 약 3%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는다.
실시형태 13에 있어서, 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품은 바이알에 포장되어 있으며, 즉, 용기는 바이알이다. 실시형태 14에 있어서, 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 동결건조 된다. 실시형태 15에 있어서, 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 용기는 1 내지 3g, 선택적으로 1g의 피브리노겐을 함유한다. 실시형태 16에 있어서,실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 재구성은 20g 피브리노겐/L의 농도로 이루어진다.
실시형태 16에 있어서, 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 실시형태 1 내지 15의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치에서, 상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3,500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 60개 이하의 SVP를 포함한다. 그리하여, 실시형태 17에 있어서, 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 의약품을 포함하는 용기의 경우, 하나의 용기를 용매, 특히 주사용수 중에서 재구성할 때, 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 60개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다.
실시형태 18에 있어서, 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 35개 이하의 SVP를 포함한다. 그리하여, 실시형태 19에 있어서, 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 용기 내의 의약품의 경우, 하나의 용기를 주사용수 중에서 재구성할 때, 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 35개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다.
실시형태 20에 있어서, 실시형태 1 내지 19의 용기 내의 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하며,상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻은 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 2500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 30개 이하의 SVP를 포함한다. 그리하여, 실시형태 21에 있어서, 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 용기 내의 의약품의 경우, 하나의 용기를 용매, 특히 주사용수 중에서 재구성할 때, 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 2500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 30개 이하의 SVP를 포함하는 피브리노겐 용액이 얻어진다.
실시형태 22에 있어서, 실시형태 1 내지 21의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 용기의 배치 내의 피브리노겐 의약품은 이하를 포함한다:
a) 폴리소르베이트,
b) 선택적으로 증량제,
c) 선택적으로 아미노산 및/또는
d) 선택적으로 염화나트륨, 시트르산나트륨 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 염.
실시형태 23에 있어서, 실시형태 1 내지 22의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 폴리소르베이트, 선택적으로 폴리소르베이트 80을 포함한다. 실시형태 24에 있어서, 실시형태 1 내지 23의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품 또는 피브리노겐 의약품의 배치는 증량제, 선택적으로 트레할로스를 포함한다. 실시형태 25에 있어서, 실시형태 1 내지 24의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 아미노산, 선택적으로 아르기닌을 포함한다. 실시형태 26에서, 실시형태 1 내지 25의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 염화나트륨, 시트르산나트륨 및 이들의 조합, 선택적으로 염화나트륨 및 시트르산나트륨을 포함하는 군으로부터 선택된 염을 포함한다.
실시형태 27에 있어서, 실시형태 1 내지 26의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 이하를 포함한다:
a) 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80,
b) 증량제, 바람직하게는 트레할로스,
c) 아미노산, 바람직하게는 아르기닌 및
d) 염화나트륨, 시트르산나트륨 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염.
실시형태 28에 있어서, 실시형태 1 내지 27의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 폴리소르베이트 80, 트레할로스, 아르기닌, 나트륨, 염화물, 시트레이트 및 잔류 수분을 포함한다. 실시형태 29에 있어서, 실시형태 1 내지 28의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 1mM 미만의 칼슘을 추가로 포함한다. 실시형태 30에 있어서, 실시형태 1 내지 29의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 알부민, 피브로넥틴, α2-마크로글로불린, IgG, IgA 또는 IgM 등의 면역글로불린, 폰 빌레브란트 인자, 피브리노펩티드 A 및 D-이량체로 구성된 군중에서 선택되는 추가 혈장 단백질을 추가로 포한다. 실시형태 31에 있어서, 실시형태 1 내지 30의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 상기 언급된 성분, 즉 피브리노겐, 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트레할로스 등의 증량제, 아르기닌 등의 아미노산, 염화나트륨 및/또는 구연산나트륨 등의 염, 또는 알부민, 피브로넥틴, α2-마크로글로불린, IgG, IgA 또는 IgM 등의 면역글로불린, 폰빌레브란트 인자, 피브리노펩티드 A 및 D-이량체를 포함하는 군으로부터 선택되거나 상기 군으로 이루어진 혈장 단백질(들)로 구성된다.
실시형태 32에 있어서, 실시형태 1 내지 31의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 피브리노겐 20g/L으로 재구성시 0.5g/L 미만의 알부민, 바람직하게는 0.15g/L 미만의 알부민을 포함한다. 실시형태 33에 있어서, 실시형태 1 내지 32의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 사카로스 및/또는 글루타메이트를 포함하지 않으며, 바람직하게는 사카로스도 글루타메이트도 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상기 언급된 비피브리노겐 혈장 단백질 중 어느 것도 0.5g/L보다 높은 농도로 함유되지 않는다.
실시형태 34에 있어서, 실시형태 1 내지 33의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 2 내지 25℃에서 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 1년 동안, 선택적으로 적어도 5년 동안 안정하다.
실시형태 35에 있어서, 실시형태 1 내지 34의 용기에 포함된 피브리노겐 의약품은 20% 미만의 응집체, 바람직하게는 10% 미만의 응집체를 포함한다.
실시형태 36에 있어서, 본 발명은, 이하의 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 제조 방법을 제공한다:
a) 피브리노겐 원약의 벌크 용액을 무균 여과하는 단계,
b) 선택적으로 교반 수단을 갖는 교반기를 포함하는 수용 탱크에 무균 여과된 벌크 용액을 수용하는 단계,
c) 선택적으로, 교반 수단이 상기 벌크 용액 중에 침지되어 있을 때 수용 탱크의 벌크 용액을 교반하는 단계,
d) 소정량의 용액을 용기에 충전하는 단계,
e) 상기 용기 내의 용액을 동결건조하여 동결건조 의약품을 얻는 단계,
f) 상기 동결건조 의약품을 건열로 처리하는 단계. 상기 용액이 단계 c)에서 교반되는 경우, 수용 탱크는 교반 수단을 갖는 교반기를 포함한다.
실시형태 37에서, 실시형태 36의 방법은 추가로 이하의 단계를 포함한다:
g) 상기 의약품을 포함하는 용기를 포장하는 단계.
실시형태 38에 있어서, 실시형태 36 또는 37 중 어느 하나의 방법에서, 동결건조 후 잔류 수분 함량은 2 내지 5%(w/w), 선택적으로 2.5 내지 3.5%(w/w), 예를 들어 약 3%(w/w)이다.
실시형태 39에 있어서, 실시형태 36 내지 38 중 어느 하나의 동결건조 방법은 이하의 단계를 포함한다:
a) -29℃ 이하에서 적어도 4시간 동안, 바람직하게는 -50℃ 이하에서 동결건조 하는 단계,
b) -10℃ 이하 및 적어도 40 μbar(4 Pa)에서 1차 단계적으로 건조하는 단계, 여기서 바람직하게는, -25℃미만 및 적어도 200μbar(20Pa)에서 시작하여 각 단계에서 온도가 증가함,
c) 17 내지 23℃에서 적어도 2시간 동안 2차 건조하는 단계, 여기서 동결건조 후 잔류 수분 함량은 2 내지 5%(w/w)임.
실시형태 40에 있어서, 실시형태 39의 동결건조 방법은 이하의 단계를 포함한다:
a) -52℃ 이하에서 8시간 이상 동결하는 단계,
b) 1차 단계적으로 건조하는 단계, 이때 상기 제1 단계는 약 -36℃, 약 280 μbar(28 Pa)에서 약 48시간 동안 수행되며, 상기 제2 단계는 약 -23℃, 약 70 μbar(7 Pa)에서 약 40시간 동안 수행되며, 상기 제3 단계는 약 -10℃, 약 40 μbar(4 Pa)에서 약 78시간 동안 수행됨,
c) 약 20℃, 약 10 μbar(1 Pa)에서 약 3 내지 4시간 동안 2차 건조하는 단계.
실시형태 41에 있어서, 실시예 36 내지 40 중 어느 하나의 방법에서, 건열 처리(단계 f)는 의약품을 100℃+/-1.5℃로 가열하는 것을 포함한다. 실시형태 42에 있어서, 실시형태 36 내지 41 중 어느 하나의 방법에서, 건열 처리는 30+/-3분 동안 수행된다. 실시형태 43에 있어서, 실시형태 36 내지 42 중 어느 하나의 방법에서, 건열 처리는 증기 오토클레이브에서 수행된다.
실시형태 44에 있어서, 실시형태 36 내지 43 중 어느 하나의 방법에서, 용액은 단계 d)에서는 교반되지 않지만, 단계 c)에서는 예를 들어 최대 1시간 동안, 바람직하게는 최대 1시간 동안 교반된다. 실시형태 45에 있어서, 실시형태 36 내지 44 중 어느 하나의 방법에서, 단계 c)에서의 교반은 최대 10분 동안, 예를 들어 최대 5분 동안 수행된다. 실시형태 46에 있어서, 실시형태 36 내지 45 중 어느 하나의 방법에서, 교반은 최대 150rpm이고, 바람직하게는, 수용 탱크는 50 내지 150 L의 용적을 갖고 원통형이며, 교반 수단은 최대 150rpm, 예를 들어 최대 80rpm으로 회전하는 중앙 구동 샤프트에 부착된 교반 날개(예를 들어 날개 또는 막대 형태)이다. 실시형태 47에 있어서, 실시형태 36 내지 46 중 어느 하나의 방법에서, 교반 막대가 용액 표면을 파괴할 때 및/또는 거품이 형성될 때 용액은 교반되지 않는다.
실시형태 48에 있어서, 실시형태 36 내지 43 중 어느 하나의 방법에서, 용액은 단계 c) 또는 d)에서 교반되지 않는다.
실시형태 49에 있어서, 본 발명은 청구항 36 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 방법으로부터 얻을 수 있는 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치를 제공한다.
실시형태 50에 있어서, 본 발명은 피브리노겐 결핍증의 치료에 사용하기 위한 실시형태 1 내지 35 또는 실시형태 49 중 어느 하나의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기의 배치를 제공한다. 실시형태 51에 있어서, 실시형태 49의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 유전적 피브리노겐 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 실시형태 52에 있어서, 실시형태 49 내지 50 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 선천성 피브리노겐 결핍증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 실시형태 53에서, 실시형태 49의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 후천성 피브리노겐 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 실시형태 54에 있어서, 실시형태 50 또는 53 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 선택적으로 (심각한) 수술 과정 중에 혈액 손실/출혈을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 실시형태 55에 있어서, 실시형태 50 또는 53 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 외상으로 인한 혈액 손실/출혈을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
실시형태 56에 있어서, 실시형태 50 내지 55 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 재구성 후 환자에게 정맥내 투여하는데 사용하기 위한 것이다. 실시형태 57에 있어서, 실시형태 50 내지 56 중 어느 하나의 용기 내의 피브리노겐 의약품은 재구성 후 사전 여과 없이 환자에게 투여하는데 사용하기 위한 것이다.
실시형태 58에 있어서, 실시형태 36 내지 48 중 어느 하나의 방법은 의약품 중 SVP의 수를 특히 본 명세서에 기술된 한계까지 감소시키기 위해 사용된다. 실시형태 59에 있어서, 실시형태 36 내지 48 중 어느 방법은 의약품 중 바이러스, 예를 들어 외피 없는 바이러스의 수를 감소시키기 위해 사용된다. 실시형태 60에 있어서, 실시형태 36 내지 48 중 어느 하나의 방법은 의약품 중 SVP의 수를 특히 본 명세서에 기술된 한계까지 감소시키고, 바이러스, 예를 들어 외피 없는 바이러스의 수를 감소시키기 위해 사용된다.
본 발명을 추가로 예시하지만, 하기 실시예 및 도면에 의해 한정되지는 않는다. 인용된 모든 문헌은 여기에 완전히 포함되어 있다.
도 1: 본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 충전 플랜트의 개략도이다. (1): 공기 흐름; (2): 압력 라인; (3): 공급 탱크, 예를 들어 80L; 4: 최종 필터; 5: 약품 흐름; 6: 수용 탱크, 예를 들어 50L; 7: 교반기(바람직하게는 최대 150rpm); 8: 교반 날개; 9: 연동 펌프, 예를 들어 290rpm 이하; 10: 용기, 예를 들어 바이알; 11: 동결건조기
도 2: 잔류 수분은 바이러스 불활성화 동역학에 상당한 영향을 미친다(I). PPV를 소량 첨가한 피브리노겐 샘플은 폴리소르베이트 80(PS 80)(폴리소르베이트를 함유하지 않은 샘플 - H3, 재구성 약품에 0.05% 폴리소르베이트가 포함된 샘플 - H5)의 존재 및 부재 하에서 <1%(w/w)의 잔류 수분 함량으로 동결건조하고, 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 다른 규정된 잔류 수분으로 부분적으로 조정하였다. 모든 샘플에 대해 99℃에서 0분, 30분, 45분 또는 60분 동안 건열(DH) 처리를 수행했다.
도 3: 잔류 수분은 바이러스 불활성화 동역학에 상당한 영향을 미친다(II). PPV를 소량 첨가한 피브리노겐 샘플은 폴리소르베이트 80(PS 80) (폴리소르베이트를 함유하지 않는 샘플 - H3, 도 3a에 도시됨, 재구성된 약품에 0.05% 폴리소르베이트가 포함된 샘플 - H5, 도 3b에 도시됨)의 존재 및 부재 하에 < 1%(w/w)의 잔류 수분 함량으로 동결건조 하고, 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 다른 규정된 잔류 수분으로 부분적으로 조정하였다. 모든 샘플에 대해 99℃에서 0분, 30분, 45분 또는 60분 동안 건열(DH) 처리를 수행했다.
도 4: 2 내지 8℃ 및 23 내지 27℃에서 본 발명의 재구성된 피브리노겐 의약품의 안정성. 2 내지 8℃에서 피브리노겐 의약품은 적어도 8주 동안 안정하다. 23 내지 27℃에서 피브리노겐 의약품은 적어도 4주 동안 안정하다(연구 B).
도 5: 6년 보관 후의 본 발명의 피브리노겐 의약품의 안정성(연구 C).
도 6: 교반 유무에 따른 원약의 균질성. 수용 탱크의 원약을 단시간 교반하고 용액의 표면, 중간 및 바닥에서 샘플을 채취했다(t=0, 왼쪽 칼럼 그룹). 5시간의 배양 후(t=5, 중앙 칼럼 그룹), 동일한 위치에서 추가 샘플을 채취했다. 이어서, 탱크를 다시 교반하고, 더 많은 샘플을 채취했다(t=5+S, 오른쪽 열 그룹). 샘플을 채취한 장소나 배양 또는 교반 후에 상관없이, 단백질 농도(A), 특정 피브리노겐 활성(B), SVP≥10㎛(C), SVP≥25㎛(D) 또는 응집체(E)에는 유의미한 차이가 없었다. A와 B에서 점선은 규격 하한이고 A의 불규칙한 선은 규격 상한이다. C-E에서 점선은 규격 상한이다.
도 2: 잔류 수분은 바이러스 불활성화 동역학에 상당한 영향을 미친다(I). PPV를 소량 첨가한 피브리노겐 샘플은 폴리소르베이트 80(PS 80)(폴리소르베이트를 함유하지 않은 샘플 - H3, 재구성 약품에 0.05% 폴리소르베이트가 포함된 샘플 - H5)의 존재 및 부재 하에서 <1%(w/w)의 잔류 수분 함량으로 동결건조하고, 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 다른 규정된 잔류 수분으로 부분적으로 조정하였다. 모든 샘플에 대해 99℃에서 0분, 30분, 45분 또는 60분 동안 건열(DH) 처리를 수행했다.
도 3: 잔류 수분은 바이러스 불활성화 동역학에 상당한 영향을 미친다(II). PPV를 소량 첨가한 피브리노겐 샘플은 폴리소르베이트 80(PS 80) (폴리소르베이트를 함유하지 않는 샘플 - H3, 도 3a에 도시됨, 재구성된 약품에 0.05% 폴리소르베이트가 포함된 샘플 - H5, 도 3b에 도시됨)의 존재 및 부재 하에 < 1%(w/w)의 잔류 수분 함량으로 동결건조 하고, 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 다른 규정된 잔류 수분으로 부분적으로 조정하였다. 모든 샘플에 대해 99℃에서 0분, 30분, 45분 또는 60분 동안 건열(DH) 처리를 수행했다.
도 4: 2 내지 8℃ 및 23 내지 27℃에서 본 발명의 재구성된 피브리노겐 의약품의 안정성. 2 내지 8℃에서 피브리노겐 의약품은 적어도 8주 동안 안정하다. 23 내지 27℃에서 피브리노겐 의약품은 적어도 4주 동안 안정하다(연구 B).
도 5: 6년 보관 후의 본 발명의 피브리노겐 의약품의 안정성(연구 C).
도 6: 교반 유무에 따른 원약의 균질성. 수용 탱크의 원약을 단시간 교반하고 용액의 표면, 중간 및 바닥에서 샘플을 채취했다(t=0, 왼쪽 칼럼 그룹). 5시간의 배양 후(t=5, 중앙 칼럼 그룹), 동일한 위치에서 추가 샘플을 채취했다. 이어서, 탱크를 다시 교반하고, 더 많은 샘플을 채취했다(t=5+S, 오른쪽 열 그룹). 샘플을 채취한 장소나 배양 또는 교반 후에 상관없이, 단백질 농도(A), 특정 피브리노겐 활성(B), SVP≥10㎛(C), SVP≥25㎛(D) 또는 응집체(E)에는 유의미한 차이가 없었다. A와 B에서 점선은 규격 하한이고 A의 불규칙한 선은 규격 상한이다. C-E에서 점선은 규격 상한이다.
실시예
방법
단백질 측정
단백질 측정은 UV 흡수법(분광광도계 Genesys™ 6, 분광광도계 Genesys™ 10)으로 수행하였다. 용액 내 단백질은 주로 티로신과 트립토판 등의 방향족 아미노산의 존재로 인해 280 nm 파장의 자외선을 흡수한다. 이 특성은 280 nm에서의 단백질 측정의 기본이다. 단백질의 UV 분광 측정의 정확도는 테스트 표본에 의한 빛의 산란으로 인해 감소될 수 있다. 이 효과를 보상하기 위해 280 nm의 흡광도에서 360 nm의 흡광도를 뺀다.
피브리노겐(Fib:Ag) 측정
Fib:Ag 농도는 BN Prospec(Siemens) 비탁계에서 비탁법으로 측정했다. 피브리노겐은 특정의 항체와 복합체를 형성한다. 이 복합체는 조사된 빛의 분산을 일으킨다. 분산의 증가는 피브리노겐 농도와 상관되어 있다.
응고성 단백질에 의한 피브리노겐 활성 측정
피브리노겐 활성(= 응고성 단백질) 분석을 위해, 샘플 제제를 충분한 트롬빈을 함유하는 적합한 완충 용액과 혼합하고 37℃에서 배양했다. 상청액 중의 잔류 단백질은 280/360 nm에서 UV 분광법으로 측정하였고, 그 결과를 총 단백질 함량(위 참조)에서 차감하여 응고성 단백질을 계산했다.
피브리노겐의 특정 활성의 측정
피브리노겐의 비활성은 UV 흡수(280 nm)로 측정한 총 단백질과 관련된 응고성 단백질 활성에 의해 결정되었다.
PPV를 소량 첨가(spiking)
22 ± 4℃에서 시험 물질에 바이러스 스톡을 첨가하고 34ml의 분취량을 용기, 예를 들어 바이알에 충전하였다. 스톡과 바이러스를 소량 첨가한 테스트 물질 중에서 샘플을 채취하여 적정했다. 모든 바이알을 동결건조시켰다. 동결 건조 후, 각 용기의 잔류 수분을 NIR(근적외선 분광학)으로 측정했다. 바이러스 적정을 위해 동결건조물을 WFI(주사용수) 50ml에 현탁시켰다.
바이러스 접종재료의 준비
PPV용 바이러스 스톡은 바이러스에 감염된 세포로부터 제조하였다. 바이러스 검증 연구를 위한 바이러스 스톡의 방출(release)의 경우, 역가는 각 적정에 연속 3배 희석을 사용하고 희석마다 8회 반복하여 적어도 3회의 독립적인 적정을 통해 검증하였다.
바이러스 적정
바이러스 특이적 세포 기반 감염성 분석(바이러스 적정)을 이용하여 샘플의 바이러스 함량을 정량적으로 분석했다. 샘플의 재현탁 후(해당하는 경우), 샘플을 희석하고 민감한 세포주에서 즉시 적정했다. 소정의 배양 시간 후에 바이러스에 의해 유발된 세포 변성 효과를 평가했다.
바이러스 역가의 계산방법
바이러스 역가는 바람직하게는 Spearman 및 Kaerber (Spearman C, Kaerber G.l In: Mayr A, Bachmann PA, Bibrack B, Wittmann G; eds. Virologische Ar-beitsmethoden, Vol. I, p. 37-39 Fischer Verlag Stuttgart, 1974)에 따라 계산하거나 포아송 분포(예를 들면, 감염성이 감지되지 않은 경우)를 적용하여 계산했다.
바이러스 감소율(virus reduction factor)의 계산
각 실험의 바이러스 감소율은 바이러스가 소량 첨가된 시험 재료의 바이러스 량(총 바이러스)와 열처리 후의 재료중의 바이러스 량의 비의 log10으로 정의하였다. 바이러스 양은 바이러스 역가의 농도와 부피를 곱하여 계산했다.
Karl Fischer 및 NIR법(근적외선 분광법)에 따라 잔류 수분 함량 측정
이러한 측정 방법은 EP 0 844 005 A1에 기재되어 있는 바와 같이 수행했다.
응집체 함량의 측정
Ph. Eur. 및 2.2.30 및 USP 621에 따라, 응집체 함량은 인접한 UV 검출을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피로 측정한다. 따라서 단백질 용액은 컬럼 수지상에 적용되며, 여기서 단백질은 크기 의존 방식으로 다공성 수지와 상호 작용한다. 작은 단백질이나 단백질 조각은 컬럼 수지와 더 강한 상호작용을 나타내므로 체류 시간이 길어지며, 반면 더 큰 단백질 또는 단백질 응집체(이량체, 삼량체 등)는 체류 시간이 짧아진다. 따라서 최초로 용출된다. 단백질 분획은 컬럼 끝에 있는 UV 검출기에 의해 검출된다.
SVP의 측정
Ph. Eur.및 2.9.19 및 USP 788에 따라, SVP의 양은 예를 들어 2 내지 400 ㎛ 크기 범위의 Hiac 모델 HRLD-400 센서가 장착된 입자 계수기 Hiac 모델 9703+(Beckman, 크레펠트, 독일)에 의해 광 차폐로 측정된다. 측정마다 단백질 용액이 모세관을 통해 흡입되어 센서를 통과한다. 최초의 측정은 시스템을 세척하는데 사용되며 결과는 폐기된다. 다음의 4가지 측정값의 평균을 이용하여 용액내의 SVP 수를 결정한다. 단백질 용액은 측정 전에 여과되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
실시예 1 - 피브리노겐 생산
1A) 일반적인 프로세스 정보
다음의 프로세스는 본 발명에 사용되는 피브리노겐 의약품의 제조에 사용될 수 있는 피브리노겐의 바람직한 제조 프로세스이다. 다른 공정, 예를 들어 당업계에 공지된 프로세스도 사용될 수 있다.
피브리노겐 농축 원약(DS)은 예를 들어 VIII 인자 제조 프로세스의 측면 분획으로부터 제조될 수 있다. 제조 프로세스는 GMP 조건에서 수행되었다. 이 프로세스는 VIII 인자가 크로마토그래피 물질에 결합되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계로 구성되었으며, 추가 처리되었다. FVIII 프로세스에서의 음이온 교환 크로마토그래피의 통과액을 피브리노겐 제조에 사용했다. 이를 회수하여 구연산 삼나트륨으로 안정화시켰다. 이어서, 글리신, NaCl 및 CaCl2를 첨가하여 피브리노겐을 침전시켰다. 침전물은 유류형 원심분리에 의해 분리되었다. 수확된 중간체 "글리신 페이스트"는 나중에 사용할 때까지 -70℃ 이하에서 보관할 수 있다.
피브리노겐 농축물 DS의 제조를 위해, 동결된 중간체 "글리신 페이스트"를 구연산나트륨 완충액(용액 F01)에 용해시키고 여과했다. 이어서, 바이러스 불활성화를 위해 UV-C 광 조사를 수행하였다. 추가 정제를 위해, 단백질 용액을 POROS 50 HS를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피로 크로마토그래피 정제했다. 수집된 컬럼 용출 분획을 한외여과(UF)로 농축했다. 폴리소르베이트 80(PS 80)과 트레할로스를 첨가한 후, pH와 단백질 농도를 조정했다. 최종 벌크 DS는 의약품(DP)으로 추가로 가공하였다.
피브리노겐 농축물 DP는 피브리노겐 농축물 DS로부터 제조하였다. 프로세스는 GMP 조건 하에서 수행하였다. 제형화된 최종 벌크 DS를 최종 용기에 충전하고, 여기서 32.0ml의 단백질 용액을 100ml의 유리 바이알에 충전했다. 마개는 바이알에 느슨하게 설치한 다음, 미리 냉각된 동결 건조기의 선반에 적재하고 동결 건조 프로세스를 시작했다. 동결 건조 후, 동결건조된 생성물을 외피, 특히 외피 없는 바이러스의 불활성화를 위해 증기 오토클레이브에서 100℃(약품 온도)에서 30분간 열처리했다.
1B) 피브리노겐 농축 원약 및 의약품의 상세한 제조 프로세스
이하의 리스트는 1g 충전 크기의 피브리노겐 DS(원약) 및 DP(의약품) 제조를 위한 프로세스 단계의 개요를 제공한다.
단계 DS 1 출발 물질(인간 혈장)
단계 DS 2 혈장의 풀링 및 해동
단계 DS 3 한랭 침전물의 분리
원심분리
온도 = 2 ± 2℃
≤ -25℃에서 한랭 침전물 보관
단계 DS 4 저온 침전물의 풀링
pH 값 = 7.05 ± 0.05
온도 = 22.5 ± 2.5℃
교반 시간 ≥ 30분
단계 DS 5 수산화알루미늄 처리
15 내지 30분 내에 2% 수산화알루미늄 현탁액의 첨가
교반 시간 = 5분
온도 = 22.5 ± 2.5℃
pH 값 = 6.55 ± 0.05
온도 = 15.0 ± 1.0℃
단계 DS 6 폴리소르베이트 80/TnBP 처리(바이러스 불활성화)
단백질 ≤ 10g/l
염화칼슘 = 0.001M
pH 값 = 7.1 ± 0.1
온도 = 25.0 ± 1.0℃
폴리소르베이트 80 = 10 ± 3g/kg
트리-n-부틸 인산염 = 3 ± 0.9 g/kg
교반 시간 = 8 내지 14시간
단계 DS 7 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피
DEAE Toyopearl
온도 = 22±4℃
통과율 = 192 l/h
단계 DS 8 통과액 수집
단계 DS 9 글리신 침전
온도 = 22±4°C
단백질 용액 kg당 시트르산삼나트륨 0.0059kg, 교반 시간 ≥ 5분
단백질 용액 kg당 글리신 0.091kg, 교반 시간 ≥ 15분
단백질 용액 kg당 염화나트륨 0.117kg 및 단백질 용액 kg당 염화칼슘 이수화물 0.000035kg, 교반 시간 ≥ 5분
완충액 A (이전의 음이온 교환 크로마토그래피의 평형화 및 세척 완충액): 10mM 시트르산삼나트륨, 120mM NaCl, 120mM 글리신, 1mM CaCl2, pH 7.0 내지 7.1.
생성된 통과액을 글리신 및 NaCl과 혼합하여 피브리노겐을 침전시켰다 (예를 들어, 실온에서, c(글리신): 1.2 M, c(NaCl): 2.0 M). 통과액 원심분리에 의해 글리신 페이스트를 제조하였다.
고체 글리신 페이스트를 냉동하고, 특히 ≤-50°C(예: -50°C 내지 -70°C)에서 급속 냉동하여 응집체의 형성이 감소되었다.
단계 DS 10 UV-C-광 조사에 의한 바이러스 불활성화(바이러스 불활성화)
온도 = 18 ± 2℃
UV-C 선량 = 125-200 J/m2,예: 254 nm
전도도 = 9 ± 1mS/cm
글리신 페이스트를 시트르산나트륨 완충액(Puffer F01)에 재현탁시킨 후 여과하였다.
조사를 위해 EP 0 840 624 B1에 따라 원주형 튜브를 갖춘 조사 장치를 사용하였다. 125 내지 200 J/m²의 254nm 조사는 약품에 대해 특히 균일하고 부드러운 처리였다.
단계 DS 11 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피(CEX)
POROS 50HS
단백질 량 = 주기당 수지 10 내지 20g/L
전도도 = 9 ± 1mS/cm
온도 = 22 ± 4℃
선형 유속 = 200 ± 100cm/h
CEX는 vWF와 추가 단백질, TnBP와 폴리소르베이트 80의 농도를 감소시켰다.
컬럼을 세척 완충액 F02(15mM 시트레이트 완충액(시트르산삼나트륨), 65mM NaCl, pH 6.5)으로 평형화했다. 피브리노겐 함유 분획을 첨가하고 피브리노겐이 컬럼에 결합시킨다. 용출 완충액(F03: 7.5 mM 시트레이트 완충액(삼나트륨 시트레이트), 150 mM NaCl, 75 mM 아르기닌, pH 7.0)을 사용하여 아르기닌/시트레이트/NaCl로 용출을 수행했다.
단계 DS 12 한외여과
단백질 농도 = 55g/l ± 10g/l
단계 DS 13 단백질 용액 조정, 0.2㎛ 여과 및 원약의 품질 관리
트레할로스 - 이수화물 = 단백질 용액 kg당 0.0170 ± 0.0017
폴리소르베이트 80 = 0.075 ± 0.0075%
pH = 7.0 ± 0.5
피브리노겐 농도 = 30-36g/l
단백질 함량은 33 g/l로 조절하였고, 시트레이트 완충액을 사용하여 pH 7.0으로 조절하였다. 0.017kg 트레할로스/kg 단백질을 첨가하였다. 0.075%(w/v) 폴리소르베이트 80(안정화, 용해도 개선, 외피 없는 바이러스(예: 파보바이러스) 감소 증가). 동결건조 전, 폴리소르베이트의 농도를 0.075% 폴리소르베이트(w/v)로 조정했다. 재구성 후에는 일반적으로 폴리소르베이트 농도가 0.05%가 된다.
→ 원약(최종벌크)
단계 DP 1+2 최종 무균 여과 및 최종 용기/판매 단위에 충전
0.2㎛m 여과
충전량 약 32.0ml
단계 DP 3 동결건조
≥ -29℃에서 ≥ 4시간 동안 냉동
1차 단계적 건조 ≤ -10℃
2차 건조 20°C ± 3℃, ≤ 4시간
총 건조 시간 약 150 내지 200시간
단계 DP 4 열처리(바이러스 불활성화)
약품 온도: 30 ± 3분 동안 100 ± 1.5°C
잔류 수분 2.0 내지 5.0%
80°C 이하로 냉각
단계 DP 5+6 DP 및 포장 품질 관리
5°C ± 3°C에서 보관
의약품의 바람직한 제조 프로세스는 EP 19 214 919.3(출원 번호, 아직 공개되지 않음) 및 하기 본 발명의 중요한 단계에서 더욱 자세히 설명되어 있다.
실시예 2 - 충전 프로세스
피브리노겐 농축 원약(DS)의 최종 충전을 위한 본 발명의 바람직한 방법에서, 제약 단백질 충전을 위한 표준화된/일상적인 충전 라인이 사용되었다 (Bausch & Strbel, Ilshofen, Germany, KS 1025, model: AS 18.2). 셋업은 도 1에 나타낸다.
a) 충전을 위해 약품 흐름(5)를 따라 압력 라인(2)와 공기 흐름(1)(예: 600mbar(600hPa) 이하)의 압력 중첩에 의해 공급 탱크(3) (일반적으로 공칭 충전 용량이 80L인 스테인리스 스틸 탱크)에서 수용 탱크(6) (일반적으로 공칭 충전 용량이 50L인 스테인리스 스틸 탱크) 내로 필터 4 (예: 필터 유형: Sartorius 5235307H9--SS, 0.2m2, 셀룰로오스 아세테이트(CA) 막)를 사용하여 최종 DS를 0.2± 여과했다. 교반기(7)의 교반 막대(8)(또는 교반봉)을 피브리노겐 용액으로 덮었을 때, 예를 들어 수용탱크(6)에 약 15L를 충전한 후, 교반기(7)는 저속, 특히 150rpm 이하, 바람직하게는 80rpm ± 20rpm의 낮은 속도로 작동되어 교반기의 교반 막대(8)가 침지되도록 했다. 이에 따라 단백질 용액 표면이 교반 수단(8) 위에 유지되어 거품 형성이 방지되었다. 이어서, 예를 들어 수용 탱크(6)로의 원약 전달이 완료된 후, 펌프 속도가 290rpm 이하, 바람직하게는 270rpm 이하인 연동 펌프(9)를 사용하여 충전을 시작했다. 유리 바이알 10(공칭 충전 용적: 100ml, 직경: 5.2cm)에 각각 32ml의 원약을 충전했다. 용액 표면이 막대/교반기 수단(8)에 도달할 때 또는 그 전에 교반기(7)를 정지시켰다.
다수의 바이알(10), 특히 50개의 바이알을 프레임, 특히 금속 프레임에 수집하여 지체 없이 미리 냉각된(<-50℃) 동결 건조기(11)로 옮겼다.
얻어진 의약품은 본 명세서에 기술된 바와 같이 낮은 수의 SVP로 재구성될 수 있었는데, 이는 온화한 교반 조건에 의한 것이다.
b) 대안적으로, 충전을 위해, 압력 라인(2)의 압력 중첩과 약품 흐름(5)를 따라 공기 흐름(1) (예, 600mbar(600hPa) 이하)에 의해 최종 DS를 필터(4) (예: 필터 유형: Sartorius 5235307H9--SS, 0.2m2, 셀룰로오스 아세테이트(CA)막)를 사용하여 공급 탱크(3) (일반적으로 예를 들어 공칭 충전량이 80L인 스테인리스 스틸 탱크)에서 수용 탱크(6) (일반적으로 공칭 충전 용량이 50L인 스테인리스 스틸 탱크)로 0.2㎛ 여과했다. 수용 탱크(6)로의 원약 전달이 완료된 후, 교반기(7)를 저속, 특히 150rpm 이하, 바람직하게는 80rpm ± 20rpm으로 작동시켰다. 용액을 5분간 교반한 후 교반기를 정지하였다. 펌프 속도가 ≤290rpm, 바람직하게는 ≤270rpm인 연동 펌프(9)를 사용하여 충전을 시작했다. 유리 바이알(10)(공칭 충전 용적: 100ml, 직경: 5.2cm)에 각각 32ml의 원약을 충전했다.
수용 탱크(6)가 비워지기 전에 남은 원약을 수용탱크(6)에 충전하고, 잔여 및 첨가된 원약 용액과 함께, 교반기(7)가 물속에 침지되어 있을 때 사용할 수 있다. 용액을 5분 동안 교반한 후, 교반기를 정지하고 충전 프로세스를 다시 시작했다. 대안적으로, 교반시에 교반 수단이 항상 물에 잠겨 있는 것이 보장된다면 교반하면서 충전을 시작할 수 있다.
다수의 바이알(10), 특히 50개의 바이알을 프레임, 특히 금속 프레임에 수집하여 지체 없이 미리 냉각된(<-50℃) 동결 건조기(11)로 옮겼다.
충전 프로세스의 여러 단계에서 샘플을 채취하고 예를 들어 피브리노겐 농도에 대하여 샘플을 비교함으로써, 본 발명자들은 놀랍게도 이 온화하고 짧은 교반이 균질한 약품에 충분하다는 것을 발견했다. 교반하지 않아도 불균일은 발견되지 않았다.
SVP의 수는 방법 a)보다 재현성이 훨씬 낮았다.
c) 교반 유무에 딸 균질성을 비교하기 위해 수용 탱크(6)의 원약을 짧게 교반하고 용액의 표면, 중간 및 바닥에서 샘플을 채취했다. 5시간 배양 후(t=5), 동일한 위치에서 추가 샘플을 채취했다. 다음에 탱크를 다시 교반하고 더 많은 샘플을 채취했다(t=5+S). 시료를 채취한 장소나 배양이나 교반 후에도 큰 차이는 없었다(도 6).
실시예 3 - 동결건조
충전된 바이알(10)을 미리 냉각된 동결 건조기에 로딩하는 것이 특히 유리하다. 이는 단백질 용액의 신속한 동결을 가능하게 했고, 양호한 다공성 케이크 구조가 얻어져, 물의 승화가 향상되었다. 동결건조는 2.5 내지 5%(w/w)의 잔류 수분을 생성하는 방식으로 수행되었다.
바람직한 프로세스에서는 최종 바이알을 로딩한 후 건조 프로그램을 시작했다. 제1 단계는 -52℃에서 8시간 동결한 후 1차 건조로 구성되어 있다. 1차 건조는 세 단계로 세분화되었다: 280μbar(28Pa) 및 -36℃에서 5 내지 45시간 동안 건조(1단계), 70 μbar(7 Pa) 및 -23℃에서 25 내지 45시간 동안 건조(2단계), 및 40 μbar(4 Pa) 및 -10℃에서 45 내지 78시간 동안 건조(3단계) (바람직하게는 1단계에서 45시간, 2단계에서 45시간, 3단계에서 45시간 또는 1단계에서 5시간, 2단계에서 25시간, 3단계에서 78시간). 이러한 수순은 최종 약품의 용해도를 향상시키고 SVP의 양을 감소시켰다. 2차 건조로 전환하려면 압력 상승 테스트(3분 이내 0.044μbar(0.44Pa))를 통과할 필요가 있다. 10 μbar(1 Pa) 및 20℃에서 3시간 동안 2차 건조하면 잔류 수분의 변화가 감소하고 열처리(100℃에서 30분) 후 동결건조물의 거동이 더욱 균질하게 되었다. 또한 20℃에서 2차 건조하면 최종 약품의 SVP 양이 감소하였다.
NIR 또는 칼-피셔(Karl-Fischer)법을 이용하여 각 배치에 대해 잔류 수분을 테스트했다. NIR 결과는 본 발명의 샘플에 대해 교정된 표를 사용하여 칼-피셔법과 상호 연관시킬 수 있다. 분석을 위해 동결건조물로부터 물을 추출하고 다음 반응을 통해 화학적으로 정량화했다.
표 1에 나타난 바와 같이, 칼-피셔법으로 검출한 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 약품의 잔류 수분 함량은 일반적으로 2.5 내지 3.5%(w/w)였다. 시판 약품과 비교했을 때 잔류 수분 함량이 1%(w/w) 미만으로 현저히 낮은 것으로 나타났다.
표 1: 비교 샘플의 잔류 수분
| 샘플 | 샘플 소스 |
칼-피셔법에 따른
잔류 수분 %(w/w) |
| 피브리노겐_1g_Fib_1169 샘플 1 | Octapharma의 Fibryga 1 g Ch.-B.: K8/3°3491 | 0.65 |
| 피브리노겐_1g_Fib_1169 샘플 2 | CSL Behring의 Haemocomplettan P 1 g Ch.-B.: P100015559 | 0.35 |
| 피브리노겐_1,5g_Fib_1169 샘플 3 | LFB의 FibClot 1,5 g Ch.-B.: 16L08426 | 0.08 |
실시예 4 - 잔류 수분 함량에 따른 바이러스 불활성화의 비교
외피 바이러스는 상술한 바와 같이 원약의 제조시에 수행되는 용매/세제 단계를 통해 확실하게 제거되었다. 외피가 없는 바이러스는 추가로 제거할 필요가 있다. 최적의 조건은 다음 실험에서 분석되었다.
외피가 없는 바이러스를 사용한 실험의 경우, 먼저, 폴리소르베이트 80(PS 80)(폴리소르베이트를 함유하지 않는 샘플 - H3, 재구성된 약품에 0.05% 폴리소르베이트가 포함된 샘플 - H5)의 존재 및 부재 하에 PPV가 소량 첨가된 피브리노겐 샘플을 동결건조하여 잔류 수분 함량이 <1%(w/w)이 되도록 했다. 동결 건조 후의 샘플의 NIR(근적외선 분광학)로 측정했다.
이어서 일부 샘플을 다시 열어 동결건조물에 닿지 않도록 규정량의 주사용수(WFI)를 바이알에 추가했다. 바이알을 마개로 다시 닫고 적용된 WFI가 증발할 때까지 배양했다. 모든 바이알에서 비슷한 압력을 얻으려면, 바이알을 열고 동결건조기의 챔버에 넣었다. 이어서, 바이알을 진공 하에 밀봉하였다. 수분 함량은 본 명세서에 기술된 바와 같은 칼-피셔법에 따라 유기 용매로 추출한 후 NIR 또는 병렬 대조 샘플로 다시 측정되었다.
모든 샘플에 대해 99℃에서 0분, 30분, 45분 또는 60분 동안 건열(DH) 처리를 수행했다. 0분은 건열 처리를 수행하지 않은 동결건조 샘플을 나타낸다. 바이러스 역가의 감소는 대수(log10)로 계산되었으며, 여기서 감소의 계산을 위한 시작 값으로 동결건조 전의 재료를 사용했다. 0분에는 유의미한 바이러스 감소가 없었다. 가열 시간(30분, 45분, 60분)이 증가함에 따라, 바이러스 불활성화의 증가는 잔류 수분 4%에서 나타났다 (log10 약 2,5 내지 4 사이, 바이러스 감소 계수는 2 log10 2 바로 아래인 30분 열처리 후에 이상값이 하나임). 잔류 수분이 1% 미만인 샘플의 바이러스 불활성화는 모든 시점에서 1 내지 1.5 log10의 범위였다. 이러한 낮은 수분에서는 폴리소르베이트 80의 효과를 볼 수 없었다. 잔류 수분 함량이 높을수록 폴리소르베이트 80이 긍정적인 효과를 보이는 경향이 있었다. 모든 시점에서 잔류 수분이 약 4%이고 폴리소르베이트를 포함하는 샘플에서 가장 높은 감소가 나타났다(도 2).
추가 실험 세트에서는 또 다른 피브리노겐 샘플을 사용하여 스파이크 실험을 반복했으며, 여기서 상술한 바와 같이 동결건조 후에 측정되고 적합되는 0 내지 5%의 기타 잔류 수분 함량이 사용되었다. H3를 포함하지 않는 샘플과 폴리소르베이트 80이 포함된 샘플(H5 - 재구성된 약품의 0.05%)을 테스트했다.
PPV에서 나타난 잔류 수분과 바이러스 불활성화 사이의 관계는 PS 80이 없는 재료와 PS 80이 있는 재료 모두에서 확인될 수 있다.
도 3a 및 도 3b에서는 샘플을 잔류 수분에 따라 그룹화하고, 99℃에서 다양한 시간 동안 건열(DH) 처리하면 바이러스 감소가 나타난다. 45분 또는 60분 DH가 포함된 샘플에서는, 더 촉촉한 샘플의 경우 훨씬 더 높은 바이러스 불활성화가 나타날 수 있다. PS 80이 있는 경우(도 3b), 또는 3.2 내지 4.3% 이상, 또는 바람직하게는 적어도 4%의 잔류 수분이 바이러스 불활성화의 중요한 효능에 최적인 것으로 나타났다. 반면 폴리소르베이트가 없는 경우(도 3a), 5% 잔류 수분이 최적이었다.
실시예 5 - 의약품의 제형화
정맥내 투여에 적합한 하나의 용기, 예를 들어 본 발명의 피브리노겐 원약의 하나의 바이알은 20g/L의 주사용수 50mL 중에서 재구성할 때 예를 들어 다음과 같은 특징을 가질 수 있다:
pH 7.0
삼투압 ≥ 240 mosmol/kg
단백질 20g/L
특이적 활성 ≥ 80%, 예: 98% ± 0,8%(n=7)
Na 95 내지 135mmol/L, 예를 들어 약 115mmol/L
Ca < 1mmol/L
Cl 100 내지 160mmol/L, 예를 들어 약 130mmol/L
시트레이트 3 내지 7mmol/L, 예: 약 5mmol/L
아르기닌 25 내지 55mmol/L, 예: 약 40mmol/L
트레할로스 22 내지 38mmol/L, 예를 들어 약 30mmol/L
폴리소르베이트 80 0,03 내지 0,07%, 예: 약 0.05%
응집체 함량 ≤20%, 예: 11 ± 1%(n=11)(HP-SEC 분석으로 결정)
표 2: 본 발명의 바람직한 피브리노겐 의약품의 부형제의 개요
| 성분 | 량 / 1 mL 재구성 용액 | 참조 기준 | 기능 |
| 시트레이트 | 0.96 mg | Ph. Eur. | 안정제 |
| 나트륨 | 2.64 mg | Ph. Eur. | 전해질 |
| 염화물 | 4.61 mg | Ph. Eur. | 전해질 |
| 아르기닌 | 6.97 mg | Ph. Eur. | 안정제 |
| 트레할로스 | 10.27 mg | Ph. Eur. | 안정제 |
| 폴리소르베이트80 | 0.5 mg (0.05%) | Ph. Eur. | 안정제 |
| 주사용수 | Ad 1mL | Ph. Eur. | 용매 |
표 3: 본 발명의 의약품에 포함될 수 있는 추가 혈장 단백질
| 매개변수 | 불순물 근원 | 평균 함량 (3개 배치) |
| 알부민 | 혈장 | 0.09 g/l |
| 피브로넥틴 | 혈장 | 0.27 g/l |
| α2-마크로글로부린 | 혈장 | 0.14 g/l |
| IgG | 혈장 | 0.06 g/l |
| IgA | 혈장 | 0.15 g/l |
| IgM | 혈장 | 0.20 g/l |
| 폰 빌레브란트 인자 | 혈장 | 4.1 U/ml |
| 피브로펩티드 A | 혈장 | 9.2 μg/l |
| D-이량체 | 혈장 | 0.19 mg/1 |
실시예 6 - SVP 측정
Ph. Eur. 2.9.19 및 USP 788에 따르면, SVP의 양은 상술한 바와 같이 측정하였다. 최종 피브리노겐 농축의약품(피브리노겐 의약품, DP)의 경우, ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 입자의 수가 측정되었다. 동결 건조된 DP를 주사용수(WFI) 50mL로 재구성했다. 재구성된 용액을 추가 여과 없이 입자 계수기로 옮겼다. 모든 샘플은 3회 측정하였다. 바이알 당 총 입자량의 평균값이 보고되었다. ≥ 25 μm의 입자도 입자 ≥ 10 μm의 군에 포함되므로, ≥ 10 μm의 입자의 수는 ≥ 25 μm 의 입자 수보다 항상 높았다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 최종 5개 배치의 결과는 최종 약품의 SVP 수가 항상 사양 내에 있음을 보여주었다(표 4). 따라서 투여 전 별도의 여과가 필요하지 않는다.
표 4: 실시예 2a의 방법에 의해 제조된 최종 DP(5개 예시적 배치)의 방출 측정에서 결정된 바이알 당 ≥ 10μm 및 바이알 당 ≥ 25μm인 SVP의 수
| B524016 | B524026 | B524017 | B524028 | B524019 | |
| 바이알 당 SVPs ≥10 μm | 1666 | 2274 | 1642 | 1870 | 1111 |
| 바이알 당 SVPs ≥25 μm | 23 | 26 | 19 | 30 | 4 |
비교를 위해 다음 표 5는 일부 경쟁사 약품에서 분석된 SVP 수를 나타낸다.
표 5: SVP 수(용기당 입자), 비교 약품
| SVP ≥10 μm | SVP ≥25 μm | |
| Fib Clot® (LFB) | 11633 | 500 |
| Fibryga® (Octapharma) | 13626 | 463 |
| Fibryga® (Octapharma) | 16917 | 167 |
| Fibryga® (Octapharma) | 16800 | 143 |
| Haemocomplettan® (CSL Behring) | 17640 | 1053 |
| Haemocomplettan® (CSL Behring) | 10947 | 264 |
본 발명의 약품에서 SVP의 양이 적은 것은 바람직하게는 최종 제형, 특히 폴리소르베이트의 존재, 온화한 충전 프로세스 및 피브리노겐에 정확하게 적용된 동결 건조 프로세스로부터 발생한다.
실시예 7 - 의약품의 안정성
7.1 연구 A - 동결건조된 의약품의 장기 안정성
피브리노겐 의약품의 장기 안정성을 조사하기 위해, 4개 배치의 피브리노겐 의약품을 안정성 시험용으로 보관했다. 배치 1개는 36개월 동안, 배치 3개는 60개월 동안 각각 5℃(± 3℃) 및 25℃(± 2℃)에서 보관했다. 이러한 데이터에 따르면 피브리노겐 의약품의 경우 5℃(± 3℃) 및 25℃(± 2℃)에서 최소 60개월의 유효 기간이 나타났다.
안정성 시험을 위해 배치는 각 보관 조건(5℃, 25℃, 55-65% 상대 습도(RH))에 대해 사전 정의된 시점에서 재구성 후 활성에 대해 시험하였으며, 즉 피브리노겐 활성은 재구성 직후 및 실온(약 25℃)에서 6시간 및 24시간 배양한 후 재구성된 수용액에서 시험하였다. 이 조사는 임상 일상에서 피브리노겐 농축액의 사용을 시뮬레이션 했다.
5℃(± 3℃)에서 보관: 안정성을 나타내는 매개변수에 대한 모든 결과는 각각 60개월(배치 B524071, B524084 및 B524032) 및 36개월(배치 B524031) 후에도 기본적으로 변하지 않았으며, 즉 재구성된 피브리노겐의 활성, pH 값, 삼투압, 색상 및 유백색은 변하지 않았다. 동결건조물의 용해 시간은 5분에서 30분 사이로 다양했으며 이는 허용 가능했다. 응집체의 증가는 감지할 수 없다. 모든 시점에서 재구성된 용액의 안정성은 실온에서 최대 24시간 동안 나타났다. 시트레이트, 트레할로스, 아르기닌과 같은 부형제의 함량은 거의 변하지 않았다. 시험된 모든 용액은 무균되었으며 발열 물질은 함유되지 않았다. 배치 내에서 측정된 잔류 수분 함량은 각각 36개월, 60개월 후 2.1 내지 3.0%였다. 수치는 이전보다 약 0.2 내지 0.3%포인트 낮아졌다.
25℃(± 2℃)에서 보관: 안정성을 나타내는 매개변수에 대한 모든 결과는 각각 60개월(배치 B524071, B524084 및 B524032) 및 36개월(배치 B524031) 후에도 기본적으로 변하지 않았으며, 즉 피브리노겐의 활성, pH 값, 삼투압, 색상 및 유백색 농도는 기본적으로 변하지 않았다. 용해 시간은 5분에서 30분 사이로 다양했으며 결과는 허용 가능했다.
안정성 연구에서 시험된 모든 샘플은 모든 보관 조건에서 무균되었으며 발열 물질이 없었다. 5℃(±3℃) 및 25℃(±2℃)에서 60개월간 보관하는 동안 알루미늄 농축이 발생하지 않았다.
요약하면, 재구성 직후 얻은 결과와 6시간 및 24시간 이후의 유효기간 동안 보관 온도 5℃ 및 25℃에서 60개월에 걸쳐 미리 정의된 각 시점에 대해 얻은 결과를 비교함으로써 재구성 후 적어도 처음 24시간 동안 피브리노겐 활성이 안정적으로 유지되는 것으로 나타났다.
7.2 연구 B - 재구성된 의약품의 안정성
배치 번호의 경우 B524071, 안정성 연구를 진행하였고, 재구성 후, 의약품은 최대 8주 동안 2 내지 8℃ 또는 23 내지 27℃에서 보관하였다(도 4). 이러한 배치의 결정된 잔류 수분은 2.4%였다.
2 내지 8℃에서 최대 8주 동안 보관할 수 있다. 단백질 분해 활성이나 응집체 함량의 증가가 없었으며, 특정 활성의 현저한 감소도 없었다. 23 내지 27℃에서 보관 시, 샘플은 또한 적어도 4주 동안 안정하였다. 8주간 후에만 비활성이 서서히 감소하고 단백질 분해 활성이 증가했다.
7.3 연구 C - 재구성된 의약품의 안정성(6년 동안 보관)
제3 안정성 연구가 수행되었으며, 여기서 6년 된 피브리노겐 의약품(배치 번호 B524032, 각각 5℃ 또는 25℃에서 6년 이상 보관)을, 규정된 기간, 즉 0시간, 6시간, 24시간, 48시간 이후 5℃ ± 3℃ 및 25℃ ± 2℃(60% RH ± 5% RH)에서 주사용수 중에서 재구성한 후 활성을 시험했다. 결과는 도 5에 나타낸다.
샘플링 후 미생물 검사는 재구성 중 미생물 오염을 확인하기 위해 규정된 시점 후에 수행되었다. 어떤 샘플에서도 미생물 오염이 나타나지 않았다. 모든 샘플의 pH는 6.9였다. 유백색과 색상은 모든 샘플에서 동일했다.
결론적으로 건조의약품을 6년(72개월) 보관한 후에도, 재구성된 의약품은 피브리노겐 활성의 손실을 나타내지 않았다. 더욱이, 재구성된 의약품은 5℃ 및 25℃에서 48시간 후에도 여전히 안정적이었다. 시험된 모든 매개변수는 재구성 직후와 그 이후의 모든 시험 시점에서 사양의 목표 범위 내에 있는 것으로 나타났다. "총 단백질(total protein)", "응집체(aggregate)" 및 "눈에 보이지 않는 입자(sub-visible particles)" 매개변수에 대해서만 약간의 변동이 관찰되었다. 이러한 높은 안정성은 놀라운 것이며, 안정화 요소, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이 상당한 양의 알부민이 없으면 더욱 그렇다.
실시예 8 - 재구성 특성
실시예 8 - 재구성 특성
비교적 높은 잔류 수분은 의약품의 용해도에 유의미한 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 다른 약품과 비교하여, 본 발명의 약품은 유사한 용해도를 갖는다. 재구성 또는 용해 과정은 일반적으로 본 발명 약품의 경우 3 내지 8분 이내에 완료되며, 주사용수에 용해된다. LFB SA(Courtaboeuf Cedex, France)의 FibCLOT®은 약 4 내지 5분 내에 용해된다. 강한 거품의 형성이 관찰된다. Fi-bryga® von Octapharma(스위스 랑겐펠트)를 8분 후에 용해된다. CSL Behring(독일 마르부르크)의 Haemocomplettan®은 약 10분 후에 용해된다. 용액 자체의 방법(바이알에 물을 직접 추가하거나 Mix2Vial®(필터를 통해 물을 추가하고 용해된 약품을 여과), 손으로 흔들거나 셰이커 사용)은 결과에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보이며, 일반적으로 Mix2Vial® 방법을 사용하면 거품 형성이 더 낮다.
요약하면, 충전 프로세스 및 제형과 조합시 본 발명의 방법에 따른 동결건조 및 건열 처리로 바이러스에 안전하고 활성이며 가용성이 높은 약품이 얻어진다.
Claims (17)
- 2 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖고, 선택적으로 2.5 내지 3.5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는, 건조 형태, 바람직하게는 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10).
- 청구항 1에 있어서,
상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어진 피브리노겐 용액이 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP(subvisible particle, 눈에 보이지 않는 입자)와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기(10). - 건조 형태, 바람직하게는 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)로서, 상기 피브리노겐 의약품이 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기(10).
- 건조 형태, 바람직하게는 동결건조 형태의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치(batch)로서, 상기 배치로부터 적어도 10개의 용기(10)의 경우, 상기 피브리노겐 의약품이 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 6000개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 600개 이하의 SVP를 포함하는, 용기(10)의 배치.
- 청구항 3 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피브리노겐 의약품이 2 내지 5%(w/w), 바람직하게는 2.5 내지 3.5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 갖는,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
a) 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80,
b) 선택적으로 증량제(bulking agent), 바람직하게는 트레할로스,
c) 선택적으로 아미노산, 바람직하게는 아르기닌 및/또는
d) 선택적으로 염, 바람직하게는 염화나트륨, 시트르산나트륨 또는 이들의 조합
을 포함하고,
상기 의약품이 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80, 트레할로스, 아르기닌, 나트륨, 염화물, 시트레이트 및 잔류 수분을 포함하는,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 청구항 2 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재구성이 20g/L의 농도로 이루어지는, 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 청구항 2 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
20g/L 피브리노겐으로 재구성 시 0.5g/L 미만의 알부민을 포함하고 사카로스 또는 글루타메이트를 포함하지 않는,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치, - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피브리노겐 의약품이 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어진 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 3500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 35개 이하의 SVP를 포함하며,
선택적으로, 상기 피브리노겐 의약품은 수용액, 바람직하게는 주사용수 중에서 재구성하기에 적합하고, 상기 의약품의 피브리노겐 1g을 재구성하여 얻어지는 피브리노겐 용액은 10 내지 100㎛의 크기를 갖는 2500개 이하의 SVP와, 25 내지 100㎛의 크기를 갖는 30개 이하의 SVP를 포함하는,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
2 내지 25℃에서 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 5년 동안 안정한,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
20% 미만의 응집체를 포함하는,
피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치. - 이하의 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 제조 방법:
a) 피브리노겐 원약의 벌크 용액을 무균 여과하는 단계,
b) 선택적으로 교반 수단(8)을 갖는 교반기(7)를 포함하는 수용 탱크(6)에 무균 여과된 벌크 용액을 수용하는 단계,
c) 선택적으로, 교반 수단(8)이 상기 벌크 용액 중에 침지되어 있을 때 수용 탱크(6)의 벌크 용액을 교반하는 단계,
d) 소정량의 용액을 용기(10)에 충전하는 단계,
e) 상기 용기(10) 내의 용액을 동결건조하여 동결건조 의약품을 얻는 단계,
f) 상기 동결건조 의약품을 건열로 처리하는 단계,
g) 선택적으로, 상기 의약품을 포함하는 용기(10)를 포장하는 단계. - 청구항 12에 있어서,
상기 수용탱크(6)는 용적이 50 내지 150L이고 원통형이며, 상기 교반 수단(8)은 최대 150rpm으로 회전하는 중앙 구동 샤프트에 부착된 교반 날개(또는 막대)이며, 상기 교반 시간은 최대 1시간, 선택적으로 약 5분이고,
바람직하게는, 단계 c)에서 교반은 최대 10분 동안이고, 벌크 용액은 단계 d) 중에 교반되지 않는, 방법. - 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 동결건조는
a) -29℃ 이하에서 적어도 4시간 동안, 바람직하게는 -50℃ 이하에서 동결건조 하는 단계,
b) -10℃ 이하 및 적어도 40 μbar(4 Pa)에서 1차 단계적으로 건조하는 단계로서, 여기서 바람직하게는, -25℃ 미만 및 적어도 200μbar(20 Pa)에서 시작하여 각 단계에서 온도가 증가하는 단계,
c) 17 내지 23℃에서 적어도 2시간 동안 2차 건조하는 단계
를 포함하고,
여기서 동결건조 후 잔류 수분 함량은 2 내지 5%(w/w)이고,
상기 동결건조는 선택적으로
a) -52℃ 이하에서 8시간 이상 동결하는 단계,
b) 1차 단계적으로 건조하는 단계로서, 여기서 제1 단계는 약 -36℃, 약 280 μbar(28 Pa)에서 약 48시간 동안 수행되고, 제2 단계는 약 -23℃, 약 70 μbar(7 Pa)에서 약 40시간 동안 수행되고, 제3 단계는 약 -10℃, 약 40 μbar(4 Pa)에서 약 78시간 동안 수행되는 단계,
c) 약 20℃, 약 10 μbar(1 Pa)에서 약 3 내지 4시간 동안 2차 건조하는 단계
를 포함하는, 방법. - 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
건열에 의한 처리는 선택적으로 증기 오토클레이브에서 상기 의약품을 100℃+/-1.5℃로 30+/-3분 동안 가열하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 방법으로부터 얻을 수 있는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치.
- 피브리노겐 결핍증의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 11 또는 청구항 16중 어느 한 항의 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10) 또는 피브리노겐 의약품을 포함하는 용기(10)의 배치.
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